CN114574591B - 一种癌症诊疗一体化纳米试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种癌症诊疗一体化纳米试剂，包括一种通过在AuNP表面修饰Y型DNA结构制备得到的miRNA识别探针和一种通过在AuNP上修饰双链DNA连接体和拉曼分子制备得到的SERS探针，本发明还公开了上述癌症诊疗一体化试剂的制备方法和应用。本发明所述的癌症诊疗一体化纳米试剂，在癌细胞内ATP驱动下，AuNP上特殊化设计的Y型DNA结构和双链DNA连接体将发生miRNA‑106a触发的构象转换，释放出miRNA‑106a并循环放大，引发SERS信号显著增强识别癌细胞；同时构象转换产生并扩增的DNAzyme能催化裂解Survivin mRNA和c‑Jun mRNA，实现有效的双重基因沉默治疗。

Description

一种癌症诊疗一体化纳米试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能纳米探针技术领域，具体涉及一种癌症诊疗一体化纳米试剂及其制备方法和应用。
背景技术
发明一种兼具诊断和治疗功能的诊疗一体化试剂是实现协同治疗癌症、高效低毒的重要途径，对癌症的早期准确诊断和有效治疗具有重要意义。实现影像指导下癌症治疗的一体化试剂为精确识别癌细胞、进一步精确治疗和及时监测治疗效果提供了有力手段。一体化试剂可以在准确识别癌症后自主启动治疗模式，即检测和治疗的级联过程，今年来得到了极大的关注。然而，集成了级联表面增强拉曼散射（SERS）成像和基因沉默治疗的纳米系统却鲜有报道。
与荧光成像易受光漂白和生物背景干扰相比，SERS可提供独特的分子指纹图谱，具有良好的光稳定性，能够超灵敏、特异性地检测复杂生物环境中的生物分子。SERS来源于等离子体纳米材料周围的局部电磁场增强，相邻的等离子体纳米粒子（NPs）之间的纳米间隙（即SERS热点）可获得极大增强的拉曼信号。通过内源性miRNAs触发纳米颗粒在活细胞内组装形成丰富热点，实现高灵敏度的SERS成像具有重要意义，但如今仍是一个巨大的挑战。目前，纳米粒子在细胞内组装的主要方法是直接形成三明治结构复合物，或纳米粒子与miRNA相互作用后，由于表面电荷的变化而不可控地形成聚集体；但前者的三明治结构难以形成大量SERS热点，后者的不可控和非特异性聚集可能会带来假阳性。核酸序列具有易于设计和反应高特异性的优点，因此，发展基于细胞内靶标触发的核酸杂交组装策略有望获得可控的网络结构聚集体，产生丰富的热点，可用于癌症早期标志物的高灵敏SERS检测。
基因沉默作为一种基因治疗手段，已被认为是一种很有前途的癌症治疗策略，特别是在解决耐药性方面具有明显的优势。其中，以DNAzyme为基础的基因沉默，因其易于修饰、设计灵活而受到越来越多的关注。为了防止正常细胞的非预期死亡，迫切需要内源性癌症特异性生物标志物（如miRNAs）触发基于DNAzyme的治疗，以有效提高治疗的准确性。此外，尽管各种基因沉默策略在一定程度上取得了成功，但由于肿瘤细胞的自身防御，单基因沉默的抗肿瘤作用往往有限，因此，迫切需要一种靶标触发的双基因沉默治疗策略，以使治疗更加精确与有效。此外，内源性癌症特异性生物标志物触发DNAzyme的扩增，可以有效提高高特异性的基因沉默效果。然而，实现细胞间miRNA触发的基于DNAzyme的双基因沉默的方法，特别是靶向触发的纳米颗粒级联组装与DNAzyme扩增的协同增强型癌症诊断和治疗的一体化试剂还没有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种癌症诊疗一体化纳米试剂，组成该试剂的AuNP-Y和AuNP-D能在ATP的驱动下进行特定的miRNA-106a触发的组装，形成具有丰富SERS热点的AuNP网络纳米结构，在癌细胞中表现出明显增强的SERS信号；此外，DNAzyme的活性也被选择性激活，在Mg2+辅助作用下催化裂解Survivin mRNA和c-Jun mRNA，实现了对癌细胞的精准双基因沉默治疗。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种癌症诊疗一体化纳米试剂，包括一种miRNA识别探针和一种SERS探针；所述miRNA识别探针为AuNP-Y，是通过金纳米颗粒（即AuNP）上修饰Y型DNA结构（即Y-motif）制备的；所述SERS探针为AuNP-D，是通过在金纳米颗粒上锚定双链DNA连接体（即dsDNA linker）和拉曼分子5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）（即DTNB）制备的，所述AuNP-Y和所述AuNP-D在ATP的驱动下进行癌症相关标志物miRNA-106a触发的组装，形成AuNP网络纳米结构。
其中，所述金纳米颗粒为直径30 nm的金纳米球；
所述Y型DNA结构是由三条DNA链组装得到，所述三条DNA链序列如下：
Y-motif ssDNA-A（即Ya）：
5’-CGTGTTGCTTAGCAAGCTACTTACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTCTACCTGCACTGTAAGCA ACACG -3’；
Y-motif ssDNA-B（即Yb）：
5’-CCTCGGCCAGGCTAGCTACAACGACCGCTCCGGATGCGAACCTTCCTCCGCAATACTCCCCC-3’；
Y-motif ssDNA-C（即Yc）：
5’-SH-TTTTTTCAACGAGAGGCGTTGCTTACAGTGCACCGGAGCGGTC-3’；
所述双链DNA连接体是由两条DNA链组装得到，所述两条DNA链序列如下：
c-Jun DNAzyme（即c-Jun）：
5’-CGGGAGGAAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTTG-3’；
Linker（即L）：
5’-SH-TTTTTTCTCCGGTGCACTGTAAGCAACGCCTCTCGTTGTAG-3’。
其中，所述miRNA识别探针和SERS探针的摩尔比例为1:1。
根据本发明的另一个方面，提供一种所述的癌症诊疗一体化纳米试剂的制备方法，包括以下步骤：
1）合成miRNA识别探针：在PBS缓冲液中混合等量的上述Y-motif ssDNA-A 、Y-motif ssDNA-B 和Y-motif ssDNA-C，然后进行退火处理以组装Y型DNA结构；然后，将组装得到的Y型DNA与金纳米颗粒在室温下孵育6-12 h后，进行老化处理；最后用PBS离心洗涤三次，所述离心的转速为5000-7000 rpm、每次离心的时间为15-25 min；然后将沉淀物重新悬浮在PBS中，得到AuNP-Y；
2）合成SERS探针：将等量的上述c-Jun DNAzyme和linker在PBS缓冲液中混合以组装双链DNA连接体；随后，将组装得到的双链DNA连接体与金纳米颗粒在室温下孵育6-12 h，加入NaCl熔液进行老化处理后，将5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）与经双链DNA连接体修饰的金纳米颗粒在室温下孵育2-4 h，用PBS离心洗涤三次，所述离心的转速为5000-7000 rpm、每次离心的时间为15-25 min；后将沉淀物重新悬浮在PBS中，得到AuNP-D；
3）将等量的miRNA识别探针和SERS探针混合，即获得miRNA响应型癌症诊疗一体化试剂。
优选地，所述步骤1）中Y型DNA结构与金纳米颗粒物质的量比为2000:1~4000:1。
优选地，所述步骤2）中双链DNA连接体与金纳米颗粒物质的量比为2000:1~4000:1。
优选地，所述步骤2）中5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）与经双链DNA连接体修饰的金纳米颗粒物质的量比为6000:1~7000:1。
根据本发明的另一个方面，还提供所述的一种癌症诊疗一体化纳米试剂在制备或筛选癌症诊断与基因治疗药物方面的应用。
反应原理：本发明的两种基于AuNP的探针，其中，AuNP-Y是通过AuNP修饰Y-motif制备的，而AuNP-D是由拉曼分子5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸），即DTNB，和dsDNA linker共同标记AuNP制备的。当miRNA-106a存在的情况下，所述AuNP-Y和AuNP-D可以组装成AuNP网络化纳米结构，并同时释放Survivin DNAzyme 和c-Jun DNAzyme，分别沉默Survivin mRNA和c-Jun mRNA。
通过合理的DNA设计，miRNA的互补段和ATP适配体被固定在一个Y型的DNA结构上，称为Y-motif，由于双链杂交，ATP适配体与ATP的结合被抑制，同时Y-motif为DNAzyme递送提供了稳定的支架。当靶标miRNA-106a存在时，miRNA-106a首先附着在Ya上，启动链式置换反应，导致Yb-Yc双链从刚性的Y-motif中被释放出来。Ya两端的部分序列由于碱基互补配对，能够形成发夹结构，使miRNA-106a从Ya中释放出来，并进一步移动到邻近的Y-motifs上，使得大量的Yb-Yc双链从AuNP-Y中释放。随后，在AuNP-D上标记的dsDNA linker的作用下，Yb-Yc双链可以脱离，通过toehold介导的链置换形成更稳定的Yb-linker双链，导致AuNP-Y和AuNP-D组装形成AuNP网络化结构，进而释放Yb和c-Jun DNAzyme，在Mg2+辅助作用下降解目标Survivin mRNA和c-Jun mRNA，抑制癌细胞增殖。因此，通过miRNA-106a的触发，在目标细胞中可以自组装形成AuNP网络化纳米结构。同时，由于网络化纳米结构的颗粒间纳米间隙的强耦合表面等离子体共振，可以增强拉曼分子SERS信号，并用于精确监测AuNP网络化纳米结构响应miRNA-106a的动态组装。因此，所提出的SERS策略结合了ATP驱动的循环放大、高特异性的靶标识别和AuNP的动态组装的优势，提供了一种有效的途径来方便地观察活细胞中的miRNA-106a，同时通过AuNP上释放的Yb和c-Jun DNAzyme来裂解mRNAs以实现细胞内基因沉默。
本发明的有益效果是：
本发明提供的一种新型的基于金纳米颗粒AuNP的治疗性纳米系统，通过 AuNP上的Y-motifs和dsDNA linker在癌细胞中发生ATP驱动的miRNA-106a触发的构象转换，从而释放出miRNA-106a进行循环扩增，进而实现基于核酸杂交的AuNP网络纳米结构的组装，其SERS信号明显增强，能够敏感识别癌细胞；同时特异性激活扩增的DNAzyme，能够催化Mg2+辅助裂解Survivin mRNA和c-Jun mRNA，实现有效的双重基因沉默治疗。这种新型的治疗性纳米系统可以为癌细胞的准确诊断和高效治疗提供有力的工具。
附图说明
图1为本发明基于ATP驱动的循环放大策略的miRNA-106a SERS成像和双靶点基因沉默治疗的示意图；
其中A为AuNP-Y和AuNP-D的制备及AuNP网络化纳米结构的形成；B为由miRNA-106a触发的AuNP网络化纳米结构的DNA工作机制；C为SGC-7901细胞中miRNA-106a激活的SERS成像和双靶点基因沉默；
图2为本发明miRNA-106a链位移级联放大传感系统工作机制的凝胶电泳表征；
图3为本发明DNAzyme在Mg2+作用下的mRNA切割的凝胶电泳表征；
图4A为本发明AuNP、AuNP-Y、AuNP-D、AuNP-Y与AuNP-D的混合物及其在miRNA-106a存在情况下的归一化吸收光谱；
图4B为本发明AuNP、AuNP-Y、AuNP-D、AuNP-Y与AuNP-D的混合物及其在miRNA-106a存在情况下的水合粒径；
图4C为AuNP探针在10 mM ATP存在前后对100 pM、1 nM和10 nM的miRNA-106a的SERS响应光谱；
图4D为AuNP探针在10 mM ATP存在前后对100 pM、1 nM和10 nM的miRNA-106a的SERS响应光谱在1330 cm-1处的SERS强度；
图5A为本发明AuNP-Y的SEM图像；
图5B为本发明AuNP-D的SEM图像；
图5C为本发明AuNP-Y和AuNP-D混合物的SEM图像；
图5D为本发明AuNP-Y和AuNP-D混合物在miRNA-106a存在的情况下的SEM图像；
图6为本发明AuNP和AuNP网络化纳米结构的FDTD电磁场分布的模拟结果；
图7为本发明SGC-7901细胞中探针组装的暗场成像；
图8为本发明提供的六种细胞与AuNP-Y和AuNP-D共培养的SERS影像，
其中所述六种细胞分别为SGC-7901、HeLa、MCF-7、HepG2、MDA-MB-231和LO2细胞；
图9A为本发明中SGC-7901细胞分别与AuNP-Y、AuNP-D以及AuNP-Y和AuNP-D孵育前后的凋亡流式分析和MTT细胞活力测定；
其中Q1：活细胞；Q2：早期凋亡细胞；Q3：晚期凋亡细胞；Q4：坏死细胞；
图9B为本发明中LO2细胞分别与AuNP-Y、AuNP-D以及AuNP-Y和AuNP-D孵育前后的凋亡流式分析和MTT细胞活力测定；
其中Q1：活细胞；Q2：早期凋亡细胞；Q3：晚期凋亡细胞；Q4：坏死细胞；
图10为本发明中qPCR分析SGC-7901和LO2细胞中Survivin mRNA和c-Jun mRNA的相对表达量；
图11为本发明中AuNP-Y和AuNP-D处理的LO2和SGC-7901细胞，与未经处理的SGC-7901细胞随时间的明场成像图。
序列表说明
SEQ ID NO.1：Y-motif ssDNA-A的核苷酸序列；
SEQ ID NO.2：Y-motif ssDNA-B的核苷酸序列；
SEQ ID NO.3：Y-motif ssDNA-C的核苷酸序列；
SEQ ID NO.4：c-Jun DNAzyme的核苷酸序列；
SEQ ID NO.5：linker的核苷酸序列。
具体实施方式
为了相关技术领域人员更好的理解本发明专利的内容，下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的内容不限于下述的实例。
实施例中所用到的核苷酸链如下：
Y-motif ssDNA-A（即Ya）：
5’-CGTGTTGCTTAGCAAGCTACTTACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTCTACCTGCACTGTAAGCA ACACG -3’，
Y-motif ssDNA-B（即Yb）：
5’-CCTCGGCCAGGCTAGCTACAACGACCGCTCCGGATGCGAACCTTCCTCCGCAATACTCCCCC-3’，
Y-motif ssDNA-C（即Yc）：
5’-SH-TTTTTTCAACGAGAGGCGTTGCTTACAGTGCACCGGAGCGGTC -3’，
c-Jun DNAzyme（即c-Jun）：
5’-CGGGAGGAAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTTG-3’，
Linker（即L）：
5’-SH-TTTTTTCTCCGGTGCACTGTAAGCAACGCCTCTCGTTGTAG-3’，
本发明的核苷酸链均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供。
实施例1：miRNA响应型癌症诊疗一体化试剂的制备
1. AuNP-Y的制备
1) 在50 μL PBS缓冲液中混合等量（50 μM，10 μL）的Y-motif ssDNA-A 、Y-motifssDNA-B 和Y-motif ssDNA-C（即分别为Ya、Yb和Yc），然后进行退火处理以组装Y型DNA结构，即Y-motif；
2) 将含有上述10 μM Y-motif的50 μL溶液与500 μL 金纳米颗粒（0.3 nM），即AuNP在室温下孵育12 h后，进行老化处理，即加入氯化钠溶液四次，每次间隔30 min，最终氯化钠浓度为0.2 M，将混合物在室温下轻轻摇动12 h；
3) 最后用PBS离心洗涤三次，所述离心的转速为7000 rpm，每次离心的时间为20min；后将沉淀物重新悬浮在50 μL的PBS中，得到AuNP-Y，并储存在4°C以备进一步使用。
2. AuNP-D的制备
1) 将10 μL 50 μM 的c-Jun DNAzyme和linker在50 μL的PBS缓冲液中混合以组装双链DNA连接体，即dsDNA linker；
2) 将上述 dsDNA linker（50 μM，10 μL）与500 μL的AuNP（0.3 nM）在室温下孵育12 h，进行上述相同的老化处理，即加入NaCl溶液四次，每次间隔30 min，最终NaCl浓度为0.2 M，将混合物在室温下轻轻摇动12 h；
3) 将10 μL的100 μM 5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸），即DTNB与500 μL的经dsDNAlinker修饰的AuNP在室温下孵育3 h；
4) 用PBS离心洗涤三次，所述离心的转速为7000 rpm，每次离心的时间为20 min，后将沉淀物重新悬浮在50 μL PBS中，得到AuNP-D，并储存在4°C以备进一步使用。
3. 将等量的AuNP-Y和AuNP-D混合，即获得miRNA响应型癌症诊疗一体化试剂。
实施例2：miRNA响应型癌症诊疗一体化试剂反应机理表征
如图1所示为本发明miRNA响应型癌症诊疗一体化试剂的工作原理，为了验证机理的正确性，使用10%的PAGE胶进行凝胶电泳实验，取5 μL DNA样品与1 μL的6×DNA loadingbuffer混匀，80 V电压下运行80 min后成像。
图2中的10% PAGE表征了Y-motif的形成及其对miRNA-106a与ATP的特异性反应。其中该DNA样品分别具体对应于不同的泳道的DNA样品，即分别具体为：M: DNA marker；泳道1：Ya；泳道2：Yb；泳道3：Yc；泳道4：Ya，Yb与Yc等量杂交（Y）；泳道5：miRNA-106a；泳道6：Y与miRNA-106a等量杂交；泳道7：Yb与Yc等量杂交；泳道8：L；泳道9：c-Jun；泳道10：L与c-Jun等量杂交；泳道11：Yb和Yc杂交产物与L和c-Jun杂交产物等量反应；泳道12：Yc与L等量杂交；泳道13：Y、miRNA-106a、ATP与L和c-Jun杂交产物等量杂交。 第4泳道中杂交产物的主条带相较三条ssDNA（1-3泳道）的电泳速度较慢，这表明Y-motif的成功形成。将Y-motif与miRNA-106a（泳道5）共孵育，在泳道6中呈现出三个条带，分别属于Y-motif、miRNA-106a附着的Y-motif和Yb-Yc双链，这表明Y-motif可以特异性地捕获miRNA-106a，并释放Yb-Yc双链（泳道7）。泳道8和9所示的电泳条分别属于L和c-Jun，泳道10的杂交产物的主条显示出较慢的电泳速度，这表明L和c-Jun的特异性杂交和dsDNA linker的高产率形成。11泳道的条带表明Yb-Yc双链可以与dsDNA linker杂交，并进一步触发对应于12泳道的Yb-linker双链的形成，同时伴随着Yb和c-Jun的释放。13泳道显示了基于ATP驱动的链式置换反应的完整过程，Yb-linker双链的形成证实了其可行性。
图3中的10% PAGE表征了Yb和c-Jun的酶切活性。各泳道中的样品分别为：M: DNAmarker；泳道1：Yb；泳道2：Survivin mRNA；泳道3：Yb与Survivin mRNA等量杂交；泳道4：Yb与Survivin mRNA在含Mg2+溶液中等量杂交；泳道5：c-Jun；泳道6：c-Jun mRNA；泳道7：c-Jun与c-Jun mRNA在含Mg2+溶液中等量杂交。其中c-Jun mRNA与Survivin mRNA，具体序列如下：
c-Jun mRNA：CAACGCCUCGUUCCUCCCG
Survivin mRNA：CCGGAGCGGAUGGCCGAGG
在泳道4和泳道7中出现了一条电泳速度更快的条带，这意味着在含Mg2+溶液中，Yb与c-Jun能够分别切割c-Jun mRNA与Survivin mRNA。
实施例3：miRNA触发的AuNP网络化纳米结构组装和SERS传感的可行性验证
将实施例1中等量（10 μL）的AuNP-Y和AuNP-D与含有0.5 nM miRNA-106a的80 μLPBS混合，在37°C下轻轻摇动孵育2 h，形成靶标诱导的AuNP网络化纳米结构。通过吸收、动态光散射（DLS）和扫描电镜（SEM）对AuNP网络纳米结构进行了表征。
如图4A所示，通过Y-motifs的修饰，AuNP的表面等离子体共振（SPR）峰由524 nm红移至526.4 nm。同样，通过dsDNA linker和DTNB的修饰，AuNP的SPR红移至526 nm，这表明AuNP-D的制备成功。
如图4B所示的DLS表征，AuNP-Y和AuNP-D的流体动力学直径分别约为33nm和31.6nm，SEM图像显示AuNP-Y和AuNP-D具有良好的分散性（图5A，B）。如图4B，在有miRNA-106a存在的情况下，AuNP-Y与AuNP-D混合物的流体动力学直径约为150.8 nm，且从SEM图像中观察到具有相对较大尺寸的AuNP网络化纳米结构（图5C，D）。这些结果证实了AuNP在miRNA-106a作用下的有效组装。
图4C显示了通过ATP驱动的循环放大策略对100 pM、1 nM和10 nM miRNA-106a在ATP加入前后的SERS信号。在图4D中绘制了1330 cm-1处的相应峰值强度。对照组和无miRNA-106a的ATP组中几乎没有检测到SERS信号，同时100 pM、1 nM和10 nM的miRNA-106a对应的SERS强度分别约为没有ATP组别的3.77倍、3.59倍和2.63倍（IATP/Iwithout ATP）。
此外，纳米结构的局部电磁场通过时域有限差分法（FDTD）进行理论模拟。对于网络化的纳米结构，根据组装两个颗粒的DNA链的长度，AuNP之间的间隙距离设定为10 nm。采用激发波长为633 nm的全散射场光源来计算AuNP网络化纳米结构的局部电磁特性。模拟区域的网格大小被设定为0.5 nm。FDTD模拟从理论上验证了网络化纳米结构的电磁场明显增强，这是由于相邻的AuNP之间的纳米间隙的电磁场强度相较单一AuNP强得多，如图6。
上述SERS检测与电磁场模拟的结果验证了miRNA-106a SERS成像的可行性，以及所提出的基于ATP驱动的循环放大传感策略的显著优势。
实施例4：细胞内miRNA-106a的SERS成像
1. 细胞培养
人胃腺癌SGC-7901细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞、人肝癌HepG2细胞和人正常肝脏LO2细胞均购自南京凯基生物技术有限公司，并按照提供的方案进行维护。除非另有说明，细胞在补充有10% FBS和1%抗生素（青霉素/链霉素，100 U/mL）的DMEM培养基中生长，细胞培养箱条件：37 °C，95%空气，5% CO2。
2. 细胞内miRNA-106a的SERS成像
将包括上述SGC-7901细胞、HeLa细胞、MCF-7细胞、HepG2细胞、MDA-MB-231细胞和LO2细胞在内的几个细胞系在DMEM培养基中培养，并使其生长到60%密度。然后在不含10%FBS和1%抗生素（青霉素/链霉素）的DMEM培养基中饥饿24 h，用PBS洗涤三次。将细胞与0.1nM的AuNP-Y和AuNP-D孵育。3 h后，用PBS清洗细胞三次，以去除游离和非特异性沉积的AuNP探针，然后在活细胞上进行miRNA-106a的SERS成像。
为了观察活细胞中的miRNA-106a，选择了人源胃腺癌miRNA-106a阳性细胞系SGC-7901作为细胞模型，按照上述细胞培养方法，将细胞与0.1 nM的AuNP-Y和AuNP-D共孵育，通过暗场显微镜成像，观察AuNP探针及其组装体在SGC-7901细胞中的分布情况。如图7，结果显示，在加入探针的前2 h形成了大量的AuNP网络化纳米结构。
之后，通过监测各种细胞系，即SGC-7901、HeLa、MCF-7、HepG2、MDA-MB-231和LO2细胞，研究了AuNP-Y和AuNP-D对细胞内miRNA-106a成像的通用性。如图8，由于miRNA-106a被认为是在多种癌细胞中上调的癌基因，所以观察到SGC-7901、HeLa、MCF-7、HepG2和MDA-MB-231细胞中高表达的miRNA-106a。相比之下，没有miRNA-106a上调的人类正常肝脏LO2细胞没有出现明显的SERS信号。这些结果证明了细胞内miRNA-106a SERS成像策略的高特异性。
实施例5： miRNA响应型癌症诊疗一体化试剂的精准治疗
AuNP-Y组、AuNP-D组、AuNP-Y和AuNP-D组这三组探针分别与SGC-7901细胞在37°C下孵育48 h。然后根据说明书，使用Annexin V-FITC/PI试剂盒对细胞进行染色，进行流式细胞仪检测。同样地，用标准的噻唑蓝比色法（即MTT检测法）对相同处理的细胞进行活力检测。
将SGC-7901和LO2细胞分为四组：对照组、AuNP-D组、AuNP-Y组、AuNP-Y和AuNP-D组。后三组分别用AuNP-D（0.5 nM）、AuNP-Y（0.5 nM）以及AuNP-Y和AuNP-D（0.5 nM）培养48h。加入放线菌素D（Act D，10 mg/mL）以阻断新的Survivin mRNA和c-Jun mRNA表达。30 min后，用RNeasy Plus Mini Kit收集总RNA，用cDNA合成试剂盒进行cDNA合成。SurvivinmRNA，c-Jun mRNA和GAPDH mRNA的引物如下；
Survivin mRNA forward primer: 5'-TTCTCAAGGACCACCGCAT-3'
Surviving mRNA reverse primer: 5'-TCTCAGTGGGGCAGTGGAT-3'
c-Jun mRNA forward primer: 5'-TGACTGCAAAGATGGAAACG-3'
c-Jun mRNA reverse primer: 5'-CAGGGTCATGCTCTGTTTCA-3'
GAPDH mRNA forward primer: 5'-TCAAGGCTGAGAACGGGAAG-3'
GAPDH mRNA reverse primer: 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'
目标cDNA在ABI7900（Thermo Fisher Scientific）中按照推荐程序进行qPCR扩增。
按照上述实验方法，这里使用细胞凋亡试剂盒来评估SGC-7901和LO2细胞在不同处理条件下的细胞活性。从图9A可以看出，仅用AuNP-Y或AuNP-D处理的SGC-7901细胞在Q2和Q3分别出现了0.44%和0.42%的凋亡信号，而用AuNP-Y和AuNP-D同时处理的SGC-7901细胞显示出高达51%的细胞凋亡，表明基因治疗只有在AuNP-Y和AuNP-D同时存在时才能被激活。同样的， MTT检测证实只有同时含有AuNP-Y和AuNP-D的组才显示出细胞杀伤力。值得注意的是，用AuNP-Y、AuNP-D以及AuNP-Y和AuNP-D处理的LO2细胞都没有显示出明显的细胞毒性（如图9B），这是因为LO2细胞的miRNA-106a表达量低，不能激活基因沉默治疗。
本实施例还使用qPCR分析了SGC-7901和LO2细胞中Survivin mRNA和c-Jun mRNA的相对表达量。如图10所示，与未处理的细胞相比，用AuNP-Y和AuNP-D组培养的SGC-7901细胞的Survivin mRNA和c-Jun mRNA表达分别被抑制了53.5%和56.5%，而在LO2细胞中没有观察到明显的抑制作用。
此外，为了进一步表征AuNP探针的治疗效果，图11给出了不同处理条件下细胞的明场图像，与用AuNP-Y和AuNP-D孵育的LO2或未处理的SGC-7901细胞相比，用AuNP-Y和AuNP-D孵育的SGC-7901细胞的细胞活力和增殖能力明显下降。
综上所述，AuNP探针为癌症细胞的精确双靶点基因治疗提供了一个高效的通用平台。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰、等同替换和改进等，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 一种癌症诊疗一体化纳米试剂及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtgttgctt agcaagctac ttacctgggg gagtattgcg gaggaaggtc tacctgcact 60
gtaagcaaca cg 72
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctcggccag gctagctaca acgaccgctc cggatgcgaa ccttcctccg caatactccc 60
cc 62
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttttcaac gagaggcgtt gcttacagtg caccggagcg gtc 43
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgggaggaag gctagctaca acgagaggcg ttg 33
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttttttctcc ggtgcactgt aagcaacgcc tctcgttgta g 41

Claims (7)

1.一种癌症诊疗一体化纳米试剂，其特征在于，所述试剂包括一种miRNA识别探针和一种SERS探针；所述miRNA识别探针为AuNP-Y，是通过金纳米颗粒AuNP表面修饰Y型DNA结构制备得到，其中所述Y型DNA结构是由三条DNA链组装得到，所述三条DNA链如下：Y-motifssDNA-A，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示；Y-motif ssDNA-B，其核苷酸序列如 SEQ IDNO.2所示；Y-motif ssDNA-C，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示；所述SERS探针为AuNP-D，是通过在金纳米颗粒AuNP表面修饰双链DNA连接体和拉曼分子5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）制备得到，其中所述双链DNA连接体是由两条DNA链组装得到，所述两条DNA链分别为c-Jun DNAzyme和linker，所述 c-Jun DNAzyme的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述AuNP-Y和所述AuNP-D在ATP的驱动下进行癌症标志物miRNA-106a触发的结果组装，形成AuNP网络化纳米结构；所述金纳米颗粒AuNP直径为15-50 nm。
2.根据权利要求1所述的一种癌症诊疗一体化纳米试剂，其特征在于，所述miRNA识别探针AuNP-Y和SERS探针AuNP-D的摩尔比例为0.5:1~1:0.5。
3.一种权利要求2所述的癌症诊疗一体化纳米试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备miRNA识别探针AuNP-Y：在PBS缓冲液中混合等量的所述Y-motif ssDNA-A、Y-motif ssDNA-B和Y-motif ssDNA-C，进行退火处理以组装Y型DNA结构；然后，将组装得到的Y型DNA结构与金纳米颗粒在室温下孵育6-12 h后，滴加NaCl溶液进行老化处理；最后用PBS离心洗涤三次，所述离心的转速为5000-7000 rpm、每次离心的时间为15-25 min；将沉淀物重新悬浮在PBS中，得到AuNP-Y；
2）制备SERS探针AuNP-D：将等量的所述c-Jun DNAzyme和linker在PBS缓冲液中混合以组装双链DNA连接体；随后，将组装得到的双链DNA连接体与金纳米颗粒在室温下孵育6-12h，加NaCl溶液进行老化处理；然后将5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）与经双链DNA连接体修饰的金纳米颗粒在室温下孵育2-4 h；用PBS离心洗涤三次，所述离心的转速为5000-7000rpm、每次离心的时间为15-25 min；将沉淀物重新悬浮在PBS中，得到AuNP-D；
3）将等量的所述步骤1）制得的miRNA识别探针AuNP-Y和所述步骤2）制得的SERS探针AuNP-D混合，即获得miRNA响应型癌症诊疗一体化试剂。
4.根据权利要求3所述的一种癌症诊疗一体化纳米试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中Y型DNA结构与金纳米颗粒物质的量比为2000:1~4000:1。
5.根据权利要求3所述的一种癌症诊疗一体化纳米试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中双链DNA连接体与金纳米颗粒物质的量比为2000:1~4000:1。
6.根据权利要求3所述的一种癌症诊疗一体化纳米试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中5,5'-二硫双（2-硝基苯甲酸）与经双链DNA连接体修饰的金纳米颗粒物质的量比为6000:1~7000:1。
7.权利要求1或2所述的一种癌症诊疗一体化纳米试剂在制备癌症诊断与基因治疗药物方面的应用。
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