CN114574424A - 用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：向蜜蜂大脑组织中加入蛋白酶溶液，充分分解后，获得蜜蜂大脑组织混合物；所述蜜蜂大脑组织混合物经过滤后，收集大脑组织混合物滤液；将所述大脑组织混合物离心后，获得沉淀物，将所述沉淀物重悬后，离心，获得的沉淀用缓冲液重悬，获得蜜蜂大脑单细胞悬液；其中，所述蛋白酶溶液中含liberse TM酶和木瓜酶。本发明的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，第一次将蜜蜂大脑单细胞进行分离，分离的单细胞纯度高，活性强，杂质碎片少，分离获得的蜜蜂大脑单细胞用于单细胞测序具有很好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法。
背景技术
蜜蜂不仅作为重要的农业昆虫在世界范围被广泛饲养，其独特的生殖现象和复杂的社会性行为也使得蜜蜂成为优秀的昆虫研究模型。意大利蜜蜂(Apis mellifera)作为社会性昆虫，在具备昆虫特征的同时，还具有明显的群体生物学的行为特点，对于人类的学习记忆能力和社会行为的研究是极为重要的模型。蜜蜂是农业网络中的关键物种，表现出极强的发育可塑性，具体体现在级型分化和社会分工的调控方面。虽然蜜蜂的遗传学操作(如基因编辑、遗传学杂交等)存在诸多困难，至今仍难以实现类似于果蝇中大规模筛选突变体的实验，但这并不影响蜜蜂逐渐成为表观遗传学和行为学研究的热点。
蜜蜂拥有体积仅约为1立方毫米的大脑，尽管大脑体积小，但在处理复杂的环境信息和调控丰富的行为能力上发挥了决定性作用。与其他昆虫一样，蜜蜂的脑组织可划分为前脑、中脑和后脑三部分。在蜜蜂中，前脑是大脑中最重要的也是所占体积最大的部分，由蕈形体(又称蘑菇体)、中心复合体、视叶和侧前脑等多种重要感觉结构组成，其中蕈形体是负责学习与记忆的高级中枢，处理来自初级中枢的各种感觉刺激。
尽管蜜蜂的大脑体积小，但少量的大脑神经细胞控制着大量的复杂行为。随着生物遗传学的发展，使人们可以从分子水平上了解蜜蜂学习记忆的机制，而对蜜蜂学习记忆相关基因及功能的研究即为一种有效的手段，对于明确其学习记忆的分子机制具有重要作用。
综上，如何获取蜜蜂的大脑组织的单细胞悬液，有助于提供从分子角度去研究蜜蜂的记忆机制以及相关生物学行为。
发明内容
为此，本发明提供一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
向蜜蜂大脑组织中加入蛋白酶溶液，充分分解后，获得蜜蜂大脑组织混合物；
所述蜜蜂大脑组织混合物经过滤后，收集大脑组织混合物滤液；
将所述大脑组织混合物离心后，获得沉淀物，将所述沉淀物重悬后，离心，获得的沉淀用缓冲液重悬，获得蜜蜂大脑单细胞悬液；
其中，所述蛋白酶溶液中含liberse TM酶和木瓜酶。
本发明的一个实施例中，所述蛋白酶溶液中，liberse TM酶的浓度为12-14U/ml。
本发明的一个实施例中，所述蛋白酶溶液中，木瓜酶的浓度为3-5mg/ml。
本发明的一个实施例中，所述重悬液为含质量百分数为9-11％％FBS的DMEM培养基。
本发明的一个实施例中，所述过滤采用40μm细胞筛过滤。
本发明的一个实施例中，所述大脑组织混合物离心条件为：4℃，300RCF，离心10min。
本发明的一个实施例中，所述蜜蜂大脑组织的分解条件为37℃水浴，10-30min，冷却至室温，同时上下颠倒蜜蜂大脑组织混合物。
本发明的一个实施例中，所述蜜蜂大脑组织分解前，先经PBS溶液清洗2-5次。
本发明的一个实施例中，所述缓冲液为质量分数为0.03-0.05％BSA的PBS溶液。
本发明具有如下优点：
本发明提供了用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，第一次将蜜蜂大脑单细胞进行分离，分离的单细胞纯度高，活性强，杂质碎片少，分离获得的蜜蜂大脑单细胞用于单细胞测序具有很好的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液显微镜下观察图；
图2为本发明实施例提供的蜜蜂大脑单细胞悬液单细胞转录组测序图；
图3为本发明实施例提供的蜜蜂大脑单细胞悬液单细胞转录组测序图；
图4为本发明实施例提供的蜜蜂大脑单细胞悬液的质检报告。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，liberse TM酶购自于Roche,德国(Code：5401119001)；
木瓜酶购自于Solarbio，中国(货号：G8430；CAS:9001-73-4)。
实施例1
本发明提供一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其方法包括以下步骤：
取意大利蜜蜂(Apis mellifera)，在显微镜下用剪刀和镊子分离头部，去除王浆腺体、白色覆膜后，将完整的大脑剥离，获得蜜蜂大脑组织，依次解剖2-3只蜜蜂大脑；取蜜蜂大脑组织分解前，先经PBS溶液清洗2-5次。
向清洗后的大约3mg蜜蜂大脑组织中，加入蛋白酶溶液，充分分解后，获得蜜蜂大脑组织混合物；其中，蛋白酶溶液中含liberse TM酶(Liberase TM Research Grade 10mg)和木瓜酶(Papain)，liberse TM酶的浓度为13U/ml，木瓜酶的浓度为4mg/ml，蛋白酶溶液的溶剂为0.0064M无钙镁的磷酸盐缓冲盐溶液(pH＝7.4)。蜜蜂大脑组织的分解条件为37℃水浴，10-30min，冷却至室温，同时上下颠倒蜜蜂大脑组织混合物。
蜜蜂大脑组织混合物经过滤后，过滤时，采用40μm细胞筛过滤，收集大脑组织混合物滤液；
将大脑组织混合物滤液离心后，获得沉淀物，将沉淀物重悬后，重悬液为含质量百分数为10％FBS的DMEM培养基，进行离心，离心条件为：4℃，300RCF，离心10min，用重悬液重悬2-3次，并进行离心处理，每次加入重悬液的量为2ml，获得的沉淀用缓冲液重悬，缓冲液的加入量为50μl，获得蜜蜂大脑单细胞悬液；其中，重悬缓冲液为质量分数为0.04％BSA的PBS缓冲液。如图4所示，为蜜蜂大脑单细胞悬液的质检报告。
实施例2
本发明提供一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其方法包括以下步骤：
取意大利蜜蜂(Apis mellifera)，在显微镜下用剪刀和镊子分离头部，去除王浆腺体、白色覆膜后，将完整的大脑剥离，获得蜜蜂大脑组织，依次解剖2-3只蜜蜂大脑；取蜜蜂大脑组织分解前，先经PBS溶液清洗2-5次。
向清洗后的大约3mg蜜蜂大脑组织中，加入蛋白酶溶液，充分分解后，获得蜜蜂大脑组织混合物；其中，蛋白酶溶液中含liberse TM酶(Liberase TM Research Grade 10mg)和木瓜酶(Papain)，liberse TM酶的浓度为12U/ml，木瓜酶的浓度为3mg/ml，蛋白酶溶液的溶剂为0.0064M无钙镁的磷酸盐缓冲盐溶液(pH＝7.4)。蜜蜂大脑组织的分解条件为37℃水浴，10-30min，冷却至室温，同时上下颠倒蜜蜂大脑组织混合物。
蜜蜂大脑组织混合物经过滤后，过滤时，采用40μm细胞筛过滤，收集大脑组织混合物滤液；
将大脑组织混合物滤液离心后，获得沉淀物，将沉淀物重悬后，重悬液为含质量百分数为9％FBS的DMEM培养基，进行离心，离心条件为：4℃，300RCF，离心10min，用重悬液重悬2-3次，并进行离心处理，每次加入重悬液的量为2ml，获得的沉淀用缓冲液重悬，缓冲液的加入量为50μl，获得蜜蜂大脑单细胞悬液；其中，重悬缓冲液为质量分数为0.03％BSA的PBS缓冲液。
实施例3
本发明提供一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其方法包括以下步骤：
取意大利蜜蜂(Apis mellifera)，在显微镜下用剪刀和镊子分离头部，去除王浆腺体、白色覆膜后，将完整的大脑剥离，获得蜜蜂大脑组织，依次解剖2-3只蜜蜂大脑；取蜜蜂大脑组织分解前，先经PBS溶液清洗2-5次。
向清洗后的大约3mg蜜蜂大脑组织中，加入蛋白酶溶液，充分分解后，获得蜜蜂大脑组织混合物；其中，蛋白酶溶液中含liberse TM酶(Liberase TM Research Grade 10mg)和木瓜酶(Papain)，liberse TM酶的浓度为14U/ml，木瓜酶的浓度为5mg/ml，蛋白酶溶液的溶剂为0.0064M无钙镁的磷酸盐缓冲盐溶液(pH＝7.4)。蜜蜂大脑组织的分解条件为37℃水浴，10-30min，冷却至室温，同时上下颠倒蜜蜂大脑组织混合物。
蜜蜂大脑组织混合物经过滤后，过滤时，采用40μm细胞筛过滤，收集大脑组织混合物滤液；
将大脑组织混合物滤液离心后，获得沉淀物，将沉淀物重悬后，重悬液为含质量百分数为11％FBS的DMEM培养基，进行离心，离心条件为：4℃，300RCF，离心10min，用重悬液重悬2-3次，并进行离心处理，每次加入重悬液的量为2ml，获得的沉淀用缓冲液重悬，缓冲液的加入量为50μl，获得蜜蜂大脑单细胞悬液；其中，重悬缓冲液为质量分数为0.05％BSA的PBS缓冲液。
试验例1
取实施例1制备的蜜蜂大脑单细胞悬液10μl加入到10μl 0.4％的台盼蓝染料中，显微镜观察蜜蜂大脑单细胞，并计数，如图1所示。
试验例2
将实施例1获得的蜜蜂大脑单细胞悬液单细胞转录组测序(single-cell RNA-seq)，结果如图2和图3所示。
如图2所示，图2中A基于UMI数量的颜色热度的二维t-SNE降维聚类图，每个细胞的标记序列barcode的整体UMI序列计数，有更多UMI序列的细胞即有更多的mRNA，在图中距离相近的细胞表示有相似的基因表达谱，颜色越亮代表细胞中的mRNA表达数量越高。图2中B，基于无监督聚类算法计算的细胞分群结果图，不同颜色代表不同的群(Cluster)，每个群(Cluster)有相似的特征，图中距离相近的细胞表示有相似的基因表达谱，无监督聚类算法采用Graph-based方法。图2中C，每个群(Cluster)高表达特异性基因，采用Log2 foldchange(L2FC)倍数比较，P值是表达差异的显著性，使用负二项分布，并利用多重比较Benjamini-Hochberg法对P值进行校准。图2中D测序饱和度，曲线断点附近的斜率可以解释为得到的上限，有利于提高测序深度，虚线表示可能的测序饱和值。图2中E每个细胞的基因中位数，随着测序深度的增加，基因中位数也趋向饱和，每个细胞的平均reads达到40k时，该细胞的基因中位数大概在3000左右趋向饱和。
如图3所示，图3中A分别为总测序细胞数量10877，每细胞平均reads为41059，每细胞的基因中位数3161。图3中B为Barcode Rank Plot，表示捕获的细胞数量与UMI数量的曲线图，第一个拐点是细胞和背景，拐点明显，说明质量很好，第二个拐点是区分含有胶珠不含细胞的空油滴和游离胶珠oligo造成的少量背景，匹配到基因组的细胞占比为86.7％。图3中C分别表示总reads为446,598,275，有效的Barcodes比例为98.3％，有效的UMIs比例为100％，测序饱和度为51.3％，图3中D匹配到基因组的数据，reads匹配到基因组为96.8％，唯一比对到基因组上reads的比例为90.5％(比对到一个基因的exon区，同时又比对到了一处非exon区)，比对到唯一基因间区的reads的比例为12.5％，比对到唯一内含子区的reads的比例为17.2％，比对到唯一外显子区的reads的比例为60.9％，比对到唯一基因转录组上reads的比例为55.4％，比对到基因转录组的反义链区域的reads比例2.5％。图3中E为样本的各项信息，分别是样品名称：zhengchang，样本描述，化学试剂Single Cell 3'v3，参考基因组路径/public/analysis/lissa/prj/10X/prj_keli/Apis_mellifera/new1/10X_RNA，转录组类别10X_RNA-，Pipeline版本cellranger-4.0.0。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
向蜜蜂大脑组织中加入蛋白酶溶液，充分分解后，获得蜜蜂大脑组织混合物；
所述蜜蜂大脑组织混合物经过滤后，收集大脑组织混合物滤液；
将所述大脑组织混合物离心后，获得沉淀物，将所述沉淀物重悬后，离心，获得的沉淀用缓冲液重悬，获得蜜蜂大脑单细胞悬液；
其中，所述蛋白酶溶液中含liberse TM酶和木瓜酶。
2.如权利要求1所述的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，
所述蛋白酶溶液中，liberse TM酶的浓度为12-14U/ml。
3.如权利要求1所述的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，
所述蛋白酶溶液中，木瓜酶的浓度为3-5mg/ml。
4.如权利要求1所述的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，
所述重悬液为含质量百分数为9-11％％FBS的DMEM培养基。
5.如权利要求1所述的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，
所述过滤采用40μm细胞筛过滤。
6.如权利要求1所述的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，
所述大脑组织混合物离心条件为：4℃，300RCF，离心10min。
7.如权利要求1所述的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，
所述蜜蜂大脑组织的分解条件为37℃水浴，10-30min，冷却至室温，同时上下颠倒蜜蜂大脑组织混合物。
8.如权利要求1所述的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，
所述蜜蜂大脑组织分解前，先经PBS溶液清洗2-5次。
9.如权利要求1所述的用于单细胞测序的蜜蜂大脑单细胞悬液的制备方法，其特征在于，
所述缓冲液为质量分数为0.03-0.05％BSA的PBS溶液。
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2022
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