CN114487414A - 一种检测人前列腺癌抗原psma、ar-v7的免疫荧光试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测人前列腺癌抗原psma、ar-v7的免疫荧光试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及癌症生物学及液体活检技术领域，尤其涉及人前列腺癌抗原PSMA、雄激素受体剪接突变体AR‑V7免疫荧光检测试剂盒，适用于不同类型样本PSMA、AR‑V7检测，还涉及该试剂盒在检测PSMA、AR‑V7中的用途；该试剂盒可检测前列腺癌非体液性稀有有核细胞中PSMA、AR‑V7的表达水平来对前列腺癌患者的用药提供指导性的意见。通过针对PSMA、AR‑V7的特异性抗体来对患者非体液性稀有有核细胞进行分型，通过对PSMA、AR‑V7阳性细胞的数量和其AR‑V7的表达水平、细胞内定位来对前列腺癌的用药提供参考性的意见，本发明中免疫荧光标本的检测可适用于不同方法富集得到的非体液性稀有有核细胞样本，包括但不限于：阴性富集法、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法等。

Description

一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒及 应用
技术领域
本发明涉及癌症生物学及液体活检技术领域，尤其涉及一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒及应用。
背景技术
PSMA(Prostate-specific membrane antigen,PSMA)，即前列腺特异膜抗原，是由750个氨基酸组成的Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表达于前列腺上皮细胞，具有较高的前列腺癌特异性。相关研究指出：有94.1％的前列腺癌患者组织切片中能够检测到PSMA，且其表达与肿瘤分级密切相关。进一步的研究显示：使用PSMA放射性配体能够快速准确的检测到早期的疾病发生及复发、转移。
AR-Vs(androgen receptor splice variants,AR-Vs)是指在雄激素受体mRNA的异常剪接或基因重组过程中产生的、在没有雄激素的情况下仍能促进靶基因转录的剪接突变体。在去势抵抗性前列腺癌患者中，AR-Vs的出现，使得患者对抗前列腺癌药物产生耐药性，增加治愈难度。AR-V7(androgen receptor splice variant 7,AR-V7)是目前已知的表达最为广泛的雄激素受体剪接突变体。临床试验表明：在AR-V7阳性的患者中，紫杉烷化疗比靶向雄激素受体的药物(enzalutamide或abiraterone)治疗更加有效；而在AR-V7阴性患者中，紫杉烷、enzalutamide以及abiraterone的治疗无显著性差异。同时，AR-V7在细胞中的不同定位也会影响患者治疗方案的选择。
目前临床对肿瘤治疗的监测主要依赖于病理学、影像学和血清学三种方法。病理学是肿瘤诊断的金标准，但是组织取样具有一定的创伤性，且受限于取材部位，同时由于肿瘤组织的异质性，单点组织取样不足以反应整体肿瘤状态，且难以重复取样动态监测。影像学方法应用较广泛，但是影像学一般存在辐射伤害。而且，影像学通常只反应肿瘤大小等信息，难以判断肿瘤的恶性程度。更重要的一点，影像学通常只能检测2mm以上的肿瘤组织，对于较小的肿瘤组织诊断敏感性较差，存在滞后性。血清学检测取样较为方便，但是灵敏度和特异性较差，且与病理生理相关性差。同样的，在治疗方面，目前临床上也存在一定的局限性。对于肿瘤患者，特别是发生转移的患者，目前通常只依据原发灶的信息来判断治疗方案，忽略了对转移灶甚至微转移灶的检测与治疗。治疗过程中通过影像学或血清学来判断治疗疗效，在疗效判断的精准性等方面存在一定的局限。
目前针对去势抵抗性前列腺癌，单纯的PSMA的检测对其治疗方案选择的指导意义并不明确，而组织中PSMA、AR-V7的检测又面临着检测是在不同组织切片上进行的，由于肿瘤细胞异质性的原因，单张片子上PSMA、AR-V7并不能反映患者整体的PSMA、AR-V7表达水平。因此需要一种新的方法能够对与疾病复发、转移相关的非体液性稀有有核细胞中PSMA、AR-V7表达水平进行检测，用于预测特定药物对患者治疗的作用，为疾病治疗方案的选择提供参考。
以循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)为主的体液肿瘤细胞的检测可为上述局限性提供一些解决方案。CTC是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，CTC的检出提示体内原发灶或转移灶的存在，或癌前病变细胞的存在，是转移病灶形成的“种子”细胞，是肿瘤发生发展的直接证据。近年来不断有证据显示：在肿瘤发生发展的早期，甚至是影像学可见病灶形成之前肿瘤就播散入血了，这种播散可能存在于肿瘤发展的整个过程中。所以，对CTC进行检测有利于早期发现肿瘤、辅助诊断或为选择治疗方案提供参考。同时，对CTC进行动态检测可了解患者对治疗药物的敏感性，及早发现耐药信号。非体液性稀有有核细胞是指体液内出现的非正常的稀有有核细胞，包含CTC，以及胸/腹腔积液、灌洗液、心包积液、脑脊液、尿液、引流液、痰液、前列腺液等来源的肿瘤细胞。对这些细胞进行检测，可为患者诊断、治疗提供更全面的信息。
因此，我们提出了一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒及应用用于解决上述问题。
发明内容
本发明中的试剂盒可检测前列腺癌非体液性稀有有核细胞中PSMA、AR-V7的表达水平来对前列腺癌患者的用药提供指导性的意见。通过针对PSMA、AR-V7的特异性抗体来对患者非体液性稀有有核细胞进行分型，通过对PSMA、AR-V7阳性细胞的数量和其AR-V7的表达水平、细胞内定位来对前列腺癌的用药提供参考性的意见。
目前肿瘤患者的病理检测，主要是进行组织学检测，面临着反复取样困难，不能动态监测，单个组织样本不足以反映整个肿瘤负荷等不足，不能实时有效的反映进入体液的非体液性稀有有核细胞变化。本发明中通过免疫荧光染色对患者的非体液性稀有有核细胞中PSMA、AR-V7的蛋白表达水平进行检测，实时监测其动态变化，能够更精确的反映前列腺癌患者不同类型非体液性稀有有核细胞(原位癌、转移灶、循环肿瘤细胞)中PSMA、AR-V7表达水平，从而为采取不同的治疗方案提供更多的依据。
针对目前单纯的非体液性稀有有核细胞计数不能直接反映PSMA、AR-V7阳性前列腺癌患者用药疗效和预后的缺点，在计数的基础上对非体液性稀有有核细胞中PSMA、AR-V7的蛋白表达水平进行检测，并分析AR-V7的细胞定位，并依据荧光强度对AR-V7的表达水平进行分类，对包括组织、血液、细胞系、灌洗液、前列腺液、尿液、引流液等来源的非体液性稀有有核细胞进行检测，并提出的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒及应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒，包括以下成分：CYP1、CYP2、CYPP、封闭液、特异性抗体、CD45抗体、荧光二抗-1、荧光二抗-2、抗体稀释液、细胞核染色液。
优选的，该试剂盒按重量份计包括以下成分：CYP1750～850份、CYP2140～170份、CYPP 10～20份、封闭液8～13份、特异性抗体1～2份、CD45抗体1～2份、荧光二抗-11～2份、荧光二抗-21～2份、抗体稀释液8～12份、细胞核染色液1～2份。
优选的，所述特异性抗体为AR-V7抗体、CD45抗体中的一种或多种。
优选的，所述AR-V7抗体针对的AR-V7序列包括mevqlglgrv yprppsktyrgafqnlfqsv reviqnpgpr hpeaasaapp gasllllqqq qqqqqqqqqq qqqqqqqqqq etsprqqqqqqgedgspqah rrgptgylvl deeqqpsqpq salechperg cvpepgaava askglpqqlp appdeddsaapstlsllgpt fpglsscsad lkdilseast mqllqqqqqe avsegsssgr areasgapts skdnylggtstisdnakelc kavsvsmglg vealehlspg eqlrgdcmya pllgvppavr ptpcaplaec kgsllddsagkstedtaeys pfkggytkgl egeslgcsgs aaagssgtle lpstlslyks galdeaaayq srdyynfplalagppppppp phpharikle npldygsawa aaaaqcrygd laslhgagaa gpgsgspsaa assswhtlftaeegqlygpc gggggggggg gggggggggg gggeagavap ygytrppqgl agqesdftap dvwypggmvsrvpypsptcv ksemgpwmds ysgpygdmrl etardhvlpi dyyfppqktc licgdeasgc hygaltcgsckvffkraaeg kqkylcasrn dctidkfrrk ncpscrlrkc yeagmtlgek frvgnckhlk mtrp。
优选的，所述AR-V7抗体针对的AR-V7序列包括mtagssyplf laayactgclaerlgwfiks sneatnitpk hnmkafldel kaenikkfly nftqiphlag teqnfqlakq iqsqwkefgldsvelahydv llsypnkthp nyisiinedg neifntslfe ppppgyenvs divppfsafs pqgmpegdlvyvnyartedf fklerdmkin csgkiviary gkvfrgnkvk naqlagakgv ilysdpadyf apgvksypdgwnlpgggvqr gnilnlngag dpltpgypan eyayrrgiae avglpsipvh pigyydaqkl lekmggsappdsswrgslkv pynvgpgftg nfstqkvkmh ihstnevtri ynvigtlrga vepdryvilg ghrdswvfggidpqsgaavv heivrsfgtl kkegwrprrt ilfaswdaee fgllgstewa eensrllqer gvayinadssiegnytlrvd ctplmyslvh nltkelkspd egfegkslye swtkkspspe fsgmpriskl gsgndfevffqrlgiasgra rytknwetnk fsgyplyhsv yetyelvekf ydpmfkyhlt vaqvrggmvf elansivlpfdcrdyavvlr kyadkiysis mkhpqemkty svsfdslfsa vknfteiask fserlqdfdk snpivlrmmndqlmfleraf idplglpdrp fyrhviyaps shnkyagesf pgiydalfdi eskvdpskaw gevkrqiyvaaftvqaaaet lseva。
优选的，还包括标记抗体的荧光素，所述标记抗体的荧光素选用绿色荧光、橘色荧光、红色或深红色荧光中的一种或多种。
优选的，所述细胞核染色液为DAPI、Hoechst、碘化丙啶中的一种。
本发明的另一方面公开了一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1：对血液和其他体液样品内的非体液性稀有有核细胞进行富集，富集后进行固定；
S2：CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；
S3：吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1洗片3min×1次，吸去多余液体，加100～150μl封闭液室温封闭25～30min；
S4：吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的PSMA抗体、AR-V7抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；
S5：避光，取CYP2100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；
S6：加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分；
S7：取10μL DAPI染液，加至标本区；
S8：盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或～20℃环境下避光保存。
优选的，所述S1中，富集方法可选用阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法；富集后的样本可采用乙醇、甲醇、福尔马林、多聚甲醛、丙酮、冰醋酸进行固定。
优选的，所述S6中，湿盒内避光孵育的环境为37℃下25～30min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明根据肿瘤组织中mRNA表达情况来指导用药相比，检测结果可以对实际用药进行指导，不仅能够反映实体肿瘤(包括原位癌和可能存在的不可见的微小转移灶)中PSMA、AR-V7的表达，同样可以反映体液中易发生转移的肿瘤细胞中PSMA、AR-V7的表达情况，从而更精准的指导用药。
2、本发明对肿瘤组织中PSMA、AR-V7进行免疫组化检测相比，对非体液性稀有有核细胞中PSMA、AR-V7细胞进行计数和表达量、细胞定位进行区分，能够更精准的反映PSMA、AR-V7与临床参数的相关性和指导用药。
3、本发明采用的样本是各种不同来源的细胞，在取材上比基于肿瘤组织的检测技术更加方便。
4、本发明在肿瘤组织中检测蛋白表达相比，采用免疫荧光对非体液性稀有有核细胞中PSMA、AR-V7的表达水平、细胞定位加以检测，可以对体液非体液性稀有有核细胞进行表型分析。
5、本发明在研究的基础上，计数PSMA+AR-V7+、PSMA+AR-V7-、PSMA-AR-V7+的细胞和细胞定位，有利于研究这部分细胞与肿瘤患者临床参数的潜在相关性。
具体实施方式
除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。“质量、浓度、温度、时间、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，1-50的范围应理解为包括选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50的任何数字、数字的组合、或子范围、以及所有介于上述整数之间的小数值，例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、和1.9。关于子范围，具体考虑从范围内的任意端点开始延伸的“嵌套的子范围”。例如，示例性范围1-50的嵌套子范围可以包括一个方向上的1-10、1-20、1-30和1-40，或在另一方向上的50-40、50-30、50-20和50-10。”
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说，在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例一
材料：阴性或阳性富集的血液和体液样本涂片、对照细胞为22RV1、LNCaP涂片。
实验步骤：
1.CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；
2.吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1洗片3min×1次；吸去多余液体，加100～150μl封闭液室温封闭25～30min；
3.吸去多余封闭液，加100μl稀释好的PSMA抗体、AR-V7抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1.5～2h；
4.避光，取CYP2 100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；
5.加100μl稀释好的二抗，湿盒内避光孵育(37℃，25～30min)；CYP2洗3min×4次，吸去多余水分；
6.复染：将DAPI管瞬时离心后，液面处取10μL DAPI染液，加至标本区；
7.盖片：盖上盖玻片，镜下观察；将PSMA或AR-V7表达阳性、CD45抗体阴性的细胞视为阳性细胞。
实施例二
材料：适量抗凝血液1管，采用膜过滤方法富集后对其进行蛋白检测
实验步骤：
1.抽取适量外周血放入含有抗凝剂采血管中，轻微震荡混匀；
2.将混悬液加入膜过滤分离肿瘤细胞技术装置中，缓慢通过滤器和滤膜；
3.待过滤完毕后，继续在膜过滤装置中加入50ml 0.01M PBS，将管壁周围附着的细胞混悬液冲入膜过滤装置内，让其通过滤器和滤膜；
4.固定滤膜上的细胞；
5.同实施例1操作检测蛋白。
实施例三
材料：适量抗凝血液1管，采用微流控方法富集后对其进行蛋白检测
实验步骤：
抽取的适量血液采用各种原理的微流控芯片进行富集，富集后样本进行蛋白免疫荧光检测。
实施例四
材料：冰冻组织切片
实验步骤：
1.由冰冻切片机中取出载有切片的载玻片，放入湿盒中；
2.待载玻片达到室温且未干时，加CYP1于切片上洗载玻片3-5次；
3.吸去多余液体，加CYPP孵育，CYP1洗片；
4.吸去多余液体，加封闭液室温封闭；
5.吸去多余封闭液，加稀释好的PSMA抗体、AR-V7抗体，室温避光孵育适当时间；
6.避光，CYP2洗片，吸去多余水分；
7.加稀释好的二抗，避光孵育；
8.CYP2洗片，吸去多余水分；
9.加10μl DAPI，封片镜检，根据细胞形态和PSMA、AR-V7表达判断是否为阳性细胞。
上述实施例中，血液和其他体液样品要求抗凝，并对其内的非体液性稀有有核细胞进行富集；富集方法可选用阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法等；富集后的样本可采用乙醇、甲醇、福尔马林、多聚甲醛、丙酮、冰醋酸等方法进行固定。
其中，免疫荧光检测是根据抗原抗体反应，将免疫学与荧光标记技术相结合从而较为直观地反应目的蛋白在细胞中的表达。本试剂盒通过对靶标细胞和白细胞共同抗原CD45进行荧光标记，通过筛选目的蛋白阳性、CD45阴性的细胞，从而对血液中特定蛋白阳性的非体液性稀有有核细胞进行判读和计数。在此基础上，将靶蛋白阳性、CD45阴性的候选非体液性稀有有核细胞按照目的蛋白荧光强度将其表达按照高、中、低表达分类。
本试剂盒涉及的操作主要包括染色、读片等步骤，涉及的上游操作可包含肿瘤细胞的富集，如阴性富集法、阳性富集法、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法等；本试剂盒适用于检测血液、灌洗液、前列腺液、尿液、引流液等中的非体液性稀有有核细胞，也可应用于细胞片如涂片/爬片、组织的免疫荧光检测等。
对上述实施例进行实施观察，结果观察按照如下流程：将标本置于荧光显微镜下，扫描整个标本区，若发现片状或者圈状信号时，切换至高倍镜下进一步鉴定，记录每个阳性细胞的坐标，并且40×物镜分别在不同通道下拍照，必要时可使用油镜观察；
结果判断如下：
a)阳性细胞：目的蛋白荧光信号阳性无血源性白细胞表面抗原荧光信号的有核细胞，记为一个阳性细胞；
b)阴性细胞：细胞有血源性白细胞表面抗原荧光信号，不论目的蛋白是否有荧光均记为阴性。
排除标准：若细胞核碎裂无法确定是单个细胞，或者是多个细胞核聚集则不能记为一个阳性细胞。
最终结果举例如下表1：
表1
Figure BDA0003431678130000131
综上，本发明提供了一种基于液体活检的试剂盒，试剂盒由缓冲液CYP1、CYP2、CYPP、封闭液，检测PSMA、AR-V7的特异性抗体至少一种，相应的荧光二抗，荧光标记的CD45抗体，抗体稀释液，细胞核染色液组成。
其中，患者可患有癌症，癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。
试剂盒包含检测PSMA、AR-V7和CD45的抗体，荧光素可以直接标记在抗体上或者通过荧光标记的第二抗体进行检测；标记抗体的荧光素具有不同的发射光谱，优选绿色荧光(如Alexa Fluor 488)、橘色荧光(如Alexa Fluor 555)、红色或深红色荧光(如AlexaFluor 594或Alexa Fluor 647)的组合；标记抗体的荧光素不限于Alexa Fluor系列荧光素，同样可以采用Dylight、华青染料、异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate，FITC)、生物素、量子点等系列的荧光素标记抗体，或者不同系列的荧光素标记抗体联用。
试剂盒涉及的富集和检测方法包含手工和自动化设备的操作，试剂盒所涉及的对照细胞可以包含或者不包含在试剂盒中，在免疫荧光操作中可加入后固定步骤，采用乙醇、甲醇、福尔马林、多聚甲醛、丙酮、冰醋酸中的任意一种或者几种不同比例的混合液固定细胞，试剂盒CYP1、CYP2、CYPP中的表面活性剂可以采用0～10％的Triton X-100、saponin、Tween、NP-40、SDS、聚乙二醇等，其溶剂为常用生物缓冲液，试剂盒使用的核染料不限于DAPI，同样可以采用Hoechst、碘化丙啶等。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括以下成分：CYP1、CYP2、CYPP、封闭液、特异性抗体、CD45抗体、荧光二抗-1、荧光二抗-2、抗体稀释液、细胞核染色液。
2.根据权利要求1所述的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒，其特征在于，按重量份计包括以下成分：CYP1750～850份、CYP2140～170份、CYPP 10～20份、封闭液8～13份、特异性抗体1～2份、CD45抗体1～2份、荧光二抗-11～2份、荧光二抗-21～2份、抗体稀释液8～12份、细胞核染色液1～2份。
3.根据权利要求1或2所述的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述特异性抗体为AR-V7抗体、CD45抗体中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述AR-V7抗体针对的AR-V7序列包括mevqlglgrv yprppsktyr gafqnlfqsvreviqnpgpr hpeaasaapp gasllllqqq qqqqqqqqqq qqqqqqqqqq etsprqqqqq qgedgspqahrrgptgylvl deeqqpsqpq salechperg cvpepgaava askglpqqlp appdeddsaa pstlsllgptfpglsscsad lkdilseast mqllqqqqqe avsegsssgr areasgapts skdnylggts tisdnakelckavsvsmglg vealehlspg eqlrgdcmya pllgvppavr ptpcaplaec kgsllddsag kstedtaeyspfkggytkgl egeslgcsgs aaagssgtle lpstlslyks galdeaaayq srdyynfpla lagpppppppphpharikle npldygsawa aaaaqcrygd laslhgagaa gpgsgspsaa assswhtlft aeegqlygpcgggggggggg gggggggggg gggeagavap ygytrppqgl agqesdftap dvwypggmvs rvpypsptcvksemgpwmds ysgpygdmrl etardhvlpi dyyfppqktc licgdeasgc hygaltcgsc kvffkraaegkqkylcasrn dctidkfrrk ncpscrlrkc yeagmtlgek frvgnckhlk mtrp。
5.根据权利要求3所述的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述AR-V7抗体针对的AR-V7序列包括mtagssyplf laayactgcl aerlgwfikssneatnitpk hnmkafldel kaenikkfly nftqiphlag teqnfqlakq iqsqwkefgl dsvelahydvllsypnkthp nyisiinedg neifntslfe ppppgyenvs divppfsafs pqgmpegdlv yvnyartedffklerdmkin csgkiviary gkvfrgnkvk naqlagakgv ilysdpadyf apgvksypdg wnlpgggvqrgnilnlngag dpltpgypan eyayrrgiae avglpsipvh pigyydaqkl lekmggsapp dsswrgslkvpynvgpgftg nfstqkvkmh ihstnevtri ynvigtlrga vepdryvilg ghrdswvfgg idpqsgaavvheivrsfgtl kkegwrprrt ilfaswdaee fgllgstewa eensrllqer gvayinadss iegnytlrvdctplmyslvh nltkelkspd egfegkslye swtkkspspe fsgmpriskl gsgndfevff qrlgiasgrarytknwetnk fsgyplyhsv yetyelvekf ydpmfkyhlt vaqvrggmvf elansivlpf dcrdyavvlrkyadkiysis mkhpqemkty svsfdslfsa vknfteiask fserlqdfdk snpivlrmmn dqlmflerafidplglpdrp fyrhviyaps shnkyagesf pgiydalfdi eskvdpskaw gevkrqiyva aftvqaaaetlseva。
6.根据权利要求1所述的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒，其特征在于还包括标记抗体的荧光素，所述标记抗体的荧光素选用绿色荧光、橘色荧光、红色或深红色荧光中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述细胞核染色液为DAPI、Hoechst、碘化丙啶中的一种。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对血液和其他体液样品内的非体液性稀有有核细胞进行富集，富集后进行固定；
S2：CYP1洗载玻片3min×3次，每次100～150μL，确保覆盖满整个标本区；
S3：吸去载玻片上多余液体，加入CYPP作用5min，CYP1洗片3min×1次，吸去多余液体，加100～150μl封闭液室温封闭25～30min；
S4：吸去多余封闭液，加100～150μl稀释好的PSMA抗体、AR-V7抗体和CD45抗体，室温湿盒内避光孵育1～2h；
S5：避光，取CYP2100～150μL/片洗片3min×3次，吸去多余水分；
S6：加100～150μL稀释好的荧光二抗，湿盒内避光孵育，CYP2洗3min×4次，吸去多余水分；
S7：取10μL DAPI染液，加至标本区；
S8：盖上盖玻片，并吸去周边液体，镜下观察或置于2～8℃或～20℃环境下避光保存。
9.根据权利要求8所述的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒的检测方法，其特征在于，所述S1中，富集方法可选用阴性富集、阳性富集、密度梯度分离法、膜过滤法、微流控法；富集后的样本可采用乙醇、甲醇、福尔马林、多聚甲醛、丙酮、冰醋酸进行固定。
10.根据权利要求8所述的一种检测人前列腺癌抗原PSMA、AR-V7的免疫荧光试剂盒的检测方法，其特征在于，所述S6中，湿盒内避光孵育的环境为37℃下25～30min。
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