CN114457155A - 一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因marchf1检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因marchf1检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因MARCHF1检测试剂盒及应用。本发明研究证实乳腺癌中MARCHF1表达显著上升。MARCHF1表达水平与免疫微环境指标StromalScore，ImmuneScore和ESTIMATEScore均呈正相关，与多种免疫细胞浸润正相关，且与免疫检查点基因表达正相关，并且设计了MARCHF1检测试剂盒。

Description

一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因MARCHF1检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种检测MARCHF1表达水平的试剂在制备用于乳腺癌检测和/或辅助免疫治疗的制剂中的应用，以及一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因MARCHF1检测试剂盒及应用。
背景技术
乳腺癌(Breast cancer，BRCA)是世界范围内女性常见的恶性肿瘤之一，其新发率和死亡率位居各类癌症首位。尽管我国乳腺癌发病率相对较低，但人口基数大，总体发病人数多，发病率有逐年上升的趋势，且发病年龄呈年轻化趋势。免疫治疗是一种具有前景的乳腺癌治疗新方式，但存在治疗响应率不高、副作用等问题，因此开发新型辅助免疫治疗新靶点对于临床肿瘤免疫治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳腺癌免疫治疗新靶点MARCHF1，并由此提供一种检测MARCHF1表达水平的试剂在制备用于乳腺癌检测和/或辅助免疫治疗的制剂中的应用，以及一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因MARCHF1检测试剂盒及应用。
本发明的第一方面提供一种检测MARCHF1表达水平的试剂在制备用于乳腺癌检测和/或辅助免疫治疗的制剂中的应用。
进一步地，所述检测MARCHF1表达水平包括检测MARCHF1的mRNA表达水平和/或检测MARCHF1的蛋白表达水平。
进一步地，所述检测MARCHF1表达水平的方法包括：通过RT-qPCR方法检测乳腺癌和癌旁组织中MARCHF1 mRNA的表达量；通过分子探针技术检测乳腺癌和癌旁组织中MARCHF1 mRNA表达量；通过免疫组化或Western-Blot检测乳腺癌和癌旁组织中MARCHF1蛋白表达量。
更具体地，所述检测MARCHF1表达水平的试剂为MARCHF1基因DNA序列或mRNA序列的寡核酸探针、PCR引物，或者为靶向MARCHF1的抗体。
根据本发明，优选地，所述检测MARCHF1表达水平的试剂为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示核苷酸序列的实时荧光定量PCR特异性引物。
5’-CTCAGGGGATTTGGCTGACG-3’(SEQ ID NO：1)
5’-GTTGTTGGGCTGCTTGCTTT-3’(SEQ ID NO：2)
本发明的第二方面提供一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因MARCHF1检测试剂盒，该试剂盒包括：检测MARCHF1表达水平的试剂。
进一步地，所述检测MARCHF1表达水平的试剂为靶向MARCHF1基因DNA序列或mRNA序列的寡核酸探针、PCR引物，或者为靶向MARCHF1的抗体。
具体地，所述检测MARCHF1表达水平的试剂为具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的实时荧光定量PCR特异性引物。
根据本发明，所述试剂盒还可以含有其他常规的用于实时荧光定量的试剂，优选地，所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：Trizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇、无RNA酶水、随机引物、5×M-MLV缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、M-MLV逆转录酶、具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的ACTB实时荧光定量PCR特异性引物。
5’-GGCACCCAGCACAATGAAGA-3’(SEQ ID NO：3)
5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’(SEQ ID NO：4)
本发明第三方面提供上述试剂盒在制备用于乳腺癌检测和/或辅助免疫治疗的制剂中的应用。
MARCHF1是膜结合E3泛素连接酶MARCH家族成员之一，本发明研究证实乳腺癌中MARCHF1表达显著上升。MARCHF1表达水平与免疫微环境指标StromalScore，ImmuneScore和ESTIMATEScore均呈正相关，与多种免疫细胞浸润正相关，且与免疫检查点基因表达正相关，由此说明，MARCHF1可以作为乳腺癌免疫治疗新靶点。并且基于此设计了MARCHF1检测试剂盒。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了乳腺癌中靶基因MARCHF1的表达变化。(A)非配对样本结果显示乳腺癌组织中MARCHF1表达显著上调；配对样本结果显示乳腺癌组织中MARCHF1表达显著上调。
图2示出了乳腺癌中MARCHF1表达与免疫细胞浸润相关性。MARCHF1表达与多种免疫细胞浸润显著正相关。
图3示出了乳腺癌中MARCHF1表达与免疫检查点基因的相关性。MARCHF1表达与免疫检查点基因显著正相关。
图4示出了乳腺癌中MARCHF1的表达变化。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例用于说明乳腺癌中靶基因MARCHF1的表达显著上调。
乳腺癌中MARCHF1表达分析：
1、数据下载与整理：
利用UCSC XENA网站(https://xenabrowser.net/datapages/)下载TCGA乳腺癌表达谱数据和临床数据资料，MARCHF1表达谱数据经log2转化后进行组间比较。
2、乳腺癌中MARCHF1的表达差异分析
利用R软件包分析乳腺癌组织与正常组织间MARCHF1 mRNA水平差异，ggplot2包用于可视化，如图1所示。
图1示出了乳腺癌中靶基因MARCHF1的表达变化。(A)非配对样本结果显示乳腺癌组织中MARCHF1表达显著上调；配对样本结果显示乳腺癌组织中MARCHF1表达显著上调。***p<0.001。
实施例2
本实施例用于说明乳腺癌中MARCHF1表达与肿瘤免疫微环境指标呈显著正相关。
乳腺癌中MARCHF1表达与肿瘤免疫微环境相关性分析：
利用R软件包ESTIMATE计算了每位乳腺癌患者组织StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATE scores，利用R软件包psych的corr.test函数计算MARCHF1表达与免疫浸润评分的皮尔森相关系数。如表1所示。
表1示出了乳腺癌中MARCHF1表达与肿瘤免疫微环境的相关性。MARCHF1表达与ESTIMATEScore、StromalScore和ImmuneScore均显著正相关。
表1
Figure BDA0003440640200000051
实施例3
本实施例用于验证乳腺癌中MARCHF1表达与免疫细胞浸润正相关。
乳腺癌中MARCHF1表达与免疫细胞浸润相关性分析：
利用R软件包GSVA包免疫浸润算法ssGSEA、psych的corr.test函数计算MARCHF1与免疫细胞浸润评分的皮尔森相关系数，ggplot2包用于可视化。如图2所示。
图2示出了乳腺癌中MARCHF1表达与免疫细胞浸润的相关性。MARCHF1表达与免疫细胞浸润显著正相关。
实施例4
本实施例用于验证乳腺癌中MARCHF1表达与免疫检查点基因表达正相关。
乳腺癌中MARCHF1表达与免疫检查点基因相关性分析：
利用R软件包psych的corr.test函数分别计算MARCHF1表达与免疫检查点基因的皮尔森相关系数，ggplot2用于可视化。如图3所示。
图3示出了乳腺癌中MARCHF1表达与免疫检查点基因的相关性。MARCHF1表达与免疫检查点基因显著正相关。
实施例5
本实施例用于说明制备检测MARCHF1表达量的试剂盒。
1、引物设计
根据人源MARCHF1基因(Gene ID:55016)转录本CDS区序列，设计PCR引物，引物序列如表2所示。
2、试剂盒组分
(1)Trizol 50.0mL；
(2)异丙醇50.0mL；
(3)氯仿50.0mL；
(4)无水乙醇50.0mL；
(5)无RNA酶水5.0mL；
(6)1.0μM随机引物(Random primers)50.0μL；
(7)5×M-MLV缓冲液2.0mL；
(8)10.0mM三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)100.0μL；
(9)40U/μL RNA酶抑制剂50.0μL；
(10)200U/μL M-MLV逆转录酶50.0μL；
(11)ABI 2×PCR Mix 2.0mL；
(12)10.0μM MARCHF1实时荧光定量PCR特异性引物30.0μL，引物序列见表2；
(13)10.0μM ACTB实时荧光定量PCR特异性引物30.0μL，引物序列见表2。
表2荧光定量RT-PCR引物序列
Figure BDA0003440640200000061
3、RT-PCR鉴定乳腺癌中MARCHF1的表达变化
(1)组织中总RNA提取：本实验在冰浴中进行。取30～50mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5mL离心管中，加入1mL Trizol充分匀浆，室温静置5min；每管加入200μL氯仿，剧烈混匀30sec，静置15min，4℃12000rpm离心15min；轻轻吸取上层液体400μL至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃12000rpm离心10min；弃上清，加入1ml 75％酒精洗涤沉淀物，4℃12000rpm离心10min；尽可能弃掉上清，室温下晾干10min，每管加入10μL无RNA酶水，溶解(65℃促溶10-15min)。测定OD260，计算RNA浓度。
RNA(mg/mL)＝40×OD260×稀释倍数(n)/1000
(2)反转录：每25μL反转录体系包括100pmol随机引物，2μg总RNA，M-MLV反转录酶1μL，RNase抑制剂0.625μL，dNTPs(10mM)1.25μL，5×M-MLV缓冲液5μL，无RNA酶水补齐至25μL。反应条件为：37℃1h，95℃5min。
(3)定量PCR：每20μL反应体系包含2×PCR Mix 10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA1μL，ddH2O 8.2μL。反应条件为：94℃2min，94℃15s，60℃40s，40个循环。
(4)2-ΔΔCT法计算NSMCE2相对表达量：ACTB作为内参基因，将qPCR测得的靶基因CT值与同组织来源的内参基因ACTB的CT值相减得到ΔCT，再将ΔCT与对照组ΔCT相减得到ΔΔCT(取癌旁样本ΔCT的平均值为ΔCT对照)，利用Excell表格中Power函数计算每组NSMCE2相对表达量。利用软件GraphPad Prism 6.0绘图，T检验分析9例乳腺癌样本(BRCA)和9例癌旁样本(normal)的表达差异，P<0.05为差异具有统计学意义。结果如图4所示。
图4示出了乳腺癌中MARCHF1的表达变化。可见，乳腺癌中MARCHF1表达显著上升。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 江苏医药职业学院
<120> 一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因MARCHF1检测试剂盒及应用
<130> 2103227
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcaggggat ttggctgacg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgttgggc tgcttgcttt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcacccagc acaatgaaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actcctgctt gctgatccac 20

Claims (10)

1.检测MARCHF1表达水平的试剂在制备用于乳腺癌检测和/或辅助免疫治疗的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测MARCHF1表达水平包括检测MARCHF1的mRNA表达水平和/或检测MARCHF1的蛋白表达水平。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测MARCHF1表达水平的方法包括：通过RT-qPCR方法检测乳腺癌和癌旁组织中MARCHF1mRNA的表达量；通过分子探针技术检测乳腺癌和癌旁组织中MARCHF1mRNA表达量；通过免疫组化或Western-Blot检测乳腺癌和癌旁组织中MARCHF1蛋白表达量。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测MARCHF1表达水平的试剂为靶向MARCHF1基因DNA序列或mRNA序列的寡核酸探针、PCR引物，或者为靶向MARCHF1的抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述检测MARCHF1表达水平的试剂为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的实时荧光定量PCR特异性引物。
6.一种乳腺癌辅助免疫治疗靶基因MARCHF1检测试剂盒，该试剂盒包括：检测MARCHF1表达水平的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述检测MARCHF1表达水平的试剂为靶向MARCHF1基因DNA序列或mRNA序列的寡核酸探针、PCR引物，或者为靶向MARCHF1的抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述检测MARCHF1表达水平的试剂为具有SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的实时荧光定量PCR特异性引物。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括以下组分中的至少一种：Trizol、异丙醇、氯仿、无水乙醇、无RNA酶水、随机引物、5×M-MLV缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、M-MLV逆转录酶、具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的ACTB实时荧光定量PCR特异性引物。
10.权利要求6-9中任意一项所述的试剂盒在制备用于乳腺癌检测和/或辅助免疫治疗的制剂中的应用。
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