CN114502737A - 用于治疗关节炎疾病的修饰的aav衣壳蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于基因疗法的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其中所述rAAV病毒体包含新型衣壳蛋白。特别地，本发明涉及此类病毒体在基因疗法中用于治疗关节炎疾病，例如像类风湿性关节炎或其症状的用途，优选地通过关节内施用。
Description
技术领域
本发明涉及基于重组腺相关病毒(rAAV)的基因疗法领域，特别涉及突变衣壳rAAV在治疗或预防关节炎疾病中的用途。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)载体已经证明对于人体内递送基因具有优异的安全性和功效特征。因此，rAAV载体已经广泛用于体内基因疗法，并且在临床前模型以及临床试验中显示出安全性和有效性。rAAV载体已成功用于一系列疾病的许多基因疗法临床试验，所述疾病包括B型血友病、A型血友病、囊性纤维化、α1抗胰蛋白酶缺乏症、脊髓性肌萎缩症(SMA)、帕金森病、杜氏肌营养不良症和Leber先天性黑蒙(Selot等人,CurrentPharmaceutical Biotechnology,2013,14,1072-1082)。阿利泼金(Alipogenetiparvovec，
uniQure)已在欧洲作为治疗脂蛋白脂酶缺乏症(LPLD)的基因疗法获得上市许可。随后，用于治疗皮肤癌的基于疱疹病毒的Talimogene laherparepvec(T-Vec,
Amgen)和用于治疗ADA-SCID的基于体外干细胞逆转录病毒的基因疗法Strimvelis(GSK)，获得了基因疗法药物批准。
基于rAAV载体的基因疗法也已经应用于类风湿性关节炎(RA)，其是影响约1％的人口的慢性炎性疾病。RA的病理学遍及滑膜关节。关节的局部性质使得体内基因疗法非常有吸引力。已经应用了提供旨在使RA中的平衡向抗炎状态转变的抗炎蛋白的疗法。
许多工作集中于开发具有所需特性的AAV衣壳蛋白。此类特性可包括更高的转导效率、组织/器官嗜性、不需要的组织/器官的脱靶、或避免预先存在的中和抗体。
然而，本领域仍然需要进一步改进rAAV基因疗法载体。具体地，需要改进rAAV基因疗法载体在关节炎疾病中的使用，更准确地，需要改进将遗传物质递送至所靶向的组织(诸如滑膜关节或滑膜关节内的特定细胞类型，优选递送至成纤维细胞样滑膜细胞(FLS))的效率。
发明内容
在一些方面，本发明涉及以下编号的实施方案：
实施方案1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其包含修饰的衣壳蛋白和与编码目的基因产物的核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述rAAV病毒体用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状，其中所述修饰的衣壳蛋白在所述蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在所述衣壳蛋白的表面上，优选地其中所述目的产物是免疫抑制剂。
实施方案2.根据实施方案1所述使用的rAAV病毒体，其中所述氨基酸序列Z：
a.包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：
y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A
其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和
b.存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。
实施方案3.根据实施方案1或2使用的rAAV病毒体，其中所述目的基因产物是IL-6抑制剂。
实施方案4.根据实施方案1或2使用的rAAV病毒体，其中所述目的基因产物是TNFα抑制剂。
实施方案5.根据实施方案1或2使用的rAAV病毒体，其中所述目的基因产物是IL-1抑制剂。
实施方案6.根据实施方案3所述使用的rAAV病毒体，其中所述IL-6抑制剂选自由IL-6受体拮抗剂、人源化抗IL-6单克隆抗体、嵌合抗IL-6单克隆抗体、人源化兔抗IL-6单克隆抗体和可溶性IL-6受体组成的组，优选地其中至少一种
i)所述IL-6受体拮抗剂是托珠单抗(tocilizumab)和赛诺菲单抗(sarilumab)中的至少一种；
ii)所述人源化抗IL-6单克隆抗体是奥洛组单抗(olokizumab)和西鲁库单抗(sirukumab)中的至少一种；
iii)所述嵌合抗IL-6单克隆抗体是司妥昔单抗(siltucimab)；并且
iv)所述人源化兔抗IL-6单克隆抗体是克拉扎珠单抗(clazakizumab)。
实施方案7.根据实施方案4所述使用的rAAV病毒体，其中所述TNFα抑制剂选自由依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗聚乙二醇(certilizumab pegol)和戈利木单抗(golimumab)组成的组，优选地其中所述TNFα抑制剂是依那西普。
实施方案8.根据实施方案5所述使用的rAAV病毒体，其中所述IL-1抑制剂选自由以下组成的组：
i)IL-1受体拮抗剂，优选人IL-1受体拮抗剂，优选人IL-1受体拮抗剂阿那白滞素(anakinra)；
ii)抗IL-1单克隆抗体，优选人抗IL-1单克隆抗体，优选人IL-1单克隆抗体卡那奴单抗(canakinumab)或吉伏组单抗(gevokizumab)
iii)人二聚抗IL-1融合蛋白，优选人二聚抗IL-1融合蛋白利纳西普(rilonacept)；以及
iv)人双可变结构域抗IL-1免疫球蛋白，优选人双可变结构域抗IL-1免疫球蛋白鲁吉珠单抗(lutikizumab)。
实施方案9.根据前述实施方案中任一项所述使用的rAAV病毒体，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子，优选所述启动子是NFκB应答型启动子，优选NFκB应答型CMV启动子，优选NFKB应答型最小CMV启动子。
实施方案10.根据前述实施方案中任一项所述使用的rAAV病毒体，其中所述序列Z包含在所述修饰的衣壳蛋白中由式II表示的位置处：
EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy-Z-(x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG
a.其中Z、x和y如实施方案2中所定义；并且
b.其中n为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
实施方案11.根据前述实施方案中任一项所述使用的rAAV病毒体，其中所述衣壳蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO：1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO：11具有至少80％序列同一性，
ii)与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO：2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO：10具有至少80％序列同一性，
iii)与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性，
iv)与具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性，
v)与具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性，
vi)与具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性，以及
vii)与具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性，
其中当在相同条件下测试时，与具有选自由SEQ ID NO:13-19组成的组的氨基酸序列的未修饰的衣壳蛋白相比，所述修饰的衣壳蛋白提供至少两倍的表达增加，优选在人FLS细胞中，其中优选地所述未修饰的衣壳蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:19或具有与所述修饰的衣壳蛋白相同的血清型。
实施方案12.根据前述实施方案中任一项所述使用的rAAV病毒体，其中所述衣壳蛋白包含选自由SEQ ID NO:1-7组成的组的氨基酸序列或由其组成，优选地其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或由其组成。
实施方案13.一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状的rAAV组合物，其中所述rAAV组合物包含如实施方案1-12中任一项所定义的rAAV病毒体和药学上可接受的载剂。
实施方案14.一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV组合物如实施方案13中所定义，并且其中所述治疗或预防包括向个体施用所述rAAV组合物和施用所述免疫抑制剂。
实施方案15.根据实施方案1-12中任一项所述使用的rAAV病毒体，根据实施方案13所述使用的rAAV组合物，或根据实施方案14所述使用的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述关节炎疾病选自由类风湿性关节炎(RA)、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎(OA)、痛风、假痛风、脊椎关节炎(SpA)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、脓毒性关节炎、关节炎、幼年型特发性关节炎、钝伤、关节置换和斯蒂尔病组成的组。
实施方案16.根据实施方案1-12中任一项所述使用的rAAV病毒体或根据实施方案13所述使用的rAAV组合物，其中所述rAAV病毒体和/或所述rAAV组合物全身和/或局部施用。
实施方案17.根据实施方案14所述使用的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV组合物和所述免疫抑制剂中的至少一种局部施用。
实施方案18.根据实施方案16所述使用的rAAV病毒体或rAAV组合物和/或根据实施方案17所述使用的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述局部施用是关节内施用。
具体实施方式
本发明人已经发现，包含修饰的衣壳蛋白的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体在转导细胞方面令人惊讶地有效，并且在转导滑膜关节的细胞方面特别有效。
在关节炎疾病例如像类风湿性关节炎的治疗中，关节中的主要靶细胞包括但不限于成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)、软骨细胞(cartilage cells)、软骨细胞(chondrocytes)和成软骨细胞。本发明的目的是提供衣壳蛋白，与本领域已知的衣壳蛋白相比，其在rAAV施用后在以下特性中一个或多个方面得到改进：i)在关节组织中，特别是在FLS中更高的表达水平；ii)改进的关节组织嗜性，特别是改进的对FLS的嗜性；和/或iii)改进的从非期望组织/器官的脱靶。具体地，与未修饰的衣壳蛋白，优选地与修饰的衣壳蛋白和/或AAV5衣壳蛋白具有相同血清型的野生型衣壳蛋白相比，包含本发明的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体的这些特性得到改进。先前已经确定，当与其他AAV血清型相比时，AAV5衣壳产生最高的FLS表达水平(Adriaansen等人(2005)Ann Rheum Dis 64:1677-1684；Apparailly等人(2005)Hum.Gene Ther.16:426-434)。由于衣壳赋予了组织/细胞嗜性特性，因此本发明中描述的修饰的衣壳与未修饰的AAV5相比具有增强的FLS转导潜力的特性。特别地，优选的是，本发明的衣壳蛋白在滑膜组织中，特别是在FLS中，优选地在关节内施用后，与未修饰的衣壳蛋白(即，相同衣壳蛋白但没有待测试的修饰，优选与修饰的衣壳蛋白具有相同的血清型)，优选野生型未修饰的衣壳蛋白(优选与修饰的衣壳蛋白相同的血清型)，更优选未修饰的AAV5或wtAAV5衣壳蛋白相比，提供更高的表达水平。
因此，在第一方面，本发明涉及包含修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体。如本文定义的rAAV病毒体特别可用于基因疗法。
如本文所用，“基因疗法”是将核酸序列(例如如下文所定义的转基因(也称为编码目的基因产物的核苷酸序列))插入个体的细胞和/或组织中以治疗或预防疾病或病状或治疗或预防疾病或病症的症状。
AAV可感染分裂细胞和休眠细胞，并且感染通过衣壳蛋白与细胞膜受体的相互作用，然后是AAV病毒体的内吞作用而发生。AAV属于依赖病毒(Dependovirus)属，其进而属于细小病毒(Parvovirinae)亚科，也称为细小病毒，其能够感染脊椎动物。细小病毒亚科属于小DNA动物病毒科，即细小病毒科。从它们的属名可以推断，依赖病毒属的成员是独特的，因为它们通常需要与辅助病毒诸如腺病毒或疱疹病毒共感染以在细胞培养物中进行生产性感染。依赖病毒属包括正常感染人的AAV和感染其他温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和羊腺相关病毒)。关于细小病毒和细小病毒科的其他成员的进一步信息描述于KennethI.Berns,"Parvoviridae:The Viruses and Their Replication,"第69章FieldsVirology(第3版1996)中。为方便起见，本文参考AAV进一步举例说明和描述本发明。然而，应当理解，本发明不限于AAV，而是可以等同地应用于其他细小病毒。
所有已知AAV血清型的基因组结构非常类似。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。反向末端重复序列(ITR)位于非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)在组装激活蛋白(AAP)的帮助下形成衣壳或蛋白壳(对于一些血清型)，所述组装激活蛋白在与VP2/VP3的开放阅读框重叠的替代开放阅读框中编码。末端核苷酸是自身互补的并且被结构化，使得可以形成能量稳定的分子内双链体，从而形成T形发夹。末端核苷酸的大小取决于血清型。例如，在AAV2的情况下，末端145nt中125nt是自身互补的，而剩余的20nt保持单链。这些发夹结构用作病毒DNA复制的起点，从而用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中感染野生型AAV(wtAAV)后，Rep蛋白(即Rep78和Rep52)分别由p5启动子和p19启动子转录的mRNA表达。两种Rep蛋白在病毒基因组的复制中都有功能。Rep ORF中的剪接事件导致实际上四种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已显示哺乳动物细胞中未剪接的mRNA编码的Rep78和Rep52蛋白足以产生AAV载体。此外，哺乳动物细胞中wtAAV或rAAV的产生依赖于两个剪接受体位点的交替使用和VP2的ACG起始密码子的次优使用的组合，这确保了所有三种衣壳蛋白以约1:1:10比率(VP1:VP2:VP3)的正确表达。
如本文所用，“rAAV病毒体”(本文也称为“rAAV载体”或“rAAV转基因载体”)是指包含非天然核酸序列的AAV衣壳。rAAV中的这种序列通常侧接ITR序列，优选来自wtAAV，并且优选编码目的基因产物，例如像转基因或同源臂。换句话说，rAAV病毒体意指被衣壳蛋白包裹的rAAV基因组，其包含(i)编码目的基因产物的核苷酸序列和(ii)至少一个AAV ITR序列。rAAV基因组可缺失一个或优选所有wtAAV基因，但仍可包含功能性ITR核酸序列。优选地，rAAV病毒体不包含任何编码病毒蛋白的核苷酸序列，诸如AAV的rep(复制)或cap(衣壳)基因。因此，rAAV病毒体不同于wtAAV病毒体，因为全部或部分病毒基因组已被编码目的基因产物的核苷酸序列替代，其相对于本文进一步定义的AAV核酸序列而言是非天然核酸。
在一个优选的实施方案中，包含本发明的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。本文描述的医学用途(例如用于治疗或预防关节炎疾病(与关节炎疾病相关联的症状)的基因疗法)是被定制为用作预防或治疗本文定义的疾病和/或病症的药物的根据本发明的rAAV病毒体，但同样可以被定制为(i)预防或治疗本文定义的疾病和/或病症或其症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用足够量或有效量的根据本发明的rAAV病毒体，和(ii)用于制备预防或治疗本文定义的疾病和/或病症的药物的根据本发明的rAAV病毒体，或(iii)根据本发明的rAAV病毒体用于预防或治疗本文定义的疾病和/或病症的用途。本发明设想了全部此类医学用途。优选地，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指将本发明的rAAV病毒体应用或施用于患有关节炎疾病的受试者，其中目的是治愈、部分或完全逆转、缓解、改善、抑制、延迟、遏制、减缓或停止关节炎疾病或与关节炎疾病相关联的症状的进展或严重程度。术语“治疗”包括减轻或缓解关节炎疾病的至少一种不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物得以减少，那么治疗通常是“有效的”。可替代地，如果关节炎疾病的进展减少或停止，那么治疗是"有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括停止或至少减缓在不存在治疗的情况下将预期的症状的进展或恶化。有益的或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的缓解、疾病程度的减小、稳定的疾病状态(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测的或是不可检测的。术语关节炎疾病的“治疗”还包括提供关节炎疾病的症状或副作用的减轻(包括姑息性治疗)。如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(prevention)”或“预防性(preventative)”(也称为预防性(prophylactic))是指将根据本发明的rAAV病毒体应用或施用于具有关节炎疾病易感性的受试者，其目的是延迟或预防未来关节炎疾病的一种或多种症状或特征的发作、缓解、改善、减轻、抑制其进展、降低其严重性和/或降低其发病率。因此，可将根据本发明的rAAV病毒体施用于未表现出关节炎疾病体征的受试者和/或仅表现出关节炎疾病早期体征的受试者，优选用于降低发展与关节炎疾病相关的病理学的风险。
如本文所用，术语“治愈(cure)”或“治愈(curing)”意指完全缓解关节炎疾病的症状或特征中的一种或多种，优选所有。如本文所用，术语“延迟(delay)”或“延迟(delaying)”意指延迟关节炎疾病的症状或特征中的一种或多种的发作和/或抑制其进展和/或降低其严重性。
在一个优选的实施方案中，当在相同条件下测试时，与未修饰的衣壳蛋白相比，本发明的修饰的衣壳蛋白提供至少两倍的表达增加。优选地，未修饰的衣壳蛋白是具有与修饰的衣壳蛋白相同的血清型但没有待测试的修饰的衣壳蛋白。更优选地，未修饰的衣壳蛋白是具有与修饰的衣壳蛋白相同的血清型的野生型(wt)衣壳蛋白，其中wt衣壳蛋白优选具有选自由SEQ ID NO:13-19组成的组的氨基酸序列。可替代地，优选的是，未修饰的衣壳蛋白具有选自由SEQ ID NO:13-19组成的组的氨基酸序列。最优选地，未修饰的衣壳蛋白具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。优选的未修饰的衣壳蛋白可取决于rAAV病毒体所靶向的组织。例如，具有AAV5衣壳蛋白的rAAV似乎是针对FLS细胞所选择的病毒体(Apparailly等人(2005)Human Gene Therapy 16(4):426-434；Adriaansen等人(2005)Ann.Rheum.Dis.64(12):1677-1684)，并且因此，无论rAAV突变病毒体的原始血清型如何，rAAV对照病毒体优选包含AAV5衣壳蛋白，更优选野生型AAV5(wtAAV5)衣壳蛋白，更优选AAV5衣壳蛋白具有SEQID NO:19所示的氨基酸序列，甚至更优选rAAV对照病毒体是rAAV5病毒体。rAAV对照病毒体是包含如本文定义的未修饰的衣壳蛋白而不是修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体。在一个优选的实施方案中，rAAV病毒体(包含修饰的衣壳蛋白)使用实施例中描述的方法在来自类风湿关节炎患者的成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)和/或HEK293，优选HEK293T细胞中体外转导后，与具有如本文定义的未修饰的衣壳蛋白而不是修饰的衣壳蛋白的相同rAAV病毒体相比，提供了更高的表达。换句话说，除了衣壳蛋白之外，rAAV病毒体和rAAV对照病毒体优选是相同的。优选地，在体外转导测定中检测转导效率：通过测量转基因编码的报告基因诸如GFP、YFP和/或荧光素酶的表达水平。在一个优选的实施方案中，测定表达的测试是如实施例2/3所述的体外转导测定。简言之，将RA-FLS(如van de Sande MG等人,(2011)Ann RheumDis 70:423-427中所述分离)以2500个细胞/孔铺板或将HEK293T细胞(人胚肾细胞)以40,000个细胞/孔铺板在96孔板中(DMEM-GlutaMAX-I(Gibco,参考号31966-021)、10％FBS(热灭活(HI)牛血清金，Gibco参考号，A15-151)、100μg/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich,参考好P0781；37℃/5％CO2)。24小时后，除去上清液并替换为含有rAAV突变病毒体或rAAV对照病毒体的培养基(DMEM-glutaMAX-I(Gibco，参考号31966-021)，0.001％pluronic F68(Sigma，参考号p5559))，所述rAAV突变病毒体或rAAV对照病毒体均在巨细胞病毒(CMV)启动子控制下表达黄色荧光蛋白(yFP)和/或荧光素酶，感染复数(MOI)为10,000、20,000和100,000。可以使用粗裂解物(即，用rAAV生产所需的所有质粒转染并含有表达报告基因的病毒体的细胞的未纯化上清液)或纯化的AAV(优选基于碘克沙醇纯化或氯化铯(CsCl)密度梯度纯化)。转导后四小时，添加含有阿霉素(Sigma，参考号D1515；终浓度0.4μM)、FBS(终浓度1％)的培养基(DMEM-GlutaMAX-I，10％FBS 100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)。48小时(HEK293T)或4-6天(RA-FLS)后，通过荧光显微术或流式细胞术测定细胞中表达YFP或荧光素酶的细胞的百分比。优选地，体外转导测定用分离自不同患者的FLS进行多次，例如像分离自2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多名患者的FLS。
“血清型”传统上是基于一种病毒的抗体与另一种病毒的抗体之间缺乏交叉反应性来定义的。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。根据传统定义，血清型意指已经针对所有存在的和表征的血清型具有特异性的血清测试了目的病毒的中和活性，并且没有发现中和目的病毒的抗体。随着更多天然存在的病毒分离株被发现并产生衣壳突变体，可能存在或可能不存在与任何目前存在的血清型的血清学差异。因此，在新型AAV没有血清学差异的情况下，此新型AAV将是相对应清型的子组或变体。在许多情况下，还必须对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行中和活性的血清学测试，以根据血清型的传统定义确定它们是否具有另一种血清型。因此，为了方便和避免重复，术语“血清型”广泛地指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及可能在给定血清型的子组组或变体中的没有血清学不同的病毒(例如AAV)。
“转导”是指通过病毒载体将转基因转移到受体宿主细胞中。用本发明的rAAV病毒体转导靶细胞导致包含在rAAV病毒体中的转基因转移到转导细胞中。“宿主细胞”或“靶细胞”是指其中发生DNA递送的细胞，诸如个体的滑膜细胞，或诸如在体外转导测定的情况下从患者分离的FLS细胞或HEK293T细胞。AAV载体能够转导分裂和非分裂细胞。在包含目的基因产物例如像GFP的细胞中，目的基因产物已经通过rAAV“转导”细胞而被引入/转移/转导。转基因已引入其中的细胞称为“转导的”细胞。
在其中转导转基因的受体宿主细胞优选为受待治疗的疾病影响的细胞，例如像滑膜细胞，更具体为在关节炎疾病的情况下的FLS、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、T淋巴细胞、树突细胞、浆细胞、肥大细胞、B淋巴细胞。如本文所用，“滑膜”或“滑膜组织”或“滑膜细胞”是指覆盖滑膜关节的非软骨表面的细胞衬里，如Tak(2000,Examination of the synovium and synovial fluid.于:Firestein GS,PanyaniGS,Wollheim FA编辑.Rheumatoid Arthritis.New York:Oxford Univ.Press,Inc.55-68)进一步描述并通过引用并入文中。滑膜由内膜衬层(或滑膜衬层)和滑膜下衬层(滑膜下层)组成，其与关节囊融合。内膜衬层包含内膜巨噬细胞(或巨噬细胞样滑膜细胞或A型滑膜细胞)和FLS(或B型滑膜细胞)。因此，“滑膜”可被“滑膜组织”替代或与“滑膜组织”同义。滑膜细胞可以包括滑膜中存在的任何细胞，包括FLS和巨噬细胞样滑膜细胞。滑膜细胞也可以是嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞和/或结缔组织细胞，它们都存在于滑膜中。
“成纤维细胞样滑膜细胞”(FLS)是间充质来源的细胞，其表现出与成纤维细胞共同的许多特征，诸如表达特定蛋白质，例如像几种类型的胶原。然而，FLS还分泌其他成纤维细胞谱系中通常不存在的蛋白质，例如像润滑素。此外，FLS表达对于介导细胞粘附重要的分子，诸如钙粘着蛋白-11、VCAM-1、几种整联蛋白及其受体。FLS的特异性是表达CD55，因此这种蛋白质通常用于通过免疫组织化学鉴定滑膜中的FLS。FLS表示位于滑膜中的关节内部的特化细胞类型，其细胞在慢性炎性疾病诸如类风湿性关节炎(RA)的发病机理中起关键作用。术语“类风湿性滑膜”或“类风湿性滑膜细胞”或“类风湿性滑膜组织”是指罹患RA的个体的关节的发炎滑膜。类风湿性滑膜的特征在于内膜衬里增生和滑膜下衬层中FLS、T细胞、浆细胞、巨噬细胞、B细胞、天然杀伤细胞和树突细胞的积累。这些积累的细胞包括在类风湿性滑膜细胞的定义中。在RA的进展过程中，滑膜组织成为不断发生炎性过程的部位，这最终可导致软骨损伤以及关节破坏和变形。据报道，RA期间滑膜中存在的FLS与正常组织中存在的FLS相比表现出改变的表型。例如，类风湿性滑膜中的FLS失去“接触抑制”，即当更多的细胞彼此接触时，它们失去阻止其生长的特性。此外，它们失去了在粘合表面上生长的依赖性。因此，患病滑膜中的FLS数量增加。炎症通过产生几种促炎信号分子，特别是白细胞介素IL-6和IL-8、前列腺素和基质金属蛋白酶(MMP)，而进一步增强。
可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一个优选的实施方案中，当在相同条件下测试时，与包含如本文定义的未修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体相比，优选与具有选自由SEQ ID NO:13-19组成的组的氨基酸序列的未修饰的衣壳蛋白相比，包含根据本发明的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体在人FLS中提供至少两倍的目的基因产物表达增加，其中优选未修饰的衣壳蛋白具有与修饰的衣壳蛋白相同的血清型或具有SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。
更优选地，与rAAV对照病毒体相比，本发明的rAAV病毒体在如上所述的体外转导后导致在人FLS细胞中目的基因产物的表达水平增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50倍的表达水平。
还优选地，和/或除上述之外，与rAAV对照病毒体相比，优选地与包含wtAAV5衣壳蛋白的rAAV病毒体相比，条件是rAAV在其他方面是相同的(除了其衣壳蛋白之外)，rAAV病毒体在体内施用于气囊滑膜(APS)小鼠模型后提供增加的表达(改编自Edwards等人(1981)J Pathol 134:147-156，如实施例4所述)。优选地，使用包含本发明的方法的突变衣壳蛋白的rAAV，目的基因产物的表达增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35倍。在实施例中提供了示例性方法。
还优选地，或除上述之外，与包含相同血清型的未修饰的(优选野生型)AAV衣壳蛋白的相同rAAV病毒体相比，包含修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体提供相似或较低的中和抗体(nAb)滴度。已知wtAAV5衣壳具有吸引人的nAb特征，并且因此，与wtAAV5相比，包含根据本发明的修饰的衣壳蛋白的rAAV的相似或更低的nAb滴度是优选的。
可替代地，体外转导测定可与上述类似地进行，但在不同于FLS的细胞类型/细胞系中进行，这取决于待靶向的细胞类型，例如像在选自由原代肝细胞、肝细胞系例如HuH、HepG2、HepA1-6、心脏细胞、骨骼肌细胞、肺细胞诸如细胞系A549、CNS细胞、眼细胞、胃肠道细胞、骨髓细胞和血细胞诸如细胞系THP-1组成的组的细胞中进行。这也可能需要不同的AAV血清型作为优选对照，这取决于野生型衣壳蛋白的嗜性。通常，对照载体优选包含天然靶向所选组织的野生型衣壳蛋白。如本领域技术人员将理解的，这还可取决于施用模式：局部或全身。例如，AAV2是最广泛研究的AAV，其对骨骼肌细胞、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞呈嗜性；AAV6对气道上皮细胞呈嗜性；AAV7对骨骼肌细胞呈嗜性；AAV8对肝细胞呈嗜性；AAV1和AAV5对血管内皮细胞呈嗜性。在全身施用后，AAV 1-3和5-9对肝具有嗜性，用AAV9、8、7、6、1观察到高蛋白水平，并且5和2水平较低；通过AAV4、6、7、8和9转导心脏；对于AAV4和6观察导胸部表达(Zincarelli等人(2008)Molecular Therapy 16(6):1073-1080)。
不希望受任何理论的束缚，我们认为与rAAV对照病毒体相比，由包含本发明的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体实现的增加的表达是由rAAV向细胞中改进的转导引起的，可能是由改变的嗜性引起的，从而导致(i)被转导的细胞群体内的细胞数目增加，和/或(ii)每个细胞的表达水平增加，例如由于更好的病毒体摄取和/或细胞内加工。
具有根据本发明的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体的另一个优点优选是其他改进，例如可能避免预先存在的中和抗体。
在本发明的一个优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含氨基酸序列Z，优选地，氨基酸序列Z包含在蛋白的C末端部分。优选地，序列Z的长度为12-18个氨基酸残基(本文也称为“环区”和“插入物”)。在一个优选的实施方案中，序列Z位于衣壳蛋白的C末端部分，优选位于对应于距野生型衣壳蛋白的C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160，最优选约150的氨基酸的位置，例如像SEQ ID NO：13-19所示。氨基酸序列Z的残基优选暴露在衣壳蛋白的表面上，例如像至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个残基暴露在衣壳蛋白的表面上(所谓的“环”)。在一个优选的实施方案中，序列Z的长度为14-18个氨基酸残基，更优选长度为15、16、17或18个残基，最优选长度为15、17或18个氨基酸残基。与未修饰的诸如野生型衣壳蛋白序列相比，序列Z可替换一些氨基酸残基。优选地，插入物替换相同序列的3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基，更优选6或7个氨基酸残基，但不插入优选未修饰的，更优选野生型序列。除了序列Z/插入物，因此在框架中，衣壳蛋白可以包含其他修饰，诸如氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)，或者框架衣壳蛋白可以是野生型氨基酸序列。其中包含插入物的框架AAV可以具有任何血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh10或AAVDJ。优选地，其中包含序列Z的框架AAV选自由AAV1、AAV2、AAV7、AAV9、AAVrh10、AAVDJ组成的组，更优选地选自具有SEQ ID NO：13-19中任一个所示的氨基酸序列的未修饰的衣壳蛋白。根据本发明的插入物优选地包含在衣壳蛋白的C末端部分，优选在对应于距野生型衣壳蛋白的C末端的100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160，最优选约150个氨基酸残基的位置，例如像SEQ ID NO：13-19所示，其中插入物的位置由式II表示：
EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy-Z-(x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG
其中x表示单个氨基酸残基，其中y表示0、1或2个氨基酸残基(其因此可以不存在)，并且其中n为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，优选8、9或10，或者其中插入物的位置由与式II具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列表示。优选地，在本发明的序列Z的N末端之前的最后三个氨基酸残基是NLQ、NHQ或NFQ。优选地，y表示0或2个氨基酸残基。在一些情况下，y表示2个氨基酸残基，因此在NxQ基序与本发明的插入物之间可以存在两个额外的氨基酸残基，优选两个丝氨酸残基。优选的是NxQ基序是NFQ的情况，例如如果AAV衣壳是SEQ ID NO:1所示的AAV1衣壳序列。本领域技术人员将能够确定这些基序和插入物所处的这个区域，并且如果其具有一些变化，例如氨基酸取代或缺失，也包括在本发明的范围内。
在一个优选的实施方案中，基于图4和5中所示的比对，插入物(序列Z)包含下式的序列或由其组成：x1-G-Q-x2-G-x3-x4-x5-R-x6-x7-x8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-x15，其中x1为Q或无，x2为S或R，x3为N或C，x4为D、Y或E，x5为C、V、S或A，x6为G、S或V，x7为无、A、V或R，x8为D、N或E，x9为C或A，x10为F或Q，x11为无、C或A，x12为无或A，x13为无或Q，x14为无或A，且X15为无或A。可替代地，插入物(序列Z)包含下式的序列或由其组成：y1-G-Q-y2-G-y3-y4-y5-R-y6-y7-y8-y9-y10-A-y11-y12-y13，其中y1为Q或无，y2为S或R，y3为N或C，y4为D、Y或E，y5为C、V、S或A，y6为G、S或V，y7为无或D，y8为无或C，y9为A、V、R或F，y10为N、D、E或C，y11为无或Q，y12为无或A，y13为无或A。在又一替代方案中，在最优选的实施方案中，基于图6和7中所示的比对，插入物(序列Z)包含通式I的序列或由其组成：
y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A
其中x表示单个氨基酸残基，并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基(其因此可以不存在)。优选地，(i)如果在N末端y表示0个氨基酸，则式I中的另一个y表示0个氨基酸残基，或(ii)如果在N末端y表示1个氨基酸残基，则式I中的另一个y表示2个氨基酸残基。更优选地，插入物(序列Z)包含更具体的下式的序列或由其组成：
z0–G–Q-z1–G-z2–z3-z4–R-z5-z6-z7–z8-z9–A–Q–A-A
其中z0为无或Q，z1为R或S，z2为C或N，Z3为D、E或Y，z4为C、A、S或V，z5为G、V或S，z6为d或无，z7为C或无，z8为F、R、V或A，z9为C、D、N或E。更优选地，如果z0为无，则z6和z7也都表示无。
更优选地，序列Z/插入物包含与选自由SEQ ID NO:8-12组成的组的氨基酸序列中的任一个具有至少80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。优选的是，序列Z/插入物包含由上述式中的任一个表示并与选自由SEQ ID NO:8-12组成的组的氨基酸序列中的任一个具有至少80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，最优选100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。
在哺乳动物细胞中，正确化学计量的三种AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的表达依赖于两个剪接受体位点的交替使用和不被昆虫细胞精确复制的VP2的ACG起始密码子的次优使用的组合。正确的化学计量对于AAV颗粒的感染性是重要的。为了以正确的化学计量在昆虫细胞中产生三种AAV衣壳蛋白，本领域中通常使用转录成能够表达所有三种VP蛋白而不需要剪接的单个多顺反子信使的构建体。为了实现这一点，VP1蛋白可以在次优翻译起始密码子而不是ATG的控制下。这种次优翻译起始密码子的实例是ACG、TTG、CTG和GTG(Urabe等人(2002)Human Gene Therapy 13:1935-1943；US20030148506；US 20040197895；WO2007/046703)。可替代地，在昆虫细胞中产生rAAV中，可使用核酸盒来表达VP1、VP2和VP3蛋白，其中这些蛋白由包含重叠开放阅读框(ORF)的核酸序列编码，如欧洲专利号2,061,891B1中所述，其中公开了包含内含子的VP表达盒，其包含在VP2 ACG起始密码子之前的启动子。本发明的修饰的衣壳蛋白相对于VP1衣壳蛋白的蛋白质序列定义。然而，由于序列Z/插入物位于VP1蛋白的C末端部分，因此本发明包括VP2和VP3蛋白，其也含有序列Z/插入物并因此被修饰(与rAAV的产生方法无关，例如像在昆虫细胞或哺乳动物细胞中)。
可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一优选的实施方案中，根据本发明的修饰的衣壳蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列或由其组成：i)与具有SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性，ii)与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性，iii)与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性，iv)与具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，最优选具有100％序列同一性，v)与具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，最优选具有100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性，vi)与具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性，以及vii)与具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最优选具有100％序列同一性。优选地，其中包含插入物的框架AAV衣壳蛋白具有野生型AAV衣壳的氨基酸序列，例如像AAV5、AAV1、AAV2、AAV7、AAV9、AAVrh10或AAVDJ，或包含保守氨基酸取代的氨基酸序列。更优选地，其中包含插入物的框架AAV衣壳蛋白具有wtAAV5衣壳的氨基酸序列或包含保守氨基酸取代的氨基酸序列。
“序列同一性”在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列确定的。在一个优选的实施方案中，基于两个给定SEQ ID NO的全长或其部分计算序列同一性。其部分优选意指两个SEQID NO的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在本领域中，“同一性”还意指氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，如通过此类序列串之间的匹配所确定的。除非本文另有说明，否则与给定SEQ ID NO的同一性或相似性意指基于所述序列的全长(即在其全长上或作为整体)的同一性或相似性。
两个氨基酸序列之间的“相似性”通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行比较来确定。“同一性”和“相似性”可易于通过已知方法计算，所述方法包括但不限于Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编,OxfordUniversity Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heine,G.,Academic Press,1987；以及SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中所述的那些。
设计确定同一性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。可公开获得的计算机程序中编纂了确定同一性和相似性的方法。用于确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux,J.等,Nucleic Acids Research,12(1):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。BLAST X程序可自NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.等,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
用于多肽序列比较的优选参数包括以下算法：Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：来自Hentikoff和Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)的BLOSSUM62；空位罚分：12；以及空位长度罚分：4。这种程序可作为“Ogap”程序从位于Madison,WI的Genetics Computer Group公开获得。前述参数是用于氨基酸比较(同时末端空位不存在罚分)的默认参数。
用于核酸比较的优选参数包括以下算法：Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0；空位罚分：50；空位长度罚分：3。可作为Gap程序获自位于Madison,Wis的Genetics Computer Group(www.biology.wustl.edu/gcg/gap)。以上给出了用于核酸比较的默认参数。
任选地，在确定氨基酸相似性的程度时，技术人员也可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这对技术人员来说是清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中所公开序列中的至少一个残基已被去除并且在其位置中插入不同残基的那些。优选地，氨基酸改变是保守的。每种天然存在的氨基酸的优选保守取代如下：Ala取代Ser；Arg取代Lys；Asn取代Gln或His；Asp取代Glu；Cys取代Ser或Ala；Gln取代Asn；Glu取代Asp；Gly取代Pro；His取代Asn或Gln；Ile取代Leu或Val；Leu取代Ile或Val；Lys取代Arg；Gln或Glu；Met取代Leu或Ile；Phe取代Met、Leu或Tyr；Ser取代Thr；Thr取代Ser；Trp取代Tyr；Tyr取代Trp或Phe；以及Val取代Ile或Leu。
可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一优选的实施方案中，衣壳蛋白包含选自由SEQ ID NO:1-7组成的组，更优选选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、6和7组成的组，甚至更优选选自由SEQ ID NO:3、4和6组成的组，还更优选选自由SEQ ID NO:4和6组成的组，最优选SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或由其组成。
本发明的rAAV病毒体可包含单一类型的修饰的衣壳蛋白，优选本文定义的单一类型的修饰的衣壳蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明的rAAV病毒体包含修饰的衣壳蛋白，其中每个修饰的衣壳蛋白具有相同或基本相同的氨基酸序列。可替代地，本发明的rAAV病毒体可包含不同类型的修饰的衣壳蛋白。作为非限制性实例，本发明的AAV病毒体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种类型的修饰的衣壳蛋白。本发明的rAAV病毒体还可包含一种或野生型衣壳蛋白，与单一类型或不同类型的修饰的衣壳蛋白组合。
在优选的实施方案中，衣壳蛋白是如本文定义的修饰的衣壳蛋白。
在优选的实施方案中，衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面上。优选地，氨基酸序列Z
a.包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：
y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A
其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和
b.存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，本发明的rAAV病毒体包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白，用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，本发明的rAAV病毒体包含AAV1 P4修饰的衣壳蛋白，用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，本发明的rAAV病毒体包含AAV2 P2修饰的衣壳蛋白，用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，本发明的rAAV病毒体包含AAV7 A6修饰的衣壳蛋白，用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，本发明的rAAV病毒体包含AAV9 A2修饰的衣壳蛋白，用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，本发明的rAAV病毒体包含AAVrh10 A6修饰的衣壳蛋白，用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，本发明的rAAV病毒体包含AAVrh10 A2修饰的衣壳蛋白，用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，本发明的rAAV病毒体包含AAV-DJ-QR-P2修饰的衣壳蛋白，用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状。
功能性ITR序列对于rAAV病毒体的复制、拯救和包装是必需的。ITR序列可以是野生型序列，或者可以与野生型序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性，或者可以通过例如核苷酸的插入、突变、缺失或取代而改变，只要它们保持功能性即可。在本文中，功能性是指将基因组直接包装到衣壳外壳中然后其允许在待转导的宿主细胞或靶细胞中表达的能力。通常，野生型AAV基因组的ITR保留在rAAV载体中。ITR可以从AAV病毒基因组克隆或从包含AAV ITR的载体切除。可以使用标准分子生物学技术将ITR核苷酸序列在任一端连接到如本文定义的转基因，或者可以将ITR之间的野生型AAV序列用所需核苷酸序列替换。rAAV载体优选包含至少AAV血清型中的一种的ITR区域的核苷酸序列，或基本上与其相同的核苷酸序列，和至少一种插入两个ITR之间的编码治疗性蛋白质的核苷酸序列(在合适的调控元件的控制下)。大多数目前使用的rAAV载体使用来自AAV血清型2的ITR序列。rAAV载体中存在的最优选的ITR是AAV2血清型。其他优选的ITR具有AAV1、AAV3、AAV5或AAV6血清型(Grimm等人(2006)J Virol 80(1):426-439)。rAAV基因组可包含单链或双链(自身互补)DNA。单链核酸分子是有义链或反义链，因为两种极性同样能够包装到AAV衣壳中。单链rAAV载体可利用野生型AAV血清型2(AAV2)ITR序列，并且双链(自身互补)rAAV载体可利用ITR的修饰形式。可替代地，在一个实施方案中，双链载体包含一个ITR，所述ITR来自AAV4。rAAV载体还可包含标志物或报告基因，诸如编码抗生素抗性基因、荧光蛋白(例如gfp)的基因或编码本领域已知的化学、酶或其他方式可检测和/或可选择的产物(例如lacZ、碱性磷酸酶(AP)、SEAP、Luc、Neo、Bla等)的基因。
使用本领域已知的方法，例如使用哺乳动物rAAV生产系统或昆虫细胞rAAV生产系统，生产rAAV载体，包括AAV血清型衣壳和AAV基因组ITR的任何可能组合。本领域已知的方法例如描述于Pan等人(J.of Virology(1999)73:3410-3417)、Clark等人(Human GeneTherapy(1999)10:1031-1039)、Wang等人(Methods Mol.Biol.(2011)807:361-404)、Grimm(Methods(2002)28(2):146-157)，并且昆虫细胞系统基于Urabe等人(Human Gene Therapy(2002)13:1935-1943)、Kohlbrenner等人(Molecular Therapy(2005)12(6):1217-1225)、国际专利公开WO 2007/046703、国际专利公开WO 2007/148971、国际专利公开WO 2009/014445、国际专利公开WO 2009/104964、国际专利公开WO 2009/154452、国际专利公开WO2011/112089、国际专利公开WO 2013/036118、美国专利号6,723,551B，其以引用的方式并入文中。简言之，所述方法通常可涉及(a)将rAAV基因组构建体引入宿主细胞，(b)将AAV辅助构建体引入宿主细胞，其中所述辅助构建体包含野生型rAAV基因组缺失的病毒功能，和(c)将辅助病毒构建体引入宿主细胞。需要存在rAAV载体复制和包装的所有功能，以实现rAAV基因组到rAAV载体中的复制和包装。引入宿主细胞可以使用标准分子生物学技术进行，并且可以同时或依次进行。最后，培养宿主细胞以产生rAAV载体，然后使用标准技术纯化，诸如CsCl梯度(Xiao等人1996,J.Virol.70:8098-8108)或碘克沙醇纯化所述rAAV载体。然后，纯化的rAAV载体通常备用于所述方法。可获得每ml超过1012个颗粒的高滴度和高纯度(不含可检测的辅助病毒和野生型病毒)(参见例如Clark等人同上和Flotte等人1995,GeneTher.2:29-37)。插入rAAV载体中的ITR区域之间的转基因的总大小通常小于5千碱基(kb)。
在本发明的上下文中，衣壳蛋白外壳可以具有与rAAV基因组不同的血清型，所述rAAV基因组包含(i)编码目的基因产物的核苷酸序列和(ii)至少一个AAV ITR序列。因此，本发明的rAAV基因组可以被本发明的衣壳蛋白外壳，即二十面体衣壳包裹，其包含根据本发明的衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3)，例如根据本发明的AAV衣壳蛋白的突变体，而rAAV载体中所含的ITR序列可以是上述AAV血清型中的任一种，包括例如AAV2或AAV5。在一个实施方案中，rAAV病毒体中存在的rAAV基因组或ITR衍生自AAV血清型2或AAV血清型5或AAV血清型8。AAV5和其他AAV血清型的完整基因组已经被测序(Chiorini等人1999,J.of Virology第73卷,第2号,第1309-1319页)，并且AAV5的核苷酸序列可在GenBank中获得(登记号AF085716)。因此，AAV2和AAV5的ITR核苷酸序列是技术人员容易获得的。AAV2的完整基因组在NCBI(NCBI参考序列NC_001401.2)中获得。它们可以被克隆或通过本领域已知的化学合成来制备，使用例如寡核苷酸合成仪，如由Applied Biosystems Inc.(Fosters,CA,USA)提供或通过标准分子生物学技术制备。
可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一优选的实施方案中，rAAV载体包含编码目的基因产物的核苷酸序列。
术语“转基因”用于指可引入细胞或生物体中的多核苷酸。转基因包括任何多核苷酸，诸如编码多肽或蛋白质的基因、转录成抑制性多核苷酸的多核苷酸或不转录的多核苷酸(例如，缺乏表达控制元件，诸如驱动转录的启动子)。本发明的转基因可以包含至少两个核苷酸序列，每个核苷酸序列是不同的或编码不同的治疗性分子。至少两个不同的核苷酸序列可以通过IRES(内部核糖体进入位点)元件连接，从而在单个启动子的控制下提供双顺反子转录物。合适的IRES元件描述于例如Hsieh等人(1995,Biochem.Biophys.Res.Commun.214:910-917)中。此外，编码不同(治疗性)多肽或蛋白质的至少两个不同核苷酸序列可通过病毒2A序列连接，以允许从单个启动子有效表达两个转基因。2A序列的实例包括来自口蹄疫病毒、马鼻炎A病毒、Thosea asigna病毒和猪捷申病毒-1的那些(Kim等人,PLoS One(2011)6(4):e18556)。转基因优选插入rAAV基因组内或ITR序列之间。转基因也可以是表达构建体，其包含表达调控元件诸如启动子或可操作地连接到编码序列的转录调控序列和3'终止序列。转基因可以是替代或补充缺陷等位基因的功能性突变等位基因。基因疗法还包括插入本质上为抑制性的转基因，即抑制、降低或减少内源或外源基因或蛋白(诸如不期望的或异常的(例如致病性的)基因或蛋白)的表达、活性或功能的转基因。此类转基因可以是外源的。外源分子或序列应理解为通常不存在于待治疗的细胞、组织和/或个体中的分子或序列。获得性和先天性疾病都适合于基因疗法。
“基因”或“编码序列”是指“编码”特定蛋白质的DNA或RNA区域。编码序列当置于合适的调控区诸如启动子的控制下时被转录(DNA)和翻译(RNA)成多肽。基因可以包含几个可操作地连接的片段，诸如启动子、5'前导序列、内含子、编码序列和3'非翻译序列，其包含聚腺苷酸化位点或信号序列。嵌合或重组基因是在自然界中通常不存在的基因，诸如其中例如启动子在自然界中不与转录的DNA区域的部分或全部缔合的基因。“基因的表达”是指基因转录为RNA和/或翻译成活性蛋白质的过程。
如本文所用，术语“启动子”或“转录调控序列”是指这样的核酸片段，其用于控制一个或多个编码序列的转录，并且相对于编码序列的转录起始位点的转录方向位于上游，并且通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点、以及本领域技术人员已知的直接或间接用于由启动子调控转录量的任何其他核苷酸序列的存在来在结构上鉴定。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是例如通过应用化学诱导剂进行生理或发育调控的启动子。“组织特异性”启动子优先在特定类型的组织或细胞中有活性。适当的启动子序列的选择通常取决于被选择用于表达DNA区段的宿主细胞。转基因可以与允许有效系统表达或允许组织特异性表达的启动子可操作地连接。
启动子
在优选的实施方案中，编码目的基因产物，优选如本文定义的目的基因产物的转基因的表达与启动子可操作地连接。因此，优选地，本发明的rAAV病毒体包含启动子序列。优选地，启动子选自由以下组成的组：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、赋予在关节细胞中的表达的启动子、CMV启动子、CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子、EF1α启动子、SV40启动子、CBA(鸡β-肌动蛋白)启动子、肝特异性启动子、NFκB应答型(诱导型)启动子、炎性调节基因的启动子、IL1β启动子、IL-6(HGF)启动子、IL8(CXCL8)启动子、CXCL10启动子、MMP3启动子、MMP2启动子、ICAM1启动子、MMP13启动子、ADAMTS4启动子、ADAMDEC1启动子、COL1A1启动子、MMP12启动子、RUNX2启动子、ADAMTS5启动子、COX2(PTGS2)启动子、TNFα(TNF)启动子、VEGF(VEGFA)启动子、(基本)FGF(FGF2)启动子和TGF-β(TGB1)启动子。
优选地，启动子选自由以下组成的组：NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子、促炎细胞因子基因的启动子、促炎细胞因子基因的最小启动子、赋予在关节炎关节细胞中的表达的启动子、赋予在结缔组织细胞中的表达的启动子、赋予在滑膜细胞中的表达的启动子、赋予在滑膜下细胞中的表达的启动子、赋予在内膜巨噬细胞中的表达的启动子、赋予在FLS中的表达的启动子、赋予在软骨细胞中的表达的启动子、赋予在软骨细胞中的表达的启动子、赋予在成软骨细胞中的表达的启动子、赋予在脂肪细胞中的表达的启动子、赋予在破骨细胞中的表达的启动子、赋予在T细胞中的表达的启动子、人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
优选地，启动子选自由以下组成的组：NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子、CMV启动子、EF1α启动子、CAG启动子、MMP13启动子、IL-6启动子和IL8启动子，优选NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J GeneMed,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受组成型启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受诱导型启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受组织特异性启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受启动子控制，所述启动子赋予在关节细胞，优选关节炎关节细胞中的表达。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受CMV启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受EF1α启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受SV40启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受CBA(鸡β-肌动蛋白)启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受肝特异性启动子控制。优选的肝特异性启动子是人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子和TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子中的至少一种。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受NFκB应答型(诱导型)启动子控制。优选的NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)CMV启动子，优选NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受炎性调节剂的启动子，优选促炎细胞因子基因的启动子控制。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受IL1β启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受IL-6(HGF)启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受IL8(CXCL8)启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受CXCL10启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受MMP3启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受MMP2启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受ICAM1启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受MMP13启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受ADAMTS4启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受ADAMDEC1启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受COL1A1启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受MMP12启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受RUNX2启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受ADAMTS5启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受COX2(PTGS2)启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受TNFα(TNF)启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受VEGF(VEGFA)启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受(基本)FGF(FGF2)启动子控制。
在优选的实施方案中，转基因，优选如本文定义的转基因的表达受TGF-β(TGB1)启动子控制。
在优选的实施方案中，rAAV病毒体内的启动子不是类固醇诱导型启动子。优选地，rAAV病毒体内的启动子不是地塞米松诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白是如本文定义的修饰的衣壳蛋白。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z
a.包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：
y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A
其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和
b.存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV1 P4修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV2 P2修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV7 A6修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV9 A2修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAVrh10A6修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAVrh10A2修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV-DJ-QR-P2修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因表达的启动子。优选地，启动子是如上定义的启动子。
术语“控制表达”和“可操作地连接”在本文中可以互换使用。如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸(或多肽)元件以功能关系的连接。当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系中时，所述核酸被是“可操作地连接”的。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则它可操作地连接到编码序列。“可操作地连接”意指被连接的DNA序列通常是连续的，并且当需要连接两个蛋白编码区时，是连续的并且在阅读框中。
目的基因产物
如本文定义的转基因优选编码如本文定义的目的基因产物。“目的基因产物”可以是“治疗性多肽”或“治疗性蛋白质”，其在本文中应理解为对个体具有有益作用的多肽或蛋白质，优选地所述个体是人，更优选地所述人罹患疾病。这种治疗性多肽可以选自但不限于由酶、辅因子、细胞因子、抗体、生长因子、激素和抗炎蛋白组成的组。
可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一优选的实施方案中，编码目的基因产物的核苷酸序列位于两个AAV ITR序列之间。可替代地，编码目的基因产物的核苷酸序列侧接两个AAV ITR序列，即一个ITR在编码目的基因产物的核苷酸序列的任一端。
可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一优选的实施方案中，目的基因产物治疗、预防或抑制与关节炎疾病相关联的症状。
在本文中应理解，目的基因产物可包括所述目的基因产物的生物类似物。
在优选的实施方案中，目的基因产物是免疫抑制剂。
在优选的实施方案中，目的基因产物选自由以下组成的组：ANP32A、Nrf2、IL-6抑制剂、可溶性IL-6受体、IL-6受体拮抗剂、人源化抗IL-6单克隆抗体、嵌合抗IL-6单克隆抗体、人源化兔抗IL-6单克隆抗体、白细胞介素1(IL-1)抑制剂、肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂、IL-1受体拮抗剂、可溶性IL-1受体、IL-17抑制剂、IL-12/IL-23抑制剂、T细胞共刺激抑制剂、B细胞消耗和抑制剂、IL-15抑制剂、IL-22抑制剂、GM-CSF抑制剂、胰岛素样生长因子(IGF-1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、核因子κ-B配体的受体激活物(RANKL)抑制剂、补体5a抑制剂、骨形态发生蛋白家族成员(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、生长分化因子家族成员(GDF)、白细胞介素18抑制剂、IL-2抑制剂、可溶性TNFα(sTNFα)受体p55、sTNFα受体p75、与IgG融合的sTNFα受体、TNFα受体p55抑制剂、sTNFα受体p75抑制剂、显性负性IκB激酶(dn-IKK-β)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素13(IL-13)、IL-33抑制剂、CCL17抑制剂、干扰素β(IFN-β)、MMP家族成员的组织抑制剂(TIMP)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)、信号传导分子/转录因子、细胞外基质组分、血管活性肠肽(VIP)、分化簇39(CD39)、分化簇73(CD73)和超氧化物歧化酶(SOD)。
在优选的实施方案中，目的基因产物选自由以下组成的组：托珠单抗、赛诺菲单抗、奥洛组单抗、西鲁库单抗、司妥昔单抗、克拉扎珠单抗、阿那白滞素、卡那奴单抗、利纳西普、吉伏组单抗和鲁吉珠单抗、依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗聚乙二醇、戈利木单抗、苏金单抗(secukinumab)、布罗达单抗(brodalumab)、艾克珠单抗(ixekizumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、瑞莎珠单抗(risankizumab)、古塞库单抗(guselkumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、阿巴西普(abatacept)、利妥昔单抗(rituximab)、贝利木单抗(belimumab)、伊利尤单抗(ianalumab)、他贝芦单抗(tabalumab)、AMG-714、Fezakunimab、仑兹鲁单抗(lenzilumab)、那美芦单抗(namilumab)、rhFGF-18/司瑞菲敏(sprifermin)、地诺单抗(denosumab)、C5aR-151、Tadekinig alfa/IL-18结合蛋白、巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、F8IL10/Dekavil、SMAD、Sox9、IkB、胶原蛋白、软骨寡聚基质蛋白(COMP)、蛋白聚糖和弹性蛋白。
在优选的实施方案中，目的基因产物是依那西普。优选地，依那西普由SEQ ID NO:28的序列编码。依那西普蛋白质可以包含信号肽，例如所述蛋白质可以具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列，并且在信号肽被切割后，所述蛋白质可以具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，目的基因产物是ANP32A。
在优选的实施方案中，目的基因产物是Nrf2。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-6抑制剂。
在优选的实施方案中，目的基因产物是可溶性IL-6受体。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-6受体拮抗剂。优选地，IL-6受体拮抗剂是托珠单抗和赛诺菲单抗中的至少一种。
在优选的实施方案中，目的基因产物是人源化抗IL-6单克隆抗体。优选地，人源化抗IL-6单克隆抗体是奥洛组单抗和西鲁库单抗中的至少一种。
在优选的实施方案中，目的基因产物是嵌合的抗IL-6单克隆抗体。优选地，嵌合的抗IL-6单克隆抗体是司妥昔单抗。
在优选的实施方案中，目的基因产物是人源化兔抗IL-6单克隆抗体。优选地，人源化兔抗IL-6单克隆抗体是克拉扎珠单抗。
在优选的实施方案中，目的基因产物是白细胞介素1(IL-1)抑制剂。优选地，白细胞介素1(IL-1)抑制剂选自由阿那白滞素、卡那奴单抗、利纳西普、吉伏组单抗和鲁吉珠单抗组成的组。优选地，IL-1抑制剂选自由以下组成的组：i)IL-1受体拮抗剂，优选人IL-1受体拮抗剂，优选人IL-1受体拮抗剂阿那白滞素；ii)抗IL-1单克隆抗体，优选人抗IL-1单克隆抗体，优选人IL-1单克隆抗体卡那奴单抗或吉伏组单抗，iii)人二聚体抗IL-1融合蛋白，优选人二聚体抗IL-1融合蛋白利纳西普；和iv)人双可变结构域抗IL-1免疫球蛋白，优选人双可变结构域抗IL-1免疫球蛋白鲁吉珠单抗。
在优选的实施方案中，目的基因产物是肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂。优选地，肿瘤坏死因子α(TNFα)抑制剂选自由依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗聚乙二醇和戈利木单抗组成的组。优选地，TNFα抑制剂是依那西普。优选地，目的基因产物是依那西普。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-1受体拮抗剂。
在优选的实施方案中，目的基因产物是可溶性IL-1受体。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-17抑制剂。优选地，IL-17抑制剂选自由苏金单抗、布罗达单抗和艾克珠单抗组成的组。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-12/IL-23抑制剂。优选地，IL-12/IL-23抑制剂选自由乌司奴单抗、瑞莎珠单抗、古塞库单抗和替拉珠单抗组成的组。
在优选的实施方案中，目的基因产物是T细胞共刺激抑制剂。优选地，T细胞共刺激抑制剂是阿巴西普。
在优选的实施方案中，目的基因产物是B细胞消耗和抑制剂。优选地，B细胞消耗和抑制剂选自由利妥昔单抗、贝利木单抗、伊利尤单抗和他贝芦单抗组成的组。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-15抑制剂。优选地，IL-15抑制剂是AMG-714。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-22抑制剂。优选地，IL-22抑制剂是fezakunimab。
在优选的实施方案中，目的基因产物是GM-CSF抑制剂。优选地，GM-CSF抑制剂是仑兹鲁单抗和那美芦单抗中的至少一种。
在优选的实施方案中，目的基因产物是胰岛素样生长因子(IGF-1)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是成纤维细胞生长因子(FGF)。优选地，成纤维细胞生长因子(FGF)是rhFGF-18/司瑞菲敏。
在优选的实施方案中，目的基因产物是核因子κ-B配体的受体激活物(RANKL)抑制剂。优选地，RANKL抑制剂是地诺单抗。
在优选的实施方案中，目的基因产物是补体5a抑制剂。优选地，补体5a抑制剂是C5aR-151。
在优选的实施方案中，目的基因产物是骨形态发生蛋白家族成员(BMP)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是转化生长因子β(TGF-β)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是生长分化因子家族成员(GDF)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是白细胞介素18抑制剂。优选地，白细胞介素18抑制剂是Tadekinig alfa/IL-18结合蛋白。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-2抑制剂。优选地，IL-2抑制剂是巴利昔单抗和达克珠单抗中的至少一种。
在优选的实施方案中，目的基因产物是可溶性TNFα(sTNFα)受体p55。
在优选的实施方案中，目的基因产物是sTNFα受体p75。
在优选的实施方案中，目的基因产物是与IgG融合的sTNFα受体。
在优选的实施方案中，目的基因产物是TNFα受体p55的抑制剂。
在优选的实施方案中，目的基因产物是sTNFα受体p75的抑制剂。
在优选的实施方案中，目的基因产物是显性负性IκB激酶(dn-IKK-β)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是白细胞介素4(IL-4)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是白细胞介素10(IL-10)。优选地，IL-10是F8IL10/Dekavil。
在优选的实施方案中，目的基因产物是白细胞介素13(IL-13)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是IL-33抑制剂。
在优选的实施方案中，目的基因产物是CCL17抑制剂。
在优选的实施方案中，目的基因产物是干扰素β(IFN-β)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是MMP家族成员的组织抑制剂(TIMP)，
在优选的实施方案中，目的基因产物是纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是信号传导分子/转录因子。优选地，信号传导分子/转录因子选自由SMAD、Sox9和IkB组成的组。
在优选的实施方案中，目的基因产物是细胞外基质组分。优选地，细胞外基质组分选自由胶原蛋白、软骨寡聚基质蛋白(COMP)、蛋白聚糖和弹性蛋白组成的组。
在优选的实施方案中，目的基因产物是血管活性肠肽(VIP)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是分化簇39(CD39)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是分化簇73(CD73)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是超氧化物歧化酶(SOD)。
在优选的实施方案中，目的基因产物是用于功能基因组编辑的序列特异性核酸酶(复合物)。用于本发明所有实施方案的功能基因组编辑系统是本领域技术人员已知的并包括：转录激活物样效应物核酸酶(TALEN，Gaj等人(2013)Trends Biotechnol.31(7):397-405)、锌指核酸酶(ZFN，Gaj等人(2013)同上)、大范围核酸酶诸如I-SceI(Arnould等人(2007)J Mol Biol 371(1):49-65；Takeuchi等人(2011)PNAS USA 108(32):13077-13082)、RNA引导的内切核酸酶系统如CRISPR/Cas(Mali等人(2013)Nat methods 10(10):957-963；Mali等人(2013)Nat Biotechnol 31(9):833-838；Cong等人(2013)Science339(6121):819-823)和CRISPR/Cpf1(Zetsche等人(2015)Cell163(3):759-771)、形成三链体的分子、合成聚酰胺和设计锌指蛋白(Uil等人(2003)Nucleic Acids Res 31(21):6064-6078)。功能基因组编辑系统使用在基因组的所需位置产生位点特异性双链断裂的核酸酶。通过非同源末端连接或同源重组修复诱导的双链断裂。因此，获得了靶向突变。通过这些方法中的任一种在其天然位置用正常等位基因替换缺陷基因(引起疾病或病症)是有利的，因为当仅需要改变一小部分基因时，不需要在rAAV病毒体中包括完整的编码序列和调节序列。部分替换的基因的表达也被认为比病毒体携带的完整基因更符合正常细胞生物学。优选的基因编辑系统是CRISPR(包括CRISPR/Cpf1和CRISPR-Cas)，因为它比其他方法更快速和更便宜。一个主要优点还在于，使用CRISPR单指导RNA，CRISPR可以容易地重新靶向不同的DNA序列。因此，可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一优选的实施方案中，rAAV基因组包含以下中的至少一种：(i)包含编码至少一种指导RNA(gRNA)的序列的多核苷酸；其中所述指导RNA与基因组中的靶多核苷酸序列基本上互补，优选互补；和(ii)包含编码核酸酶的序列的多核苷酸；其中所述核酸酶与所述指导RNA形成核糖核酸酶复合物，并且其中所述核糖核酸酶复合物使得基因组中的位点特异性双链DNA断裂。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白是如本文定义的修饰的衣壳蛋白。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z
a.包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：
y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A
其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和
b.存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV1 P4修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV2 P2修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV7 A6修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV9 A2修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAVrh10A6修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAVrh10A2修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含AAV-DJ-QR-P2修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含编码目的基因产物的转基因。优选地，目的基因产物是如上定义的目的基因产物。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的组成型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含组织特异性启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CMV启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CBA(鸡β肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的EF1α启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的TGF-β(TGB1)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的IL1β启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的IL8(CXCL8)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP3启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ICAM1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS4启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COL1A1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的RUNX2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COX2(PTGS2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的VEGF(VEGFA)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的组成型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含组织特异性启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CMV启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CBA(鸡β肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的EF1α启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的TGF-β(TGB1)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的IL1β启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的IL8(CXCL8)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP3启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ICAM1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS4启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COL1A1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含。在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1 P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ IDNO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的RUNX2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COX2(PTGS2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的VEGF(VEGFA)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的组成型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含组织特异性启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CMV启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CBA(鸡β肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的EF1α启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的TGF-β(TGB1)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的IL1β启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的IL8(CXCL8)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP3启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ICAM1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS4启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COL1A1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的RUNX2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制的COX2(PTGS2)启动子。在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2 P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的VEGF(VEGFA)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的组成型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含组织特异性启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CMV启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的CBA(鸡β肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的EF1α启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的TGF-β(TGB1)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL1β启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL8(CXCL8)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP3启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ICAM1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS4启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COL1A1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的RUNX2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COX2(PTGS2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的VEGF(VEGFA)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的组成型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含组织特异性启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CMV启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CBA(鸡β肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的EF1α启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TGF-β(TGB1)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL1β启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL8(CXCL8)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP3启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ICAM1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS4启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COL1A1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的RUNX2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COX2(PTGS2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的VEGF(VEGFA)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的组成型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含组织特异性启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CMV启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CBA(鸡β肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的EF1α启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TGF-β(TGB1)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL1β启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL8(CXCL8)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP3启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ICAM1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS4启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COL1A1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的RUNX2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COX2(PTGS2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的VEGF(VEGFA)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的组成型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含组织特异性启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CMV启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CBA(鸡β肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的EF1α启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TGF-β(TGB1)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL1β启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL8(CXCL8)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP3启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ICAM1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS4启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COL1A1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的RUNX2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COX2(PTGS2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的VEGF(VEGFA)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的组成型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含组织特异性启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CMV启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CBA(鸡β肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的EF1α启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的TGF-β(TGB1)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL1β启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选本文定义的转基因)表达的IL8(CXCL8)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP3启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ICAM1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS4启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COL1A1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的RUNX2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的COX2(PTGS2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的VEGF(VEGFA)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含赋予在关节细胞中的表达的启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达。优选地，赋予在关节细胞中的表达的启动子是赋予在关节炎关节中的细胞的表达的启动子。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的SV40启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的NFκB应答型(诱导型)启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的炎性调节剂的启动子。优选地，启动子是促炎细胞因子基因的启动子。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL-6(HGF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CXCL10启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP13启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMDEC1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP12启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS5启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TNFα(TNF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在衣壳蛋白的表面。优选地，氨基酸序列Z；a)包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和b)存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的基本FGF(FGF2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含赋予在关节细胞中的表达的启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达。优选地，赋予在关节细胞中的表达的启动子是赋予在关节炎关节中的细胞的表达的启动子。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的SV40启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的NFκB应答型(诱导型)启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的炎性调节剂的启动子。优选地，启动子是促炎细胞因子基因的启动子。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL-6(HGF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CXCL10启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP13启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMDEC1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP12启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白在蛋白的C末端部分包含。在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1 P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ IDNO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS5启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TNFα(TNF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(AAV1P4)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:1具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的基本FGF(FGF2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含赋予在关节细胞中的表达的启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达。优选地，赋予在关节细胞中的表达的启动子是赋予在关节炎关节中的细胞的表达的启动子。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的SV40启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的NFκB应答型(诱导型)启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的炎性调节剂的启动子。优选地，启动子是促炎细胞因子基因的启动子。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL-6(HGF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CXCL10启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP13启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMDEC1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP12启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS5启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制的TNFα(TNF)启动子。在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列(AAV2 P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:2具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的基本FGF(FGF2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含赋予关节细胞中表达的启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达。优选地，赋予在关节细胞中的表达的启动子是赋予在关节炎关节中的细胞的表达的启动子。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的SV40启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的NFκB应答型(诱导型)启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的炎性调节剂的启动子。优选地，启动子是促炎细胞因子基因的启动子。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL-6(HGF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CXCL10启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP13启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMDEC1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP12启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS5启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TNFα(TNF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列(AAV7A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:3具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的基本FGF(FGF2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含赋予在关节细胞中的表达的启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达。优选地，赋予在关节细胞中的表达的启动子是赋予在关节炎关节中的细胞的表达的启动子。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的SV40启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的NFκB应答型(诱导型)启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的炎性调节剂的启动子。优选地，启动子是促炎细胞因子基因的启动子。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL-6(HGF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CXCL10启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP13启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMDEC1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP12启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS5启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TNFα(TNF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列(AAV9A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:4具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的基本FGF(FGF2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含赋予在关节细胞中的表达的启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达。优选地，赋予在关节细胞中的表达的启动子是赋予在关节炎关节中的细胞的表达的启动子。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的SV40启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的NFκB应答型(诱导型)启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的炎性调节剂的启动子。优选地，启动子是促炎细胞因子基因的启动子。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL-6(HGF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CXCL10启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP13启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMDEC1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP12启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS5启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TNFα(TNF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列(AAVrh10 A6)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:5具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的基本FGF(FGF2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含赋予在关节细胞中的表达的启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达。优选地，赋予在关节细胞中的表达的启动子是赋予在关节炎关节中的细胞的表达的启动子。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的SV40启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的NFκB应答型(诱导型)启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的炎性调节剂的启动子。优选地，启动子是促炎细胞因子基因的启动子。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL-6(HGF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CXCL10启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP13启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMDEC1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP12启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS5启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TNFα(TNF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列(AAVrh10 A2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:6具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的基本FGF(FGF2)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的诱导型启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含赋予在关节细胞中的表达的启动子，所述启动子控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达。优选地，赋予在关节细胞中的表达的启动子是赋予在关节炎关节中的细胞的表达的启动子。优选的启动子赋予在结缔组织细胞、滑膜细胞、滑膜下细胞、内膜巨噬细胞、FLS、软骨细胞、软骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、破骨细胞和T细胞中的至少一种中的表达，优选所述启动子赋予在FLS细胞中的表达。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的SV40启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CAG(巨细胞病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的肝特异性启动子。优选地，肝特异性启动子是TBG(甲状腺素结合球蛋白)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的NFκB应答型(诱导型)启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)启动子是NFκB应答型(诱导型)最小CMV启动子。优选地，NFκB应答型(诱导型)CMV启动子是Khoury等人2007,J Gene Med,9:596-604中描述的启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的炎性调节剂的启动子。优选地，启动子是促炎细胞因子基因的启动子。优选地，促炎细胞因子基因的启动子是促炎细胞因子基因的最小启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的IL-6(HGF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的CXCL10启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP2启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP13启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMDEC1启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的MMP12启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的ADAMTS5启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的TNFα(TNF)启动子。
在优选的实施方案中，修饰的衣壳蛋白包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列(AAV-DJ-QR-P2)或由其组成。优选地，修饰的衣壳蛋白与SEQ ID NO:7具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。优选地，SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性。优选地，包含如本文定义的修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体还包含控制转基因(优选如本文定义的转基因)表达的基本FGF(FGF2)启动子。
在第二方面，本发明涉及用于治疗、预防或抑制与关节炎疾病相关联的症状的rAAV组合物，其中所述rAAV组合物包含本发明的rAAV病毒体和药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂，优选药学上可接受的载剂。此类药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂可以例如在Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第20版.Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins,2000中找到。任何合适的药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂可用于本发明组合物中(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,1997年4月)。优选的药物形式将与无菌盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液或其他药学上可接受的无菌流体组合。可替代地，可以使用固体载剂，例如像微载剂珠。
药物组合物通常在制造和储存条件下是无菌且稳定的。药物组合物可被配制为适于适应高药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其他有序结构。载剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可例如通过使用包衣剂诸如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需要的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在很多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖类，多元醇诸如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠。可以通过在组合物中包含例如单硬脂酸盐和明胶的延长吸收的试剂实现可注射组合物的延长吸收。细小病毒病毒体可以作为丸剂或在控释制剂中施用，例如在包含缓释聚合物或将保护化合物免于快速释放的其他载剂的组合物中施用，所述组合物包括植入物和微囊化递送系统。可以例如使用生物可降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。如本文所用，“药学上可接受的载剂”或“赋形剂”优选地包括生理上可相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载剂包括无菌水性溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或剂与活性化合物不相容，否则预期其在本发明的药物组合物中的用途。
以易于施用和实现剂量均匀性的剂量单位形式配制肠胃外组合物可以是有利的。如本文中所用，“剂量单位形式”是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理离散单元，各单元含有根据计算产生所需治疗效果的预定量的活性化合物以及需要的药物载剂。本发明的剂量单位形式的规格可由活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及由配混这种活性化合物以用于治疗个体病状的领域中固有的限制因素来规定。
补充活性化合物也可掺入本发明的药物组合物中。关于共同施用另外的治疗剂的指导可以例如在加拿大药剂师协会(Canadian Pharmacists Association)的药物和专业大纲(CPS)中找到。
在一个实施方案中，rAAV组合物还包含空颗粒(即仅衣壳颗粒，因此不包含rAAV基因组)。因此，可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一实施方案中，本发明的rAAV组合物还包含空衣壳，空衣壳与rAAV病毒体的比率为至少1:1，更优选至少5:1，甚至更优选至少10:1。rAAV组合物可以包含如上定义的rAAV病毒体和空衣壳，例如像WO 2016/055437中所定义的，所述专利通过引用并入本文，并且如Aalbers等人(2017)Hum.GeneTher.28(2):168-178中所述。与本发明的组合物的rAAV转基因载体相比，空衣壳可以具有相同血清型或不同血清型。优选地，空衣壳与rAAV病毒体具有相同的血清型。在此种rAAV组合物中，空衣壳和rAAV病毒体的衣壳可包含本发明的修饰的衣壳蛋白，优选相同类型的修饰的衣壳蛋白。然而，还包括一种rAAV组合物，其中与rAAV病毒体的修饰的衣壳蛋白相比，空衣壳具有不同的血清型或者是不同的修饰的衣壳蛋白。还包括一种rAAV组合物，其中空衣壳具有血清型的混合物，诸如但不限于AAV2和AAV5衣壳的混合物。本发明人报告了在关节内施用与显著量的空衣壳混合的rAAV病毒体后关节中转基因表达的增加效果。优选地，rAAV病毒体和空衣壳存在于组合物中，空衣壳与rAAV病毒体的比率为至少1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、15:1、20:1、50:1、100:1或1000:1，优选至少5:1(即空衣壳的量为rAAV转基因载体的量的至少5倍)。优选地，所述组合物包含rAAV病毒体和空衣壳，空衣壳与rAAV-转基因载体的比率为至多10000:1、5000:1、4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、15:1、10:1或5:1，优选至多1000:1。优选地，所述组合物包含rAAV病毒体和空衣壳，空衣壳与rAAV病毒体的比率为1:1至100:1、2:1至100:1、5:1至100:1、1:1至20:1、2:1至20:1或优选地在5:1至20:1之间。
上文提供了一个实施方案，其中rAAV病毒体和空衣壳存在于单一组合物中。本发明还包括一个替代性实施方案，其中rAAV病毒体和空衣壳存在于(至少两个或更多个)分开的、不同的组合物中。在此替代性实施方案中，rAAV病毒体和空衣壳可以在时间(例如，依次地)和/或位置方面分开施用，其中位置应理解为施用位点。此外，rAAV病毒体和空衣壳可以同时施用，例如在基本上相同的时间，任选地在分开的位置。
在第三方面，本发明涉及一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV组合物如上所定义，并且其中所述治疗或预防包括向个体施用所述rAAV组合物和施用所述免疫抑制剂。通过引用并入本文的WO 2016/055437公开了当用免疫抑制剂和rAAV病毒体两者治疗受试者时，免疫抑制剂对AAV转基因表达的增加效果。此外，WO 2016/055437公开了免疫抑制剂与空载体一起对rAAV转基因表达的惊人协同效果。在一个实施方案中，免疫抑制剂与rAAV组合物分开应用，分开意指在位置和/或时间上分开。在这样的实施方案中，免疫抑制剂和rAAV组合物可以存在于分开和不同的组合物中。免疫抑制剂、rAAV病毒体和任选的空载体甚至可以各自存在于分开的、不同的组合物中。在另一个实施方案中，免疫抑制剂和rAAV组合物可以存在于单一组合物中。在另一实施方案中，rAAV病毒体和免疫抑制剂存在于单一组合物中，并且优选地，此组合物与包含空衣壳的单独组合物一起用于治疗。在更进一步的实施方案中，免疫抑制剂和空衣壳存在于单一组合物中，并且优选地，此组合物与包含rAAV病毒体的单独组合物一起用于治疗。因此，本发明还提供了包含如本文定义的空衣壳和免疫抑制剂的组合物，包含如本文定义的rAAV病毒体和免疫抑制剂的组合物，以及包含如本文定义的rAAV组合物和免疫抑制剂的组合物。
优选地，用于本发明的免疫抑制剂是先天免疫细胞抑制剂，优选巨噬细胞抑制剂。先天免疫细胞在本文中定义为嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或树突细胞，其具有参与对外来物质的炎性应答的潜力。先天免疫细胞抑制剂在本文中定义为导致先天免疫细胞活性和/或先天免疫细胞数目减少的剂。巨噬细胞抑制剂在本文中定义为导致巨噬细胞活性和/或巨噬细胞数目减少的剂。“巨噬细胞”在本文中理解为在称为吞噬作用的过程中吞噬和消化细胞碎片、外来物质、微生物和癌细胞的先天免疫细胞。优选地，与治疗前先天免疫细胞或巨噬细胞的初始数目或活性相比，本发明的先天免疫细胞或巨噬细胞抑制剂导致先天免疫细胞或巨噬细胞的数目或活性减少至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％或优选100％。先天免疫细胞或巨噬细胞活性和/或数目可以通过本领域技术人员已知的任何合适的测定来检测，诸如但不限于如Ferrari等人(Journal of Immunological Methods,131(1990)165-172)描述的用于体外测试巨噬细胞细胞毒性活性的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基四唑溴化物)比色测定、通过测量细胞因子水平(例如CCL2、TNF)、通过组织学和组织化学检测方法，例如通过CD68标记或通过体内磁共振成像(MRI)检测巨噬细胞对超顺磁性氧化铁(SPIO)的摄取(优选在静脉内施用SPIO之后)，如由Yi-Xiang J.Wang(Quant.ImagingMed Surg(2011)1:35-40)所综述。检测可以在体外或体内进行。优选地，体内检测在动物模型，优选大鼠或鼠模型中进行。
优选地，免疫抑制剂是糖皮质激素和/或二膦酸盐，优选脂质体二膦酸盐。糖皮质激素的具体非限制性实例是皮质醇、可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮和醛固酮。优选地，免疫抑制剂是曲安西龙。二膦酸盐的具体非限制性实例是依替膦酸盐、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、帕米膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸盐和唑来膦酸盐。优选地，二膦酸盐是脂质体包封的二膦酸盐或脂质体二膦酸盐，优选脂质体氯膦酸盐。优选地，糖皮质激素不是地塞米松。应当理解，本发明的炎性或巨噬细胞抑制剂不限于糖皮质激素和/或二膦酸盐。例如，本发明的炎性或巨噬细胞抑制剂也可以是炎性或巨噬细胞消耗性抗体，诸如抗F4/80抗体。优选地，此种抗体是人或人源化抗体。本发明中使用的其他相关免疫抑制剂是细胞抑制药物(例如烷化剂和/或抗代谢物诸如甲氨蝶呤)、改变嘌呤能信号传导途径的药物(例如甲氨蝶呤、腺苷类似物、腺苷受体拮抗剂或激动剂)、非甾体抗炎药物(NSAIDS，例如布洛芬、双氯芬酸、美洛昔康、萘普生、乙酰水杨酸)、生物制剂诸如TNF阻断剂(例如英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗)、IL-6阻断剂(例如托珠单抗)、IL-2阻断剂(例如巴利昔单抗、达克珠单抗)、IL-1β阻断剂(例如阿那白滞素、利纳西普、卡那奴单抗)、IL-17(苏金单抗、布罗达单抗、艾克珠单抗(ixekinumab))、抗IL-12/IL-23(乌司奴单抗)、PDE4抑制剂(阿普斯特)莫罗单抗、阿巴西普、和/或利妥昔单抗、和/或其他化合物，诸如羟基氯喹、氯喹、来氟米特、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、金盐、mTOR抑制剂(例如雷帕霉素/西罗莫司、依维莫司)和青霉胺。
优选地，rAAV组合物和/或包含空衣壳的组合物和/或包含免疫抑制剂的组合物还包含如本文别处定义的药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂。
优选地，根据本发明的基因疗法还包括施用如本文定义的免疫抑制剂，所述免疫抑制剂存在于rAAV组合物中，或包含在分开的、不同的组合物中，即与rAAV组合物分开且不同的组合物。在施用时，将本发明的rAAV组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂递送至个体、所述个体的细胞、组织或器官，优选罹患如本文定义的病状或疾病的个体。优选地，rAAV组合物和免疫抑制剂同时施用。同时施用在本文中应理解为或多或少同时施用，优选在时间上间隔不超过15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、12小时或24小时，优选在时间上间隔不超过15分钟。在另一个实施方案中，依次施用rAAV组合物和免疫抑制剂，其中优选在rAAV组合物之前施用免疫抑制剂。优选地，在施用rAAV组合物之前至少1小时、3小时、12小时、24小时、2天、4天或1周施用免疫抑制剂。在rAAV病毒体和空衣壳存在于分开的组合物中的情况下，免疫抑制剂可以与空衣壳同时或在空衣壳之前至少15分钟、1小时、2小时、3小时、1天、2天或1周内施用，并且空衣壳进而与rAAV病毒体同时或在rAAV病毒体之前至少15分钟、1小时、2小时、3小时、1天、2天或3天内施用。
在本文定义的实施方案中，免疫抑制剂可以重复施用，即在rAAV组合物之前和/或同时施用。如上文所述，优选地，rAAV组合物包含大量的空衣壳。此外，本发明包括施用在分开的、不同的组合物中的rAAV转基因载体和空衣壳两者，其可以在本发明的方法或用途中同时或依次施用。如果包含在分开的组合物中，rAAV转基因载体和空衣壳优选同时施用。在另一实施方案中，在rAAV-转基因载体施用之前至多3天、2天、1天、24小时、12小时、3小时、2小时、1小时、30分钟、15分钟或5分钟，优选至多24小时施用空衣壳。此外，如果包含在分开的组合物中，则rAAV-转基因载体和空衣壳优选在相同位点施用。
免疫抑制剂剂量取决于免疫抑制剂的类型。有效剂量是本领域技术人员已知的。曲安西龙的优选治疗有效剂量如上所述。脂质体氯膦酸盐的优选治疗有效剂量优选是本领域技术人员已知的治疗有效剂量，例如优选80-320mg/关节内剂量，更优选160mg/关节内剂量(Barrera等人2000,Arthritis&Rheumatism第43(9)卷,第1951-1959页)。
通常，关节病症被称为关节病，并且当涉及一个或多个关节的炎症时，所述病症被称为关节炎。大多数关节病症涉及关节炎，然而，由外部物理创伤引起的关节损伤通常不称为关节炎。如本文所用，术语“关节炎疾病”，也称为“关节炎”，在本文中定义为涉及一个或多个关节的炎症的关节病症的形式。目前，估计有超过一百种不同形式的关节炎。关节炎疾病在本文中被理解为是指“关节疼痛”或“关节疾病”。在一个优选的实施方案中，关节炎疾病选自由以下组成的组：成年型斯蒂尔病、强直性脊柱炎、关节炎、背痛、贝克西特病、钝伤、滑囊炎、焦磷酸钙沉积病(CPPD)、腕管综合征、软骨软化髌骨、慢性疲劳综合征、复杂区域性疼痛综合征、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、退行性椎间盘疾病、髋关节发育不良、埃勒斯-当洛斯(Ehlers-Danlos)、家族性地中海热、纤维肌痛、第五疾病、巨细胞动脉炎、痛风、血色病、感染性关节炎、炎性关节炎、炎性肠病、关节置换、幼年型关节炎、幼年型皮肌炎(JD)、幼年型特发性关节炎(JIA)、幼年型类风湿性关节炎、幼年型硬皮病、川崎病、狼疮、儿童和青少年狼疮、莱姆病、混合性结缔组织病、肌炎(包括多肌炎、皮肌炎)、骨关节炎(OA)、骨质疏松症、佩吉特病、回文性风湿病、髌股疼痛综合征、小儿风湿病、小儿SLE、风湿性多肌痛、假痛风、银屑病关节炎、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、莱特尔氏综合征、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性关节炎、干燥病、椎管狭窄、脊椎关节炎、斯蒂尔病、系统性幼年特发性关节炎、系统性红斑狼疮、儿童和青少年系统性红斑狼疮、系统性硬化症、颞动脉炎、腱炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病。在进一步优选的实施方案中，关节炎疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(RA)、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎(OA)、痛风、假痛风、脊椎关节炎(SpA)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、脓毒性关节炎、关节炎、幼年型特发性关节炎、钝伤、关节置换和斯蒂尔病。在一个更优选的实施方案中，关节炎疾病是涉及一个或多个关节的炎症的关节病症。优选地，关节炎疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(RA)、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎(OA)、痛风、假痛风、脊椎关节炎(SpA)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、脓毒性关节炎、关节炎、幼年型特发性关节炎和斯蒂尔病。
可替代地，或与另一个实施方案组合，在本发明的另一优选的实施方案中，rAAV病毒体或rAAV组合物全身和/或局部施用。本发明的rAAV组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂可使用本领域已知的合适方法直接或间接施用。本发明的方法和用途包括全身、区域或局部或通过任何途径，例如通过注射、输注、口服(例如摄取或吸入)或局部(例如透皮)递送和施用rAAV组合物和/或空载体和/或免疫抑制剂。示例性施用和递送途径包括静脉内(i.v.)、关节内、腹膜内(i.p.)、动脉内、肌内、肠胃外、皮下、胸膜内、局部、真皮、皮内、透皮、肠胃外(例如经粘膜)、颅内、脊柱内、口服(消化道)、粘膜、呼吸、鼻内、插管、肺内、肺内滴注、颊、舌下、血管内、鞘内、腔内、离子电渗、眼内、眼、光、腺内、器官内、淋巴管内。考虑到迄今为止已经取得的进展，预期用于向个体或所述个体的细胞、组织、器官提供本发明的rAAV组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂的手段的改进。当然可以结合此类未来的改进以实现本发明的上述效果。当施用本发明的rAAV组合物和/或空衣壳和/或免疫抑制剂时，优选将这种组合和/或组合物溶于与递送方法相容的溶液中。对于静脉内、皮下、肌内、鞘内、关节内和/或心室内施用，优选溶液是生理盐溶液。在本发明的rAAV组合物中存在免疫抑制剂的情况下，免疫抑制剂在与rAAV组合物相同的部位施用，即优选如上所述局部施用。在免疫抑制剂包含在不同于rAAV组合物的分开组合物中的实施方案中，免疫抑制剂可以全身施用，优选肌内或静脉内施用。rAAV组合物也可局部施用，优选在包含大量如本文定义的巨噬细胞的身体部位施用，并且免疫抑制剂全身施用，优选肌内或静脉内施用。本发明还包括一个实施方案，其中免疫抑制剂和rAAV组合物，即使存在于不同的组合物中，也在相同的部位施用，优选局部施用，更优选关节内施用。如本文进一步所述，此类不同组合物的施用可以是同时的或依次的。在本发明的一个优选的实施方案中，rAAV组合物和免疫抑制剂中的至少一种局部施用。更优选地，局部施用是关节内施用。“关节内注射”(也称为“关节注射”或“关节内注射”)在本文中定义为注射或输注到关节中。关节内注射通常用于将抗炎剂施用到受炎症影响的关节中。
在另一方面，本发明涉及一种rAAV组合物，其包含本发明的rAAV病毒体和药学上可接受的载剂、稀释剂、增溶剂、填充剂、防腐剂和/或赋形剂，优选如本文定义的药学上可接受的载剂。在一个优选的实施方案中，组合物还包含如本文定义的空衣壳和/或如本文定义的免疫抑制剂。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗、预防或抑制与关节炎疾病相关联的症状的方法，其中所述方法包括关节内施用包含有效量的如本文定义的rAAV病毒体或如上定义的rAAV组合物的药物的步骤。
"治疗有效量"是指在必要剂量和时间段内有效达成所需治疗结果的量。核酸、核酸构建体、rAAV病毒体或药物组合物的治疗有效量可根据诸如待治疗受试者的疾病状态、年龄、性别和体重、以及核酸、核酸构建体、rAAV病毒体或药物组合物在受试者中引发所需应答的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。治疗有效量通常也是其中核酸、核酸构建体、rAAV病毒体或药物组合物的治疗有益效果超过任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需预防结果(诸如预防或抑制各种病状)的量。预防剂量可以在疾病之前或疾病的早期阶段用于受试者，并且在一些情况下，预防有效量可以大于或小于治疗有效量。所施用的剂量可在很大程度上取决于所治疗的受试者的病状和体型以及治疗制剂、治疗频率和施用途径。持续疗法的方案，包括剂量、配方和频率可由初始应答和临床判断指导。
术语“受试者”或“患者”在本文中可互换使用，并且是指可用本发明的组合物和/或rAAV治疗的动物，包括人类。因此，术语“受试者”或“患者”包括但不限于人、非人灵长类动物诸如黑猩猩和其他猿和猴物种、或任何哺乳动物诸如狗、猫、马、羊、猪、牛等。在本发明的一个优选的实施方案中，用根据本发明的rAAV治疗的受试者是哺乳动物，更优选人、狗、猫或马，最优选人。
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变化以其非限制性意义使用，意指包括所述词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，通过不定冠词"一个(a)”或“一种(an)”引用的要素并不排除存在超过一个所述要素的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个且近一个所述要素。因此，不定冠词"一个”或“一种”通常是指“至少一个/种”。
词语“近似”或“约”在与数值(近似10、约10)结合使用时，优选地意指所述值可以是10的给定值±所述值的10％。
本说明书中引用的所有专利以及参考文献特此以引用的方式整体并入。
仅出于说明目的提供以下实施例，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
下面将参考附图更详细地讨论本发明：
图1：在HEK293T和FLS细胞上筛选衣壳血清型。含有7种表达黄色荧光蛋白(YFP)的突变衣壳血清型(加AAV5)的粗裂解物用于转导HEK293T细胞或3种不同的FLS细胞系(每种来自不同的RA患者)。72小时(HEK293T)或6天(FLS)后，通过流式细胞术测定细胞中表达YFP的细胞的百分比。图A示出了表达YFP的HEK 293T细胞％；图B示出了3种不同FLS细胞系中表达YFP的细胞％；图C示出了HEK293T细胞中的平均荧光强度(MFI)；图D示出了3种不同FLS细胞系(所有细胞)中的MFI；图E示出了3种不同FLS细胞系(仅阳性群体)中的MFI。样品图例如表2所示。
图2：衣壳突变体在FLS细胞中相对于wt-AAV5示出增加的荧光素酶表达。使用两种MOI(20000或100000rAAV颗粒/细胞)，使用表达YFP-Luc融合蛋白的纯化AAV(4种突变血清型或AAV5)转导来自不同RA患者的三种不同FLS细胞系：BB5498(FLS 1)、BB5540(FLS 2)和BB7144(FLS 3)。4天后，裂解细胞并测量荧光素酶表达。数据表示为绝对荧光素酶表达水平(RLU；白色条)或相对于AAV5的倍数增加(黑色条)。图A示出了MOI 20K下的FLS 1；图B示出了MOI 100K下的FLS 1；图C示出了MOI 20K下的FLS 2；图D示出了MOI 100K下的FLS 2；图E示出了MOI 20K下的FLS 3；并且图F示出了MOI 100K下的FLS 3。空心条示出了荧光素酶(RLU)，并且实心条示出了相对于AAV5的“倍数增加”。在不同的实验中，使用2种MOI(10K或100K rAAV颗粒/细胞)，用表达荧光素酶的AAV(7种突变血清型或AAV5)转导来自RA患者的另外三种FLS细胞系：BB4308(FLS 4)、BX1592(FLS 5)、BB4426(FLS 6)。图G示出了MOI10K下的FLS 4；图H示出了MOI 100K下的FLS 4；图I示出了MOI10K下的FLS 5；图J示出了MOI 100K下的FLS 5；图K示出了MOI10K下的FLS 6；图L示出了MOI 100K下的FLS 3。
还在HEK293T细胞中评价了7种突变血清型或AAV5(MOI100K)的转导功效(图M)。空心条显示荧光素酶表达(RLU)，并且实心条显示相对于AAV5的“倍数增加”。
图3A：衣壳突变体在体内表现出增加的基因表达。使用气囊滑膜模型将两种衣壳突变体(AAV9-A2和AAV7-A6)与wtAAV5进行比较。在气囊形成后第0天施用荧光素酶表达载体，并在转导后第3天通过活体动物成像(IVIS)测量荧光素酶表达。示出的数据是以平均值+SEM表示的气囊中的发光(光子/秒/平方厘米m2/球面度)。
图3B：在第二个实验中，将5种选择的衣壳突变体(AAV1-P4、AAV7-A6、AAV9-A2、AAVrh10-A2、AAVrh10-A6)和wtAAV5注射到小鼠的膝关节中。在第0天注射荧光素酶表达载体，并在施用后的指定时间点通过活体成像(IVIS)测量表达。所示数据是以平均值+SEM表示的发光(光子/秒/平方厘米m2/球面度)(左图)。在第14天，相对于wtAAV5，**P<0.05，***P<0.01，****P<0.00001。图3C：相对于wtAAV5的倍数增加。
图4：通过MAFFT FFT-NS-I(v7.215)进行CLUSTAL格式比对。比对下方是表示保守残基(*)；和非保守突变()的键。
图5：通过MUSCLE(3.8)的CLUSTAL多序列比对。比对下方是表示保守残基(*)；保守突变(：)；半保守突变(.)；和非保守突变()的键。
图6：通过MAFFT FFT-NS-I(v7.215)的插入物P4、A2、A6、P2和QR-P2(SEQ ID NO:8-12)的CLUSTAL格式比对。比对下方是表示保守残基(*)；和非保守突变()的键。
图7：通过MUSCLE(3.8)的插入物P4、A2、A6、P2和QR-P2(SEQ ID NO:8-12)的CLUSTAL多序列比对。比对下方是表示保守残基(*)；和非保守突变()的键。
图8：在EF1α-hTNFR-IgG1 AAV衣壳突变体转导的HEK293T/17细胞的上清液中的hTNFR2表达水平。
序列表
表1提供了与SEQ ID No相关的序列参考的解释。
表1:序列参考的解释
实施例
实施例1
衣壳文库的初始筛选
1.1.材料和方法
从海德堡大学的Dirk Grimm和Kathleen 
获得用含有来自91种不同AAV衣壳血清型的AAV的粗裂解物点样(并随后干燥)的96孔板。每个载体编码由CMV启动子驱动的YFP转基因。因为FLS是关节中的主要靶细胞，所以筛选AAV衣壳突变体文库中的血清型，这些血清型在从类风湿性关节炎患者的关节中分离出的人FLS(RA-FLS)中示出增加的表达(如van de Sande MG等人,(2011)Ann Rheum Dis 70:423-427中所述)。将RA-FLS直接铺板(2500/孔，37℃/5％CO2)在点样板(DMEM-GlutaMAX-I(Gibco，参考号31966-021)、10％FBS(热灭活(HI)牛血清金，Gibco，参考号A15-151)、10mM HEPES(Gibco，参考号15630-056)、50μg/ml庆大霉素(Gibco，参考号15710-049)、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich，参考号P0781))上，并且在6天后通过荧光显微镜观察所有孔的YFP表达。
1.2.结果
衣壳突变体相对于WT-AAV5在来自RA患者的FLS中的转导功效。
在筛选91种衣壳突变体时，虽然总体表达水平低，但本发明人鉴定了7种不同的血清型，其示出了比wtAAV5更高的表达：AAV9-A2、AAV7-A6、AAV1-P4、AAVDJ-QR-P2、AAVrh10-A6、AAVrh10-A2和AAV2-P2(氨基酸序列SEQ ID NO:1-7；wtAAV5 SEQ ID NO:19)。
将所有7种载体的粗裂解物用于3种不同患者FLS细胞系和HEK293T细胞中的体外转导测定(实施例2)。
表2：图1的样品图例
实施例2
7种选择的突变体的粗裂解物的表达
2.1.材料和方法
AAV产生
关于产生粗AAV裂解物的细节可在Grosse等人(J.Virol,2017,doi:10.1128/JVI.01198-17)中找到。
将所选择的7种衣壳突变体中的每一种的粗裂解物的等分试样(加上wtAAV5作为对照)用于转导细胞(HEK293T或从RA患者分离的3种不同的FLS细胞系)，并且在转导后3天(HEK293T)-5天(FLS)通过流式细胞术测量YFP表达。具体而言，将HEK293T以每孔45000个细胞接种在96孔板(Greiner Bio-One，参考号655180)中。将RA-FLS以每孔2500个细胞接种在96孔板中。过夜孵育后，将细胞上清液替换为含有0.001％pluronic F68溶液(SigmaP5556)的40μl DMEM-glutaMAX-I(Gibco 31966-021)。一式两份加入病毒裂解物，10μl/孔。4小时后，将含FBS(热灭活(HI)牛血清金，Gibco，参考号A15-151)，终浓度1％)的DMEM-glutaMAX-I中的阿霉素(终浓度0.4μM)(Sigma D1515)(阿霉素提高AAV转导效率)加入孔中(每孔50μl)。第二天，除去FLS培养基并加入DMEM-glutaMAX-I(10％FBS(热灭活(HI)牛血清金，Gibco，参考号A15-151)、10mM HEPES(Gibco，参考号15630)、50μg/ml庆大霉素(Gibco参考号15710-049)、100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich，参考号P0781))(200μl/孔)。HEK293T细胞的培养基没有改变。转导后三天(HEK293T细胞)或6天(FLS)，使用PBS(Gibco，参考号10010)中的0.5％胰蛋白酶/EDTA(Gibco参考号15400-054)将细胞胰蛋白酶化，并通过流式细胞术(FACSCanto II,BD Biosciences)分析YFP表达。测定所有细胞的表达细胞百分比和平均荧光强度(MFI)。
2.2.结果
将所有7种载体的粗裂解物用于3种不同患者FLS细胞系和HEK293T细胞中的体外转导测定。通过荧光显微镜(数据未示出)或流式细胞术(图1图A-E)测定细胞中表达YFP的细胞的百分比。虽然细胞类型之间存在一定程度的差异，但所有突变衣壳在FLS和HEK293T细胞中的表达均高于AAV5-WT(图1)。表2提供了图1的样品图例。基于这些结果，选择四种衣壳突变体用于进一步研究(参见实施例3)。
实施例3
衣壳变体在HEK293T和FLS中的体外测试
3.1材料和方法
3.1.1进一步研究了四种突变衣壳蛋白AAV9-A2、AAV7-A6、AAV1-P4和AAVDJ-QR-P2。产生表达YFP-荧光素酶融合蛋白(以允许进行可视化(YFP)以及通过荧光素酶测定的定量)的纯化载体(碘克沙醇梯度)。用每种血清型以2个载体剂量(MOI 20,000或100,000)转导从类风湿性关节炎患者分离的三种不同的原代FLS系(如van de Sande MG等人,(2011)Ann Rheum Dis 70:423-427中所述)，并且在4天后，收获细胞并且通过荧光素酶测定(Promega荧光素酶测定试剂盒)定量基因表达。
具体而言，将RA-FLS以2500个细胞/孔铺板在96孔板(Greiner Bio-One，参考号655207)中的培养基(DMEM-GlutaMAX(Gibco参考号31966-021)、10％FBS(热灭活(HI)牛血清金，参考号A15-151)、10mM HEPES(Gibco参考号15630-056)、50μg/ml庆大霉素(Gibco，参考号15710-049)、100u/ml青霉素/100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich Merck参考号P0781))中。48小时后，除去培养基，并以20,000或100,000的MOI加入病毒(在含有0.001％Pluronic-68(Sigma，参考号p5556)的DMEM-Glutamax中)。4小时后，加入含阿霉素(Sigma，参考号D1515，终浓度0.4μM)和FBS(终浓度1％)的培养基。
24小时后，用DMEM-GlutaMAX(10％FBS，10mM HEPES，50μg/ml庆大霉素，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素)替换培养基。转导后四天，用100μl PBS(Gibco，参考号10010)洗涤细胞1次，并使用ONE GloTM荧光素酶测定系统(Promega，参考号E6110)测定荧光素酶活性：加入100μl裂解缓冲液，并将细胞置于振荡器上10分钟，在RT下900rpm。随后，将20μl裂解物转移到白色96孔板中，加入80μl底物，持续3分钟(暗处)并在光度计上测定荧光素酶活性(1秒/孔，synergy HT，Biotek)。
3.1.2.在类似的实验中，用AAV5和来自与3.1.1中所述不同的AAV制品(AAV9-A2、AAV1-P4、AAV7-A6、AAVDJ-QR-P2、AAVrh10-A6、AAVrh10-A2、AAV2-P2)的含有荧光素酶基因的7种衣壳突变体(MOI 10,000和100,000)转导从类风湿性关节炎患者分离的另外三种FLS细胞系。AAV制品之间的空颗粒的数目不同。为了排除对转导功效的可能影响，通过加入AAV5空颗粒以使每个制品中空颗粒的百分比相等来进行空衣壳校正。
3.1.3.还在HEK293T细胞中测试了来自与3.1.2中所述相同制品的7种衣壳突变体。具体而言，将HEK293T以每孔50000个细胞接种在96孔板(Greiner Bio-One，参考号655180)中。过夜孵育后，用含有0.001％pluronicF68溶液(Sigma P5556)的DMEM-glutaMAX-I(Gibco 31966-021)替换细胞上清液。以100,000的MOI一式两份加入不同载体。在此方案中，如3.1.2所述进行空衣壳校正。4小时后，将含FBS(热灭活(HI)牛血清金，Gibco，参考号A15-151)，终浓度1％)的DMEM-glutaMAX-I中的阿霉素(终浓度0.4μM)(SigmaD1515)加入孔中。转导后三天，收获细胞并在光度计(BMG Labtech Fluostar Omega)上通过荧光素酶测定(Promega荧光素酶测定试剂盒)定量基因表达。
3.2.结果
3.2.1按照3.1.1中描述的方案，使用包含4种突变衣壳中的一种的重组AAV(以及作为对照的AAV5，以相同的方式制备)进行三种不同FLS细胞系的体外转导。当与AAV5比较时，所有4种血清型示出增加的表达水平，范围从2倍到35倍增加，这取决于使用的血清型和细胞系(图2A-F)。
3.2.2在另一系列的实验中，在3种FLS细胞系中评估了7种突变衣壳(以及AAV5对照，以相同的方式制备)的体外转导功效。当与AAV5比较时，所有7种血清型示出增加的荧光素酶表达水平，范围从6倍到55倍增加，这取决于使用的血清型和细胞系(图2G-L)。
3.2.3在HEK293T细胞中进行类似的实验。与wtAAV5相比，用所有7种血清型转导导致增强的荧光素酶表达，范围从2倍到12倍增加(图2M)。
实施例4
气囊滑膜模型中的体内研究
4.1.材料和方法
动物
雌性Balb/c小鼠(8-10周龄，体重20-25g；(Harlan,Boxmeer,the Netherlands))被饲养在阿姆斯特丹学术医疗中心动物设施的单独通风笼中。食物和水可随意获得。所有动物实验根据阿姆斯特丹大学动物研究伦理委员会的指导方针进行。
气囊滑膜(APS)模型
将两种血清型AAV9-A2和AAV7-A6与wtAAV5进行比较。气囊滑膜模型改编自Edwards等人(1981；J Pathol 134:147-156)。在第0天，将3ml空气皮下注射到7-9周龄雌性Balb/cOlaHsd小鼠(Harlan)的背部皮肤中(第0天)。形成气囊后，立即取出1ml空气，将1ml含0.001％pluronic F68(Sigma，参考号p5556)的PBS(Gibco，参考号10010中的AAV(2e10载体基因组/小鼠直接加入气囊中。转导后三天，通过体内动物成像测量基因表达。
荧光素酶表达的成像
在第3天测量荧光素酶表达。最初计划在载体施用后持续监测表达长达3个月，然而，动物设施的细小病毒感染导致所有正在进行的实验过早终止。腹膜内注射D荧光素钾盐底物(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA,USA)(150mg/kg体重，体积近似200μl)。使用冷却的电荷耦合器件(CCD)相机系统(Photon Imager,Biospace Lab,,Paris,France)在施用底物5分钟后的10分钟获取光子计数，并使用M3Vision(Biospace Lab)进行图像处理以及信号强度定量和分析。计算每秒每平方厘米每球面度发射的光子数目作为荧光素酶活性的量度。
一般动物条件和伦理声明
在异氟烷麻醉(3％异氟烷和氧气)下进行气囊形成、载体施用和体内成像。在实验结束时，在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺处死动物，然后进行颈脱位。这些研究得到阿姆斯特丹大学的动物护理和使用委员会审查和批准，并严格按照荷兰动物福利法(荷兰语：“Wetop Dierproeven”)中的建议进行。将动物在阿姆斯特丹大学的动物设施中维持在无病原体条件下。
4.2.结果
基于这些有希望的结果，使用气囊滑膜(APS)模型进行初步体内研究，其中将两种血清型AAV9-A2和AAV7-A6与wtAAV5进行比较。由于动物设施中的不幸感染需要提前终止本研究，因此我们仅能够从载体施用后第3天的单个时间点获得数据。在该时间点，清楚的是当与AAV5相比时，衣壳突变体产生增加的基因表达，其中AAV7-A6示出约6倍增加的表达并且AAV9-A2示出约22倍增加的表达(图3A)。
实施例5：
体内研究：健康动物的关节内注射
5.1.材料和方法
动物
雄性DBA1/J小鼠(12周龄，Envigo)被饲养在阿姆斯特丹学术医疗中心动物设施的单独通风笼中。食物和水可随意获得。所有动物实验都是在中心委员会动物实验(CCD)和荷兰阿姆斯特丹大学的动物研究伦理委员会批准后进行的。
表达研究
将包含衣壳突变体即AAV9-A2、AAV1-P4、AAV7-A6、AAVrh10-A6和AAVrh10-A2的五种rAAV与wtAAV5进行比较。由于衣壳负载可能影响表达(Aalbers CJ等人,Hum Gene Ther2017；28(2):168-178)，因此通过加入wtAAV5空颗粒校正rAAV制品的衣壳负载。健康小鼠(每组n＝9)在双膝关节内注射携带荧光素酶基因的AAV载体(每膝7.5x109个病毒基因组)。在载体施用后的几个时间点通过体内成像测定基因表达。
荧光素酶表达的成像
在指定的时间点测定荧光素酶表达(图3B)。在每个时间点，腹膜内注射D荧光素钾盐底物(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA,USA)(150mg/kg体重，体积近似约200μl)。使用冷却的电荷耦合器件(CCD)相机系统(Photon Imager,Biospace Lab,Paris,France)在施用底物5分钟后的15分钟获取光子计数。使用M3 Vision(Biospace Lab)进行图像处理以及信号强度定量和分析。计算每秒每平方厘米每球面度发射的光子数目作为荧光素酶活性的量度。
一般动物条件和伦理声明
在异氟烷麻醉(4％异氟烷和氧气)下进行载体施用和体内成像。这些研究严格按照荷兰动物福利法(荷兰语：“Wet op Dierproeven”)中的建议进行。将动物在阿姆斯特丹大学的动物设施中维持在无病原体条件下。
5.2.结果
在第一时间点，第3天，膝中AAV介导的表达在所有组中检测到并随时间增加(图3B)。除AAV1-P4之外的所有衣壳突变体示出相对于wtAAV5增加的表达，其中AAV9-A2显示最高的表达(在第14天相对于wtAAV5增加约5倍)(图3C)。第14天的表达水平从高到低：AAV9-A2>AAVrh10-A2>AAVrh10-A6>AAV7-A6>wtAAV5>AAV1-P4。在第7天，AAVrh10-A2、AAV9-A2和AAVrh10-A6相对于wtAAV5示出显著增加的表达(相对于第14天的wtAAV5，**P<0.05，***P<0.01，****P<0.00001)。(图3B)。
实施例6：
人血清中针对衣壳突变体的中和抗体滴度的测定
6.1材料和方法
将HEK293T细胞铺板在96孔透明底的板中的含有9％FBS、0.9％青霉素/链霉素的DMEM中。在转导之前使细胞静置24小时(在37℃，5％CO2下)。如下稀释人血清样品(从法国血液研究所获得)：未稀释的纯血清–1:4–1:16–1:64–1:256–1:1,024(纯血清意指1体积病毒/1体积血清)。–将合并的小鼠血浆样品(来自10只DBA/1小鼠，在关节内注射AAV5载体后42天采集)在FBS中如下连续稀释：1:10–1:50–1:250–1:6,250–1:31,250。将人静脉内免疫球蛋白(IVig,Sanquin,批号15D30H4560A)的溶液从1:10连续半对数稀释至1:10,000。将样品和对照与适当的衣壳突变体或wtAAV5载体一起在35℃-38℃下孵育30'±5min，MOI为2,500(如先前所测定)。48±2小时后，加入荧光素酶试剂，并用VictorX酶标仪测量发光发射。转导抑制滴度被确定为仍与可检测的中和活性相关的最高血清稀释度，即中和活性>50％。
6.2结果
如表3所示，70％-85％的样品不含有针对wtAAV5或7种衣壳突变体的中和抗体。大多数样品对七种衣壳突变体具有反应性，因此对野生型AAV5衣壳具有反应性的血清样品也对其他衣壳有反应。就应答水平而言，它们在衣壳突变体之间也是相当的。对于每个衣壳突变体，指出未反应的样品数目(ND＝未检测到)。这些数据仅作为信息给出，因为很难比较不同载体的滴度。关于来自关节内注射的关节的合并的小鼠血清样品，其仅对用于免疫动物的WT AAV5衣壳有反应，而对突变衣壳未观察到应答(表3)。所有衣壳突变体和WT AAV5被IVIg中和(滴度>100)(数据未示出)。
表3：对于每种血清样品以及合并的小鼠血浆，报告了抑制滴度，并且所述抑制滴度对应于仍与可检测的中和活性相关的最高稀释度。滴度>8被认为是血清阳性。正信号以粗体/斜体突出显示。ND＝未检测到
实施例7：
含有EF1α启动子和hTNFR2-IgG1转基因的AAV衣壳突变体在HEK293T/17细胞中的体外表达。
材料和方法
产生表达人TNFR2-IgG1(依那西普)的三种AAV载体(AAV5wt、AAV9A2、AAVrh10A2)(基于抗体的亲和力和氯化铯梯度纯化)，并在HEK293T/17细胞中评估表达水平。AAV5wt是野生型AAV5，AAV9A2包含修饰的衣壳蛋白AAV9 A2，并且AAVrh10A2包含修饰的衣壳蛋白AAVrh10 A2。
具体而言，将HEK293T/17细胞以105,000个细胞/孔接种在48孔板(Costar，参考#3548.)中。过夜孵育后，用含有0.001％pluronic F68溶液(Sigma P5556)的DMEMglutaMAX-I(Gibco 31966-021)替换细胞上清液。以100,000的感染复数(MOI)一式两份加入不同载体。4小时后，向孔中加入在含FBS(热灭活(HI))牛血清金，(Gibco，参考号10270-106)，(终浓度1％)的DMEM-glutaMAX-I中的阿霉素(终浓度0.4μM)(Sigma D1515)或阿霉素(终浓度0.4μM)(Sigma D1515)与LPS(终浓度1μg/ml)(Sigma，参考#L2880-10 mg)(LPS诱导细胞炎症)的组合。转导后三天，收获上清液，通过可溶性hTNFR2 DuoSet Elisa(R&Dsystems参考#DY726)定量上清液中的hTNFR2-IgG1水平。
结果
与wtAAV5相比，用AAV9A2和AAVrh10A2转导导致hTNFR2表达水平增加，在未刺激和LPS刺激的细胞中增加9-13倍。(图8)。
结论
与AAV5wt病毒体相比，包含修饰的衣壳蛋白AAV9A2或AAVrh10A2的病毒体在HEK293/17细胞中产生更高的基因表达水平。
以上参考附图所示的多个示例性实施方案描述了本发明。一些部分或元件的修改和替代实施是可能的，并且包括在所附权利要求限定的保护范围内。
Claims (18)
1.一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其包含修饰的衣壳蛋白和与编码目的基因产物的核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述rAAV病毒体用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状，其中所述修饰的衣壳蛋白在所述蛋白的C末端部分包含氨基酸序列Z，其残基暴露在所述衣壳蛋白的表面上，优选地其中所述目的产物是免疫抑制剂。
2.根据权利要求1所述使用的rAAV病毒体，其中所述氨基酸序列Z:
a.包含式I的氨基酸残基序列或由其组成：
y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A
其中x表示单个氨基酸残基并且其中y表示0、1或2个氨基酸残基；和
b.存在于对应于距野生型AAV衣壳蛋白C末端的位置100-200，优选120-180，更优选130-170，更优选140-160的氨基酸残基的位置。
3.根据权利要求1或2所述使用的rAAV病毒体，其中所述目的基因产物是IL-6抑制剂。
4.根据权利要求1或2所述使用的rAAV病毒体，其中所述目的基因产物是TNFα抑制剂。
5.根据权利要求1或2所述使用的rAAV病毒体，其中所述目的基因产物是IL-1抑制剂。
6.根据权利要求3所述使用的rAAV病毒体，其中所述IL-6抑制剂选自由IL-6受体拮抗剂、人源化抗IL-6单克隆抗体、嵌合抗IL-6单克隆抗体、人源化兔抗IL-6单克隆抗体和可溶性IL-6受体组成的组，优选地其中至少一种
i)所述IL-6受体拮抗剂是托珠单抗和赛诺菲单抗中的至少一种；
ii)所述人源化抗IL-6单克隆抗体是奥洛组单抗和西鲁库单抗中的至少一种；
iii)所述嵌合抗IL-6单克隆抗体是司妥昔单抗；并且
iv)所述人源化兔抗IL-6单克隆抗体是克拉扎珠单抗。
7.根据权利要求4所述使用的rAAV病毒体，其中所述TNFα抑制剂选自由依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗聚乙二醇和戈利木单抗组成的组，优选地其中所述TNFα抑制剂是依那西普。
8.根据权利要求5所述使用的rAAV病毒体，其中所述IL-1抑制剂选自由以下组成的组：
i)IL-1受体拮抗剂，优选人IL-1受体拮抗剂，优选人IL-1受体拮抗剂阿那白滞素；
ii)抗IL-1单克隆抗体，优选人抗IL-1单克隆抗体，优选人IL-1单克隆抗体卡那奴单抗或吉伏组单抗
iii)人二聚抗IL-1融合蛋白，优选人二聚抗IL-1融合蛋白利纳西普；以及
iv)人双可变结构域抗IL-1免疫球蛋白，优选人双可变结构域抗IL-1免疫球蛋白鲁吉珠单抗。
9.根据前述权利要求中任一项所述使用的rAAV病毒体，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子，优选所述启动子是NFκB应答型启动子，优选NFκB应答型CMV启动子，优选NFκB应答型最小CMV启动子。
10.根据前述权利要求中任一项所述使用的rAAV病毒体，其中所述序列Z包含在所述修饰的衣壳蛋白中由式II表示的位置处：
EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy-Z-(x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG
a.其中Z、x和y如权利要求2中所定义；并且
b.其中n为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
11.根据前述权利要求中任一项所述使用的rAAV病毒体，其中所述衣壳蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:1的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:11具有至少80％序列同一性，
ii)与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:2的位置585-602处的氨基酸与SEQ ID NO:10具有至少80％序列同一性，
iii)与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:3的位置587-601处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性，
iv)与具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:4的位置586-600处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性，
v)与具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:5的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:9具有至少80％序列同一性，
vi)与具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:6的位置588-602处的氨基酸与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性，以及
vii)与具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中在SEQ ID NO:7的位置587-604处的氨基酸与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性，
其中当在相同条件下测试时，与具有选自由SEQ ID NO:13-19组成的组的氨基酸序列的未修饰的衣壳蛋白相比，所述修饰的衣壳蛋白提供至少两倍的表达增加，优选在人FLS细胞中，其中优选地所述未修饰的衣壳蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:19或具有与所述修饰的衣壳蛋白相同的血清型。
12.根据前述权利要求中任一项所述使用的rAAV病毒体，其中所述衣壳蛋白包含选自由SEQ ID NO:1-7组成的组的氨基酸序列或由其组成，优选地其中所述衣壳蛋白包含SEQID NO:4或SEQ ID NO:6或由其组成。
13.一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状的rAAV组合物，其中所述rAAV组合物包含如权利要求1-12中任一项所定义的rAAV病毒体和药学上可接受的载剂。
14.一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关联的症状的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV组合物如权利要求13中所定义，并且其中所述治疗或预防包括向个体施用所述rAAV组合物和施用所述免疫抑制剂。
15.根据权利要求1-12中任一项所述使用的rAAV病毒体，根据权利要求13所述使用的rAAV组合物，或根据权利要求14所述使用的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述关节炎疾病选自由类风湿性关节炎(RA)、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎(OA)、痛风、假痛风、脊椎关节炎(SpA)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、脓毒性关节炎、关节炎、幼年型特发性关节炎、钝伤、关节置换和斯蒂尔病组成的组。
16.根据权利要求1-12中任一项所述使用的rAAV病毒体或根据权利要求13所述使用的rAAV组合物，其中所述rAAV病毒体和/或所述rAAV组合物全身和/或局部施用。
17.根据权利要求14所述使用的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述rAAV组合物和所述免疫抑制剂中的至少一种局部施用。
18.根据权利要求16所述使用的rAAV病毒体或rAAV组合物和/或根据权利要求17所述使用的rAAV组合物和免疫抑制剂，其中所述局部施用是关节内施用。
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