CN114632160B - 一种治疗急性呼吸窘迫综合征肺水肿的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗急性呼吸窘迫综合征肺水肿的药物组合物及其应用，药物组合物包括微丝解聚抑制剂、炎症小体抑制剂、瞬时受体电位阳离子通道6抑制剂和磺酰脲类受体1‑瞬时受体电位M4拮抗剂。通过药物联用的方式能够改善细胞内PN、钙信号和阳离子流入，可以有效缓解细胞内OP和肺内皮的非选择性通透性，改善体外和体内的上皮细胞液体吸收和肺水肿，从而实现对急性呼吸窘迫综合征和COVID‑19的肺水肿的有效治疗。

Description

一种治疗急性呼吸窘迫综合征肺水肿的药物组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种药物组合物，尤其涉及一种治疗急性呼吸窘迫综合征肺水肿的药物组合物及其应用。
背景技术
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种急性呼吸系统疾病，由肺部或全身性的炎症反应继发的肺泡损伤所致。其特点是炎症反应、血管通透性增加和非心源性肺水肿。根据最近的研究，41.8％的COVID-19患者发生了ARDS，而且几乎所有死于COVID-19的患者都患有ARDS。然而，在ARDS中，肺水肿液积聚在肺间质和气隙中，导致呼吸压力增加和气体交换不良，从而导致低氧血症，二氧化碳排泄减少，最终导致急性呼吸衰竭。目前，对这种情况仍然没有有效的药物治疗，重要的是进一步深入研究ARDS的发病机制，从而提供新的针对性治疗方案。
之前的研究表明，SARS-COV2通过病毒包膜上的刺突蛋白与靶细胞上的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，ACE2通过肾素-血管紧张素(RAS)和Kinin-Kallikrein(KKS)系统参与肺部的生理和病理过程。ACE2可以将血管紧张素I(Ang I)和血管紧张素II(AngII)裂解为Ang-(1-7)，促进肺水肿和肺损伤。同时，ACE2可以与2型受体(BK2)中的缓激肽结合，并通过BK2受体信号传导导致液体外渗和白细胞招募到肺部。BK2受体的激活导致过量液体转换和肺水肿的发生。同时，ARDS伴随着肺泡的高通透性，导致促炎症因子的积累和炎症反应的产生。因此，刺突蛋白、AngII和缓激肽如何通过炎症反应诱发肺水肿仍不确定。
水的代谢和水肿的发生取决于体内的跨膜渗透压梯度。根据最近的研究，蛋白质纳米颗粒的产生可以导致渗透压增高(PN-OP)和水的流动，这也与膜流动性的上调和促进非选择性渗透密切相关。以前的研究表明，ARDS与促炎症细胞因子的分泌和炎症体的产生有关。然而，需要更多的研究来验证纳米颗粒相关的渗透压、炎症小体和肺水肿之间的关系。即亟需一种专门且高效治疗肺水肿、尤其是急性呼吸窘迫综合征的肺水肿的药物。
发明内容
本发明提供一种治疗急性呼吸窘迫综合征肺水肿的药物组合物及其应用，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种治疗肺水肿的药物组合物，具有这样的特征：包括微丝解聚抑制剂、炎症小体抑制剂、瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)抑制剂和磺酰脲类受体1-瞬时受体电位M4(Sur1-Trpm4)拮抗剂。
进一步，本发明提供一种治疗肺水肿的药物组合物，还可以具有这样的特征：其中，所述微丝解聚抑制剂为番泻苷A(SennosideA)；所述炎症小体抑制剂为曲尼斯特(Tranilast)；所述瞬时受体电位阳离子通道6抑制剂为SAR7334；所述磺酰脲类受体1-瞬时受体电位M4拮抗剂为格列本脲(Glibenclamide)。
进一步，本发明提供一种治疗肺水肿的药物组合物，还可以具有这样的特征：其中，所述番泻苷A的浓度为100μM；所述曲尼斯特的浓度为50μM；所述SAR7334的浓度为10μM；所述格列本脲的浓度为100μM。
进一步，本发明提供一种治疗肺水肿的药物组合物，还可以具有这样的特征：还包括药物上可接受的载体。
进一步，本发明提供一种治疗肺水肿的药物组合物，还可以具有这样的特征：药物组合物的剂型包括注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、喷雾剂、鼻粘膜滴剂和肺吸雾剂。
本发明还提供所述药物组合物在制备治疗肺水肿药物中的应用。
本发明还提供所述药物组合物在制备治疗急性呼吸窘迫综合征的肺水肿药物中的应用。
本发明还提供所述药物组合物在制备治疗COVID-19的肺水肿药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种治疗急性呼吸窘迫综合征肺水肿的药物组合物，可以有效治疗急性呼吸窘迫综合征和COVID-19的肺水肿。通过药物联用的方式能够改善细胞内PN、钙信号和阳离子流入，可以有效缓解细胞内OP和肺内皮的非选择性通透性，改善体外和体内的上皮细胞液体吸收和肺水肿。研究表明，PN-OP在ARDS和COVID-19患者的肺水肿中起着至关重要的作用，跨膜渗透压梯度的恢复为肺水肿提供了潜在的治疗方法，并开发了肺损伤的新的药物靶点。
附图说明
图1是在AngⅡ或BK刺激下，有效药物或其组合降低了细胞内蛋白质纳米颗粒相关渗透压的实验结果图；其中，(A和B)15分钟内不同处理下Vimentin张力的归一化CFP/FRET比值的平均值；(C)通过AngⅡ或BK测量A549细胞的细胞质渗透压，最佳有效药物组合；(D)用激光共聚焦显微镜观察经药物组合处理的A549细胞中Phalloidin(FITC)、α-管蛋白(TRITC)和ASC(FITC)的免疫荧光图像；(E)使用抗体对A549细胞中的ASC和NLRP3进行免疫荧光；(F-H)A549细胞经AngⅡ或BK、AngⅡ或BK与药物组合处理后，细胞质钙离子(F)、氯离子(G)、钠离子(H)的荧光强度变化；ns，p>0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图2是AngⅡ或BK和药物组合处理后肺泡上皮细胞和血管内皮细胞通透性的变化的实验结果图；其中，(A-D)各组的归一化TEER值；对照组测得的TEER值被定义为100％；A549和HPMEC细胞分别在AngⅡ或BK、SennosideA、Tranilast、SAR7334和Gli处理90分钟(上)和24小时(下)；(E)小鼠肺部EB外渗浓度的量化(μM)；(F)在AngⅡ或BK和药物组合治疗后，小鼠肺部支气管肺泡灌洗液中蛋白质浓度的变化。
图3是药物组合对AngⅡ或BK诱导的A549细胞α-ENaC的影响的实验结果图；其中，(A)在没有阿米洛利(10μM)和有阿米洛利(10μM)的情况下，由-100mV的测试电位引起的全细胞电流密度的汇总数据；(B)通过Western印迹法检测细胞裂解液中ENaC-α亚单位蛋白的表达；(C)Na-K-ATPase酶活性的变化；ns，p>0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4是药物组合在AngⅡ或BK诱导的小鼠肺水肿中的治疗作用的实验结果图；其中，(A)肺部干湿比(W/D)；(B)与AngⅡ或BK组相比，药物组合组血清中的caspase-1活性水平明显下降；(C)经AngⅡ或BK诱导的小鼠肺部切片的苏木精和伊红染色的组织学，经药物组合治疗后，这种情况明显逆转；(D)对对照组、AngⅡ或BK、AngⅡ或BK及药物组合的肺组织进行IHC分析；细胞质用caspase-1抗体染色(棕色)；ns，p>0.05；**p<0.01；***p<0.001。
具体实施方式
以下通过实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
一、实施例
本实施例提供一种治疗肺水肿的药物组合物，包括微丝解聚抑制剂、炎症小体抑制剂、瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)抑制剂和磺酰脲类受体1-瞬时受体电位M4(Sur1-TRPM4)拮抗剂。
本实施例中，微丝解聚抑制剂为番泻苷A(SennosideA，SenA)；炎症小体抑制剂为曲尼斯特(Tranilast，TR)；瞬时受体电位阳离子通道6抑制剂为SAR7334；磺酰脲类受体1-瞬时受体电位M4拮抗剂为格列本脲(Glibenclamide,Gli)。
其中，番泻苷A的浓度为100μM；曲尼斯特的浓度为50μM；SAR7334的浓度为10μM；格列本脲的浓度为100μM。
所述药物组合物用于治疗肺水肿，包括急性呼吸窘迫综合征和COVID-19的肺水肿。
二、药效实验
(一)、细胞药效实验
1.FRET实验：
1.1质粒转染
将A549细胞培养在共聚焦皿中，生长至70-80％细胞密度左右，转染前6h将全培换成无血清培养基。取2.5μL质粒在100μLOPTI-MEM中，并加入2μL转染试剂充分混合，于室温下孵育20min，再加入900μL无血清培养基，混匀后加入共聚焦皿中，于37℃，5％CO2培养箱中培养6h，换完全培养基继续培养。
1.2 cpstFRET测定与分析
A549细胞接种于共聚焦皿中，转染后，使用TCS SP5(Leica)激光共聚焦显微镜在63倍镜下进行拍摄。实验条件为：CFP供体通道：475nm激发、505nm发射；YFP受体通道：538nm激发、601nm发射；FRET通道：475nm最小激发波长，505nm最大激发波长；使用CFP供体通道进行查找转染好的带有荧光的细胞，弃去培养基，加入含有药物组合物的Hanks溶液，根据设置好的程序进行15分钟内的FRET拍摄。以FRET和R作为能量传递指数的测定指标，使用公式1/R＝ICerulean donor/IVenus acceptor计算CFP/FRET比值。
含有药物组合物的Hanks溶液的配制方法：分别用1ml的DMSO配制成100mM番泻苷A、50mM曲尼斯特、10mM SAR7334、100mM格列本脲的母液。-20℃冰箱保存备用。分别吸取1μl各药物组分的母液加入1ml的Hanks溶液中，得到含有所述药物组合物的Hanks溶液。
结果如图1A和1B所示。结果表明药物组合物可降低Vimeintin的张力。
2.细胞质渗透压OP的测定和蛋白纳米颗粒的计数
将细胞培养基、渗透溶液HEPES和胰蛋白酶溶液都校准为300±10Osm/kg。将A549细胞培养在90mm的培养皿里。当细胞密度达到>95％时，将含有药物组合物的Hanks溶液作用细胞2h；消化细胞并放置于HEPES等渗溶液中，离心转移到1.5ml的微离心管中；离心(13000g，5min，4℃)，超声(75％振幅，5次，5s)，再离心(13000g，10min，4℃)；最后，将50μl上清液(细胞质)吸取至0.5mL试管。在使用之前，将Osmomat 3000冰点渗透压仪和050膜渗透压仪校准三次，测量细胞质OP。用Nanosight NS300检测细胞质纳米颗粒数量(Kcps)。
结果如图1C所示。
3.细胞内离子的检测(加药方式与FRET实验相同)：
3.1细胞内钙离子检测
(1)用DMSO溶解Fura-2AM染料，配制成1mM母液。使用Hank’s溶液配制成4μM的Fura-2工作液，并加入1％的PluronicF127；(2)将共聚焦皿里的细胞置于Fura-2工作液中孵育，在37℃、5％CO2培养箱中培养30min；(3)用Hank’s溶液洗涤细胞3次，加入Hank’s溶液，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养30min；(4)用Leica Thunder显微镜对细胞进行荧光钙离子检测。设置激发波长340nm/380nm，每60秒获得一次荧光图像。根据在15分钟内施加药物之后(Ft)或之前(F0)的离子荧光计算Fura-2 AM荧光强度归一化值(Ft/F0)。
3.2细胞内钠离子检测
(1)用DMSO溶解Enhached NaTrium Green-2 AM染料，配制成1mM母液。使用DMEM培养基溶液配制成4μM的ENG-2工作液，并加入1％的PluronicF127；(2)将共聚焦皿里的细胞置于ENG-2工作液中孵育，在37℃、5％CO2培养箱中培养30min；(3)用DMEM培养基溶液洗涤细胞3次，加入10％FBS的DMEM溶液，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养30min；(4)用LeicaThunder显微镜对细胞进行荧光钠离子检测。设置激发波长494nm，每60秒获得一次荧光图像。根据在15分钟内施加药物之后(Ft)或之前(F0)的离子荧光计算ENG-2AM荧光强度归一化值(Ft/F0)。
3.3细胞内氯离子检测
(1)用DMSO溶解MQAE-AM染料，配制成1mM母液。使用HEPES溶液配制成1μM的MQAE工作液；(2)将共聚焦皿里的细胞置于MQAE工作液中孵育，在37℃、5％CO2培养箱中培养60min；(3)用HEPES溶液洗涤细胞3次；(4)用Leica Thunder显微镜对细胞进行荧光钠离子检测。设置激发波长494nm，每60秒获得一次荧光图像。根据在15分钟内施加药物之后(Ft)或之前(F0)的离子荧光计算ENG-2AM荧光强度归一化值(F0/Ft)。
结果如图1F、G、H所示。
4.免疫荧光
(1)种皿：取出细胞密度达到80％-90％的对数生长期的A549细胞，消化、离心，收集细胞吹打成细胞悬液，计数，调整细胞数，接种到共聚焦皿中，放入培养箱中让其贴壁生长。次日，加入含有药物组合物的DMEM全培作用细胞一定时间。含有药物组合物的DMEM全培的配制方法为：分别用1ml的DMSO配制成100mM番泻苷A、50mM曲尼斯特、10mM SAR7334、100mM格列本脲的母液；-20℃冰箱保存备用；分别吸取1μl各药物组分的母液加入1ml的DMEM全培中，得到含有药物组合物的DMEM全培。(2)洗涤：每孔加入1ml预冷的PBS，置于摇床上洗涤细胞3次，5min。(3)固定：吸弃PBS，每孔加入1ml 4％多聚甲醛，孵育30min。(4)洗涤：每孔加入1ml预冷的PBS摇床上洗涤细胞3次，每次5min。(5)通透：吸弃PBS，每孔加入1ml的2％的曲拉通(PBS配制)，室温放置10min。(6)洗涤：每孔加入1ml预冷的PBS摇床上洗涤细胞3次，每次5min。(7)封片：吸弃PBS，每孔加入200μl的1％BSA(PBS配制)室温封闭60min。(8)洗涤：每孔加入1ml预冷的PBS摇床上洗涤细胞3次，每次5min。(9)孵育一抗:以(一抗:PBS配制的1％BSA＝1:100)的比例配制一抗溶液，每孔加入100μl的对应的一抗溶液，摇匀后4℃放置过夜。(10)洗涤：次日，吸弃一抗，每孔加入1ml预冷的PBS摇床上洗涤细胞5次，每次5min。(11)孵育二抗：以(二抗:PBS配制的1％BSA＝1:200)的比例配制二抗溶液，将每孔加入150μl的对应的二抗溶液，37℃孵育2h，避光操作。(12)洗涤：吸弃二抗溶液，每孔加入1ml预冷的PBS摇床上洗涤细胞5次，每次5min，避光操作。(13)染核：每孔加入150μl的DAPI溶液染核，室温下孵育5min，避光操作。(14)洗涤：吸弃DAPI溶液，每孔加入1ml预冷的PBS摇床上洗涤细胞5次，每次5min，避光操作。(15)使用共聚焦荧光显微镜对其观察拍照。
结果如图1D-E所示。
根据图1C-H的结果表明，联合用药后，MFs和MTs的细胞内结构、NLRP3炎症体的水平以及细胞内的Ca2+和Na+水平都有明显改善。
以上结果表明，通过Sennoside A和Tranilast抑制PN的产生，通过SAR7334和Glibenclamide阻断Ca2+和Na+的流入，可以有效地减弱AngII和BK刺激下肺泡上皮细胞内的PN-OP。
5.跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)测定(通透性实验)
(1)将A549细胞、HULEC-5a细胞(1×105/孔)分别接种在Transwell小室多聚碳酸酷膜上，加入600μlDMEM高糖培养基，置入6孔板中，底层小室每孔加入1mL培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h形成细胞单层。(2)然后将ERS-2Voltohmmeter电阻仪的两片电极垂直置于上下室，浸没于培养液液面以下，测出每个小室的基础电阻值，此为空白电阻(TEERblank)。(3)在Transwell小室中加入不同药物(含有药物组合物的DMEM全培)，对照组加入同样体积的DMEM全培，分别作用90min和24h。(4)90min和24h后，用同样的方法测量每个小室的电阻值(TEERc)，按照以下公式计算的TEER值，TEER＝(TEERc-TEERblank)*S(有效膜面积)，单位为(Ω.cm2)。
结果如图2A-D所示。结果表明，用AngII或BK处理可以在24小时内明显降低TEER值，而联合用药后，TEER值大幅提高。AngII或BK诱导的PN可以增加通透性，减少肺泡水肿液的清除，在体内或体外，PN-OP的恢复可以有效改善肺微血管内皮和肺泡上皮通透性的变化。
6.肺泡液清除实验
6.1α-ENaC的蛋白质和活性检测(Western Blotting实验、电生理)
6.1.1 Western Blotting实验：
6.1.1.1细胞种皿：取出细胞密度达到80％-90％的对数生长期的A549细胞，消化、离心，收集细胞吹打成细胞悬液，计数，调整细胞数，接种到共聚焦皿中，放入培养箱中让其贴壁生长。次日，加入含有药物组合物的DMEM全培作用细胞一定时间；按照实验方法进行蛋白提取与定量。
6.1.1.2 Western Blotting
(1)制备SDS-PAGE凝胶：将玻璃板装入支架中，配制15ml体系10％分离胶和5ml体系5％浓缩胶；(2)加入适量体积的10％分离胶，约占玻璃板横截面2/3时，加入ddH2O至顶部，室温放置待分离胶凝固后，倒掉ddH2O，并用滤纸吸干。随后，加入5％浓缩胶至玻璃板顶部，迅速插入梳子，室温凝固。(3)电泳与转膜：将玻璃板装入电泳槽中，并于槽中加入1×Running Buffer，快速拔出梳子、加样，随后以40mA恒流，120min跑电泳，待溴酚蓝跑到分离胶底部终止电泳。取出胶切去周围无样品上样的部分，转膜夹黑板在下，依次放置滤纸、凝胶、甲醇活化后的PVDF膜、滤纸、白板顺序依次对齐铺好。置于电泳仪中，冰水中100V×90min恒压条件下进行转膜。(4)抗体孵育：将PVDF膜放入5％脱脂奶粉中封闭2h，TBST洗涤3次，每次10min。随后加入不同的目的一抗，4℃冰箱孵育过夜。次日，回收一抗放于-20℃冰箱。TBST洗涤PVDF膜3次×10min，加入相应二抗封闭2h，回收二抗，4℃保存。TBST洗涤PVDF膜3次×10min。(5)曝光与灰度值计算：将PVDF膜平铺于玻璃皿中，滴加ECL发光液，采用凝胶成像系统进行程序曝光。采用Image Lab软件分析曝光条带，测定各个条带的灰度值，计算出目的蛋白条带/内参(GAPDH)条带灰度值的比值。
结果如图3B所示。结果表明，与对照组相比，在AngII和BK组中，肺泡细胞中的α-ENaC的表达水平被下调。
6.2电生理
6.2.1主要溶液的配制
(1)标准的细胞外溶液配制(单位：mM)：145NaCl，5KCl，1CaCl2，1MgCl2，10葡萄糖和10HEPES，用NaOH调节pH值至7.4。(310-320mOsm)。(2)标准的细胞内溶液配制(单位：mM)：140KCl、5NaCl、1CaCl2、1MgCl2、10葡萄糖和10HEPES(pH7.3，290-300mOsm)。(3)TRPC6记录的细胞内溶液配制(单位：mM)：140CsCl、2MgCl2、1CaCl2、10HEPES、10EGTA、2Na2ATP(pH7.3，290-300mOsm)。(4)TRPM4记录的细胞内溶液配制(单位：mM)：140CsCl，2MgCl2，1CaCl2，10HEPES，10EGTA，4Mg-ATP(pH7.3，290-300mOsm)。(5)ENaC记录的细胞内溶液配制(单位：mM)：140CsCl，2MgCl2，1CaCl2，10HEPES，10EGTA，4Mg-ATP(pH7.3，290-300mOsm)。
6.2.2全细胞膜片钳实验
(1)细胞以适当的密度接种在9mm的聚赖氨酸涂层玻璃盖玻片上，全细胞膜片钳实验前，将玻片安装在一个腔室中，放置在倒置显微镜的平台上，并灌注相应的溶液。(2)通过使用Multiclamp 700B放大器和Digidata 1550B数字转换器记录细胞的TRPC6、TRPM4、ENaC电流。用垂直两级移液器拉动器从硼硅酸盐毛细管玻璃拉出贴片电极。电极充满了细胞内溶液，其电阻在2到5MΩ之间。在整个细胞配置建立后，在记录前进行电容补偿和串联电阻补偿的调整。如果在实验过程中接入不稳定(在实验结束时串联电阻增加超过15％)，则从分析中略去该细胞。电流由200ms的电压斜坡协议(1mV/ms，从100mV到-100mV)诱导，每10秒从0mV的保持电位开始。电流密度的计算方法是用电流振幅除以细胞电容，通过使用贴片钳放大器的模拟电路校正记录细胞中的电容性瞬变来获得。膜电位的测量是通过将放大器切换到电流钳模式。实验前将培养皿里的培养基换成含有药物组合物的Hanks溶液。
结果如图3A所示。结果表明，在A549细胞的膜片钳研究中，根据电流密度与电压的关系和全细胞电流中可以看出，AngII和BK明显阻断了ENaC的离子电流。
根据图3A和B的结果表明，在药物组合组中，α-ENaC的蛋白质和活性都有增加。
6.2Na+、K+-ATP酶的活性
(1)将细胞接种到6孔板中，药物(含有药物组合物的DMEM全培)处理一定时间；(2)用胰酶将细胞消化下来，或用细胞刮将细胞刮下来，将其置于离心机中以1000r/min，室温离心10分钟，弃上清留细胞沉淀；(3)在细胞沉淀中加入0.5-1ml等渗的PBS，轻轻颠倒混匀。重复上述操作反复洗涤1～2次；(4)使用BCA蛋白浓度测定试剂盒，测定细胞蛋白浓度；(5)严格按照试剂盒说明进行细胞Na-K-ATPase酶活性测定。
结果如图3C所示。结果表明，在药物组合组中，α-ENaC的蛋白质和活性都有增加。
以上结果表明，对PN-OP的抑制通过ENaC和Na+,K+-ATP酶介导的肺部经上皮活性钠蛋白转运的两个基本机制促进AFC。
(二)、动物药效实验
将50只小鼠随机分为以下五组：正常生理盐水处理的对照组(假手术组)，AngⅡ模型组，AngⅡ给药物组，缓激肽模型组以及用缓激肽和药物组。同时，药物通过腹腔注射的方式给药。
其中，AngⅡ模型组和缓激肽模型组的动物造模方法分别为：将血管紧张素II(5mmol/L)、缓激肽(10mmol/L)分别溶于的生理盐水中。使用血管紧张素II、缓激肽气管滴注法分别诱导小鼠急性呼吸衰竭综合征模型。
动物药物配制及给药方式为：曲尼斯特(200mg/kg)，番泻苷A(50mg/kg)，SAR7334(10mg/kg)，格列本脲(5mg/kg)，四种药物(母液)共同加入生理盐水进行腹腔注射，给药体积为0.2ml/10g体重。
使用uWBP对小鼠进行AngII或BK吸入的肺功能测量。结果如表1所示。
表1药物组合治疗对AngⅡ或BK诱导的肺功能参数的影响。
数据显示为平均值±标准误差。AngⅡ或BK组与生理盐水对照组相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。#p<0.05.##p<0.01.###AngⅡ或BK/药物组合处理的小鼠与AngⅡ或BK相比，##p<0.001。Ti：吸气时间；Te：呼气时间；PIF：吸气流量峰值；PEF：呼气流量峰值；EIP：吸气末停顿；EEP：呼气末停顿；RT：放松时间；F：呼吸频率；Penh：加强停顿；EF50：呼气流量50和TV：潮气量。
结果表明，AngII或BK诱导后，几个肺活量参数明显增加(Ti、Te、PEP、F、Penh、EF50和Sr)或减少(RT、PIF和TV)，所有这些变化都被药物组合处理有效阻止。
肺组织含水量的测量表明，AngII或BK明显增加了肺水肿，而药物组合则抑制了它，如图4A所示。同时，与AngII或BK组相比，药物组的肺组织中明显的肺间质水肿和大量炎症细胞的浸润明显减弱，如图4C)。此外，免疫组化(IHC)染色和caspase-1活性测定，肺组织和血清中，药物组中caspase-1的活性低于AngII或BK组，如图4B和D所示。总的来说，这些结果表明，药物组合可以有效地缓解AngII或BK引起的体内水肿。
三、药理作用
所述药物组合物包括三个靶点，分别为蛋白纳米颗粒(PN)、Ca2+和Na+。其中，SennosideA和Tranilast为PN相关药物，SennosideA是一种SSH抑制剂，可以稳定肌动蛋白丝，Tranilast是一种抗过敏的临床药物，是一种直接的NLRP3抑制剂，SennosideA和Tranilast可以分别抑制微丝解聚、炎症小体的产生。SAR7334为Ca2+相关药物，是一种强效和特异性的TRPC6抑制剂，可抑制化学信号DAG诱导的Ca2+流入。Glibenclamide为Na+相关药物，是一种Sur1-TRPM4的拮抗剂，有助于减少细胞内Na+的含量。
SennosideA和Tranilast可以抑制微丝解聚、炎症小体的产生。根据唐南效应和双层理论，只有0.1-1000纳米的蛋白颗粒对阳离子有吸附作用，因此，抑制微丝解聚和炎症小体生成均参与膜电位的恢复并可以进而减少相应细胞内的Ca2+，从而有效减少PN-OP。细胞内PN的抑制和OP的恢复也可以明显改善异常的膜电位和细胞体积及离子平衡。此外，PN-OP增加诱导的肺血管屏障破坏、抑制ENaC和Na+、K+-ATP酶的活性都能抑制肺泡上皮细胞的肺泡液重吸收能力。总的来说，抑制微丝解聚、炎症小体的产生、Ca2+和Na+的流入，可以促进肺部微血管内皮和肺泡上皮细胞的离子平衡和电位平衡，改善肺上皮和内皮细胞的通透性，增加肺泡清除率，降低炎症反应，最终实现对肺水肿的治疗。
具体的，肺水肿被认为是急性呼吸窘迫综合征的一个典型特征，并伴有肺泡间质渗出和肺泡液体清除障碍。渗透压(OP)是控制水肿的主要因素，Ca2+和Na+是细胞内OP上调和肺水肿发展的重要诱因。本发明研究发现PN关键性地参与了OP调节，与细胞内Ca2+和Na+的增加密切相关。同时，膜电位的改变是PN-OP的一个重要生物物理机制，涉及离子通道的激活和离子的流入。然而，化学信号DAG也可以通过配体依赖的TRPC6激活和钙信号增强参与OP调节，这与PN的产生作用不同。因此，本发明提出PN、Ca2+和Na+协同调节OP及其相关的肺水肿的物理调节，是ARDS患者和COVID-19晚期患者的一个重要发病机制。
炎症小体、细胞骨架解聚和血浆白蛋白是肺部细胞内和细胞外蛋白纳米颗粒的重要来源。炎症体的激活可能参与了细胞因子风暴的形成，驱动肺部炎症的级联，然后激活NF-κB途径，促进更多基于炎症体的纳米粒子产生。抑制NLRP3的激活可以减少细胞内PN，阻碍跨膜渗透压梯度的形成，然后缓解水从血浆流入肺泡间的情况。丝状肌动蛋白(F-actin)的解聚是NLRP3炎症体激活的必要条件。本发明研究表明，细胞骨架的破坏通过进一步激活NLRP3/IL-1β途径发挥促炎作用。炎症小体和细胞骨架的解聚可以协同促进PN的增加和OP的上调以及肺水肿的发生。此外，细胞外PN的积累也会诱发渗透效应的改变，并通过离子吸收发挥高渗功能，以应对细胞内高渗的情况，维持等渗状态。因此，肺上皮细胞和肺泡上皮细胞对肺水肿中OP的异常改变起着关键作用。抑制肺泡PN的产生和肺泡间PN(血浆蛋白)的清除是改善ARDS治疗的有效治疗方法。
PN诱导膜电位的超极化和去极化，两者都参与了各种电压依赖性离子通道的激活。对膜电位的影响不仅与它的电位(变化)有关，而且还参与调节TRPC6和TRPM4等离子通道的时程发展。然而，PN在调节膜电位方面不仅与它的数量有关，而且还与它的粒度分布有关。根据唐南效应和双层理论，只有0.1-1000纳米的蛋白颗粒对阳离子有吸附作用，其吸附离子的变化也受二价钙、镁离子等高价离子的调节，说明PN与各种因素共同参与膜电位调节。因此，即使抑制了细胞骨架解聚和炎性小体的产生，也很难使细胞内PN及其离子吸附恢复到正常状态。因而改善临床肺水肿，仍然是一个棘手的问题。
Na+流入是细胞内OP增加的一个重要来源。然而，在本发明研究发现PN和Ca2+是Na+通道激活和Na+流入的关键因素，这两者是相关但不同的。具体来说，PN诱导的膜电位变化可以独立激活电压依赖性Ca2+和Na+通道；同时，化学信号DAG也可以诱导配体依赖性Ca2+通道(TRPC)的激活，这与电位变化有关，但与单纯PN诱导的电位变化的作用不同，它更有效地激活TRPC6通道，介导非选择性的钙流入；钙信号可以激活非选择性的Na+通道及其流入，这也与膜电位变化密切相关。因此，PN对水肿控制至关重要，但它不是肺泡水肿的唯一调节因素。因此，本发明提出了一种结合PN、钙离子和钠离子的多种来源，采用多靶点阻断来平衡细胞内OP，继而改善水肿治疗的药物组合物。
细胞内的蛋白质纳米颗粒和离子控制着跨膜渗透梯度和水通量。基于此，抑制微丝解聚、炎症小体的产生、Ca2+和Na+的流入可以有效减少PN-OP。细胞内PN的抑制和OP的恢复也可以明显改善异常的膜电位和细胞体积及离子平衡，这可以从以下数据得到支持：HCN、L-VGCC和TRPV4通道的抑制剂和Na+/K+ATP酶的恢复剂对改善OP和肺水肿的效果比PN和TRPC6及Sur1-TRPM4的抑制作用要小。然而，PLC作为DAG和TRPC6的上游信号，对PN-OP的作用小于TRPC6，其中PIP2或IP3信号可能通过其他途径参与细胞内离子平衡的改善。同时，该药物组合也改善了COVID-19患者的PN-OP和由刺突蛋白引起的肺功能障碍。
PN-OP的增加不仅导致水代谢的潜在变化，而且还诱导肺血管屏障的破坏，与肺部间质液体积聚的力学机制密切相关。细胞内PN和OP的增加参与BBB功能的破坏，并导致其对多种化学刺激的非选择性渗透性增加。因此，肺泡PN的形成参与了内皮细胞和肺泡屏障功能的破坏，这促进了肺泡内间质液渗入高水平的蛋白质。细胞外高蛋白水平又明显增加跨膜OP梯度，导致跨内皮和跨上皮的液体进入间质及肺泡空间，从而导致肺泡间隙的液体增加。此外，PN-OP还通过抑制ENaC和Na+、K+-ATP酶的活性来抑制肺泡上皮的渗出物再吸收能力。总的来说，PN-OP的恢复可以促进肺微血管内皮和肺泡上皮的离子平衡和电位平衡，表明力、电和化学信号对活细胞发挥了协同功能。
总之，由炎症小体生成和细胞骨架解聚为主导的蛋白纳米颗粒在ARDS和COVID-患者的肺水肿中起着关键作用。细胞内PN通过超极化和钙信号在毛细血管、肺泡隔和肺泡上皮之间构成跨膜渗透压梯度。同时，肺泡间质PN也有助于膜去极化和跨膜渗透压梯度。总之，下调PN的生成和阻断非选择性阳离子通道(TRPC6和TRPM4)可以缓解ARDS的肺水肿。

Claims (6)

1.一种治疗肺水肿的药物组合物，其特征在于：
包括微丝解聚抑制剂、炎症小体抑制剂、瞬时受体电位阳离子通道6抑制剂和磺酰脲类受体1-瞬时受体电位M4拮抗剂；
所述微丝解聚抑制剂为番泻苷A；
所述炎症小体抑制剂为曲尼斯特；
所述瞬时受体电位阳离子通道6抑制剂为SAR7334；
所述磺酰脲类受体1-瞬时受体电位M4拮抗剂为格列本脲；
所述番泻苷A的浓度为100μM；
所述曲尼斯特的浓度为50μM；
所述SAR7334的浓度为10μM；
所述格列本脲的浓度为100μM。
2.根据权利要求1所述的治疗肺水肿的药物组合物，其特征在于：
还包括药物上可接受的载体。
3.根据权利要求1所述的治疗肺水肿的药物组合物，其特征在于：
药物组合物的剂型包括注射剂、散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、喷雾剂、鼻粘膜滴剂和肺吸雾剂。
4.如权利要求1-3任意一项所述药物组合物在制备治疗肺水肿药物中的应用。
5.如权利要求1-3任意一项所述药物组合物在制备治疗急性呼吸窘迫综合征的肺水肿药物中的应用。
6.如权利要求1-3任意一项所述药物组合物在制备治疗COVID-19的肺水肿药物中的应用。
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