CN114524859A - 水稻球蛋白的提取方法及液相检测方法 - Google Patents

水稻球蛋白的提取方法及液相检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水稻球蛋白的提取方法及液相检测方法。本发明对水稻球蛋白进行提取后，直接使用上清液进行高效液相色谱检测，对水稻球蛋白的组成进行定性分析，并对不同品种水稻中球蛋白的相对含量进行比较。本发明首次将液相检测方法用于水稻球蛋白组分结构，本发明提供的方法，适合于不同来源的水稻品种的鉴别，以及从蛋白组分结构方面对稻米食味品质进行评价。

Description

水稻球蛋白的提取方法及液相检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种水稻球蛋白的提取方法及液相检测方法。
背景技术
稻米品质的好坏直接影响其经济效益和商品价值。稻米蛋白质组分含量是重要的稻米营养品质指标。稻米蛋白组分含量的品种间遗传差异及其与稻米其他品质性状关系的研究具有极其重要的理论与实际意义。不同水稻品种的遗传差异研究，导致了不同水稻品种蛋白质含量及其各氨基酸含量存在差异，而水稻品种蛋白组分的差异决定了不同品种的米质性状差异。
球蛋白是水稻种子胚乳中一种重要的盐溶性储藏蛋白，含量占水稻胚乳蛋白总量的10％左右。不同水稻品种(系)的谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白等4种蛋白组分存在明显的品种(间)差异；不同水稻品种(系)种子的蛋白组分的变异系数大小依次为球蛋白>醇溶蛋白>清蛋白>谷蛋白。获取球蛋白及其氨基酸的含量，有助于获取不同遗传背景下水稻品种的蛋白组分与其米质性状的关系。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻球蛋白的提取方法及液相检测方法。
水稻含有谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白等4种蛋白组分，在对球蛋白进行提取及检测时，会受到其他蛋白的影响，本发明提供的提取及检测方法，在使用氯化钠溶液同时，调整离心的转速及离心时间，获得纯度高且可直接上样进行液相检测的球蛋白提取液。
为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一种球蛋白的提取方法，具体为待测大米样品与氯化钠溶液混合，将混合液涡旋后，置于试管旋转器中室温下混合25-35min，在14000-15500rpm离心25-35min，获取球蛋白提取液。
在本发明提供的提取方法中，待测大米样品与氯化钠溶液的固液比为(0.2-0.3):1。
第二方面，本发明提供一种水稻球蛋白的检测方法，使用上述的提取方法得到的球蛋白提取液进行液相色谱检测。所述液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的超纯水。
在本发明提供的检测方法中，液相色谱的条件为柱温50℃，检测波长280nm，色谱梯度为25-85％的乙腈。
在本发明提供的检测方法中，所述色谱梯度为1-4min，25-35％乙腈；5-9min，35-50％乙腈；10-16min，50-75％乙腈；17min，75％乙腈；18-19min，75-85％；20-25min，85-25％乙腈。
作为本发明的具体实施方式，一种水稻球蛋白的检测方法，包括以下步骤：
(1)向大米样品中加入1mol/L的氯化钠溶液并涡旋，将样品置于试管旋转器中，室温下混合30分钟，然后25℃，15000rpm离心30分钟；
(2)将上清液转移到2mL HPLC小瓶进行高效液相色谱分析；
(3)液相色谱条件：柱温50℃，检测波长280nm；色谱柱型号为Phenomenex,Jupiter5mm C18 300A,250×4.6mm；流动相为含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的超纯水，色谱梯度为起始梯度25％乙腈，5分钟时增长到35％乙腈，10分钟时达到50％乙腈，17分钟时为75％乙腈，18到19分钟之间达到最大85％乙腈，在19到25分钟之间恢复到25％乙腈。
具体地，在本发明的具体实施方式中，步骤(1)中将0.25g大米粉样品到2ml微胶管中，向样品中加入1毫升1mol/L的氯化钠溶液并涡旋1分钟。
根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护上述的提取方法或上述的检测方法在水稻品种鉴定中的应用。以及上述的提取方法或上述的检测方法在水稻米质鉴定中的应用。
本发明的有益效果在于，本发明对水稻球蛋白进行提取后，直接使用上清液进行高效液相色谱法，对水稻球蛋白的组成进行定性分析，并对不同品种水稻中球蛋白的相对含量进行比较。本发明首次将液相检测方法用于水稻球蛋白组分结构，本发明提供的方法，适合于不同来源的水稻品种的鉴别，以及从蛋白组分结构方面对稻米食味品质进行评价。
附图说明
图1为本发明实施例1的水稻球蛋白液相色谱图。
图2为本发明实施例2的水稻球蛋白液相色谱图。
图3为本发明实施例3的水稻球蛋白液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供稻花香2号球蛋白的提取及检测方法，具体步骤如下：
称取0.25g大米粉样品到2ml微胶管中，向样品中加入1毫升1mol/L的氯化钠溶液并涡旋1分钟。将样品置于试管旋转器中，室温下混合30分钟，然后25℃，15000转离心30分钟，上清液直接转移到2mL HPLC小瓶进行高效液相色谱分析。
液相色谱条件：柱温50℃，检测波长280nm。色谱柱型号为Phenomenex,Jupiter5mm C18 300A,250×4.6mm；流动相为含有0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈(ACN)和含有0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水，色谱梯度为起始梯度25％ACN，5分钟时增长到35％，10分钟时达到50％，17分钟时为75％，18到19分钟之间达到最大85％，在19到25分钟之间恢复到25％。液相色谱结果见图1。
实施例2
本实施例提供南粳46球蛋白的提取及检测方法，具体步骤如下：
称取0.3g大米粉样品到2ml微胶管中，向样品中加入1毫升1mol/L的氯化钠溶液并涡旋1分钟。将样品置于试管旋转器中，室温下混合30分钟，然后25℃，14000转离心35分钟，上清液直接转移到2mL HPLC小瓶进行高效液相色谱分析。
液相色谱条件：柱温50℃，检测波长280nm。色谱柱型号为Phenomenex,Jupiter5mm C18 300A,250×4.6mm；流动相为含有0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈(ACN)和含有0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水，色谱梯度为起始梯度25％ACN，5分钟时增长到35％，10分钟时达到50％，17分钟时为75％，18到19分钟之间达到最大85％，在19到25分钟之间恢复到25％。液相色谱结果见图2。
实施例3
本实施例提供沈农508球蛋白的提取及检测方法，具体步骤如下：
称取0.2g大米粉样品到2ml微胶管中，向样品中加入1毫升1mol/L的氯化钠溶液并涡旋1分钟。将样品置于试管旋转器中，室温下混合25分钟，然后25℃，15500转离心25分钟，上清液直接转移到2mL HPLC小瓶进行高效液相色谱分析。
液相色谱条件：柱温50℃，检测波长280nm。色谱柱型号为Phenomenex,Jupiter5mm C18 300A,250×4.6mm；流动相为含有0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈(ACN)和含有0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水，色谱梯度为起始梯度25％ACN，5分钟时增长到35％，10分钟时达到50％，17分钟时为75％，18到19分钟之间达到最大85％，在19到25分钟之间恢复到25％。液相色谱结果见图3。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种水稻球蛋白的提取方法，其特征在于，待测大米样品与氯化钠溶液混合，将混合液涡旋后，置于试管旋转器中室温下混合25-35min，在14000-15500rpm离心25-35min，获取球蛋白提取液。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，待测大米样品与氯化钠溶液的固液比为(0.2-0.3):1。
3.一种水稻球蛋白的检测方法，其特征在于，使用权利要求1-2任一项所述的提取方法得到的球蛋白提取液的上清液进行液相色谱检测。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的超纯水。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，液相色谱的条件为柱温50℃，检测波长280nm，色谱梯度为25-85％的乙腈。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述色谱梯度为1-4min，25-35％乙腈；5-9min，35-50％乙腈；10-16min，50-75％乙腈；17min，75％乙腈；18-19min，75-85％；20-25min，85-25％乙腈。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向大米样品中加入1mol/L的氯化钠溶液并涡旋，将样品置于试管旋转器中，室温下混合30分钟，然后25℃，15000rpm离心30分钟；
(2)将上清液转移到2mL HPLC小瓶进行高效液相色谱分析；
(3)液相色谱条件：柱温50℃，检测波长280nm；色谱柱型号为Phenomenex,Jupiter 5mmC18 300A,250×4.6mm；流动相为含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的超纯水，色谱梯度为起始梯度25％乙腈，5分钟时增长到35％乙腈，10分钟时达到50％乙腈，17分钟时为75％乙腈，18到19分钟之间达到最大85％乙腈，在19到25分钟之间恢复到25％乙腈。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中将0.25g大米粉样品到2ml微胶管中，向样品中加入1毫升1mol/L的氯化钠溶液并涡旋1分钟。
9.权利要求1所述的提取方法或权利要求2-8任一项所述的检测方法在水稻品种鉴定中的应用。
10.权利要求1所述的提取方法或权利要求2-8任一项所述的检测方法在水稻米质鉴定中的应用。
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