CN114585908A - 用于确定抗微生物剂给药方案的基于光学的方法 - Google Patents

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Abstract

基于光学的方法确定对患有微生物感染的受试者的临床上最有效的抗微生物剂治疗，包括对所述微生物剂产生耐药性的那些受试者。所提供的方法基于区分生长在培养基中的活微生物和死微生物的能力。

Description

用于确定抗微生物剂给药方案的基于光学的方法
技术领域
本公开涉及一种基于光学的方法，用于确定对患有微生物感染的受试者临床上有效的抗微生物剂治疗，包括那些微生物已经对一种或多种抗微生物剂产生耐药性的情况。所提供的方法基于在培养基中并暴露于一种或多种抗微生物剂的微生物群体中区分活微生物和死微生物的能力，其中活细胞和死细胞的微生物群体大小一起通过基于光学的方法连续监测。所提供的方法允许人们随时间连续确定由一种或多种抗微生物剂诱导的微生物杀灭率，包括微生物对此类药剂的耐药性的产生。
背景技术
抗微生物剂耐药性的惊人传播正在威胁我们的抗微生物医疗设备(Arias,2009,NEng J Med.360:439-43)。在美国，每年有近200万人在医院期间发生细菌感染，其中有90,000人死亡(Klevens,2007,Pub Health Rep.122:160-6)。美国社会每年因抗微生物剂耐药性而造成的总成本为令人吃惊的50亿美元(医学研究所，1998年)。铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)通常与肺炎和败血症等严重的院内感染有关；它们还与多种抗生素的多种耐药性机制相关(外排泵、β-内酰胺酶产生、孔蛋白通道缺失、靶位点突变等)(Bonomo,2006,Clin.Infect.Dis.1:43Suppl.2:S49-56；Landman,2009,Epid Biol Infect 137:174-80；Livermore,2002,Clinical Infectious Diseases 34:634-640；Urban,1994,Lancet 344:1329-32)。这些(多重)耐药性感染的治疗对临床医生来说是一个挑战，因为许多(如果不是全部)可用的抗生素是无效的，并且由这些病原体引起的感染已被证明与不利的临床结果相关(Cao,2004,Mol Microbiol 53:1423-36；Harris,1999,Clin.Infect Dis 28:1128-33；Kwa,2007Antimicrob Agents chemotherapy 54；3717-3722；Kwa et al 2007,AntimicrobAgents chemotherapy 54；1160-4；Tam,2010b Diag Microbiol Inf Dis 58:99-104)。因此，迫切需要协同努力来开发有效的治疗来对抗这些感染(Talbot,2006,Clin Infect Dis42:657-68)。然而，新的抗微生物剂需要时间来开发，而且不太可能及时提供以解决该危机(Cooper,2011,Nature 472:32)。
作为最后的手段，临床医生经常求助于现有抗生素的组合来治疗由这些有问题的病原体引起的感染。然而，目前对联合疗法的设计指导很差。在选择联合疗法来治疗受感染的患者时，临床医生目前缺乏做出合理决定的信息和研究细菌抗性机制的时间。具体而言，在设计联合疗法时要考虑的各种变量(例如，药剂、剂量、给药频率、IV施用的持续时间)的可能排列使得对所有可能性的综合评估难以进行。因此，大多数联合疗法的临床决策都是基于传闻经历或直觉凭经验做出的。因此，非常需要帮助临床医生设计联合疗法的方法。
发明内容
本公开涉及用于确定微生物细胞群体对一种或多种抗微生物剂处理的反应的快速方法。该方法基于使用光信号来检测微生物细胞群体随时间与一种或多种抗微生物剂接触的反应。以前使用光信号来估算活细菌负荷的一个缺点是无法区分活细胞和死细胞。本公开提供了用于在数学上解决实验上无法区分活细胞和死细胞这一情况的方法，从而提供在抗微生物剂存在下微生物细胞生长或下降的更准确测定。这样的方法为微生物感染的受试者(包括那些已经被对抗微生物剂产生耐药性的微生物感染的受试者)提供了个体化和有效的治疗策略。
所提供的方法包括将微生物细胞群体随时间暴露于一系列固定浓度的一种或多种抗微生物剂中的一种或多种，并测量在抗微生物剂存在下微生物群体的变化。通过检测测量微生物密度随时间变化的光信号来测量微生物细胞群体的变化。以下数学框架(1)包括公式，所述公式，当提供输入数据(即，(活的和死的)细菌细胞总群体大小随时间的测量值)时，能够预测活细胞对一种或多种抗微生物剂的微生物反应：
Figure BDA0003608559200000031
其中N总是总细菌群体；N活是活细菌群体；Nmax是最大细菌群体；Kg是生长率常数；Kd是自然死亡率常数；rmin是耐药性最强的亚群体的杀灭率；λ是适应的幅度；a是适应率。
本公开提供了一种基于以上数学框架(1)的时间段内的值来确定对受感染受试者的微生物细胞群体药理学上有效的临床给药方案的方法。本公开还涉及一种使用确定的给药方案治疗患有由微生物细胞群体感染引起的病理状况的受试者的方法。在另一方面，本公开涉及一种使用确定的给药方案在已经暴露于微生物细胞群体的受试者中预防病理状况的方法。
这样的给药方案可以包括在给定的治疗时间内施用单一抗微生物剂或一种或多种抗微生物剂的组合。
本公开进一步涉及一种用于抑制微生物细胞群体对一种或多种抗微生物剂的获得性耐药性出现的方法，可用于治疗受试者中与其相关的病理状况。该方法包括根据通过数学框架(1)确定的给药方案向受试者施用药理学上有效量的一种或多种抗微生物剂。
在又一方面，提供了一种方法，该方法包括使用所提供的数学框架(1)筛选一种或多种单独或组合的潜在抗微生物剂，用于在治疗和/或抑制一个或多个细胞群体的耐药性获得中的功效。在另一方面，提供了一种方法，该方法涉及编制有效治疗和/或抑制微生物细胞群体中出现获得性耐药性的抗微生物剂和给药方案的库。
所提供的方法进一步包括将微生物细胞群体随时间暴露于一系列固定浓度的一种或多种抗微生物剂中的一种或多种，并测量在抗微生物剂存在下微生物群体的变化。通过检测测量微生物细胞密度随时间变化的光信号来测量微生物细胞群体的变化。以下数学框架(2)由公式(1)的分析解得到，当提供输入数据(即，测量的总的(活的和死的)微生物细胞群体大小随时间的变化)时，其能够通过相应参数的估算拟合所述输入数据：
Figure BDA0003608559200000041
其中N总、N活、Nmax、Kg、Kd、rmin、λ和a如前所述。然后可以使用所述参数的估算值对(1)的二阶微分公式进行时间积分，以预测活微生物细胞对一种或多种抗微生物剂的反应。
本公开提供了一种基于以上数学框架(2)的时间段内的值来确定对受感染受试者的微生物细胞群体药理学上有效的临床给药方案的方法。本公开还涉及一种使用确定的给药方案治疗患有由微生物细胞群体感染引起的病理状况的受试者的方法。在另一方面，本公开涉及一种使用确定的给药方案在已经暴露于微生物细胞群体的受试者中预防病理状况的方法。
这样的给药方案可以包括在给定的治疗时间内施用单一抗微生物剂或一种或多种抗微生物剂的组合。
本公开进一步涉及一种用于抑制微生物细胞群体对一种或多种抗微生物剂的获得性耐药性出现的方法，可用于治疗受试者中与其相关的病理状况。该方法包括根据通过数学框架(2)确定的给药方案向受试者施用药理学上有效量的一种或多种抗微生物剂。
在又一方面，提供了一种方法，该方法包括使用所提供的数学框架(2)筛选一种或多种单独或组合的潜在抗微生物剂，用于在治疗和/或抑制一个或多个细胞群的耐药性获得中的功效。在另一方面，提供了一种方法，该方法涉及编制有效治疗和/或抑制微生物细胞群体中出现获得性耐药性的抗微生物剂和给药方案的库。
附图说明
本方法的各种实施方案在本文中参考附图进行描述，其中：
图1.理论和实际模型表现。左：下降后再生长表现为生长滞后——虚线为活菌计数(N活)，实线为预期光信号(N测量)。右：通过Bacterioscan 216Dx获取的拟合为细菌生长曲线的典型模型。
图2.两个波动曲线与一系列浓度的相关性。左：具有不同消除半衰期和给药频率的两种药物(用实线和虚线表示)的药代动力学曲线。右：因子浓度阵列用于模拟随时间变化的代表性浓度组合；A：两种药物的浓度都高；E：一种药物的浓度高，另一种药物的浓度低；B和D：一种药物的浓度高，另一种药物的浓度中等；C和F：一种药物的浓度中等，另一种药物的浓度低；G：两种药物的浓度都低；Ctrl：没有药物(对照)。
图3.鲍曼不动杆菌(A.baumannii)1261暴露于16种不同浓度的左氧氟沙星(L)和阿米卡星(A)组合。每个点序列代表细菌群体(基线接种物约2-5×105CFU/ml)暴露于一种左氧氟沙星/阿米卡星浓度组合(例如，左氧氟沙星20mg/l+阿米卡星30mg/以空心方格表示)的时间过程。暴露于无活性药物的细菌产生的曲线与安慰剂对照的曲线重叠；抗微生物活性表现为生长延迟或不生长。
图4.抗生素在不随时间变化的浓度下对包含不同程度抗生素耐药性的亚群体的异质细菌群体的定性影响。随着抗生素浓度设置的值越来越高，细菌随时间的反应会从完全生长变为饱和点(在没有抗生素的情况下)，再到生长减缓，再到再生长(由于对抗生素高度敏感的细菌亚群体迅速下降并结合以对抗生素较不敏感的亚群体的生长)，然后再生减缓，最终完全根除整个细菌群体。如果耐药性亚群体包含在原始细菌群体中或在抗生素暴露过程中发展，则不会发生完全根除。
图5.如图4中所述，响应于不随时间变化的抗生素浓度，随时间测量与活细菌细胞群(细线)相对应的(活和死)细菌细胞总数(粗线)的定性模式。
图6.公式(15)、(16)和(17)中的每一个的典型曲线。
图7.将公式3拟合到暴露于多个不随时间变化的浓度的LVX的AB细菌群体通过涂板产生的N活的实验数据。
图8.通过光密度仪产生的实验数据与公式(2)和(B1)的输出的比较，其中参数值被设置为从拟合表1中报告的数据产生的三个估算值的平均值，参见图7。
图9.将公式(2)拟合到暴露于多个不随时间变化的浓度的LVX的AB细菌群体通过光密度仪产生的N总的实验数据。
图10.将公式(2)拟合到暴露于24小时的多个不随时间变化的浓度的LVX的AB细菌群体通过光密度仪产生的N总的实验数据。
图11.将公式(2)拟合到暴露于12小时的多个不随时间变化的浓度的LVX的AB细菌群体通过光密度仪产生的N总的实验数据。
图12.将公式(2)拟合到暴露于9小时的多个不随时间变化的浓度的LVX的AB细菌群体通过光密度仪产生的N总的实验数据。
图13.将公式(2)拟合到暴露于6小时的多个不随时间变化的浓度的LVX的AB细菌群体通过光密度仪产生的N总的实验数据。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解含义相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但本文描述了合适的方法和材料。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，在一些情况下是指人，其是用于治疗或预防与微生物群体相关的病理状况的抗微生物剂的接受者。
如本文所用，术语“细胞群”是指微生物细胞群体。
如本文所用，术语“微生物”通常指多细胞或单细胞生物并且包括例如细菌、原生动物和真菌。微生物包括但不限于所有革兰氏阴性(Gram-)和革兰氏阳性(Gram+)细菌、真菌类、古生菌类等。在非限制性实例中，微生物可以是选自肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌科(Enterobacteriacae)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普罗维登氏菌属(Providencia)、变形杆菌属(Proteus)、摩根氏菌属(Morganella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、产碱菌属(Alcaligenes)和分枝杆菌属(Mycobacterium)中的至少一种微生物。微生物还可以包括粪肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌属(Enterobacter)，但本文描述的概念的示例性实施方案不限于此。
如本文所用，术语“抗微生物剂”通常是指杀灭微生物、停止或减缓微生物生长的药剂。此类抗微生物剂包括但不限于阿米卡星、阿莫西林、氨苄青霉素、氨曲南、苄青霉素、克拉维酸、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢替坦、头孢西丁、头孢泊肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢呋辛、环丙沙星、达福普汀、多利培南、达托霉素、厄他培南、红霉素、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、利奈唑胺、美罗培南、米诺环素、莫西沙星、呋喃妥因、诺氟沙星、哌拉西林、奎奴普丁、利福平、链霉素、舒巴坦、磺胺甲恶唑、泰利霉素、四环素、替卡西林、替加环素、妥布霉素、甲氧苄啶和万古霉素。
在实施方案中，本公开提供了一种用于确定微生物群体随时间对一种或多种抗微生物剂的反应的方法，包括：使微生物群体随时间暴露于一系列固定浓度的一种或多种抗微生物剂；确定在一种或多种抗微生物剂存在下抗微生物细胞群体生长随时间的变化率；并将所述数据输入以下数学模型或建模框架：
Figure BDA0003608559200000081
其中N总是总细菌群体；N活是活细菌群体；N最大是最大细菌群体；Kg是生长率常数；Kd是死亡率常数；rmin是耐药性最强的亚群体的杀灭率；λ是适应的幅度；a是适应率。
在其他实施方案中，本公开提供了一种用于确定微生物群体随时间对一种或多种抗微生物剂的反应的方法，包括：使微生物群体随时间暴露于一系列固定浓度的一种或多种抗微生物剂；确定在一种或多种抗微生物剂存在下抗微生物细胞群体生长随时间的变化率；并将所述数据输入以下数学模型或建模框架(2)：
Figure BDA0003608559200000082
其中N总、N活、Nmax、Kg、Kd、rmin、λ和a如前所述。
与预测细菌对各种药物暴露的反应的框架相关的数学公式见附录A、B和C。
为了确定微生物细胞群体生长的变化率，可以使用任何基于光学的仪器或设备，其提供微生物细胞群体生长的实时定量。在非限制性实施方案中，可以使用BacterioScan216Dx激光微生物生长监测仪(BacterioScan,Inc.)以高精度快速测量微生物细胞群体密度。BacterioScan平台依赖于测量液体样品中悬浮粒子的光密度和前向角激光散射。激光束穿过定制的一次性比色皿，散射激光的角分布被位于比色皿另一端的电荷耦合器件(CCD)相机获取。产生的原始信号被输入专有的数据积分算法，该算法将输入转换为每毫升菌落形成单位(CFU/ml)值。由于仪器可以在最佳温度下孵育样品以使得例如细菌生长(35-37℃)，因此随时间进行的重复测量可以观察到粒子数量的扩大或停滞。当微生物细胞在不同抗生素存在下孵育时，这些测量值分别与微生物耐药性或敏感性相关。
与使用BacterioScan 216Dx平台相关的一个优势是它能够实时跟踪微生物群体。在延长的时间范围(例如，4-48小时)内，可以每5分钟监测一次抗生素暴露期间的微生物反应。这些信息丰富的数据集随后可用作本文公开的数学框架的输入数据，以预测在延长的时间范围(治疗过程中长达数天)内的微生物根除或生长。
本公开提供了一种基于由数学建模框架(1)和/或(2)解决的时间段内的值来确定对受试者中的微生物细胞群体药理学上有效的临床给药方案的方法。该方法包括(i)收集表明在一段时间内在一种或多种抗微生物剂存在下微生物细胞群体的生长反应的信息丰富的数据集；(ii)将所述数据集输入数学建模框架(1)和/或(2)以确定微生物细胞群体在所述一段时间内与一种或多种抗微生物剂接触期间的敏感性；(iii)在所述时间段结束时，将在抗微生物剂存在下微生物敏感性的增加与对受试者中的微生物细胞群体药理学上有效的可能临床给药方案相关联。该方法进一步提供以确定的剂量施用所述抗微生物剂。
微生物群体在暴露于固定浓度的抗微生物剂时的适应可以以数学建模框架及其相关参数估算的形式被获取。数学建模框架获取了微生物负荷和抗微生物剂浓度之间的关系。数学建模框架提供了一种用于指导给药方案的高度针对性测试的方法，这可以大大加速抗微生物剂的开发。更具体地说，24小时的标准时间杀伤研究数据被用作框架输入。可以以全面的方式有效筛选大量给药方案的效用，在临床前研究和临床试验中进一步研究有希望的方案。预计由于给药方案旨在防止出现耐药性，新的抗微生物剂或药物的临床效用寿命将延长。
本公开还涉及一种使用确定的给药方案治疗患有由微生物细胞群体感染引起的病理状况的受试者的方法。在这种情况下，以确定的给药方案将一种或多种受试抗微生物剂施用于受试者。
在另一方面，本公开涉及一种使用确定的给药方案预防受试者因暴露于微生物细胞群体而引起的病理状况的方法。在这种情况下，以确定的给药方案将一种或多种受试抗微生物剂施用于暴露的受试者。
本公开提供了一种基于在如上所述的数学框架(1)和/或(2)的时间段内的值确定对受试者中的微生物细胞群体药理学上有效的临床给药方案的方法，该微生物细胞群体已对一种或多种抗微生物剂产生耐药性。该方法包括：(i)收集表明在一段时间内在一种或多种抗微生物剂存在下的微生物细胞群体反应的信息丰富的数据集，其中所述微生物细胞群体已对一种或多种抗微生物剂产生耐药性；(ii)将所述数据集输入数学建模框架(1)和/或(2)以确定微生物细胞群体在所述一段时间内与一种或多种抗微生物剂接触期间的敏感性；(iii)基于数学建模框架产生微生物细胞群体的敏感性的输出值；和/或(iv)基于所产生的输出值，将在所述时间段结束时在一种或多种抗微生物剂存在下微生物敏感性的增加与可能的临床给药方案相关联，该临床给药方案对受试者中的耐药性微生物细胞群体药理学上有效。
本公开进一步涉及一种用于抑制微生物细胞群体对可用于治疗与受感染受试者相关的病理状况的抗微生物剂的获得性耐药性出现的方法。该方法包括根据通过在微生物细胞群体与抗微生物剂接触的一段时间内的生长反应的所公开的数学框架(1)和/或(2)确定的给药方案向受试者施用药理学上有效量的抗微生物剂。
在另一方面，提供了一种方法，包括使用所提供的数学建模框架(1)和/或(2)筛选潜在抗微生物剂在治疗和/或抑制一个或多个细胞群体的耐药性获得中的功效。在又一实施方案中，提供了一种用于高通量筛选有效抑制与病理生理状况相关的细胞群中出现获得性耐药性的抗微生物剂的方法，包括：利用数学建模框架(1)和/或(2)输入值，所述数学建模框架具有用于计算在特定时间段内细胞对抗微生物剂的敏感性变化率和存活细胞群中细胞负荷变化率的公式，所述公式可操作地与初始参数值相关联；以及在所述时间段结束时或接近结束时，将细胞敏感性输出值的增加和细胞群生长值的降低与抑制细胞群内对抗微生物剂的获得性耐药性的出现相关联。
在该实施方案的基础上，所述方法可以包括编制有效抑制细胞群中出现获得性耐药性的抗微生物剂和给药方案的库。在两个实施方案中，初始参数值可以对应于时间、抗微生物剂的输注速率、分布体积、抗微生物剂的清除、达到细胞群最大杀灭率的50％的浓度和细胞群的最大大小，以及用于细胞群的最大适应和适应率以及细胞群的生长率、最大杀灭率和sigmoidicity的常数。
本公开基于数学建模框架(1)和/或(2)的时间段内的输出值提供对微生物群体药理学上有效的给药方案。给药方案可用于治疗或预防受试者中由为其设计给药方案的微生物群体引起的病理状况。
在实施方案中，微生物细胞群体可以是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、霉菌、分枝杆菌、病毒或各种传染原的群体。革兰氏阴性菌的代表性实例是大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomaonas aeruginosa)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。革兰氏阳性菌的代表性实例是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在一些实施方案中，微生物细胞群体是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、粪肠球菌(E.faecalis)或产气肠杆菌(E.aerogenes)感染。病毒的代表性实例是HIV或禽流感。病理生理状况可以是与微生物群体相关或由微生物群体引起的任何此类状况。特别地，病理生理状况可以是院内感染。
在一些实施方案中，感染是由耐甲氧西林或耐万古霉素的病原体引起的。在一些实施方案中，感染是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染。在一些实施方案中，感染是耐喹诺酮金黄色葡萄球菌(QRSA)感染。在一些实施方案中，感染是耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)感染。
用于治疗受试者的抗微生物剂可以包括抗细菌剂、抗真菌剂和/或抗病毒剂。抗微生物剂及其药物组合物、制剂和载体的施用途径是标准的并且是本领域众所周知的。它们通常由本领域普通技术人员根据病理状况的类型和状态、施用是用于抗微生物治疗还是预防性治疗、以及受试者的病史和家族史等因素进行选择。
如可以理解的，设备和/或系统可以包括或可操作地耦合到任何合适的计算设备、电路和/或控制器以接收、分析和/或传送信息或数据(例如，通过电信号)。如本文所用，术语“控制器”和类似术语用于表示控制数据从计算机或计算设备传输到外围设备或单独设备(反之亦然)的设备，和/或机械操作和/或致动外围设备或单独设备的机械设备和/或机电设备(例如，杠杆、旋钮等)。术语“控制器”还包括“处理器”、“数字处理设备”和类似术语，用于表示微处理器或中央处理单元(CPU)。CPU是计算机内的电子电路，它通过执行指令指定的基本算法、逻辑、控制和输入/输出(I/O)操作来执行计算机程序的指令，并且作为非限制性实例，包括服务器计算机。在一些实施方案中，数字处理设备包括被配置为执行可执行指令的操作系统。操作系统是例如软件(包括程序和数据)，它管理设备的硬件并为应用程序的执行提供服务。本领域技术人员将认识到合适的服务器操作系统包括，作为非限制性实例，FreeBSD、OpenBSD、
Figure BDA0003608559200000121
Linux、
Figure BDA0003608559200000122
Mac OS X
Figure BDA0003608559200000123
Windows
Figure BDA0003608559200000124
和
Figure BDA0003608559200000125
在一些实施方案中，操作系统由云计算提供。
在一些实施方案中，控制器包括存储和/或存储器设备。存储和/或存储器设备是一个或多个用于临时或永久存储数据或程序的物理装置。在一些实施方案中，控制器包括易失性存储器并且需要电力来维持存储的信息。在一些实施方案中，控制器包括非易失性存储器并在其未通电时保留存储的信息。在一些实施方案中，非易失性存储器包括闪存。在一些实施方案中，非易失性存储器包括动态随机存取存储器(DRAM)。在一些实施方案中，非易失性存储器包括铁电随机存取存储器(FRAM)。在一些实施方案中，非易失性存储器包括相变随机存取存储器(PRAM)。在一些实施方案中，控制器是存储设备，作为非限制性实例，包括CD-ROM、DVD、闪存设备、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器和基于云计算的存储。在一些实施方案中，存储和/或存储器设备是设备(例如本文所公开的那些)的组合。
在一些实施方案中，控制器包括向用户发送视觉信息的显示器。在一些实施方案中，显示器是阴极射线管(CRT)。在一些实施方案中，显示器是液晶显示器(LCD)。在一些实施方案中，显示器是薄膜晶体管液晶显示器(TFT-LCD)。在一些实施方案中，显示器是有机发光二极管(OLED)显示器。在各种一些实施方案中，OLED显示器上是无源矩阵OLED(PMOLED)或有源矩阵OLED(AMOLED)显示器。在一些实施方案中，显示器是等离子显示器。在一些实施例中，显示器是视频投影仪。在一些实施方案中，显示器是可检测用户交互/手势/响应等的交互式的(例如，具有触摸屏或传感器，例如相机、3D传感器、LiDAR、雷达等)。在又一些实施方案中，显示器是设备(例如本文所公开的那些)的组合。
如可以理解的，控制器可以包括或耦合到服务器和/或网络。如本文所用，术语“服务器”包括“计算机服务器”、“中央服务器”、“主服务器”和类似术语，以指示网络上管理所公开的设备、组件和/或其资源的计算机或设备。如本文所用，术语“网络”可以包括任何网络技术，包括例如蜂窝数据网络、有线网络、光纤网络、卫星网络和/或IEEE 802.11a/b/g/n/ac无线网络等。
在一些实施方案中，控制器可以耦合到网状网络。如本文所用，“网状网络”是其中每个节点为网络中继数据的网络拓扑。所有网状节点在网络中的数据分布中进行协作。它可以应用于有线和无线网络。无线网状网络可以被认为是一种“无线自组织”网络。因此，无线网状网络与移动自组织网络(MANET)密切相关。尽管MANET不限于特定的网状网络拓扑，但无线自组织网络或MANET可以采用任何形式的网络拓扑。网状网络可以使用泛洪技术或路由技术中继消息。通过路由，消息通过从节点跳到节点沿路径传播，直到它到达其目的地。为确保其所有路径都可用，网络必须允许连续连接，并且必须使用自我修复算法(例如最短路径桥接)围绕断开的路径对自身进行重新配置。自我修复允许基于路由的网络在节点发生故障或连接变得不可靠时运行。因此，网络通常非常可靠，因为在网络中的源和目的地之间通常有不止一条路径。这个概念也可以应用于有线网络和软件交互。节点都相互连接的网状网络是全连接网络。
在实施方案中，控制器可以包括一个或多个模块。如本文所用，术语“模块”和类似术语用于指示中央服务器的自包含硬件组件，中央服务器又包括软件模块。在软件中，模块是程序的一部分。程序由一个或多个独立开发的模块组成，这些模块在程序链接之前不会组合在一起。单个模块可以包含一个或多个例程，或执行特定任务的程序部分。
如本文所用，控制器包括用于管理所公开的设备和/或系统的各个方面和功能的软件模块。
本文所述的系统还可以利用一个或多个控制器来接收各种信息并将接收到的信息转换以生成输出。控制器可以包括任何类型的计算设备、计算电路或能够执行存储在存储器中的一系列指令的任何类型的处理器或处理电路。控制器可以包括多个处理器和/或多核中央处理单元(CPU)，并且可以包括任何类型的处理器，例如微处理器、数字信号处理器、微控制器、可编程逻辑器件(PLD)、现场可编程门阵列(FPGA)等。控制器还可以包括存储数据和/或指令的存储器，这些数据和/或指令在由一个或多个处理器执行时使一个或多个处理器执行一种或多种方法和/或算法。
本文描述的任何方法、程序、算法或代码都可以被转换为编程语言或计算机程序，或以编程语言或计算机程序来表达。如本文所用，术语“编程语言”和“计算机程序”均包括用于向计算机指定指令的任何语言，并且包括(但不限于)以下语言及其派生语言：汇编语言、Basic、批处理文件、BCPL、C、C+、C++、Delphi、Fortran、Java、JavaScript、机器代码、操作系统命令语言、Pascal、Perl、PL1、脚本语言、Visual Basic、本身指定程序的元语言，以及所有第一代、第二代、第三代、第四代、第五代或更新一代的计算机语言。还包括数据库和其他数据模式，以及任何其他元语言。解释、编译或同时使用编译和解释方法的语言之间没有区别。程序的编译版本和源版本之间没有区别。因此，对程序的引用(其中编程语言可能以一个以上的状态(例如源、编译的、对象或链接的)存在)是对任何和所有此类状态的引用。对程序的引用可能包含实际指令和/或那些指令的意图。
实施例1
抗生素组合的传统测试(例如，棋盘法和时间-杀伤研究)大部分基于观察期结束时的结果。这些方法是劳动密集型的并且结果与临床结果没有很好的相关性(Hilf,1989,Am J Med 87:540-6；Saballs,2006,J Antimicrob Chemother 58:697-700)。多年来，已经建立了几个数学建模框架，旨在准确预测细菌对临床相关浓度的抗生素的反应，这些浓度会随时间波动(Bhagunde,2010,Antimicrob Agents Chemother 54:4739-43；Bhagunde,2011,J Antimicrob Chemother 66:1079-86；Nikolaou,2006a J Math Biol 52:154-82；Nikolaou,2007,Ann Biomed Eng 35:1458-70)。虽然这些框架已针对几种针对不同细菌的抗生素进行了验证，但鉴于对纵向数据输入(即获取细菌如何在短时间范围内和跨不同方案对抗生素作出反应的数据)的要求，这些方法的临床应用仍然有限。使用基于成像的方法来获取此类数据，而不是依靠微生物学方法来量化细菌负荷，提供了技术能力上的突破。例如，BacterioScan自动化微生物学平台可用于此目的，为研究如何利用组合的抗生素活性来对抗耐药性提供了起点。
研究了实验室(例如，ATCC)和临床分离的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌(每个物种多达20个分离株)对抗生素治疗的反应。这三种革兰氏阴性菌在医院获得性感染中经常遇到。确定分离株对抗生素筛选组的敏感性以确定它们的野生型或多重耐药表型。通过脉冲场凝胶电泳评估分离株的克隆亲缘；尽可能使用克隆独特的分离株来增强该方法的普遍性。
六种抗生素被用于测试，它们是每个主要抗生素家族的代表性成员(例如，美罗培南、左氧氟沙星、阿米卡星、利福平、米诺环素和多粘菌素B)。目前所有六种药剂都用于治疗临床(革兰氏阴性)感染。从开发的角度来看，使用不同结构类别的抗生素也增强了技术平台的稳健性。
为确保BacterioScan最佳信号提供准确的CFU/ml定量，在不同的生长培养基(例如，补充或不补充阳离子的Mueller Hinton Broth)中制备来自待研究的三种病原体中的每一种的代表性菌株的悬浮液，并将每种悬浮液的连续10倍稀释液制成新鲜培养基。对于每种目标病原体，评估至少一种抗生素敏感和一种多重耐药的临床分离株。实时分析不同接种物的悬浮液(例如，103-7CFU/ml)，每小时进行相应的基于板的测量，直到达到稳定期。根据医疗设备的监管(FDA)执行标准，评估仪器的可重复性，以确定仪器之间的任何可变性来源；制备平行测定的悬浮液并加载到不同的单元中并同时运行。为了评估日常可变性(偏差和精确度)，连续5-6天用新鲜制备的悬浮液重复这些测定。当观察到仪器输出和基于板的CFU/ml值之间的变化≤10％时，实现了细菌密度随时间变化的成功表示。
尽管有数据采集的能力，但使用光信号来估算活细菌负荷的一个缺点是无法区分活细胞和死细胞。光谱成像方法获取的物理属性(例如散射光)受到活细胞、非生长细胞或死细胞的影响。来自活跃生长的细菌群体的信号比来自下降群体的信号含有更丰富的信息。鉴于此限制，已确定数学建模框架(1)以解决此潜在缺点。
在实施方案中，当且仅当rmin大于Kg时，可以根除细菌群体。
在此框架下，细菌在初始下降后的再生长表现为生长延迟(图1)。
许多抗生素单独对多重耐药性细菌无效，但一些抗生素在联合使用时可能具有改善的抗细菌活性。由于多重耐药性可以通过各种分子机制介导，因此确定这些针对患者特异性分离株的有用组合可能是劳动密集型的。因此，设计一种更简单的方法来鉴定对多重耐药菌有效的抗生素组合将具有重要的抗微生物意义。评估联合抗生素活性的传统方法与隐含假设相关，与临床结果无关。已经提出了更强大的建模方法，但这些工具在临床环境中的应用具有挑战性。
一种筛选针对多重耐药性细菌的有用抗生素组合的方法已经过验证(Hirsch,2013,J Infec Dis 207:786-93；Lim,2008,Antimicrob Agents Chemother 52:2898-904；Yuan,2010,J Infec Dis 201:889-97)。该框架是开发针对患者特异性抗生素组合选择的工具的起点。
不同药物浓度的组合与具有波动浓度曲线的临床药物暴露更好地相关。当给患者服用抗生素时，血清药物浓度随时间波动。然而，几乎所有体外测试方法都依赖于固定的药物浓度。为了提高从体外测试推断体内结果的能力，可以使用因子浓度阵列(图2)。可以使用如下所述的数学建模对来自不同浓度组合的杀灭率进行积分，以实现对治疗结果的更可靠的预测。
无效的抗生素在组合时可能具有可接受的活性。将鲍曼不动杆菌的临床分离株暴露于4x4阵列中的不同抗生素浓度组合，并使用原型技术平台216Dx在24小时内跟踪细菌负荷。虽然分离株对左氧氟沙星、阿米卡星和头孢吡肟具有耐药性(多重耐药)，但细菌生长在选定的组合中被延迟(图3)，并且曲线被上述数学建模框架(1)合理获取(图1，右)。
用于量化抗生素给药方案强度的建模框架。已经开发了采用标准时间杀伤数据来预测单一抗生素给药方案对具有不同程度耐药性的细菌群体的影响的数学建模框架(美国专利8,452,543；“补充报道1公式(2)和(3)”)。该框架已针对几种针对不同细菌的抗生素进行了验证(Tam,2011)。
补充内容1-异质细菌群体的动力学(Nikolaou,2006b)
从均匀群体的平衡dN/dt＝(Kg-r)N(t)出发，异质群体(具有不同耐药性程度的细菌)被表明满足以下公式：
Figure BDA0003608559200000171
其中，N(t)＝t时刻的细菌群体大小；Kg＝生长率常数；μ(t),σ2(t)分别＝遍布群体分布的依赖药物浓度的杀灭率常数r的平均值和方差；κn(t)＝r(C)的n阶累积量(Weisstein,2005)，A为适应率常数。简化(类泊松)假设产生：
Figure BDA0003608559200000172
建模框架表示不同抗生素给药方案的给药强度(D)，而与细菌杀灭的浓度/时间依赖性无关。该框架依赖于指数D/Kg以及明确的计算公式(Nikolaou,2007)。使用纵向细菌反应数据作为输入，拟合公式(3)中的参数，并绘制D/Kg的表面作为相关宿主药代动力学的给药方案(每日剂量和给药间隔)的函数。有效的联合方案是联合杀灭率超过细菌生长速度(对应于D/Kg>1)导致细菌抑制的方案。随后在中性粒细胞减少的鼠肺炎模型中验证了对两种不同药剂组合的联合抗微生物活性的预测。
多重耐药菌的选择。研究了来自铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的多达五种临床和多重耐药分离株。确定了赋予多重耐药性的具体机制(例如，β-内酰胺酶产生、靶位点改变和外排泵过度表达)。如果可能，使用克隆独特的分离株(具有不同的耐药性机制)。
抗生素的选择。使用了上面详述的六种抗生素。通过从不同结构类别中选择两种抗生素来测试15种双药剂组合。
动物。允许瑞士韦伯斯特小鼠(雄性和雌性，21-25克)随意进食和饮水。
比较不同抗生素组合的活性。进行体外研究以产生有关不同抗生素对上述细菌的活性的数据。在如上确定的最佳条件(例如，生长培养基、初始接种物等)的指导下，研究采用增加n x n阵列中六种抗生素中的任意两种的浓度。如图3所示，每5分钟监测一次细菌群体，持续72小时。
预测模型的开发。为了确保来自患者特异性细菌的输入数据可以在临床环境中得到最佳使用，通过考虑到终点的时间(例如，1-log增加)来修改数学模型(补充报道2：“补充报道2公式(4)”)。
补充内容2.药物相互作用的新表征(Tam,2004)
两种抗生素对细菌群体的联合作用可以通过以下公式来表征：
Figure BDA0003608559200000181
其中，TAB是药物A和B的联合作用；Tintercept是在没有药物的情况下到终点的时间；TA(CA)和TB(CB)分别表示到终点的时间为单个药物A和B的函数浓度；函数f(Tinterceptp′TA(CA)，Tg(Cg)是指在浓度为CA和CB时，联合使用非相互作用药物A和B所产生的到终点的理论时间。可以得到f的解析表达式，其中假设药物A和药物B在t＝0时联合使用产生的杀灭率常数的平均值μ(0)和方差σ(t)2是相加的。
响应面(其中x和y轴代表不同的抗生素浓度，z轴描绘到终点的时间)用于描述各种恒定浓度组合下的预期效果。
通过对从阶乘阵列中的各种浓度组合观察到的响应进行积分来预测从波动的浓度-时间曲线预期的效果(图2，右)。通过比较预计到终点的时间与观察到的时间，得出基于时间的相互作用量度，以描述所研究的两种抗生素之间的药效学相互作用的性质和程度。
实施例2
确定体外暴露于抗生素的感染性细菌群体的药效学可以为设计用于挑战临床感染的有效疗法提供指导。然而，通过进行详细的时间杀伤实验来完成这项任务是受资源限制的，因此通常会被绕过以支持经验上的捷径。资源限制可以通过使用光密度测量随着时间的推移连续评估抗生素暴露下细菌群体的大小来解决。然而，此类测量对活细胞和死细胞进行计数，虽然可用于生长的细菌群体，但它们无法评估下降的活细胞群的大小。本公开通过提供一种基于模型的方法来填补这一空白，该方法使用活细胞和死细胞的组合计数来推断暴露于抗生素的细菌群体中活细胞的数量。因此，可以很容易地识别细菌群体和抗生素之间相互作用的体外药效学，并可以指导治疗。该方法对于包含对一种或多种抗生素具有不同程度敏感性的细菌群体来说足够通用，不对赋予耐药性的潜在机制做任何假设，并且适用于在暴露于抗微生物剂下对其进行监测能够产生活细胞和死细胞的组合计数的任何微生物群体。下面的实施例展示了在一项关于鲍曼不动杆菌暴露于左氧氟沙星的反应的实验研究中使用基于模型的方法，如下所述。
虽然时间杀伤实验与用于评估细菌群体大小的涂板相结合是标准的研究工具，但它们耗时、劳动密集并且产生有限数量的数据点。这使得它们难以在时间或资源有限但需要快速获得可靠结果的情况下使用，例如在临床环境中。一种比涂板基本上更有效的替代方法是连续评估悬浮中细菌群体的大小。通过光密度法(分光光度法)测量样品浊度(浑浊度)可以满足该要求(Mytilinaios等人，(2012)International Journal of FoodMicrobiology 154:169-176；Lopez等人(2004)International Journal of FoodMicrobiology 96:289-300；McMeekin等人，(1993)Predictive Microbiology:Theory andApplication.Wiley,New York)。光密度测量依赖于众所周知的原理，并且可以轻松地实时提供连续的数据流。
然而，光密度测量也有一个基本限制：它们对细菌群体中的活细胞和死细胞进行计数，因为这两种细胞都通过阻挡/吸收光来产生光信号。因此，光密度测量通常适用于监测生长的细菌群体，但不能跟踪呈现出如图4所示模式的下降群体。
实际上，当细菌群体下降(响应抗生素暴露)时，光密度测量产生连续的不下降信号，因为活细胞和死细胞的总和不下降，图5。特别是，光密度测量在细菌群体包含具有不同程度的抗生素耐药性的亚群体的时间杀伤实验的重要实例中几乎没有价值，这是因为在某些抗生素浓度下，由于易感亚群体的早期下降和对抗生素具有耐药性的亚群体的晚期生长，群体的再生长会发生，如图5所示。在该图中，对应于生长的细菌群体(在低抗生素浓度下)的活细胞和死细胞计数的粗曲线通过检查提供了关于活细胞计数(细线)的足够定性信息。然而，对于再生长、减缓再生长或衰退中的群体(图5)，仅检查粗线并不能表明活细胞计数(细线)的趋势，并且几乎没有提供任何设计有效的治疗的线索。正是针对这些从治疗的观点来看必不可少的情况，本文公开的基于数学模型的方法提供了一般解决方案。
建立这种数学模型结构所采用的方法从获取抗生素对异质细菌群体的影响的公式开始，该异质细菌群体包括具有不同程度耐药性的亚群体，如图4中定性地显示(Bhagunde PR等人，(2015)Aiche Journal 61(8):2385-2393；Nikolaou M和Tam VH(2006)Journal of Mathematical Biology 52(2):154-182)。该模型结构被扩大以描述抗生素对细菌群体中整个细胞计数的影响，包括活细胞和死细胞，如图5所示。如下文详述，所公开的模型结构依赖于最小假设并且包括可以根据实验数据容易地估算的少量参数。
本文提供了构成主要结果起点的基本公式，这些公式在“数学建模”部分中形成，并通过下面的实验研究进行说明。
材料和方法
数学建模的背景。当细菌群体暴露于抗生素时，群体经历的杀灭率r≥0(GiraldoJ等人，(2002)Pharmacology&Therapeutics 95:21-45；Justco等人，(1971)J Pharm Sci60:892-895；Wagner J(1968)J Theoret Biol 20:173-201)，其在整个群体的亚群体中变化，因为这些亚群体对设定浓度的抗生素具有不同的敏感性(Giraldo J.等人，(2002)Pharmacology&Therapeutics 95:21-45；Lipsitch M,等人，(1997)Antimicrobial Agentsand Chemotherapy 41(2):363-373)。如果这种异质的细菌群体暴露于不随时间变化的浓度的抗生素，则杀灭率的分布随时间而变化，因为敏感细菌比不太敏感(更耐药)的细菌被杀灭得更快，从而改变了抗生素/细菌相互作用的药效学。最不敏感(最耐药)的亚群体最终成为主导，并经历根除或再生，这取决于该最耐药亚群体的自然生长率分别低于或高于该浓度的抗生素对该亚群体产生的杀灭率(Giraldo J.等人，(2002)Pharmacology&Therapeutics 95:21-45；27-29；Jusko W(1971)J Pharm Sci 60:892-895；Wagner J(1968)J Theoret Biol 20:173-201；Hill AV(1910)J Physiol 40:iv-vii)。
可以表明(Nikolaou M,Tam VH(2006)Journal of Mathematical Biology 52(2):154-182.doi:10.1007/s00285-005-0350-6；Mytilinaios IS,等人，(2012)International Journal of Food Microbiology 154(3):169-176)，在现实的假设下，随时间暴露于恒定浓度的抗生素下的异质细菌群体的大小可以通过以下公式很好地近似表示
Figure BDA0003608559200000221
随时间的平均杀灭率可以通过以下公式很好地近似表示
Figure BDA0003608559200000222
并且杀灭率随时间的变化可以通过以下很好地近似表示
Figure BDA0003608559200000223
其中
N活(t)是活细菌群体大小，初始值为N0
Kg是整个细菌群体的生理净生长率，对所有亚群体都是通用的
rmin是抗生素对最耐药(最不敏感)亚群体产生的杀灭率
Nmax是在生长条件下达到饱和的细菌群体的最大大小
μ(t)是时间t时细菌群体的平均杀灭率
σ(t)2是时间t时细菌群体的杀灭率方差
λ>0,a>0是与群体平均杀灭率初始下降相关的常数，对应于平均值和方差等于λ的泊松分布变量
Figure BDA0003608559200000224
请注意，上述关于N活(t)和μ(t)的两个公式的推导基本上没有对可能产生细菌耐药性的机制作出任何假设。上述公式中出现的参数Kg、rmin、λ、a、Nmax可以从时间杀伤实验中进行估算，该实验产生在不同设定浓度的抗生素下N活(t)随时间的测量值。
参数(例如Kg和rmin)的估算对于指导有效给药方案的设计是必不可少的。例如，Nikolaou M等人(Ann Biomed Eng 35(8):1458-1470)已经证明了定期注射抗生素并在每个周期内遵循指数衰减的药代动力学对异质细菌群体是有效的，当
Figure BDA0003608559200000231
其中rmin(C(t))是作为抗生素浓度C(t)的函数的最耐药亚群体的杀灭率，通常是以下类型的表达(Giraldo J等人，(2002)Pharmacology&Therapeutics 95:21-45；Jusko W(1971)J Pharm Sci 60:892-89；Wagner J(1968)；J Theoret Biol 20:173-201)。
Figure BDA0003608559200000232
其中Kk是C→∞时的最大杀灭率；C50是常数，等于达到50％的最大杀灭率时的抗微生物剂浓度；H是Hill指数(Hill AV(1910)J Physiol 40:iv-vii)，对应于r作为C的函数的变化。
为了估算模型参数，通常可以通过在不同时间点从细菌群体中抽取小样本并使用标准涂板方法(Sanders ER(2012)Journal of Visualized Experiments(63):e3064)来获得N活(t)的测量值。虽然这种测量方法很成熟，但它费力、耗时，并且在现实条件下只能在几个不同的时间点产生测量值。相比之下，简单的光学方法随时间产生细菌群体大小的基本连续信号。如前所述，这些方法的致命弱点在于，虽然它们会为生长中的细菌群体产生信号，通过检查很容易解释，但当活细胞的细菌群体下降(由于抗生素暴露)时，产生的光学密度信号实际上不可能通过检查来解释。因此，有动机开发公式来获取暴露于抗生素的活细胞和死细胞的组合群体的药效学，作为公式(3)和(5)的对应。此类公式的效用将用于从群体中总(活的和死的)细胞计数的测量中推断活细胞计数随时间的曲线。该信息将指导有关有效使用抗生素的决策，特别是根除对一种或多种抗生素表现出不同程度耐药性的细菌群体。下一节将讨论此类公式的开发。
抗生素。左氧氟沙星(LVX)粉末是来自Achaogen(加利福尼亚州南旧金山)的礼物。已提前在无菌水中制备了1024μg/mL的储备溶液并储存在-70℃。对于每项实验研究，通过标准实验室技术将药物稀释至最佳浓度。
微生物。研究中使用了实验室参考野生型鲍曼不动杆菌(AB)，ATCC BAA747。细菌在-70℃储存在
Figure BDA0003608559200000241
小瓶中。实验前，将细菌在35℃下在5％血琼脂平板上至少传代两次，每次24小时，并使用新鲜菌落。先前发现对LVX的敏感性(MIC)为0.25μg/mL。
光密度测量。细菌群体大小的实时测量由
Figure BDA0003608559200000242
(St.Louis,MO)提供的光学仪器(型号216Dx)提供。该仪器使用激光散射与传统的光密度测量相结合，以提供液体样品中的粒子(例如细菌)密度的定量测量。将制备好的样品装入定制的灭菌盒中，然后插入仪器中进行自动光学分析。该仪器利用650nm波长的激光穿过液体样品(具有2.5cm光程)并收集散射光和非散射光(无粒子相互作用)信号。使用专有算法，这些信号被转换为数值，并根据典型细菌细胞的平均大小和密度标准被调节为每毫升细菌菌落形成单位(CFU/ml)。在其当前版本中，该仪器允许同时测量维持在35℃的悬浮液中的16种单独组合的抗生素和细菌群体。完整的计算机连接允许连续监控、存储和传输所有测量值。
细菌敏感性研究。细菌最初在温度调节的振动浴中生长以记录相生长并被稀释至
Figure BDA0003608559200000243
的浓度。通过630nm处的吸光度值估算初始目标浓度。将所需初始浓度的细菌群体样品转移到六个受温度调节的烧瓶中，这些烧瓶具有阳离子调节的MuellerHinton培养基和{0,0.5,2,8,16,32}×MIC的LVX浓度。在0、2、4、8和24小时从每个烧瓶中取出一式两份的系列样品。首先将含有抗生素的每个样品离心以去除上清抗生素溶液，用等体积的无菌盐水代替以最小化药物残留效应，随后对样品定量涂板以确定活细菌负荷。上述程序在不同的日子重复了3次。
光学仪器敏感性研究。细菌最初在温度调节的振动浴中生长以记录相生长并被稀释至
Figure BDA0003608559200000244
的浓度。通过630nm处的吸光度值估算初始目标浓度。将所需初始浓度的细菌群体样品转移到光学仪器内的4个受温度调节的covet中，这些covet具有阳离子调节的Mueller Hinton培养基和{0,0.5,2,8}×MIC的LVX浓度。该仪器大约每1分钟自动从每个烧瓶中采集连续样品，持续48小时。上述程序在不同的日子重复了3次。
数据拟合。公式(3)用于拟合来自上述活力涂板实验的数据。同样公式(19)或(2)用于拟合来自光密度仪的数据。参数估算由MS
Figure BDA0003608559200000251
和
Figure BDA0003608559200000252
提供。因为不能直接从涂板数据中获得估算值，所以它们是通过对由光密度仪产生的数据拟合公式(19)或(2)获得的，所有剩余参数被设置为从涂板数据估算的值。
结果
数学建模。对暴露于不随时间变化的浓度的抗生素的异质细菌群体的整个大小的动力学和分析表达式进行逐步推导。这是时间杀伤实验中的典型设置，因为它产生的数据(特别是如果成功建模)可以很好地用于分析抗生素在与具有临床意义的实际药代动力学相对应的随时间变化的浓度下的效果，Nikolaou M,Schilling AN,Vo G,Chang KT,Tam VH(2007)。对微生物群体建模对抗微生物剂的时间周期浓度作出反应。(Ann Biomed Eng 35(8):1458-1470)。
可以证明(Bhagunde PR等人，(2015)Aiche Journal 61(8):2385-2393)，当异质细菌群体暴露于抗生素时，活细菌细胞群的动力学变为
Figure BDA0003608559200000253
同样，死细胞群的动力学变为
Figure BDA0003608559200000254
将上述两个公式相加得到活细胞和死细胞的整个群体的以下公式
N总＝N活+N死 (10)
Figure BDA0003608559200000261
其中常数Kg、Kb和Kb之间的关系在附录B中进行了讨论。
上述公式的组合立即意味着
Figure BDA0003608559200000262
Figure BDA0003608559200000263
请注意，从上面的公式(12)可以明显看出，当且仅当
rmin＞Kg (14)时，细菌群体最终可以被根除。
上述公式(12)和(13)可以解析求解，以提供如下所述的N总(t)的封闭形式表达式。N总(t)是不断生长的群体(无抗生素)
在不存在抗生素的情况下，公式(12)产生
Figure BDA0003608559200000264
其产生
Figure BDA0003608559200000265
将以上N总(t)代入公式(13)并积分产生
Figure BDA0003608559200000266
注意上述公式(16)的渐近性行为：
·对于t≈0，其中初始细菌群体大小远低于其饱和点，
Figure BDA0003608559200000271
其意味着
Figure BDA0003608559200000272
每个公式(15)、(16)和(17)的典型曲线如图6所示。
·对于t→∞，可以得到
Figure BDA0003608559200000273
暴露于抗生素的一般群体。
在抗生素的存在下，公式(12)最终产生(见附录C)
Figure BDA0003608559200000274
请注意，当初始群体远离其饱和点时，即
Figure BDA0003608559200000275
则公式(12)产生
Figure BDA0003608559200000276
这意味着公式(19)可以简化为
Figure BDA0003608559200000277
为了说明上述数学建模框架的适用性，获得了以下结果。这些结果用于比较通过涂板估算的活细菌计数与通过光密度测量和提出的基于模型的方法估算的计数：
a.如上所述(图7)，使用公式(1)拟合使用标准活力涂板方法产生的Nlive的实验数据。参数估算如表1所示。
b.将(a.)部分的参数估算用于公式(2)，以产生Ntotal(t)的值并将这些值与使用光密度测量通过实验产生的数据进行比较(图8)。使用上述参数估算代入公式Eq.还产生了Nlive(t)的值，用于与图7比较。
c.使用公式(2)拟合使用光密度测量通过实验产生的Ntotal的数据(图9)。参数估算如表1所示。
d.使用公式(2)对在24小时(图10)、12小时(图11)、9小时(图12)和6小时(图13)期间通过实验产生的数据重复拟合Ntotal的数据。相应的参数估算如表1所示。
表1.公式(1)和(2)+中模型的参数估算
Figure BDA0003608559200000291
+未报告在16和32MIC下进行的涂板实验的参数，因为没有在这些浓度下使用光密度仪进行相应的实验
*应谨慎解释标准误差，因为也存在小的系统误差
**请参阅下面有关此估算的讨论
图7到图13和表1的结果表明，在数学建模部分中开发的数学框架使得根据活细胞和死细胞的全部数量N总(t)的光学测量估算活细胞随时间的数量N活(t)是可行的。这种基本能力提供了将光密度测量常规用作识别细菌/抗生素相互作用的药效学并将结果用于设计个性化治疗的高效工具的能力。
更具体地说，对异质细菌群体(公式(2))的时间依赖性大小得出的解析表达式被证明是分析光学数据的关键。事实上，使用来自拟合N活到涂板数据的参数估算由公式(2)产生的N总的曲线与来自光密度测量的N总非常吻合(图8)。此外，拟合公式(2)到光密度数据产生的图9中的N活的曲线与图8的曲线相当接近。更重要的是，仅通过将模型拟合到光密度测量值得出的估算值接近于来自通过涂板产生的N活的直接测量的估算值。最后，通过在图10到图13中在较短的时间段24、12、9和6小时内拟合实验数据产生的N活的估算值分别证明了该方法的稳健性，因为在所有情况下，N活估算值仍然彼此接近。应该强调的是，在短时间内获得合理的估算值对于使用该方法快速设计治疗方法至关重要。
在收集的所有光密度测量值(图8到图13)中，小的系统误差是明显的。例如，图8到图13中的光学测量曲线表现出从大约几小时开始的生长率暂时下降。生长率在6小时左右恢复到其之前的值。最后，它在10小时左右开始趋于平稳。从初始值到较低值并返回的生长率波动纯粹是所用仪器的伪影，因为在不同的时间范围内使用不同的光学方法(衍射和吸收)进行细胞计数。时间生长曲线对于重现时间杀伤曲线至关重要，因为它提供了细菌的自然死亡率参数Kd。因此，拟合细菌总数的时间生长模型的微小波动对实际存在的活细菌以及时间杀伤结果都有很大影响。在时间杀伤曲线中也注意到人为波动，1/2×MIC大约在6小时和24-35小时，2×MIC曲线在12小时，而8×MIC曲线稍晚一些。
正如预期的那样，模型拟合在不同时间段收集的数据将受到这些波动的影响。实际上，从图9(48小时内的光密度测量值的拟合)和图10(24小时内的光密度测量值的拟合)开始，除了1/2×MIC情况外，没有显著的偏差，但即使在这种情况下，模型产生的N活曲线也相当接近彼此。继续图11(12小时内的光密度测量值的拟合)，由模型产生的8×MIC曲线在一小时后完全稳定，与图9和图10中的对应曲线有偏差。这是因为所使用的光学仪器在分配的时间(12小时)内没有改变测量模式，并且群体呈现出略微下降的曲线。分析表明，这样的曲线代表抗生素在相应的8×MIC浓度下完全根除细菌。在图12和图13中可以观察到类似的现象，其中2×MIC开始显示出对细菌的更大抑制，随后相应地完全根除细菌群体。
拟合模型中包含的信息可用于设计针对挑战性感染的有效疗法，例如通过确保rmin>Kg或通过确保满足公式(6)。这强调了使用所提出的数学建模框架从不可能检测到的测量中提取有关群体下降的信息并有效使用这些信息的重要作用。开发了一种基于数学模型的方法，以从暴露于抗生素的细菌群体的时间杀伤实验中收集的其他无法使用的光密度测量值收集体外药效学。基于模型的方法被应用于随时间的实验性光密度测量，并产生了活细菌计数的估算值，其与在几个采样点通过标准涂板方法手动产生的计数一致。本文公开的基于数学模型的方法有助于保留与光密度测量相关的所有优点，同时消除它们的基本缺点，即它们无法区分活细胞和死细胞，从而跟踪因暴露于抗生素而下降的细菌群体的大小。这种基于模型的方法允许快速系统地设计针对耐药性细菌的有效个性化给药方案。随着光密度测量技术进展的进一步发展，例如通过简化校准或扩展动力学范围(Pla ML,Oltra S,Esteban MD,Andreu S,Palop A(2015)BioMed Research International 2015:14；Mytilinaios IS等人，(2012)International Journal of Food Microbiology 154(3):169-176；López S等人，(2004)International Journal of Food Microbiology 96(3):289-300)，预计使用本文提供的基于模型的方法将证明对改善治疗耐药性临床感染的治疗结果的有用性。
本领域技术人员将理解，本文具体描述并在附图中示出的结构和方法是非限制性示例性实施例，并且描述、公开和附图应仅被解释为特定实施例的示例性。因此，应当理解，本公开不限于所描述的精确实施例，并且本领域技术人员可以在不背离本公开的范围或精神的情况下进行各种其他改变和修改。此外，在不脱离本公开的范围的情况下，结合某些实施例示出或描述的元件和特征可以与某些其他实施例的元件和特征组合，并且这样的修改和变化也包括在本公开的范围内。因此，本公开的主题不受已经具体示出和描述的内容的限制。
附录A
建立基本公式
活细胞群体
如之前的工作所示(Bhagunde等人，AlChE J.，出版中，2015)：
Figure BDA0003608559200000321
Figure BDA0003608559200000322
Figure BDA0003608559200000323
和
Figure BDA0003608559200000324
其中
Figure BDA0003608559200000325
和
-参数rmin、a、μ和
Figure BDA0003608559200000326
与抗生素浓度C有关；
-Kg＝Kb-Kd是细菌的净生理生长，等于生理诞生率Kb和生理死亡率Kd之间的差值；
-μ(t)是细菌的抗生素诱导的平均杀灭率；和
-不完全γ函数(与以上积分中的一些有关)被定义为
Figure BDA0003608559200000327
Kg、Kb和Kd之间的关系
在不存在抗生素的情况下，公式(1)隐含了
Figure BDA0003608559200000331
其中
Figure BDA0003608559200000332
和
Figure BDA0003608559200000333
死细胞和活细胞群体
在抗生素存在下，公式(1)隐含了
Figure BDA0003608559200000334
其中
μ(t)＝rmin+λae-at (11)
和
Figure BDA0003608559200000335
→
Figure BDA0003608559200000341
公式(10)、(11)和(13)→
Figure BDA0003608559200000342
Figure BDA0003608559200000343
从以上公式(14)可以清楚看出，当且仅当
Figure BDA0003608559200000344
时，细菌群体可以被完全根除。
生长中的群体，无抗生素
-对照(无抗生素，λ＝a＝0)→
公式(1)隐含了
Figure BDA0003608559200000345
公式(14)、(15)和(17)隐含了
Figure BDA0003608559200000346
Figure BDA0003608559200000351
渐近行为：
Figure BDA0003608559200000352
Figure BDA0003608559200000353
暴露于抗生素的一般群体
-抗生素，λ≠0，a≠0，rmin≠0→
公式(1)→
Figure BDA0003608559200000354
和
Figure BDA0003608559200000355
Figure BDA0003608559200000361
暴露于抗生素的一般群体，无饱和点
Figure BDA0003608559200000362
Figure BDA0003608559200000363
附录B.(实施例2)
Kg、Kb和Kd之间的关系
在不存在抗生素的情况下，细菌群体的生长动力学通过以下表征
Figure BDA0003608559200000364
其中
Figure BDA0003608559200000365
并且
Kg＝Kb-Kd 公式(A.3)
附录C.公式(19)的推导
可以解析解得公式(12)以产生
Figure BDA0003608559200000371
其中λ>0,a>0,rmin>0。因此
Figure BDA0003608559200000372
其推出公式(17)。

Claims (29)

1.一种用于确定对受试者中的微生物细胞群体药理学上有效的临床给药方案的方法，所述方法包括：
(i)收集指示在固定浓度的一种或多种抗微生物剂存在下在一段时间内的微生物细胞群体生长反应的信息丰富的数据集；
(ii)将所述数据集输入数学建模框架(1)中以确定微生物细胞群体在所述一段时间内与一种或多种抗微生物剂接触期间的敏感性，
Figure FDA0003608559190000011
其中Ntotal是总细菌群体；Nlive是活细菌群体；Nmax是最大细菌群体；Kg是生长率常数；Kd是死亡率常数；rmin是耐药性最强的亚群体的杀灭率；λ是适应的幅度；a是适应率；和
(iii)基于所述数学建模框架产生微生物细胞群体敏感性的输出值；和
(iv)基于产生的输出值，在所述时间段结束时，将在抗微生物剂存在下微生物敏感性的增加与对受试者中的微生物细胞群体药理学上有效的可能的临床给药方案相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括，基于在所述数学建模框架的时间段内的输出值设计对所述微生物细胞群体药理学上有效的给药方案。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物细胞群体是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、霉菌、分枝杆菌、病毒或传染原的细胞群体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗微生物剂是抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂。
5.一种使用根据权利要求1所述的方法确定的抗微生物给药方案来治疗患有由微生物细胞群体感染引起的病理状况的受试者的方法。
6.一种使用根据权利要求1所述的方法确定的抗微生物给药方案来预防由受试者暴露于微生物细胞群体引起的病理状况的方法。
7.根据权利要求1所述的方法，其中指示在一种或多种抗微生物剂存在下微生物细胞群体生长反应的信息丰富的数据集是来源于光学的。
8.一种用于确定对受试者中已对一种或多种抗微生物剂产生耐药性的微生物细胞群体药理学上有效的临床给药方案的方法，所述方法包括：
(i)收集指示在一种或多种抗微生物剂存在下在一段时间内的微生物细胞群体生长反应的信息丰富的数据集，其中所述微生物细胞群体已对一种或多种抗微生物剂产生耐药性；
(ii)将所述数据集输入数学建模框架(1)中以确定微生物细胞群体在所述一段时间内与一种或多种抗微生物剂接触期间的敏感性，
Figure FDA0003608559190000021
其中Ntotal是总细菌群体；Nlive是活细菌群体；Nmax是最大细菌群体；Kg是生长率常数；Kd是死亡率常数；rmin是耐药性最强的亚群体的杀灭率；λ是适应的幅度；a是适应率；和
(iii)基于所述数学建模框架产生微生物细胞群体敏感性的输出值；和
(iv)基于产生的输出值，在所述时间段结束时，将在一种或多种抗微生物剂存在下微生物敏感性的增加与对受试者中的耐药性微生物细胞群体药理学上有效的可能的临床给药方案相关联。
9.根据权利要求8所述的方法，进一步包括设计对所述微生物细胞群体药理学上有效的给药方案，其中所述微生物细胞群体已对所述一种或多种抗微生物剂产生耐药性。
10.根据权利要求8所述的方法，进一步包括编制有效抑制微生物细胞群体中出现获得性耐药性的抗微生物剂和给药方案的库。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述微生物细胞群体是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、霉菌、分枝杆菌、病毒或传染原的细胞群。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗微生物剂是抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂。
13.一种使用根据权利要求8所述的方法确定的抗微生物给药方案来治疗患有由耐药性微生物细胞群体感染引起的病理状况的受试者的方法。
14.一种使用根据权利要求8所述的方法确定的抗微生物给药方案来预防由受试者暴露于耐药性微生物细胞群体引起的病理状况的方法。
15.根据权利要求8所述的方法，其中指示在一种或多种抗微生物剂存在下微生物细胞群体生长反应的信息丰富的数据集是来源于光学的。
16.一种用于确定对受试者中的微生物细胞群体药理学上有效的临床给药方案的方法，所述方法包括：
(i)收集指示在固定浓度的一种或多种抗微生物剂存在下在一段时间内的微生物细胞群体生长反应的信息丰富的数据集；
(ii)将所述数据集输入数学建模框架(2)中以确定微生物细胞群体在所述一段时间内与一种或多种抗微生物剂接触期间的敏感性，
Figure FDA0003608559190000031
(iii)基于所述数学建模框架产生微生物细胞群体敏感性的输出值；和
(iv)基于产生的输出值，在所述时间段结束时，将在抗微生物剂存在下微生物敏感性的增加与对受试者中的微生物细胞群体药理学上有效的可能的临床给药方案相关联。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包括基于在所述数学建模框架的时间段内的输出值设计对所述微生物细胞群体药理学上有效的给药方案。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述微生物细胞群体是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、霉菌、分枝杆菌、病毒或传染原的细胞群。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗微生物剂是抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂。
20.一种使用根据权利要求16所述的方法确定的抗微生物给药方案来治疗患有由微生物细胞群体感染引起的病理状况的受试者的方法。
21.一种使用根据权利要求16所述的方法确定的抗微生物给药方案来预防由受试者暴露于微生物细胞群体引起的病理状况的方法。
22.根据权利要求16所述的方法，其中指示在一种或多种抗微生物剂存在下微生物细胞群体生长反应的信息丰富的数据集是来源于光学的。
23.一种用于确定对受试者中已对一种或多种抗微生物剂产生耐药性的微生物细胞群体药理学上有效的临床给药方案的方法，所述方法包括：
(i)收集信息丰富的数据集，所述数据集指示在一种或多种抗微生物剂存在下在一段时间内的微生物细胞群体生长反应，其中所述微生物细胞群体已对一种或多种抗微生物剂产生耐药性；
(ii)将所述数据集输入数学建模框架(2)中以确定微生物细胞群体在所述一段时间内与一种或多种抗微生物剂接触期间的敏感性，
Figure FDA0003608559190000041
(iii)基于所述数学建模框架产生微生物细胞群体易感性的输出值；和
(iv)基于产生的输出值，在所述时间段结束时，将在一种或多种抗微生物剂存在下微生物敏感性的增加与对受试者中的耐药性微生物细胞群体药理学上有效的可能的临床给药方案相关联。
24.根据权利要求23所述的方法，进一步包括设计对所述微生物细胞群体药理学上有效的给药方案，其中所述微生物细胞群体已对所述一种或多种抗微生物剂产生耐药性。
25.根据权利要求23所述的方法，进一步包括编制有效抑制微生物细胞群体中出现获得性耐药性的抗微生物剂和给药方案的库。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述微生物细胞群体是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、霉菌、分枝杆菌、病毒或传染原的细胞群。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗微生物剂是抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂。
28.一种使用根据权利要求23所述的方法确定的抗微生物给药方案来治疗患有由已产生耐药性的微生物细胞群体感染引起的病理状况的受试者的方法。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述指示在一种或多种抗微生物剂存在下微生物细胞群体生长反应的信息丰富的数据集是来源于光学的。
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