CN114456152B - 一种高尔基体靶向的共价结合蛋白的光热试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高尔基体靶向的共价结合蛋白的光热试剂及其制备方法和应用，属于生物医药和疾病治疗技术领域。本发明的光热试剂具有对高尔基体主动靶向能力，而且能与高尔基体内带巯基的蛋白共价结合，成功地将光热试剂锚定在蛋白上。在808nm激光的照射下，该光热试剂产生的热量直接作用于高尔基体内的蛋白，造成蛋白失活进而使高尔基体功能紊乱，最终诱导细胞凋亡。该策略不仅增加了分子光热剂在高尔基体中的积累，而且有效地减少了热量损失。通过体内体外的系列实验证明，该光热剂能够有效地抑制肿瘤生长，不会对正常组织造成损伤，因此具有良好的实际应用价值。

Description

一种高尔基体靶向的共价结合蛋白的光热试剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药和疾病治疗技术领域，具体涉及一种高尔基体靶向的共价结合蛋白的光热试剂及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

癌症，也称恶性肿瘤，是因为细胞不受机体调控，过度扩增繁殖所导致的疾病。在物理、化学、病毒等致癌因子作用下正常细胞中的原癌基因和抑癌基因发生突变而转变成癌细胞，与正常细胞不同，癌细胞易不受控制地无限分裂，会进攻周边正常组织，身体其他部分也会因癌细胞借助体内循环系统或淋巴系统遭到袭击，因此癌症是一种很难治愈的致命性疾病。据统计，现有的癌症类型有200多种，几乎覆盖全身的组织和器官。肿瘤细胞在早期不易被查出是因病症不明显，而到了晚期癌症病人就会有发低烧、少食、体态消瘦，甚至贫血、发热等症状。癌症已成为危害人类生命健康的大敌。

随着对癌症研究的不断深入，涌现出越来越多的癌症治疗方法。除手术治疗外，化疗、放疗、免疫治疗、光动力学治疗、基因治疗等都不断被报道和研究。但这些方法本身存在一定的缺陷，例如：手术治疗因其侵入性对正常组织造成损伤；化疗的毒性和多药耐药问题；放疗对肿瘤细胞和正常细胞的同时杀伤作用；基因治疗严重的免疫反应和差的长期循环稳定性；光动力学治疗固有的乏氧问题。这些治疗方法固有的缺陷，限制了他们在肿瘤治疗上的应用。光热治疗作为一种新兴的治疗手段，因其非侵入性、低副作用和治疗时间短引起了人们的广泛关注。光热治疗利用细胞对热的敏感性，诱导细胞凋亡，是治疗肿瘤的一种有效方法。由于肿瘤细胞具有比正常细胞低的耐热性，升高温度可以杀死肿瘤细胞，同时避免对正常细胞的显著副作用。

目前已经报道了多种光热剂用于光热治疗，包括无机纳米颗粒、碳材料、有机材料及其复合材料，但常用的光热剂对癌细胞没有选择性，也可以破坏正常细胞，这导致严重的副作用和低治疗效果。高尔基体是由许多扁平的囊泡构成的细胞器，负责对细胞合成的蛋白质进行加工，分类。其中，参与肿瘤发生和发展的分泌蛋白均在高尔基体内被修饰、运输和分泌。肿瘤细胞的增殖速度快一方面也是因为蛋白质分泌活性旺盛的原因。这些恶性细胞处于增生状态，从而增加高尔基体的大小。因此，肿瘤细胞的高尔基体可以作为肿瘤治疗的特殊靶点，破坏高尔基体的功能和结构是抑制肿瘤细胞生长的一种很有前景的思路。

虽然高尔基体已经成为光热治疗的一个重要靶点，但是针对高尔基体靶向设计开发的光热剂却很少。有机分子光热剂因其结构明确、制备灵活性以及好的生物相容性和材料降解性等优点得到了广泛的研究。但是，目前报道的大多数分子光热剂在细胞内易被快速清除，光热试剂在肿瘤细胞中的滞留时间短，导致实际治疗效果不佳。蛋白质作为细胞活动的重要原料和参与者，是生命体极其重要的构成成分之一。通过对蛋白质的结构以及功能的研究发现，蛋白质参与许多重要的细胞生理和病理反应过程，因此在癌症检测、成像及治疗中成为新药物设计的重要分子靶点，尤其是硫醇蛋白，他参与了许多细胞的生理功能，如抗氧化、调节细胞生长、抑制细胞凋亡、调节细胞内转运过程等，而硫醇基团在维持蛋白质的氧化还原环境中起重要作用，一旦蛋白受损会使细胞内的功能紊乱导致细胞凋亡。

因此，利用高尔基体内含有60％蛋白质的特性，发展一种能够锚定在高尔基体内蛋白上的分子光热剂，不仅增加分子光热剂在高尔基体中的滞留时间，而且在蛋白质附近集中产生热量，直接破坏蛋白质，进而造成高尔基体功能紊乱，最终有效地消除肿瘤细胞，这对提高癌症治疗效果具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种高尔基体靶向的共价结合蛋白的光热试剂(GA-PRT-PT)及其制备方法和应用。本发明的光热试剂具有对高尔基体主动靶向能力，而且能与高尔基体内带巯基的蛋白共价结合，成功地将光热试剂锚定在蛋白上。在808nm激光的照射下，该光热试剂产生的热量直接作用于高尔基体内的蛋白，造成蛋白失活进而使高尔基体功能紊乱，最终诱导细胞凋亡。该策略不仅增加了分子光热剂在高尔基体中的积累，而且有效地减少了热量损失。通过体内体外的系列实验证明，该光热剂能够有效地抑制肿瘤生长，不会对正常组织造成损伤。该光热剂具有良好的实际应用价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种化合物，所述化合物其结构式如式(I)所示：

本发明的第二个方面，提供合成上述化合物的方法，所述方法包括：

(1)对溴甲基苯甲酸与2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚反应生成化合物1，化合物1结构如下：

(2)环己酮在和三氯氧磷作用下生成化合物2，化合物2结构如下：

(3)化合物1与化合物2反应生成化合物3，化合物3结构如下：

(4)对磺酰胺苯甲酰氯和化合物3反应生成化合物4，化合物4结构如下：

(5)马来酰亚胺与金属钠在甲醇溶液中反应，然后与对甲苯磺酸反应回流，最后在氩气气氛下，加入2-(boc-氨基)-1-乙醇和偶氮二甲酸二乙酯并在室温下反应，生成化合物5，化合物5结构如下：

(6)化合物4与化合物5反应即生成式(I)化合物。

本发明的第三个方面，提供上述化合物在光热试剂中的应用。该化合物可以作为高尔基体靶向的共价结合蛋白的近红外分子光热剂，能够有效抑制肿瘤生长。本发明的光热剂能够实现对高尔基体的主动靶向，同时光热剂能够成功锚定到蛋白上增加分子光热剂在高尔基体的积累。

因此，本发明的第四个方面，提供上述化合物在制备预防和/或治疗(辅助治疗)肿瘤相关疾病的药物中的应用。

同时，需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。

本发明的第五个方面，提供一种药物组合物，其包含上述化合物。

本发明的第六个方面，提供一种药物制剂，其包含上述化合物和药学上可接受的辅料和/或载体。

本发明的第七个方面，提供一种系统，所述系统包括：

a)上述化合物、药物组合物或药物制剂；以及

b)光照装置。

其中，所述光照装置发射光源为近红外光源，具体的，近红外光源波长可为808nm，经试验验证，上述化合物在功率密度为0.8W/cm²的808nm激光照射下有效地抑制了肿瘤的生长，实现了良好的光热治疗，同时不会对周围正常组织造成损伤。

本发明的第八个方面，提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括：其包括向受试者施用治疗有效剂量的上述化合物、上述药物组合物、上述药物制剂或上述系统。

上述技术方案的有益技术效果：

1)上述技术方案提供的这种高尔基体靶向的共价结合蛋白的近红外分子光热剂能够有效抑制肿瘤生长。上述技术方案的光热剂能够实现对高尔基体的主动靶向，同时光热剂能够成功锚定到蛋白上，增加了分子光热剂在高尔基体的积累，其具有毒性低、生物安全性高的优点，光热转换效率能达到38.46％。在激光照射下产生的热量直接损伤蛋白使高尔基体功能紊乱，减少了热量损失并有效抑制小鼠乳腺癌的生长，极大地提高了光热治疗效果，本发明的光热剂毒性低，生物安全性好，可用于生物体的治疗。

2)上述技术方案中分子光热试剂的合成方法简单，不引入有毒试剂，同时不存在有毒试剂残留问题，生物安全性高，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明式(I)化合物GA-PRT-PT的质谱图。

图2为本发明式(I)化合物GA-PRT-PT的核磁谱图。

图3为本发明式(I)化合物GA-PRT-PT的表征图，其中，(a)为式(I)化合物GA-PRT-PT在不同浓度下的紫外吸收光谱图；(b)为式(I)化合物GA-PRT-PT的紫外吸收标准曲线图。

图4为本发明式(I)化合物GA-PRT-PT的光热效率相关图；其中，(a)为光热剂GA-PRT-PT在不同功率密度激光的照射下，温度随的时间变化；(b)为不同浓度的GA-PRT-PT溶液在0.8W/cm²的激光照射下，温度随时间的变化。

图5为本发明式(I)化合物GA-PRT-PT对蛋白的活性影响；其中，(a)为实施例2中式(I)化合物GA-PRT-PT与BSA反应后的凝胶电泳成像图；(b)激光照射下GA-PRT-PT对HRP的活性影响图。

图6为本发明实施例3中式(I)化合物GA-PRT-PT与高尔基体的共定位情况。

图7为本发明GA-PRT-PT对蛋白锚定以及对蛋白活性影响图；其中，(a)为实施例3中式(I)化合物GA-PRT-PT与细胞内蛋白结合的共聚焦成像图；(b)为实施例3中式(I)化合物GA-PRT-PT在激光照射下对高尔基体内蛋白的表达图(使用western blot法)。4T1细胞分别进行不同组别的处理，其中1组：PBS；2组：Laser；3组：GA-PRT-PT+Laser；4组：PT+Laser；5组：GA-PT+Laser；6组：PRT-PT+Laser；7组：GA-PRT-PT+Laser。材料浓度都是100μM。

图8为本发明实施例3中细胞毒性实验结果；其中，(a)为4T1细胞孵育不同浓度的GA-PRT-PT材料后，24小时之后细胞存活率结果；(b)为4T1细胞孵育100μMGA-PRT-PT材料后，进行不同功率密度的激光照射下细胞存活率结果；(c)4T1细胞分别进行不同治疗处理后细胞存活率结果。其中1组：PBS；2组：Laser；3组：GA-PRT-PT+Laser；4组：PT+Laser；5组：GA-PT+Laser；6组：PRT-PT+Laser；7组：GA-PRT-PT+Laser；(d)为活死细胞染色实验结果图；

图9为本发明实施例3中活体治疗期间肿瘤体积和小鼠体重的变化曲线图；其中，(a)为肿瘤体积的变化曲线图；(b)为小鼠体重的变化曲线图；

图10为本发明实施例3中活体治疗期间小鼠体内各主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的H&E染色图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种化合物，所述化合物其结构式如式(I)所示：

该化合物选择近红外的类花菁染料作为发热母体，然后在其结构上修饰了对磺酰胺苯甲酰氯和马来酰亚胺衍生物。一方面利用对磺酰胺苯甲酰氯使化合物对高尔基体主动靶向，另一方面通过马来酰亚胺衍生物使化合物能与高尔基体内带巯基的蛋白共价结合，将化合物成功锚定在蛋白上。在激光照射下化合物产生的热量直接作用于高尔基体内的蛋白，造成蛋白失活进而使高尔基体功能紊乱，最终诱导细胞凋亡。

本发明的又一具体实施方式中，提供提供合成上述化合物的方法，所述方法包括：

(1)对溴甲基苯甲酸与2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚反应生成化合物1，化合物1结构如下：

(2)环己酮在和三氯氧磷作用下生成化合物2，化合物2结构如下：

(3)化合物1与化合物2反应生成化合物3，化合物3结构如下：

(4)对磺酰胺苯甲酰氯和化合物3反应生成化合物4，化合物4结构如下：

(5)马来酰亚胺与金属钠在甲醇溶液中反应，然后与对甲苯磺酸反应回流，最后在氩气气氛下，加入2-(boc-氨基)-1-乙醇和偶氮二甲酸二乙酯并在室温下反应，生成化合物5，化合物5结构如下：

(6)化合物4与化合物5反应即生成式(I)化合物。

具体的，所述步骤(1)具体方法为：2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚和对溴甲基苯甲酸溶于有机溶剂I中，在高温下反应；反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，将所得混合物在有机溶剂II中析出，经纯化后即得化合物1。

其中，在高温下反应具体条件为：在100-120℃下反应1-5小时，优选为110℃反应4小时；

所述有机溶剂I可以为乙腈，所述有机溶剂II可以为乙醚。

所述步骤(2)具体方法为：在冰浴条件下，将三氯氧磷加入N,N-二甲基甲酰胺中，低温反应一段时间后再加入环己酮，加热反应，反应结束后低温析晶，纯化后即得化合物2。

其中，低温反应一段时间具体为：在0-5℃条件下反应0.1-1小时，优选为反应0.5小时。

加热反应具体条件为：在40-60℃反应1-10小时，优选为50℃反应6小时。

所述步骤(3)具体方法为：将化合物1、化合物2和无水乙酸钠溶于乙酸酐；在惰性环境下，将所得混合物加热反应；减压蒸馏除去溶剂，纯化后即得。

其中，所述化合物1、化合物2和无水乙酸钠的投加摩尔比为1-2:2-5:1-2；优选为1:2:1，加热反应具体条件为：在60-80℃条件下搅拌反应0.5-5小时，优选为70℃搅拌反应1小时。

所述步骤(4)具体方法为：在低温条件下，将化合物3溶于有机溶剂混合液中搅拌处理后，再向其中加入三乙胺进行搅拌反应，然后，再加入对磺酰胺苯甲酰氯继续搅拌反应；随后转移至室温下搅拌反应，经减压除去溶剂后纯化即得。

其中，所述有机溶剂混合液为无水四氢呋喃和无水二氯甲烷的混合液，所述无水四氢呋喃和无水二氯甲烷体积比可以为1:1，将化合物3溶于有机溶剂混合液中搅拌处理具体搅拌时间为1-60分钟，优选为10分钟；再向其中加入三乙胺进行搅拌反应，具体搅拌反应时间为0.1-1小时，优选为0.5小时；再加入对磺酰胺苯甲酰氯继续搅拌反应，继续搅拌反应时间为0.5-5小时，优选为1小时；转移至室温下搅拌反应时间为10-20小时，优选为12小时。

所述步骤(5)具体方法为：在低温条件下将溴与马来酰亚胺溶于甲醇溶液中搅拌，然后浓缩得到黄色粘稠液体粗产物；再次将粗产物重新溶解在甲醇中并加入含有金属钠的甲醇溶液中，搅拌反应，将反应混合物浓缩；并用乙酸乙酯、饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥；干燥后有机相经浓缩，得白色固体；将白色固体和对甲苯磺酸溶解在新鲜的甲苯中并加热回流；反应结束后，将反应液冷却至室温，粗品以石油醚/乙酸乙酯为洗脱液，经硅胶柱层析纯化，得到黄色固体；最后，将产物与三苯基膦溶解在四氢呋喃中；在氩气气氛下，加入2-(boc-氨基)-1-乙醇和偶氮二甲酸二乙酯并在室温下反应；得到的粗品以石油醚/乙酸乙酯为洗脱液，经硅胶柱层析纯化；将纯化后的产物进行脱boc反应；通过减压蒸馏除去溶剂，用乙醚洗涤，过滤沉淀即得到化合物5。

其中，低温条件下将溴与马来酰亚胺溶于甲醇溶液中搅拌，所述低温条件可以为0℃，溴与马来酰亚胺的摩尔比为0.5-5:1，优选为1:1；搅拌处理时间为10-20小时，优选为16小时；

再次将粗产物重新溶解在甲醇中并加入含有金属钠的甲醇溶液中，搅拌反应15-25小时，优选为20小时；

加热回流时间为1-10小时，优选为6小时；

加入2-(boc-氨基)-1-乙醇和偶氮二甲酸二乙酯并在室温下反应10-20小时，优选为12小时。

所述步骤(6)具体方法为：将化合物4、EDC和DMAP溶于二氯甲烷中，搅拌反应；然后将化合物5加入到反应混合物中，并继续搅拌反应；减压除去溶剂后，纯化后即得式(1)化合物。

其中，所述化合物4、EDC和DMAP的摩尔比为1-3:3-5:0.1-0.3，优选为1:3:0.1；

所述化合物4和化合物5的摩尔比为1-3:4-8，优选为1:5；

搅拌反应具体条件为：在20-30℃条件下搅拌反应0.1-1小时，优选为25℃搅拌反应0.5小时；

继续搅拌反应具体条件为：在20-30℃条件下搅拌反应10-20小时，优选为25℃搅拌反应12小时。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物在光热试剂中的应用。该化合物可以作为高尔基体靶向的共价结合蛋白的近红外分子光热剂，能够有效抑制肿瘤生长。本发明的光热剂能够实现对高尔基体的主动靶向，同时光热剂能够成功锚定到蛋白上，增加分子光热剂在高尔基体的积累。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述化合物在制备预防和/或治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。

同时，需要说明的是，“肿瘤”或“癌症”可互换使用，这些术语意指存在这样的细胞，所述细胞具有致癌细胞的典型特点，如不受控制的增殖、永生化、转移潜能、快速生长和增殖速率，以及某些特有形态学特征。癌细胞通常呈肿瘤形式，但是这类细胞可单独存在于动物体内，或可以是非致瘤性癌细胞，如白血病细胞。这些术语包括实体肿瘤、软组织肿瘤或转移病灶。如本发明所使用的，术语“肿瘤”包括恶化前肿瘤以及恶性肿瘤。在某些实施例中，肿瘤是实体肿瘤、软组织肿瘤或转移病灶。所述术语还指代针对形成实体肿瘤、血液、骨髓或淋巴系统癌症的细胞类型命名的实体肿瘤。实体肿瘤的实例包括但不限于肉瘤和癌瘤。血液癌症的实例包括但不限于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。这些术语包括但不限于起源于身体中具体部位的原发性癌症、从其开始的位置扩散至身体其它区部的转移性癌症、缓解后原始的原发性癌症的复发，和第二种原发性癌症，所述第二种原发性癌症是具有与后者不同类型的既往癌症病史的人员的新原发性癌症。

本发明的又一具体实施方式中，所述癌症选自以下的良性或恶性肿瘤组成的组：肺(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、支气管、前列腺、乳腺(包括散发性乳腺癌和考登病患者)、胰腺、胆囊、胃肠道、结肠、直肠、结肠癌、结直肠癌、甲状腺、肝、胆道、肝内胆管、肝细胞、肾上腺、胃、胃部、中枢或周围神经系统(包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤和神经鞘瘤)、神经内分泌、子宫内膜、肾、肾盂、膀胱、子宫、宫颈、阴道、卵巢、多发性骨髓瘤、食管、鼻、颈或头、脑、口腔和咽、喉、小肠、黑素瘤、结肠绒毛腺瘤、肉瘤(包括骨肉瘤、纤维肉瘤或横纹肌肉瘤和卡波济氏肉瘤)、瘤形成、上皮特征性肿瘤、乳腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、光化性角化病、红细胞增多、原发性血小板增多症、甲状腺滤泡状癌、白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、骨髓性白血病、脑膜白血病和早幼粒细胞白血病)、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯奇氏淋巴瘤)、骨髓增生异常综合征、绒毛膜癌、横纹样癌、精原细胞瘤、畸胎癌、着色性干皮病；视网膜母细胞瘤、角化棘皮瘤、髓样化生性骨髓纤维化、瓦尔登斯特伦氏病和Barret腺癌。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物组合物，其包含上述化合物。

本发明化合物的药物组合物，可以以选自以下任意方式施与：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物制剂，其包含上述化合物和药学上可接受的载体。

上述药物制剂可以是药剂学上可以接受的任何药物剂型，如片剂(包括分散片、缓释片、肠溶片、泡腾片、口腔崩解片、咀嚼片、异型片等)、硬胶囊剂(包括胃溶、肠溶、缓释胶囊)、软胶囊剂(包括胃溶、肠溶软胶囊)、滴丸剂、微丸剂、颗粒剂、干混悬剂、散剂、口服液体剂(包括溶液、混悬液、乳液剂)、注射剂(包括注射用粉针剂和注射液)等，以上这些药物剂型在《中国药典》中都有记载和描述。

根据药物剂型的不同，视需要还可以选择性地含有其它适宜的药用载体，诸如稀释剂、填充剂、崩解剂、表面活性剂、助悬剂、粘合剂、润滑剂、着色剂、调味剂等。所述“选择性地含有”是指可以选其中一种或几种，也可以不选。

所用的适宜填充剂或稀释剂包括乳糖、甘露醇、山梨醇、微晶纤维素、淀粉、改性淀粉、糊精、环糊精及其衍生物、磷酸钙、蔗糖、聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、预胶化淀粉、木糖醇、果糖、麦芽糖醇、右旋糖酐、葡萄糖、硫酸钙、磷酸氢钙，等等；所述崩解剂包括羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、玉米淀粉、交联羧甲基淀粉钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钙，等等；所述表面活性剂包括十二烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠、聚山梨酯(通用名：吐温，包括其各种型号)、脂肪酸山梨坦(通用名：司盘，包括其各种型号)，等等；所述粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉浆、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、明胶、瓜耳胶、黄原胶，等等；所述助悬剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、阿拉伯胶、黄原胶、羧甲基纤维素钠，等等；所述润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、硬脂基富马酸钠，等等。另外，还可包括pH值调节剂或缓冲剂，例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸盐缓冲液、稀盐酸、碳酸钠、氢氧化钠，等等；还可包括防腐剂，例如苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯，等等；还可包括稳定剂和抗氧剂，例如依地酸钙钠、亚硫酸钠、维生素C、维生素E，等等；还可包括口味调节剂，例如麦芽糖醇、阿司帕坦、甜菊素、果糖、蔗糖、糖精钠、香精诸如桔子香精、草莓香精，等等。

当然，药用载体并不限于以上所述，根据药物剂型的不同，视需要还可包括其它常规的、恰当的添加剂或药用辅料，如润湿剂，可选自水、乙醇、水-乙醇溶液等。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种系统，所述系统包括：

a)上述化合物、药物组合物或药物制剂；以及

b)光照装置。

其中，所述光照装置发射光源为近红外光源，具体的，近红外光源波长可为808nm，经试验验证，上述化合物在功率密度为0.8W/cm²的808nm激光照射下有效地抑制了肿瘤的生长，实现了良好的光热治疗，同时不会对周围正常组织造成损伤。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括：其包括向受试者施用治疗有效剂量的上述化合物、上述药物组合物、上述药物制剂或上述系统。

所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。“治疗有效剂量”指导致任何参数或者临床症状改进的数量。实际的剂量可能随着每个患者的不同而变化，并且不一定指消除所有疾病症状的总量，可用本领域内公知的方法确定。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实验材料及仪器：

材料：马来酰亚胺、2-(boc-氨基)-1-乙醇、偶氮二甲酸二乙酯、对溴甲基苯甲酸、2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚和三氟乙酸购自天津希恩思生化科技有限公司。三苯基膦(PPh₃)、三氯氧磷、4-氨基苯硫酚、对磺酰胺苯甲酸、氯化亚砜、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、3-(3-二甲氨基丙基)-1-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)购自阿达玛斯试剂有限公司。无水甲醇、乙腈、甲苯、乙酸酐、二甲基亚砜(DMSO)、对甲苯磺酸、环己酮、无水乙酸钠和三乙胺(TEA)购自国药集团化学试剂有限公司。石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇购自天津富宇精细化工有限公司。3-(4,5-二甲基噻唑)-2-基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。三(羟甲基)氨基甲烷和牛血清白蛋白(BSA)购自北京索莱宝科技有限公司。Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、考马斯蓝染色液和SDS-PAGE上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自博士德生化科技有限公司。所有化学试剂均为分析纯，未经纯化处理直接用于实验。所有水溶液均使用去离子水(18.2MΩ·cm^-1)制备。小鼠乳腺癌细胞系(4T1)购自上海奥鲁生物科技有限公司。实验使用Balb/C小鼠(4-6周龄，雌性，体重18-21g)。

仪器：高分辨质谱(Bruker Daltonics maXis UHR-TOF，德国)；核磁共振波谱仪(Bruker，瑞士)；FLS-980型荧光光度计(Edinburgh Instruments Ltd，英国)；UV-1700型紫外可见分光光度计(Shimadzu，日本)；Laser scanning Confocal Microscopy SP8激光共聚焦荧光显微镜(Leica，德国)；Synergy 2多功能酶标仪(Biotek，美国)；高速冷冻离心机(Sigma 3K 15，美国)。

实施例1式(I)化合物的合成

(1)将2,3,3-三甲基-4,5-苯并-3H-吲哚(1.0g，4.8mmol)和对溴甲基苯甲酸(1.2g，5.7mmol)溶于乙腈(30mL)中，在110℃条件下反应4小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，将所得混合物在乙醚中析出，过滤得到粗化合物1为灰白色固体。将沉淀溶于二氯甲烷中，使用乙醚析出，过滤，干燥，得到化合物1，为白色粉末。

(2)在冰浴中，将三氯氧磷(68mL)缓慢滴加到含有N,N-二甲基甲酰胺(100mL)的250mL圆底烧瓶中。加完后，保持0-5℃反应0.5小时，然后滴加新蒸的环己酮。移除冰浴，将溶液加热至50℃反应6小时，反应体系逐渐由浅黄色变为深红色。反应结束后，将混合物分批倒入冰中。继续搅拌5小时后，抽滤得到大量黄色针状固体。所得粗品用冷超纯水洗涤至中性后，再用乙酸乙酯洗涤，真空干燥得化合物2为黄色固体。

(3)将化合物1、化合物2和无水乙酸钠按1:2:1的摩尔比溶解在乙酸酐(10mL)中。在氩气环境下，将所得混合物加热至70℃并搅拌反应1小时。减压蒸馏除去溶剂，粗品溶于少量二氯甲烷中，然后在乙醚中沉淀析出固体。过滤后，所得化合物以二氯甲烷/甲醇(v/v，10:1)为洗脱液通过硅胶柱层析纯化，得到化合物3。

(4)在0℃下，将化合物3(913mg，0.92mmol)溶解在10mL无水四氢呋喃/无水二氯甲烷(v/v,1:1)溶液中并搅拌10分钟。然后向混合物中缓慢滴加三乙胺，将反应搅拌0.5小时。随后，将对磺酰胺苯甲酰氯加入到混合物中，继续搅拌反应1小时。然后将其转移至室温后，搅拌反应12小时。减压除去溶剂后，所得固体以二氯甲烷/甲醇(v/v,5:1)为洗脱液，通过硅胶柱层析纯化，得到化合物4。

(5)在0℃下将溴与马来酰亚胺按1比1摩尔比溶于甲醇溶液中，室温搅拌16小时，然后真空浓缩得到黄色粘稠液体。再次将粗产物重新溶解在甲醇中并滴加到含有金属钠的甲醇溶液中。搅拌反应20小时后，将反应混合物真空浓缩。并用乙酸乙酯、饱和NaCl溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。干燥后的有机相经真空浓缩，得到白色固体。接着将白色固体和对甲苯磺酸溶解在新鲜的甲苯中并加热回流6h。反应结束后，将反应液冷却至室温，粗品以石油醚/乙酸乙酯(v/v，2∶1)为洗脱液，经硅胶柱层析纯化，得到黄色固体。最后，将产物与三苯基膦溶解在四氢呋喃中。在氩气气氛下，加入2-(boc-氨基)-1-乙醇和偶氮二甲酸二乙酯并在室温下反应12小时。得到的粗品以石油醚/乙酸乙酯(v/v，1∶1)为洗脱液，经硅胶柱层析纯化。将纯化后的产物进行脱boc反应。通过减压蒸馏除去溶剂，用乙醚洗涤，过滤沉淀得到化合物5。

(6)将化合物4(1.0mmol)、EDC(3.0mmol)和DMAP(0.1mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，25℃搅拌反应0.5小时。然后将化合物5(5.0mmol)加入到反应混合物中，并在25℃下搅拌反应12h。减压除去溶剂后，粗品以二氯甲烷/甲醇(v/v，15∶1)为洗脱液，经硅胶柱层析纯化，得到式(1)化合物。

实施例2化学体系的表征

1、光热剂的光热效率

根据之前报道的方法测量并计算光热转换效率(η)，测量结果如图4所示，不同浓度的材料在808nm激光器的照射下，温度随时间的变化情况。

根据图4并依据下列公式计算得到本申请光热剂的光热转换效率为38.46％。

ΔT_max是样品在最高稳态温度下的温度变化。

是溶剂(例如水)在最高稳态温度下的温度变化。h为传热系数，s为容器表面积，hs的值由公式2确定。I为激光功率密度，A为808nm处的吸光度。

m为含有光热剂的溶液质量，C为溶液的比热容，τs为相关时间常数，可由式3确定。

t＝-τ_sln(θ)-----公式3

θ是一个无量纲参数，称为驱动力温度，由公式4计算。

Tmax和TSurr分别是最大稳态温度和环境温度。

为了获得GA-PRT-PT溶液(100μM)的光热转换效率，用808nm激光照射10分钟后，溶液温度升高27.6℃。水(溶剂)的比热容为4.2J/(g·℃)。

2、GA-PRT-PT对蛋白的活性影响。

PT、GA-PT、PRT-PT和GA-PRT-PT分别在相同条件下与牛血清白蛋白(BSA)反应，然后通过透析去除游离光热剂，并通过凝胶成像检测光热剂在蛋白质条带上的荧光信号。结果如图5a显示，PRT-PT和GAP-PRT-PT的荧光强度高于没有马来酰亚胺衍生物的其他组，这表明具有蛋白质锚定功能的光热剂可以通过共价结合与BSA稳定结合。采用HRP来评估GA-PRT-PT对激光照射下的蛋白质活性。随着激光照射时间的延长，与PT+HRP组相比，GA-PRT-PT+HRP组中偶氮化合物的紫外吸收显着降低(图5b)，这表明GA-PRT-PT产生的热量导致更多的蛋白质失活，GA-PRT-PT的蛋白质锚定功能有效避免了热量损失。

实施例3生物实验

1、高尔基体共定位实验

本例研究了光热剂(实施例1制备)与高尔基体的共定位情况。把光热剂GA-PRT-PT和Golgi-Tracker Green(高尔基体绿色荧光探针)对细胞进行孵育，利用共聚焦荧光显微镜对在高尔基体中的GA-PRT-PT进行荧光成像。结果如图6显示，在4T1细胞中，高尔基体绿色荧光探针与GA-PRT-PT的荧光重叠良好，证明GA-PRT-PT主要集中在高尔基体。

2、GA-PRT-PT对蛋白锚定以及对蛋白活性影响实验

通过共聚焦荧光成像验证GA-PRT-PT能够主动锚定在高尔基体内的蛋白质上。将细胞分别与PT、GA-PT、PRT-PT和GA-PRT-PT孵育后，通过含有Triton的多聚甲醛溶液将4T1细胞固定并通透穿孔。然后用PBS洗涤细胞3次对细胞内光热剂的荧光成像。如图7a所示，细胞中PRT-PT和GA-PRT-PT的荧光强度更亮，表明共价结合蛋白的光热剂可以成功地固定在细胞内蛋白质上。这种策略增强了光热剂在细胞中的积累。同时，评估了在激光照射与GA-PRT-PT协同作用下高尔基体内蛋白质的表达的情况。环氧合酶2作为高尔基体内的巯基蛋白，用于研究不同治疗处理后高尔基体内蛋白质的表达水平(图7b)。结果表明，激光照射下，GA-PRT-PT孵育的4T1细胞中环氧合酶2的表达显着降低，这表明GA-PRT-PT产生的热量可以明显抑制蛋白质的活性。这些实验结果表明，将光热剂锚定在高尔基体内蛋白质上的策略可以有效地破坏高尔基体并消除肿瘤。

3、细胞毒性实验

通过MTT测试测量小鼠乳腺癌(4T1)细胞的细胞活力，进一步研究了GA-PRT-PT在细胞水平的潜在细胞毒性。首先将细胞与不同浓度(0，10，20，40，60，80，100，120μM)的GA-PRT-PT孵育24小时。图8a中我们观察到当细胞浓度为100μM时，细胞活力仍大于90％，说明GA-PRT-PT本身对细胞没有毒性。此外，为了研究GA-PRT-PT在体外的光热效应，评估了GA-PRT-PT在不同激光功率密度的激光照射下4T1细胞的细胞毒性。我们发现孵育了光热剂GA-PRT-PT的细胞在0.8W·cm^-2的808nm激光照射10分钟后细胞活力下降了80％(图8b)。因此，选择100μM的光热剂浓度和0.8W·cm^-2的激光功率密度作为优化参数。随后，通过MTT法测试不同处理组对细胞的杀伤能力(图8c)。结果显示，PBS、GA-PRT-PT和仅激光照射组的4T1细胞存活率无明显变化，而GA-PRT-PT+激光组细胞活力最低，说明高尔基体靶向的共价结合蛋白的光热剂GA-PRT-PT能有效地损伤肿瘤细胞。另外，我们通过活死细胞染色实验(图8d)进一步验证了GA-PRT-PT在激光照射下对肿瘤细胞很好的杀伤效果。

4、活体实验

该实施例探究了光热剂GA-PRT-PT对活体的治疗效果，我们进行了小鼠活体实验。所有的动物实验的进行都按照中华人民共和国实验室动物护理原则进行。选取雌性Balb/c小鼠作为研究对象，通过皮下注射小鼠乳腺癌细胞制作荷瘤小鼠模型，待肿瘤生长至50mm³开始给药。将小鼠分为不同的组别，各组给予不同的处理方式：(1)PBS组；(2)激光组；(3)GA-PRT-PT组；(4)PT+激光组(5)GA-PT+激光组；(6)PRT-PT+激光组；(7)GA-PRT-PT+激光组(实验组)。“激光”代表小鼠肿瘤部位给予808nm近红外光照射；并且给药方式为瘤内注射。实验周期中，隔天观察肿瘤体积及小鼠体重。实验结果表明，PBS组中小鼠的肿瘤生长很快，仅激光和光热剂处理的肿瘤细胞生长也很快，而GA-PRT-PT+激光组处理的小鼠肿瘤生长速度受到明显抑制，表明本发明可有效抑制小鼠模型中的肿瘤生长。相反，与实验组相比，PT+激光组、GA-PT+激光组、和PRT-PT+激光组的小鼠肿瘤体积比实验组要高，该结果表明，只有本发明处理的组表现出最优的肿瘤治疗效果(图9a)。小鼠体重是评估材料对身体的全身毒性的重要参数，所有组的小鼠体重随着时间延长没有明显变化，这意味着利用本发明进行治疗没有对小鼠产生明显的副作用，适用于活体水平的肿瘤治疗(图9b)。另外，七组小鼠进行不同的处理后，把各主要器官组织(心、肝、脾、肺和肾)进行组织切片H&E染色，从图10中可以说明小鼠各器官均无明显的损伤。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (8)

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物其结构式如式(I)所示：

2.权利要求1所述化合物在制备光热试剂中的应用。

3.权利要求1所述化合物在制备预防和/或治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。

4.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述化合物。

5.一种药物制剂，其特征在于，其包含权利要求1所述化合物和药学上可接受的辅料和/或载体。

6.一种装置，其特征在于，所述装置包括：

a)权利要求1所述化合物、权利要求4所述药物组合物或权利要求5所述药物制剂；

b)光照装置。

7.如权利要求6所述装置，其特征在于，所述光照装置发射光源为近红外光源。

8.如权利要求7所述装置，其特征在于，所述近红外光源波长为808nm。

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