CN114555822A - 具有修饰核苷酸的单链dna的切割 - Google Patents

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Abstract

提供了一种方法，其包括例如，(a)将含有修饰核苷酸的ssDNA(例如，在其5’端附近具有修饰核苷酸的ssDNA)与能够在修饰核苷酸处切割ssDNA的DNA切割酶组合(例如，以生成具有3’OH的第一ssDNA片段和具有修饰核苷酸的第二ssDNA片段)；其中酶与DNA底物的比小于1:1摩尔比(m/m)；和(b)在修饰核苷酸处切割至少95％的ssDNA。在一些实施方式中，该方法可以包括(a)将(i)(例如，在其5’端附近)包括修饰核苷酸的ssDNA与(ii)能够在修饰核苷酸处切割ssDNA的DNA切割酶组合(例如，以(在切割之后)生成具有3’OH的第一ssDNA片段和包括修饰核苷酸的第二ssDNA片段)，其中酶与DNA底物的比小于1:1摩尔比，和在修饰核苷酸处切割至少95％的ssDNA。在一些实施方式中，本文提供的方法可以包括(a)(i)将(1)固定到基底上并且(2)包括修饰核苷酸的ssDNA与(ii)能够在修饰核苷酸处切割ssDNA的ssDNA切割酶组合(例如，以(在切割之后)生成具有3’OH的第一ssDNA片段和包括修饰核苷酸的第二ssDNA片段)；和(b)切割固定的ssDNA以从所述基底释放所述第二单链DNA片段。包括修饰核苷酸的至少95％(m/m)的ssDNA可以在少于60分钟内切割。

Description

具有修饰核苷酸的单链DNA的切割
背景技术
传统的亚磷酰胺化学在固体载体微阵列上从3’-5’方向合成DNA。寡核苷酸的释放通常通过化学切割，诸如例如35％NH4OH处理2小时(Kosuri等人，Nat Methods，11，499-507(2014)；Cleary等人，Nat Methods，1，241-248(2004)；Tian等人，Nature，432，1050-1054(2004))。
最近，酶促方法已被用于使用修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和修饰的核苷酸终止子合成长寡核苷酸。在该方法中，TdT通过在束缚(tethered)寡核苷酸的3’端并入特定的核苷酸终止子碱基，从固定引物沿5’-3’方向构建寡核苷酸。在核苷酸终止子封闭基团的洗涤和去保护之后，添加下一个核苷酸终止子。通过TdT并入、洗涤和去保护循环在固体载体上合成寡核苷酸。然而，这些方法必须有效地从固体载体上移出合成的寡核苷酸。目前的方法使用光活化从固体载体上释放寡核苷酸。需要改进的从固体载体释放寡核苷酸的方法来最大化产量和效率。
尽管通过寡核苷酸阵列可以在池中产生的寡核苷酸数量很大，但是它们的个体浓度非常低，并且需要额外的扩增步骤。直接在寡核苷酸阵列上进行PCR扩增可以扩增寡核苷酸，但是，效率可能低于溶液PCR(Kosuri等人，(2014)Nat Methods，11，499-507)。因此，从阵列中释放寡核苷酸可以改善文库的后续PCR扩增。
用于释放固定化DNA的现有酶方法通常对双链DNA(dsDNA)(例如EndoV、RNase H2和糖基化酶/裂合酶类)具有显著的优先。此外，据报道，对于一些酶系统，切割所需的酶浓度显著超过单链(ss)寡核苷酸浓度，这表明这些酶对于常规使用是不切实际的(参见例如Shiraishi等人，Nucleic Acids Res，43，2853-2863(2015))。在一些切割方案例如化学切割中，从固体载体切割单链DNA(ssDNA)是低效的(例如反应时间为10小时或更长)。
发明内容
提供的方法包括例如(a)将含有修饰核苷酸的ssDNA(例如，在其5’端附近具有修饰核苷酸的ssDNA)与能够在修饰核苷酸处切割ssDNA的DNA切割酶组合(例如，以生成具有3’OH的第一ssDNA片段和具有修饰核苷酸的第二ssDNA片段)；其中酶与DNA底物(substrate)的比小于1:1摩尔比(m/m)；和(b)在修饰核苷酸处切割至少95％的ssDNA。在一些实施方式中，方法可以包括(a)将(i)(例如，在其5’端附近)包括修饰核苷酸的ssDNA与(ii)能够在修饰核苷酸处切割ssDNA的DNA切割酶组合(例如，以(在切割之后)生成具有3’OH的第一ssDNA片段和包括修饰核苷酸的第二ssDNA片段)，其中酶与DNA底物的比小于1:1摩尔比，和在修饰核苷酸处切割至少95％的ssDNA。在一些实施方式中，本文提供的方法可以包括(a)将(i)(1)固定到基底(substrate)上并且(2)包括修饰核苷酸的ssDNA与(ii)能够在修饰核苷酸处切割ssDNA的ssDNA切割酶组合(例如，以(在切割之后)生成具有3’OH的第一ssDNA片段和包括修饰核苷酸的第二ssDNA片段)；和(b)切割固定的ssDNA以从基底释放第二单链DNA片段。包括修饰核苷酸的至少95％(m/m)的ssDNA可以在少于60分钟内切割。
在一些实施方式中，方法可以包括下述一项或多项：
(a)在少于60分钟内切割至少95％的ssDNA；
(b)包括修饰核苷酸的ssDNA进一步包括在ssDNA5’端附近的修饰核苷酸；
(c)ssDNA切割酶包括内切核酸酶，ssDNA被附接(例如，固定)到固体基底(例如，在ssDNA的5’端处，和/或修饰核苷酸在5’端(例如，结合的5’端)附近)，并且切割进一步包括从基底释放包括修饰核苷酸和修饰核苷酸3’的核苷酸的ssDNA片段；
(d)在步骤(a)之前通过逆转录RNA生成ssDNA；
(e)在其5’端附近含有修饰核苷酸的ssDNA进一步包括在3’端的标记，其中标记是例如荧光标签；
(f)ssDNA在其5’端附近含有修饰核苷酸并且5’端被固定在固体载体上；
(g)固体载体是珠；
(h)固体载体是具有(例如，包括)孔的塑料板；
(i)固体载体是ssDNA在其上形成阵列的二维表面；
(j)ssDNA切割酶包括嗜热性内切核酸酶，例如，优先切割ssDNA的古细菌内切核酸酶，例如EndoQ或AGOG；
(k)ssDNA切割酶包括融合蛋白，其中例如内切核酸酶与SNAP-标签融合，该标签又可与固体基底结合；
(l)修饰核苷酸是8-氧鸟嘌呤(8oxoG)或脱氧尿苷(dU)或脱氧肌苷(dI)或脱氧黄苷(deoxyxanthosine)(dX)或四氢呋喃(THF)位点；
(m)单链寡核苷酸是ssDNA合成产物并且任选地含有随机生成的核苷酸的条形码；
(n)单链DNA是或包括适配体；
(o)单链合成是化学的或酶促的。
提供组合物，其包括切割ssDNA的古细菌内切核酸酶或糖基化酶和包括修饰核苷酸的合成DNA底物的人工混合物。组合物可以具有以下一项或多项：
(a)固定在固体基底上的合成DNA底物；
(b)固体基底选自珠、多孔盘中的孔和2-维阵列表面；
(c)修饰核苷酸选自THF位点、dU、dI、8-oxoG和dX；和
(d)内切核酸酶是可以包括SNAP-标签的融合蛋白。
附图说明
图1显示了使用具有ssDNA>dsDNA活性的内切核酸酶从固相载体释放修饰的合成ssDNA寡核苷酸的工作流程。如图所示，一种用于DNA合成的方法，其包括(1)将ssDNA的一端(例如，5’端，标记为“0”)附接到固体载体上，该ssDNA在其3’端或附近包含修饰碱基(“X”)(例如，dI、dU、8-oxo-dG、dX、THFP)，(2)从其自由端合成地延伸ssDNA以形成延伸寡核苷酸(例如使用TdT或化学延伸(参见例如Perkel，(2019)Nature 566，565))，(3a)使延伸的ssDNA与具有ssDNA切割活性的内切核酸酶接触(3b)以在修饰碱基附近的位置切割延伸的ssDNA，形成包括修饰碱基和延伸寡核苷酸的游离切割产物以及仍然束缚在载体上的结合的寡核苷酸片段，以及(4)从固体载体上洗脱切割产物。
图2显示了用修饰的ssDNA寡核苷酸和具有ssDNA>dsDNA切割活性的内切核酸酶捕获和富集核酸的工作流程。如图所示，固定的修饰的ssDNA寡核苷酸的释放是使用优先ssDNA切割活性的内切核酸酶实现的。切割的寡核苷酸可用于基因组装方法、下一代测序(例如，Illumina、PacBio、Oxford Nanopore)、PCR引物或其他技术。固体载体可以选自或包括珠、板和/或材料。可以使用诸如链霉亲和素：生物素结合、SNAP-标签、CLIP-标签、点击化学等技术来实现将捕获寡核苷酸与固体载体偶联。捕获珠可以包括互补捕获序列，其可以是或包括例如聚脱氧胸苷酸(poly(dT))、聚腺苷酸(poly(A))、mRNA、对预期的靶DNA或RNA种类特异性的定制序列，和/或富集某些DNA或RNA种类(例如，外显子)的序列文库。
图3A-3D显示热球菌属某种(Thermococcus sp)9°N(9°N)EndoQ和Thermococcuskodakarensis(Tko)EndoQ均显示优先切割含有dU的ssDNA。
图3A显示了用于测量含有dU的DNA的9°N EndoQ切割活性的实验设计。
图3B显示9°N EndoQ ssDNA-dU比dsDNA-dU切割基本上更大且更快。ssDNA的切割在反应开始后2分钟基本完成，而甚至在10分钟后，dsDNA也没有完全切割。对ssDNA-dU(空心圆圈)和dsDNA-dU(实心圆圈)切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))。ssDNA-dU的切割速率为5.7min-1，和dsDNA-dU的切割速率为0.16min-1。9°N EndoQ的ssDNA-dU：dsDNA-dU活性比为35。
图3C显示了用于测量包含dU的DNA的Tko EndoQ切割活性的实验设计。
图3D显示Tko EndoQ ssDNA-dU比dsDNA-dU切割基本上更大且更快。对ssDNA-dU(空心圆圈)和dsDNA-dU(实心圆圈)切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))。ssDNA-dU的切割速率为0.3min-1，和dsDNA-dU的切割速率为0.03min-1。Tko EndoQ的ssDNA-dU：dsDNA-dU活性比为10。
图4A-4D显示9°N EndoQ和TKO EndoQ均显示优先切割包括dI的ssDNA。
图4A显示了用于测量包含idI的DNA的9°N EndoQ切割活性的实验设计。
图4B显示9°N EndoQ ssDNA-dI比dsDNA-dI切割基本上更大且更快。对ssDNA-dI(空心圆圈)和dsDNA-dI(实心圆圈)切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))。ssDNA-dI的切割速率为1.0min-1，和dsDNA-dI的切割速率为0.2min-1。9°N EndoQ的ssDNA-dI：dsDNA-dI活性比为5。
图4C显示了用于测量包含dI的DNA的Tko EndoQ切割活性的实验设计。
图4D显示Tko EndoQ ssDNAd-I比dsDNA-dI切割基本上更大且更快。对ssDNA-dI(空心圆圈)和dsDNA-dI(实心圆圈)的切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))。ssDNA-dI的切割速率为0.45min-1，和dsDNA-dI的切割速率为0.013min-1。Tko EndoQ的ssDNA-dI：dsDNA-dI活性比为35。
图5A-5B显示AGOG显示优先切割包括8-oxoG的ssDNA。
图5A显示了用于确定DNA底物的AGOG切割活性的实验设计。
图5B显示AGOG以比dsDNA-8oxoG切割活性高3.5倍的活性切割ssDNA-8oxoG。
对ssDNA-8oxoG(空心圆圈)和dsDNA-8oxoG(实心圆圈)的切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))。ssDNA-8oxoG的切割速率为4.3min-1，和dsDNA-8oxoG的切割速率为1.2min-1。
图6A-6C显示dDNA的RNase H2切割活性(在不到1秒内完成)比ssDNA底物的切割(约2小时内完成)更快。这与图3A-5B中的结果形成对比，其显示ssDNA切割超过dsDNA切割。
图6A显示了用于确定DNA底物的RNaseH2切割活性的实验设计。
图6B-6C显示了(B)dsDNA-rG(实心圆圈)和(C)ssDNA-rG(空心圆圈)在不同温育时间的级分。对切割产物的量计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))。ssDNA-rG的切割速率为0.03min-1，和dsDNA-rG的切割速率为3,500min-1。9°N RNaseH2的ssDNA-rG：dsDNA-rG活性比为8.5×10-6。
图7A-7E显示9°N EndoQ和Tko EndoQ在从磁珠切割具有修饰的dU或dI的ssDNA方面同样有效。
图7A显示了用于确定自珠的含有dU修饰的DNA底物的EndoQ切割活性的实验设计。
图7B显示了9°N EndoQ对ssDNA-dU的切割效率如何随酶的浓度而变化。
图7C显示通过9N Endo Q(实心圆圈)或Tko EndoQ(实心正方形)从磁珠切割ssDNA-dU。“无酶”对照(空心圆圈)。
图7D显示了用于确定自珠的含有dI修饰的DNA底物的EndoQ切割活性的实验设计。
图7E显示了9N Endo Q从磁珠切割ssDNA-dI(实心圆圈)。“无酶”对照(空心圆圈)。
图8A-8D显示了2种不同的EndoQ可以有效地从多孔板切割含有两种不同的修饰核苷酸的DNA底物。
图8A显示了用于确定自板表面的ssDNA-dU DNA底物的EndoQ切割活性的实验设计。
图8B显示了由9°N和Tko EndoQ从板切割ssDNA-dU。(A)随着时间的推移由9°NEndo Q(实心圆圈)、Tko EndoQ(空心圆圈)或“无酶对照”(空心正方形)从板切割ssDNA-dU。
图8C显示了用于确定自板表面的ssDNA-dI DNA底物的EndoQ切割活性的实验设计。
图8D显示了由9°N和Tko EndoQ从板切割ssDNA-dI。(A)随着时间的推移由9°NEndo Q(实心圆圈)、Tko EndoQ(空心圆圈)或无酶对照(空心正方形)从板切割ssDNA-dI。
图9A-9B显示使用ssDNA-dU-3’-FAM底物和9°N EndoQ，使用小于或等于1：1摩尔比的EndoQ：固定ssDNA-dU切割至少90％的固定ssDNA-dU。
图9A显示30nM 9°N EndoQ如何导致ssDNA基本上100％切割。
图9B显示了9°N EndoQ与固定的ssDNA-dU的摩尔比。
具体实施方式
根据实施方式、章节标题、附图、描述和实施例可以进一步理解本公开内容的各方面，其中任何一个都不应被解释为以任何方式限制本公开内容的整个范围。因此，以下提出的权利要求应根据本公开内容的全部广度和精神来解释。
本文描述和图解的各个实施方式中的每一个都具有分立的组件和特征，它们可以容易地与其他几个实施方式中的任何一个的特征分离或组合，而不背离本教导的范围或精神。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或任何其他逻辑上可能的顺序来执行。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。此外，为了清楚和便于参考，本文针对本公开内容的实施方式定义了某些术语。
普遍理解的术语和符号的来源可能包括：标准论文和文本，比如Kornberg andBaker,DNA Replication,第二版(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry,第二版(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan and Read,HumanMolecular Genetics,第二版(Wiley-Liss,New York,1999)；Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach(Oxford University Press,NewYork,1991)；Gait,editor,Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach(IRLPress,Oxford,1984)；Singleton,et al.,Dictionary of Microbiology and Molecularbiology,2d ed.,John Wiley and Sons,New York(1994)；和Hale&Markham,the HarperCollins Dictionary of Biology,Harper Perennial,N.Y.(1991)等。
如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”和“一(an)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“蛋白质”是指一种或多种蛋白质，即单一蛋白质和多种蛋白质。还应注意，可以将权利要求撰写为排除任何任选的要素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素或使用“否定”限制时使用“仅仅”、“仅”等这类排他性术语的引用基础。
数字范围包括定义范围的数字。所有数字应理解为包含高于和低于该整数的整数的中点，即，数字2包含1.5-2.5。数字2.5包括2.45-2.55等。当提供样本数值时，每个单独可以代表一个值范围内的中间值，并且可以一起代表一个范围的极值，除非另有说明。
在本公开内容的上下文中，“非天然存在的”是指在自然界中不存在的多核苷酸、多肽、碳水化合物、脂质或组合物。这种多核苷酸、多肽、碳水化合物、脂质或组合物可以在一个或多个方面不同于天然存在的多核苷酸多肽、碳水化合物、脂质或组合物。例如，聚合物(例如，多核苷酸、多肽或碳水化合物)可能在组分构建块(例如，核苷酸序列、氨基酸序列或糖分子)的种类和排列方面不同。就其所连接的分子(一个或多个)而言，聚合物可能不同于天然存在的聚合物。例如，“非天然存在的”蛋白质可以通过具有连接到多肽(例如，融合蛋白)、脂质、碳水化合物或任何其他分子的化学键(例如，包括肽键、磷酸键、二硫键、酯键和醚键等的共价键)在其二级、三级或四级结构上不同于天然存在的蛋白质。类似地，“非天然存在的”多核苷酸或核酸可以在核酸的5’-端、3’-端和/或5’-端和3’-端之间包含一个或多个其他修饰(例如，添加的标记或其他部分)(例如甲基化)。“非天然存在的”组合物可能在以下一个或多个方面不同于天然存在的组合物：(a)具有在自然界中未结合的组分，(b)具有在自然界中未发现的浓度的组分，(c)省略在天然存在的组合物中以其他方式发现的一种或多种组分，(d)具有自然界中未发现的形式，例如干燥的、冷冻干燥的、结晶的、水性的，和(e)具有除了自然界中发现的那些之外的一种或多种额外的组分(例如，缓冲剂、去污剂、染料、溶剂或防腐剂)。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每篇单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地表明通过引用并入的程度相同。
为在靶位点处切割ssDNA的问题提供了解决方案，其中切割后释放的切割部分或片段在5’切割端处保留了末端修饰的核苷酸。如图1中所图解的，在一些实施方式中，方法可以包括将ssDNA附接至固体载体上，该ssDNA在5’到3’方向上包括5’端、修饰核苷酸(“X”)和3’端。在一些实施方式中，ssDNA可以在5’端包括能够结合固体载体的结合部分，例如链霉亲和素、生物素、SNAP-标签、CLIP-标签和/或苄基-G。图1显示(1)将ssDNA(·—X-3’)附接到固体载体上，(2)从3’端延伸ssDNA(灰线)，(3a)使ssDNA与ssDNA切割酶(例如，内切核酸酶)接触(3b)以形成保持与固体载体结合的ssDNA片段并释放包括修饰核苷酸的ssDNA片段，并洗脱释放的ssDNA片段。这可以以阵列形式进行，并且洗脱的ssDNA片段可以用于任何所需的应用。例如，洗脱的ssDNA片段可用于基因合成的寡核苷酸。在本公开内容的上下文中，“修饰核苷酸”是指任何非常规核苷、核苷酸或其相应的磷酸化形式。修饰核苷酸可以包括一种或多种骨架或碱基修饰。修饰核苷酸的实例包括dI、dU、8-oxo-dG、dX和THF。修饰核苷酸的额外的实例包括美国专利公开号US20170056528A1、US20160038612A1、US2015/0167017A1和US20200040026A1中公开的修饰核苷酸。修饰核苷酸可以包括天然或非天然存在的核苷酸。
在一些实施方式中，ssDNA可以在5’至3’方向包括5’端、修饰核苷酸(“X”)、条形码或引发(priming)位点(例如，下一代测序(NGS)条形码或NGS引发位点)、互补捕获序列和3’端(图2，步骤1)。5’端可以包含基底结合部分(例如，生物素或苄基胍)。捕获珠可以包括捕获序列，其可以是或包括例如聚脱氧胸苷酸、聚腺苷酸、mRNA、对预期的靶DNA或RNA种类特异性的定制序列和/或富集某些DNA或RNA种类(例如，外显子)的序列文库。ssDNA可以与珠(图2，步骤2)、板(例如，包含多个孔的板的孔)或其他材料(例如，宏观结构和/或不溶性材料)偶联以形成捕获珠。捕获珠可用作诱饵以吸引与捕获序列互补或大体互补的多核苷酸。单链诱饵支持结合序列与包括或可能包含互补序列的一种或多种互补核酸杂交(图2，步骤3)。如图2中所图解(步骤4)，一旦杂交，结合的ssDNA序列可以以模板依赖性方式(例如，使用DNA聚合酶或逆转录酶)延伸以产生延伸产物，其在5’至3’方向包括结合的5’端、修饰核苷酸、条形码和/或引发位点、互补的捕获序列、与捕获的核酸互补的序列和3’端。在一些实施方式中，捕获的互补核酸可以包括一种或多种修饰核苷酸(例如，以促进在步骤6(下文)期间除去捕获的互补核酸)。在一些实施方式中，互补核酸可以与延伸产物分离(例如，通过热或化学变性)。根据一些实施方式的方法的一个优点是延伸产物的新生部分附接至载体(例如，珠)，允许任选的洗涤和其他操作(图2，步骤5)。当需要时，延伸产物的新生部分可以从载体上释放。例如，延伸产物可以与在修饰核苷酸处或附近切割的ssDNA切割酶(内切核酸酶)接触以形成(a)保持与载体(例如，珠)结合的ssDNA片段，该载体包括例如，原始ssDNA的5’端，和(b)释放的未结合的ssDNA片段。未结合的ssDNA片段可以包括修饰核苷酸、条形码或引发位点、捕获序列、延伸序列(即与(以前)捕获的互补核酸互补)和3’端(图2，步骤6)。未结合的ssDNA片段(包括与捕获的分子互补的序列)可以用例如洗涤缓冲液从珠上洗脱下来(图2，步骤6)。可以通过下一代测序(例如，Illumina、PacBio、Oxford Nanopore)分析未结合的ssDNA片段(图2，步骤7a)。如图所示，未结合的ssDNA可以与3’衔接子(adapter)结合(例如，通过连接、TdT或聚腺苷酸聚合酶)，然后进行第二链合成和PCR扩增。在一些实施方式中，未结合的ssDNA片段可以通过定量PCR(qPCR)或DROPLET DIGITALTMPCR(ddPCRTM)(图2，步骤7b)或常规PCR(图2，步骤7c)用例如靶特异性引物(例如，p53致癌基因引物)进行分析。在一些实施方式中，未结合的ssDNA可以通过使用靶特异性引物(例如，p53癌基因引物)的Sanger测序(例如，用于突变检测)进行分析(图2，步骤7d)。
以这种方式实现切割的益处是固定的ssDNA可以从固体表面释放，同时保留标签以供进一步操作。本文中描述的方法的实施方式的另一个益处是酶与底物的比率小于1:1。本文中描述的方法的实施方式的另一个益处是ssDNA显著优先于dsDNA被切割，这在测序方案中是有用的特征。本文中描述的方法的实施方式的另一个益处是切割反应仅需要单一酶。
本文中描述的方法的实施方式的另一个益处是在不再包括修饰核苷酸的ssDNA切割产物的切割端上存在3’OH。该方法的实施方式能够更有效地从固体载体切割修饰的ssDNA，用于寡核苷酸合成、基因组装以及核酸捕获和富集。
切割修饰的ssDNA的方法的实施方式(其中例如将DNA固定在固体载体上)包括：从珠中切割捕获和延伸的ssDNA/RNA；从单个单元格(cell)的珠中切割捕获和延伸的ssDNA/RNA；从固体载体阵列切割化学合成的寡核苷酸；从固体载体阵列切割酶促合成的寡核苷酸；从固体载体切割带条形码的寡核苷酸；从固体载体切割ssDNA：蛋白质；和/或从固体载体切割适配体池。
ssDNA切割酶优选ssDNA而不是dsDNA的实例(其反应时间优选小于10小时，并且优选地在酶与底物的摩尔比小于1:1时有效)包括：EndoQ，例如，热稳定的EndoQ比如9°NEndoQ、Tko Endo Q；8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(AGOG)、Argonaute(参见例如作为该家族的说明性成员的序列(SEQ ID NO：1-3))。在一些实施方式中，例如在AGOG是ssDNA切割酶的情况下，修饰核苷酸可以在切割反应中被消耗，使得所生成的ssDNA片段都不包含存在于底物ssDNA中的修饰核苷酸。
这些酶可以是冻干、纯化和/或固定的试剂。为了便于纯化或处理，这些酶可以与亲和性结合蛋白融合。试剂酶可以在储存缓冲液中或在加入至单链寡核苷酸之前、期间或之后在反应缓冲液中。
修饰核苷酸的实例包括脱氧尿苷、脱氧肌苷、8-氧鸟嘌呤、无嘌呤位点、四氢呋喃位点、NMP、无嘧啶NMP、rNMP和脱氧黄苷或胸腺嘧啶二醇。其他实例可以包括苄基鸟嘌呤及其修饰，其中修饰可以包括用于检测或移动的标记。
用于连接ssDNA的固体基底的实例包括例如珠、阵列、板或纸、微流体装置、管和/或柱。
ssDNA的分子生物学用途以可能利用dsDNA补体的方式不断增加。例如，ssDNA可用于与核酸(RNA、dsDNA、cDNA)杂交；固定的ssDNA可以与靶核酸杂交并延伸以将序列与固体载体偶联，而不是仅依靠杂交来捕获。ssDNA也可用于合成和其他不需要单链补体的应用。
实例使用寡核苷酸合成、基因组装和核酸捕获和富集、下一代测序(NGS)或Sanger测序或通过诸如定量聚合酶链式反应(qPCR)或双脱氧PCR(ddPCR)的其他方法。切割的寡核苷酸可用于基因组装方法(Klein等人，Nucleic Acids Res，44，e43(2016))、PCR引物或其他技术。
可以提供用于上述各种情况的试剂盒。例如，用于在珠上捕获聚腺苷酸mRNA用于逆转录或用于核酸捕获和释放作为测序工作流程的一部分或全部的试剂盒可以包括ssDNA切割内切核酸酶(用于dU或dI的EndoQ，用于8-oxoG的AGOG)和一种或多种下述组分：链霉亲和素珠、捕获寡核苷酸[生物素-引物(dU或dI或8oxoG或dX)-poly(T)]、逆转录酶、dNTP；
Figure BDA0003597849840000081
Ultra II文库制备试剂盒(New England Biolabs，Ipswich，MA)。
试剂盒中的试剂可以作为单独的组分储存在不同的管中，或者可以形成对用户和使用最方便的混合物。说明书也包括在试剂盒中。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每篇单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入的程度相同。
实施例
实施例1：9°N EndoQ具有ss≥dsDNA-dU切割活性
在ssDNA或dsDNA模板中测定9°N EndoQ切割尿嘧啶的效率(在图3A中示意性地描绘)。在65℃下将1X
Figure BDA0003597849840000082
缓冲液(New England Biolabs，Ipswich，MA)(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，pH 7.9@25℃，10mM乙酸镁，100μg/ml BSA)中含有dU(ssDNA-dU：生物素-TGGAGATTTTGATCACGGTAACCdUATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAG GAGG-FAM)的FAM标记的ssDNA底物(10nM)与9°N EndoQ(最终浓度为1nM)一起温育。在0、0.25、0.5、1、2、5、10和20分钟时移出反应等分试样(10μl)，并与10μl 50mM EDTA混合以使反应中止。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图3B)。ssDNA-dU的切割速率(m3)为5.7min-1(表1)。
类似地，测定了9°N EndoQ对dsDNA-dU的切割速率。使用标准退火方案在1XCutSmart缓冲液中将含有dU(ssDNA-dU：生物素-TGGAGATTTTGATCACGGTAACCdUATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-FAM)的FAM标记的ssDNA底物(10nM)退火至未标记的互补模板寡核苷酸(12nM)(CCTCCTGGGTGAATTCGGGCTTGTTGTCATTCTGATAGGTTACCGTGATCAAAATCTCCA)来制备底物dsDNA-dU。切割反应物(100μl)是在65℃下的1X CutSmart缓冲液中的10nMdsDNA-U与10nM 9°N EndoQ。在0、0.25、0.5、1、2、5、10和20分钟时移出反应等分试样(10μl)，并与10μl 50mM EDTA混合以使反应中止。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图3B)。dsDNA-dU的切割速率(m3)为0.16min-1(表1)。
实施例2：Tko EndoQ具有ss≥dsDNA-dU切割活性
在ssDNA或dsDNA模板中测定Tko EndoQ切割dU的效率(在图3C中示意性地描绘)。在65℃下将1X CutSmart缓冲液(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，pH 7.9@25℃，10mM乙酸镁，100μg/ml BSA)中含有dU(ssDNA-dU：生物素-TGGAGATTTTGATCACGGTAACCdUATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-FAM)的FAM标记的ssDNA底物(10nM)与Tko EndoQ(最终浓度为1nM)一起温育。在0、0.25、0.5、1、2、5、10和20分钟时移出反应等分试样(10μl)，并与10μl50mM EDTA混合以使反应中止。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图3C)。ssDNA-dU的切割速率(m3)为0.3min-1(表1)。
类似地，测定了Tko EndoQ对dsDNA-dU的切割速率。使用标准退火方案在1XCutSmart缓冲液中将含有dU(ssDNA-dU：生物素-TGGAGATTTTGATCACGGTAACCdUATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-FAM)的FAM标记的ssDNA底物(10nM)退火至未标记的互补模板寡核苷酸(12nM)(CCTCCTGGGTGAATTCGGGCTTGTTGTCATTCTGATAGGTTACCGTGATCAAAATCTCCA)来制备底物dsDNA-dU。切割反应物(100μl)是在65℃下的1X CutSmart缓冲液中的10nMdsDNA-U与10nM Tko EndoQ。在0、0.25、0.5、1、2、5、10和20分钟时移出反应等分试样(10μl)，并与10μl 50mM EDTA混合以使反应中止。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图3D)。dsDNA-dU的切割速率(m3)为0.03min-1(表1)(参见图3D)。
实施例3：9°N EndoQ具有ss≥dsDNA-dI活性
在ssDNA或dsDNA模板中测定9°N EndoQ切割肌苷的效率(在图4A中示意性地描绘)。在65℃下将1X CutSmart缓冲液(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，pH 7.9@25℃，10mM乙酸镁，100μg/ml BSA)中含有dI(ssDNA-dI：生物素-TGGAGATTTTGATCACGGTAACCdIATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-FAM)的FAM标记的ssDNA底物(10nM)与9°N EndoQ(最终浓度为1nM)一起温育。在0、0.25、0.5、1、2、5、10和20分钟时移出反应等分试样(10μl)，并与10μl 50mM EDTA混合以使反应中止。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图4B)。ssDNA-dI的切割速率(m3)为1.0min-1(表1)。
类似地，测定了9°N EndoQ对dsDNA-dI的切割速率。使用标准退火方案在1XCutSmart缓冲液中将含有dI(ssDNA-dI：生物素-TGGAGATTTTGATCACGGTAACCdIATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-FAM)的FAM标记的ssDNA底物(10nM)退火至未标记的互补模板寡核苷酸(12nM)(CCTCCTGGGTGAATTCGGGCTTGTTGTCATTCTGATTGGTTACCGTGATCAAAATCTCCA)来制备底物dsDNA-dI。切割反应物(100μl)是在65℃下的1X CutSmart缓冲液中的10nMdsDNA-dI与10nM 9°N EndoQ。在0、0.25、0.5、1、2、5、10和20分钟时移出反应等分试样(10μl)，并与10μl 50mM EDTA混合以使反应中止。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图4B)。dsDNAd-I切割速率(m3)为0.2min-1(表1)(参见图4B)。
实施例4：Tko EndoQ具有ss≥dsDNA-dI活性
在ssDNA或dsDNA模板中测定Tko EndoQ切割肌苷的效率(在图4C中示意性描绘)。在65℃下将1X CutSmart缓冲液(50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，pH 7.9@25℃，10mM乙酸镁，100μg/ml BSA)中含有idI(ssDNA-dI：生物素-TGGAGATTTTGATCACGGTAACCdIATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-FAM)的FAM标记的ssDNA底物(10nM)与Tko EndoQ(最终浓度为1nM)一起温育。在0、0.25、0.5、1、2、5、10和20分钟时移出反应等分试样(10μl)，并与10μl 50mM EDTA混合以使反应中止。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图4D)。ssDNA-dI的切割速率(m3)为0.45min-1(表1)。
类似地，测定了Tko EndoQ对dsDNA-dI的切割速率。使用标准退火方案在1XCutSmart缓冲液中将含有dI(ssDNA-dI：生物素-TGGAGATTTTGATCACGGTAACCdIATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-FAM)的FAM标记的ssDNA底物(10nM)退火至未标记的互补模板寡核苷酸(12nM)(CCTCCTGGGTGAATTCGGGCTTGTTGTCATTCTGATTGGTTACCGTGATCAAAATCTCCA)来制备底物dsDNA-dI。切割反应物(100μl)为在65℃下的1X CutSmart缓冲液中的10nMdsDNA-dI与10nM Tko EndoQ。在0、0.25、0.5、1、2、5、10和20分钟时移出反应等分试样(10μl)，并与10μl 50mM EDTA混合以使反应中止。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图4D)。dsDNA-dI的切割速率(m3)为0.013min-1(表1)(参见图4D)。
实施例5：AGOG具有ss≥dsDNA-8oxoG活性
在ssDNA或dsDNA模板中测定AGOG切割8-oxoG的效率(在图5A中示意性地描绘)。SsDNA-8oxoG底物是(FAM-TGGAGATTTTGATCACGGTAACC(8oxoG)ATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-ROX)。通过在85℃下在1x退火缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5和100mMNaCl)中将1uM含有60-nt标记损伤的寡核苷酸(FAM-TGGAGATTTTGATCACGGTAACC(8oxoG)ATCAGAATGACAACAAGCCCGAATTCACCCAGGAGG-ROX)退火至1.25uM 60-nt互补的寡核苷酸(CCTCCTGGGTGAATTCGGGCTTGTTGTCATTCTGATCGGTTACCGTGATCAAAATCTCCA)，持续5分钟，并允许缓慢冷却至室温，来制备含有dsDNA-8oxoG底物。
为了测定AGOG对ssDNA-8oxoG或dsDNA-8oxoG的糖基化酶和裂合酶活性的速率，使用超过底物的AGOG进行单周转动力学测定。对于每个时间点，在含有20nM底物ssDNA-8oxoG或dsDNA-8oxoG的1x
Figure BDA0003597849840000112
缓冲液(New England Biolabs，Ipswich，MA)中制备了10μL反应物。为了开始反应，加入100nM AGOG(最终浓度)。对照实验表明，底物被5倍过量的AGOG饱和。在测量反应碱去除步骤时，在适当的时间点用等体积的0.1N NaOH、0.25％SDS使反应停止，并且然后用等体积的1M Tris-HCl pH 7.5中和。为了测量总反应的速率，用等体积的80％甲酰胺、50mM EDTA终止反应。在所有情况下，如上所述使用毛细管电泳对反应物进行净化和分析。将产物浓度绘制为时间函数并拟合单指数方程((y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x)))以使用KaleidaGraph(Synergy Software，Reading，PA)获得观察到的底物切割速率(kobs)。AGOG对ssDNA-8oxoG的切割速率为4.3min-1，和对ssDNA-8oxoG的切割速率为1.2min-1(参见图5B)。
实施例6：9°N RNaseH2具有ss<dsDNA活性
如Heider等人，J Biol Chem，292，8835-8845(2017)中所述，在ssDNA或dsDNA模板中测定9°N RNaseH2切割rG的效率(在图6A中示意性描绘)。通过毛细管电泳分离和分析反应产物。对切割产物的级分计算、绘制并拟合指数上升方程(y＝m1+m2*(1-exp(-m3*x))(图6B和6C)。ssDNA-rG的切割速率(m3)为0.03min-1(表1)。
类似地，测定了9°N RNaseH2对dsDNA-rG的切割速率(Heider等人，J Biol Chem，292，8835-8845(2017))。dsDNA-I的切割速率(m3)为3,500min-1(表1和图6B和6C)。9°NRNaseH2的ssDNA-rG：dsDNA-rG活性比为8.5×10-6，并且因此9°N RNaseH2具有ss<dsDNA-rG活性(参见图6B和6C)。
表1：各种嗜热性内切核酸酶对修饰的ssDNA和dsDNA底物的活性比的总结。
Figure BDA0003597849840000111
Figure BDA0003597849840000121
实施例7：用EndoQ切割ssDNA-dU-珠
将生物素-ssDNA-dU-3’-FAM(1μM)附接至链霉亲和素磁珠。在用洗涤缓冲液(0.5NaCl，20mM TrisHCl，pH 7.5)洗涤未结合的ssDNA后，将10nM 9°N EndoQ或Tko EndoQ加入100μl 1X CutSmart缓冲液中并在dU处切割以从磁珠中释放FAM标记的产物(在图7A中示意性地描绘)。通过Molecular Devices酶标仪(Molecular Devices，San Jose，CA)测量释放的FAM荧光(图7B)。图7A-7E定量随时间推移由9°N EndoQ的滴定(图7A)或9°N或TkoEndoQ(图7B)切割的ssDNA-dU-3’-FAM。未加入酶作为阴性对照(参见图7A-C)。
实施例8：用9°N EndoQ切割ssDNA-dI-珠
将生物素-ssDNA-dI-3’-FAM(1μM)附接至链霉亲和素磁珠。在用洗涤缓冲液(0.5NaCl，20mM TrisHCl，pH 7.5)洗涤未结合的ssDNA后，将10nM 9°N EndoQ加入100μl1XCutSmart缓冲液中，并在尿嘧啶处切割以从磁珠中释放FAM标记的产物(在图7D中示意性地描绘)。通过Molecular Devices酶标仪测量释放的FAM荧光。图7D-7E定量随时间的推移由9°N EndoQ切割的ssDNA-dI-3’-FAM或无酶对照。
实施例9：用9°N EndoQ切割ssDNA-dU-珠
将生物素-ssDNA-dU-3’-FAM(1μM)附接至链霉亲和素磁珠并用洗涤缓冲液(0.5NaCl、20mM TrisHCl、pH 7.5)洗涤(5次)以除去未结合的ssDNA。将50μl反应物与200nMssDNA-dU-珠、1X CutSmart缓冲液和不同量(100nM至3.16nM)的9°N EndoQ在65℃下温育20分钟。EndoQ与ssDNA-dU的比为1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和1:128。EndoQ在尿嘧啶处切割以从磁珠中释放FAM标记的产物(在图7A中示意性地描绘)。通过Molecular Devices酶标仪测量总的和释放的FAM荧光。通过公式：％P＝100*(释放的FAM-ssDNA-dU/FAM-ssDNA-dU+FAM-ssDNA-dU-珠)计算％产物。图7B-7C对9°N EndoQ切割的ssDNA-dU-3’-FAM进行定量。使用小于或等于1:1的EndoQ：固定ssDNA-dU比切割至少90％的固定ssDNA-U(参见图9A-9B)。
实施例10：用EndoQ切割ssDNA-dU-板
通过将0.5μM生物素-ssDNA-dU-3’-FAM在100μl洗涤缓冲液(0.5NaCl，20mMTrisHCl，pH 7.5)中在25℃下温育30分钟，将生物素-ssDNA-dU-3’-FAM附接至链霉亲和素包被的聚苯乙烯板(Thermo Nunc Immobilizer Streptavidin C8)。将未结合的ssDNA用洗涤缓冲液(0.5NaCl，20mM TrisHCl，pH 7.5)洗掉。将9°N EndoQ或Tko EndoQ(10nM)加入1XCutSmart Buffer中以在dU处切割，以从板中释放FAM标记的产物(在8A-8D中示意性地描绘)。通过Molecular Devices酶标仪测量释放的FAM荧光(图8B)。
实施例11：用EndoQ切割ssDNA-dI-板
通过将0.5μM生物素-ssDNA-dI-3’-FAM在100μl洗涤缓冲液(0.5NaCl，20mMTrisHCl，pH 7.5)中在25℃下温育30分钟，将生物素-ssDNA-dI-3’-FAM附接至链霉亲和素包被的聚苯乙烯板(Thermo Nunc Immobilizer Streptavidin C8)。将未结合的ssDNA用洗涤缓冲液(0.5NaCl，20mM TrisHCl，pH 7.5)洗掉。将9°N EndoQ或Tko EndoQ(10nM)加入1XCutSmart Buffer中以在dI处切割，以从板中释放FAM标记的产物(在图8C中示意性描绘)。通过Molecular Devices酶标仪测量释放的FAM荧光，并将结果显示在图8D中。
Tko EndoQ：
MIVDADLHIHSRYSKAVSKAMTIPNLAENARFKGLEMVGTGDILNPNWEKELLKYTKKVDEGTYERNGIRFLLTTEVEDTRRVHHVLIFPNIETVREMRERLKPYSSDIESEGRPHLTLSAAEIADIANELDVLIGPAHAFTPWTSLYKEYDSLKEAYNGAKIHFLELGLSADSEMADMIKAHHKLTYLSNSDAHSPMPHRLGREFNRFEVNEATFEEIRKAILKRGRKIVLNAGLDPRLGKYHLTACSRCYTKYSLEEAKAFRWKCPKCGGRIKKGVRDRILELADTTERPKDRPPYLHLAPLAEIIAMVLGKGVETKAVRLVWERFLREFGSEIRVLVDVPVEELAKVHEEVAKAVWAYRKGKLIVISGGGGKYGEIKLPDEVRNARIEDLETIEVEVPNVEEKPKQRSITEFLRKSNK(SEQ ID NO：1)
9°N EndoQ
MLVDADLHLHSRYSKAVSKAMTIPNLAQNARFKGLGLVGTGDILNPHWEAELLRYAKKVDEGTYELNGIRFLLTTEVEDNRRVHHVLIFPSIETVREMREILKRYSTDIETEGRPHLSLSAAEIADIANDLDILIGPAHAFTPWTSLYKEYDSLKEAYRNARVHFLELGLSADSEMADMIKAHHRLTYLSNSDAHSPMPHRLGREFNRFEVEEVTFEEVRKAILRRGGRRIVLNAGLDPRLGKYHLTACSRCYAHYSLGEAKAFKWKCPKCGGRIKKGVKDRILELADTEERPKDRPPYLRLAPLAEIISMVIGKGIETKAVRLIWERFLRDFGSEIRVLVDVPVKELANVHEEVAKAIWAYRNGKLIVIPGGGGKYGEIKLPEEIRKARVEDLESVEVEIPEETEKPRQRSITDFLK(SEQ ID NO：2)
Tk AGOG：
MSLERFVKIKYQTNEEKADKLVEGLKELGIECARIIEEKVDLQFDALRHLRENLNDDETFIKLVIANSIVSYQLSGKGEDWWWEFSKYFSQNPPEKSIVEACSKFLPSSRTNRRLVAGKIKRLEKLEPFLNSLTLQELRRYYFENMMGLRNDIAEALGSPKTAKTVVFAVKMFGYAGRIAFGEFVPYPMEIDIPEDVRIKAYTERITNEPPVSFWRRVAEETGIPPLHIDSILWPVLGGKREVMERLKKVCEKWELVLELGSL(SEQ ID NO：3)。
序列表
<110> 新英格兰生物实验室公司
<120> 具有修饰核苷酸的单链DNA的切割
<130> NEB-418
<150> 62/890,291
<151> 2019-08-22
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Tko EndoQ
<400> 1
Met Ile Val Asp Ala Asp Leu His Ile His Ser Arg Tyr Ser Lys Ala
1 5 10 15
Val Ser Lys Ala Met Thr Ile Pro Asn Leu Ala Glu Asn Ala Arg Phe
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Met Val Gly Thr Gly Asp Ile Leu Asn Pro Asn Trp
35 40 45
Glu Lys Glu Leu Leu Lys Tyr Thr Lys Lys Val Asp Glu Gly Thr Tyr
50 55 60
Glu Arg Asn Gly Ile Arg Phe Leu Leu Thr Thr Glu Val Glu Asp Thr
65 70 75 80
Arg Arg Val His His Val Leu Ile Phe Pro Asn Ile Glu Thr Val Arg
85 90 95
Glu Met Arg Glu Arg Leu Lys Pro Tyr Ser Ser Asp Ile Glu Ser Glu
100 105 110
Gly Arg Pro His Leu Thr Leu Ser Ala Ala Glu Ile Ala Asp Ile Ala
115 120 125
Asn Glu Leu Asp Val Leu Ile Gly Pro Ala His Ala Phe Thr Pro Trp
130 135 140
Thr Ser Leu Tyr Lys Glu Tyr Asp Ser Leu Lys Glu Ala Tyr Asn Gly
145 150 155 160
Ala Lys Ile His Phe Leu Glu Leu Gly Leu Ser Ala Asp Ser Glu Met
165 170 175
Ala Asp Met Ile Lys Ala His His Lys Leu Thr Tyr Leu Ser Asn Ser
180 185 190
Asp Ala His Ser Pro Met Pro His Arg Leu Gly Arg Glu Phe Asn Arg
195 200 205
Phe Glu Val Asn Glu Ala Thr Phe Glu Glu Ile Arg Lys Ala Ile Leu
210 215 220
Lys Arg Gly Arg Lys Ile Val Leu Asn Ala Gly Leu Asp Pro Arg Leu
225 230 235 240
Gly Lys Tyr His Leu Thr Ala Cys Ser Arg Cys Tyr Thr Lys Tyr Ser
245 250 255
Leu Glu Glu Ala Lys Ala Phe Arg Trp Lys Cys Pro Lys Cys Gly Gly
260 265 270
Arg Ile Lys Lys Gly Val Arg Asp Arg Ile Leu Glu Leu Ala Asp Thr
275 280 285
Thr Glu Arg Pro Lys Asp Arg Pro Pro Tyr Leu His Leu Ala Pro Leu
290 295 300
Ala Glu Ile Ile Ala Met Val Leu Gly Lys Gly Val Glu Thr Lys Ala
305 310 315 320
Val Arg Leu Val Trp Glu Arg Phe Leu Arg Glu Phe Gly Ser Glu Ile
325 330 335
Arg Val Leu Val Asp Val Pro Val Glu Glu Leu Ala Lys Val His Glu
340 345 350
Glu Val Ala Lys Ala Val Trp Ala Tyr Arg Lys Gly Lys Leu Ile Val
355 360 365
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Gly Glu Ile Lys Leu Pro Asp Glu
370 375 380
Val Arg Asn Ala Arg Ile Glu Asp Leu Glu Thr Ile Glu Val Glu Val
385 390 395 400
Pro Asn Val Glu Glu Lys Pro Lys Gln Arg Ser Ile Thr Glu Phe Leu
405 410 415
Arg Lys Ser Asn Lys
420
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 9oN EndoQ
<400> 2
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Val Ser Lys Ala Met Thr Ile Pro Asn Leu Ala Gln Asn Ala Arg Phe
20 25 30
Lys Gly Leu Gly Leu Val Gly Thr Gly Asp Ile Leu Asn Pro His Trp
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Asn Asp Leu Asp Ile Leu Ile Gly Pro Ala His Ala Phe Thr Pro Trp
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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225 230 235 240
Leu Gly Lys Tyr His Leu Thr Ala Cys Ser Arg Cys Tyr Ala His Tyr
245 250 255
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260 265 270
Gly Arg Ile Lys Lys Gly Val Lys Asp Arg Ile Leu Glu Leu Ala Asp
275 280 285
Thr Glu Glu Arg Pro Lys Asp Arg Pro Pro Tyr Leu Arg Leu Ala Pro
290 295 300
Leu Ala Glu Ile Ile Ser Met Val Ile Gly Lys Gly Ile Glu Thr Lys
305 310 315 320
Ala Val Arg Leu Ile Trp Glu Arg Phe Leu Arg Asp Phe Gly Ser Glu
325 330 335
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340 345 350
Glu Glu Val Ala Lys Ala Ile Trp Ala Tyr Arg Asn Gly Lys Leu Ile
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Glu Ile Arg Lys Ala Arg Val Glu Asp Leu Glu Ser Val Glu Val Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Tk AGOG
<400> 3
Met Ser Leu Glu Arg Phe Val Lys Ile Lys Tyr Gln Thr Asn Glu Glu
1 5 10 15
Lys Ala Asp Lys Leu Val Glu Gly Leu Lys Glu Leu Gly Ile Glu Cys
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Ala Arg Ile Ile Glu Glu Lys Val Asp Leu Gln Phe Asp Ala Leu Arg
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Trp Trp Trp Glu Phe Ser Lys Tyr Phe Ser Gln Asn Pro Pro Glu Lys
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Arg Arg Leu Val Ala Gly Lys Ile Lys Arg Leu Glu Lys Leu Glu Pro
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Ile Pro Glu Asp Val Arg Ile Lys Ala Tyr Thr Glu Arg Ile Thr Asn
195 200 205
Glu Pro Pro Val Ser Phe Trp Arg Arg Val Ala Glu Glu Thr Gly Ile
210 215 220
Pro Pro Leu His Ile Asp Ser Ile Leu Trp Pro Val Leu Gly Gly Lys
225 230 235 240
Arg Glu Val Met Glu Arg Leu Lys Lys Val Cys Glu Lys Trp Glu Leu
245 250 255
Val Leu Glu Leu Gly Ser Leu
260

Claims (31)

1.一种方法，其包括：
(a)将包括修饰核苷酸的单链DNA(ssDNA)与能够在所述ssDNA中的所述修饰核苷酸处切割所述ssDNA的单链DNA切割酶组合以生成具有3’OH的第一ssDNA片段和具有所述修饰核苷酸的第二ssDNA片段，其中酶与DNA底物的比小于1:1摩尔比，和
(b)在修饰核苷酸处切割至少95％的所述ssDNA。
2.一种方法，其包括：
(a)将(i)(1)固定到基底上并且(2)包括修饰核苷酸的单链DNA(ssDNA)与(ii)能够在所述ssDNA中的所述修饰核苷酸处切割所述DNA的ssDNA切割酶组合以在切割之后生成具有3’OH的第一ssDNA片段和具有所述修饰核苷酸的第二ssDNA片段；和
(b)切割所述固定的ssDNA以从所述基底释放所述第二ssDNA片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中(b)进一步包括在少于60分钟内切割至少95％的所述ssDNA。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包括修饰核苷酸的所述ssDNA进一步包括在所述ssDNA的5’端附近的修饰核苷酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ssDNA被固定在固体载体上。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中切割进一步包括用所述ssDNA切割酶切割在所述修饰核苷酸附近的固定的DNA并从所述基底释放包括所述修饰核苷酸和所述修饰核苷酸3’的核苷酸的ssDNA片段。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括在步骤(a)之前通过逆转录RNA生成所述ssDNA。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在其5’端附近含有修饰核苷酸的所述ssDNA进一步包括在3’端的标记。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述标记是荧光标签。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述固体载体是珠。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述固体载体是具有孔的塑料板。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述固体载体是所述ssDNA在其上形成阵列的二维表面。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述sssDNA切割酶包括嗜热性内切核酸酶。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述嗜热性内切核酸酶是古细菌内切核酸酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述嗜热性内切核酸酶为EndoQ。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述ssDNA切割酶是AGOG。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ssDNA切割酶包括融合蛋白。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述ssDNA切割酶进一步包括SNAP-标签。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述SNAP-标签与固体基底结合。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述修饰核苷酸是8-oxoG。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述修饰核苷酸是脱氧尿苷。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述修饰核苷酸是脱氧肌苷。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单链寡核苷酸是ssDNA合成的产物并且任选地含有随机生成的核苷酸的条形码。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ssDNA是适配体。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ssDNA合成是化学的或酶促的。
26.一种组合物，其包括切割ssDNA的古细菌内切核酸酶或糖基化酶和包括修饰核苷酸的合成DNA底物的人工混合物。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述合成的DNA底物被固定在固体基底上。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述固体基底选自珠、多孔盘中的孔和二维阵列表面。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的组合物，其中所述修饰核苷酸选自脱氧尿苷、脱氧肌苷、8-oxoG、脱氧黄苷和四氢呋喃位点。
30.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述ssDNA切割酶是融合蛋白。
31.根据权利要求26所述的组合物，其中所述融合蛋白包括SNAP-标签。
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010048605A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
EP4015005A1 (en) 2011-10-03 2022-06-22 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US9476089B2 (en) * 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
ES2815099T3 (es) * 2013-08-05 2021-03-29 Twist Bioscience Corp Genotecas sintetizadas de novo
EP3053585A1 (en) 2013-12-13 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
JP6550649B2 (ja) * 2014-09-11 2019-07-31 タカラバイオ株式会社 耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法
US10487105B2 (en) 2016-10-19 2019-11-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Trinucleotide MRNA cap analogs

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