CN114423444A - CAMKII-δ9拮抗剂及其用途 - Google Patents

CAMKII-δ9拮抗剂及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了治疗或预防Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶II(CaMKII)介导的疾病的方法，减轻心脏损伤的方法，刺激泛素结合酶的活性的方法，防止泛素结合酶降解的方法，防止心肌细胞死亡的方法，减少细胞中DNA损伤的方法，用于诊断CaMKII介导的疾病的方法，用于诊断CaMKII介导的疾病的试剂盒，用于诊断CaMKII介导的疾病的生物标志物，以及CaMKIIδ9作为用于诊断CaMKII介导的疾病的生物标志物的用途。本文还提供了用于鉴定分子、分离的多肽、分离的核酸及其拮抗剂的方法。

Description

CAMKII-δ9拮抗剂及其用途
技术领域
本发明涉及生物医学领域。特别是，本发明涉及CaMKII-δ9拮抗剂及其用途。
背景技术
在生物体的整个生命周期中，基因组不断受到各种内部和外部压力信号的攻击，导致DNA损伤。过度的DNA损伤会损害基因组完整性，并阻碍DNA复制和转录(Campisi,J.&d'Adda di Fagagna,F.Nature reviews.Molecular cell biology 8,729-740,doi:10.1038/nrm2233(2007))。作为一种保护措施，DNA修复可以抵御有害的DNA损伤，从而保持基因组稳定性和细胞活力。异常的DNA修复会导致DNA损伤的积累和基因组的不稳定，从而导致细胞死亡。由于哺乳动物的心肌细胞几乎没有再生能力，终末分化的心肌细胞的丧失是许多类型心脏类疾病的常见病因，包括心肌梗塞、心肌病和心力衰竭。然而，心肌细胞DNA修复的潜在机制在很大程度上仍然是未知的。
Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶II(CaMKII)是多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，其参与调节心肌细胞生存和细胞死亡(Erickson,J.R.,He,B.J.,Grumbach,I.M.&Anderson,M.E.Physiological reviews 91,889-915,doi:10.1152/physrev.00018.2010(2011))。CaMKII由四个基因编码，CaMKII-α、β、γ和δ，CaMKII-δ主要在心脏中表达。CaMKII-δ在两个可变域选择性剪接--在外显子13和17之间(可变域1)以及外显子20和22之间(可变域2)--产生11种不同的剪接变体。特别是，CaMKII-δ2(也称为CaMKII-δC)和CaMKII-δ3(或CaMKII-δB)先前已被鉴定为主要的心脏剪接变体，它们分别位于细胞质和细胞核中。新出现的证据表明，CaMKII-δ2和δ3对心肌细胞活力产生不同甚至相反的影响(Peng,W.等人Circulationresearch 106,102-110,doi:10.1161/CIRCRESAHA.109.210914(2010))。然而，人们对心脏中CaMKII-δ9的生理和病理功能知之甚少。
发明内容
在本发明中，本发明人已经将CaMKII-δ9，而不是经过充分研究的CaMKII-δ2和δ3鉴定为人类心脏中主要的CaMKII-δ剪接变体。在对各种刺激的反应中，CaMKII-δ9被上调，并且在触发心肌细胞DNA损伤、基因组不稳定和心脏病变方面比其他剪接变体(CaMKII-δ2和δ3)更有力。本发明人还破译了由外显子13-16-17编码的肽，即CaMKII-δ9的特征序列，赋予对UBE2T磷酸化和降解的剪接变体特异性调节。
在一个方面，本发明公开了治疗或预防受试者的CaMKII介导的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。
在另一个方面，本发明公开了减轻受试者的心脏损伤的方法，其包括向受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。
在又一个方面，本发明公开了刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的方法，其包括向受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。
在又一个方面，本发明公开了防止受试者的泛素结合酶降解的方法，其包括向受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。
在又一个方面，本发明公开了防止样本中心肌细胞死亡的方法，其包括使样本与有效量的CaMKII-δ9拮抗剂接触。
在又一个方面，本发明公开了减少细胞中DNA损伤的方法，其包括使细胞与有效量的CaMKII-δ9拮抗剂接触。
在一些实施方式中，本文公开的CaMKII-δ9拮抗剂能够抑制CaMKII-δ9的激活或抑制CaMKII-δ9的激酶活性。在一些实施方式中，CaMKII-δ9通过CaMKII-δ9本身的磷酸化和/或氧化而被激活。在一些实施方式中，CaMKII-δ9的激酶活性显示为其磷酸化其底物的能力，例如泛素结合酶，或更具体地，泛素结合酶2T(UBE2T)。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂是一种用于抑制泛素结合酶磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，泛素结合酶是UBE2T。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制UBE2T在Ser110处磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂是CaMKII-δ9的特异性拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂抑制CaMKII-δ9的水平或活性，但不显著抑制CaMKII-δ2或CaMKII-δ3的水平或活性。
在一些实施方式中，拮抗剂是特异性识别CaMKII-δ9的抗体、与CaMKII-δ9结合的小分子化合物、靶向CaMKII-δ9编码序列的RNAi分子、靶向CaMKII-δ9编码序列的反义核苷酸或与CaMKII-δ9竞争结合其底物的药剂。
在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体或全人类抗体。在一些实施方式中，抗体与CaMKII-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列结合。
在一些实施方式中，RNAi分子是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。在一些实施方式中，RNAi分子具有10-100个碱基。在一些实施方式中，反义核苷酸经修饰以提高其稳定性。在一些实施方式中，RNAi分子和反义核苷酸与CaMKII-δ基因的外显子16结合。在一些实施方式中，RNAi分子和反义核苷酸与CaMKII-δ基因的外显子13和外显子16(在本发明中也称为“外显子13-16”)，或CaMKII-δ基因的外显子16和外显子17(在本发明中也称为“外显子16-17”)，或CaMKII-δ基因的外显子13和外显子16和外显子17(在本发明中也称为“外显子13-16-17”)结合。
在一些实施方式中，与CaMKII-δ9竞争结合其底物的药剂是表达无磷酸化或无氧化功能的CaMKII-δ9的载体。在一些实施方式中，载体是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或质粒。在一些实施方式中，AAV是AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9或AAVrh10。
在一些实施方式中，受试者是人类或非人灵长类动物。在一些实施方式中，非人灵长类动物是恒河猴。在一些实施方式中，受试者是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。
在一些实施方式中，CaMKII介导的疾病与CaMKII-δ9的水平或活性增加有关。在一些实施方式中，CaMKII介导的疾病是心脏类疾病或代谢类疾病。在一些实施方式中，心脏类疾病选自由以下组成的组：心肌病、心肌炎、糖尿病性心脏病、心肌缺血、心脏缺血/再灌注损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂、心绞痛、心脏肥大、心脏损伤、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心绞痛、心肌炎、冠心病和心包炎。在一些实施方式中，心脏类疾病是肥厚型心肌病。在一些实施方式中，代谢类疾病选自由以下组成的组：胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病、高血压、血脂异常、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖症、高血脂症、痛风和高尿酸血症。
在另一个方面，本发明涉及用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的方法，其包括：(a)获得受试者的测试生物样本；(b)检测测试生物样本中CaMKII-δ9的水平或活性；其中在受试者的测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性指示受试者罹患CaMKII介导的疾病或罹患CaMKII介导的疾病的概率增加。
在一些实施方式中，测试生物样本中CaMKII-δ9的水平或活性是通过使样本与特异性结合CaMKII-δ9的试剂接触来检测。在一些实施方式中，将在测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性与在参考样本中检测到的CaMKII-δ9的参考水平或活性进行比较。在一些实施方式中，在测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性高于CaMKII-δ9的参考水平或活性指示受试者罹患CaMKII介导的疾病或罹患CaMKII介导的疾病的概率增加。在一些实施方式中，参考样本来自健康受试者，或者是比测试生物样本更早或更晚从同一受试者获得的样本。在一些实施方式中，测试生物样本来自受试者的心脏。在一些实施方式中，受试者是人类或非人灵长类动物。
在另一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的试剂盒，其包含特异性识别CaMKII-δ9的抗体或抗体片段。
在另一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的生物标志物，其中生物标志物包括CaMKII-δ9的全长蛋白质序列或其片段。在一些实施方式中，生物标志物包括如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明公开了CaMKII-δ9作为用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的生物标志物的用途。
在另一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制CaMKII-δ9活性的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和UBE2T接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制CaMKII-δ9磷酸化能力的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和UBE2T接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9磷酸化能力的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制CaMKII-δ9本身磷酸化和/或氧化的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和可以检测CaMKII-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平降低鉴定了抑制CaMKII-δ9磷酸化和/或氧化的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定治疗或预防CaMKII介导的疾病的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和UBE2T接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了治疗或预防CaMKII介导的疾病的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定治疗或预防CaMKII介导的疾病的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和可以检测CaMKII-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平降低鉴定了治疗或预防CaMKII介导的疾病的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减轻心脏损伤的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和UBE2T接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了减轻心脏损伤的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减轻心脏损伤的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和可以检测CaMKII-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平降低鉴定了减轻心脏损伤的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定防止心肌细胞死亡的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和UBE2T接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了防止心肌细胞死亡的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定防止心肌细胞死亡的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和可以检测CaMKII-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平降低鉴定了防止心肌细胞死亡的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减少DNA损伤的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和UBE2T接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了减少DNA损伤的分子。
在一些实施方式中，UBE2T磷酸化是在Ser110处。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减少DNA损伤的分子的方法，其包括使分子与CaMKII-δ9和可以检测CaMKII-δ9磷酸化和/或氧化状态的抗体接触，并确定磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平是否降低，其中磷酸化和/或氧化的CaMKII-δ9的水平降低鉴定了减少DNA损伤的分子。
在另一个方面，本发明公开了分离的CaMKII-δ多肽，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、如SEQID NO:4所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明公开了分离的CaMKII-δ核酸，其包含编码本发明多肽的核酸序列。在一些实施方式中，CaMKII-δ核酸包含选自由以下组成的组的核酸序列之一：SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19以及与SEQ ID NO:6-19具有至少80％同源性的核酸序列。
在又一个方面，本发明公开了能够抑制CaMKII-δ9的水平或活性的CaMKII拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制泛素结合酶磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，泛素结合酶是UBE2T。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制UBE2T在Ser110处磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂是CaMKII-δ9的特异性拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂抑制CaMKII-δ9的水平或活性，但不显著抑制CaMKII-δ2或CaMKII-δ3的水平或活性。在一些实施方式中，拮抗剂是与CaMKII-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向CaMKII-δ基因的外显子16的RNAi分子或靶向CaMKII-δ基因的外显子16的反义核苷酸。在一些实施方式中，拮抗剂是与CaMKII-δ基因的外显子13和外显子16编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向CaMKII-δ基因的外显子13和外显子16的RNAi分子或靶向CaMKII-δ基因的外显子13和外显子16的反义核苷酸。在一些实施方式中，拮抗剂是与CaMKII-δ基因的外显子16和外显子17编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向CaMKII-δ基因的外显子16和外显子17的RNAi分子或靶向CaMKII-δ基因的外显子16和外显子17的反义核苷酸。在一些实施方式中，拮抗剂是与CaMKII-δ基因的外显子13、外显子16和外显子17编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向CaMKII-δ基因的外显子13、外显子16和外显子17的RNAi分子或靶向CaMKII-δ基因的外显子13、外显子16和外显子17的反义核苷酸。在一些实施方式中，拮抗剂是与全长CaMKII-δ9的氨基酸序列结合的抗体、靶向全长CaMKII-δ9的编码序列的RNAi分子或靶向全长CaMKII-δ9的编码序列的反义核苷酸。
在又一个方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含本发明的拮抗剂和药学上可接受的载体。
附图说明
图1说明CaMKII-δ9是重要的心脏胞质CaMKII-δ剪接变体。(a)，小鼠、大鼠、恒河猴和人类心脏中所有CaMKII-δ剪接变体的剪接情况和表达水平。转录图显示了通过SMRT测序获得的11个报告的选择性剪接变体(行)。外显子(列)如果存在则为黑色，并在底部编号(下列，UTR区；黑线，外显子连接)。每个框的长度与每个外显子的长度成正比，每个剪接变体的百分比用条形图表示(右图，CaMKII-δ9为灰色)，一些主要变体的绝对读数显示在条形图上(每个物种有3个样本被汇集在一起)。(b)，用外显子21抗体对小鼠心脏的总蛋白进行相互免疫沉淀，并用外显子16抗体进行探测，反之亦然。IP(input)泳道来自同一膜的较长时间的暴露。n＝3个生物独立样本。(c)，在用抗外显子21或抗外显子16免疫沉淀的人类心脏中，通过定量质谱分析的CaMKII-δ外显子拼接体的相对肽量。n＝3个(左图)和8个(右图)生物独立样本。(d)，感染了Ad-Flag-CaMKII-δ9和Ad-HA-CaMKII-δ2的NRVM中Flag-CaMKII-δ9(右上图)和HA-CaMKII-δ2(左下图)的胞质位置的免疫荧光共聚焦显微图像。比例尺，10μm。n＝6个生物独立样本。(e)、(f)，暴露在1μM阿霉素(24小时)(e，n＝12个(媒剂)和10个(Dox)生物独立样本)或200μM H2O2(24小时)(f，n＝7个(媒剂)和5个(H2O2)生物独立样本)的NRVM中的CaMKII-δ9蛋白水平。(g)、(h)，肥大小鼠心脏(TAC 2周)(g，n＝5只(假手术)和6只(TAC)生物独立动物)和患有肥厚型心肌病(HCM)的人的心肌组织(h，n＝7个(正常人)和6个(HCM)生物独立样本)的CaMKII-δ9蛋白水平及其相应对照。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析(c，左图)，双侧学生t检验(c，右图，e-h)。
图2说明CaMKII-δ9通过下调UBE2T诱导心肌细胞死亡。(a)、(b)，在存在或不存在H2O2(200μM)(a)或Dox(1μM)(b)的情况下，用加扰或CaMKII-δ9siRNA处理的NRVM中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝6个生物独立样本。(c)，以指定MOI感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ9和Ad-CaMKII-δ248小时的NRVM中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝6个(Ad-β-gal和Ad-CaMKII-δ9)和4个(Ad-CaMKII-δ2)生物独立样本。(d)，在感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ9或Ad-CaMKII-δ2(MOI 50，48小时)的NRVM中，通过实时PCR分析的由CaMKII-δ9而不是CaMKII-δ2上调的3个基因的mRNA水平的平均数据。n＝14个生物独立样本。(e)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示CaMKII-δ9，而不是δ2，以剂量依赖性方式减少UBE2T。n＝8个生物独立样本。(f)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示在用加扰或CaMKII-δ9siRNA转染的NRVM中UBE2T的表达。n＝5个生物独立样本。(g)，感染了Ad-β-gal和Ad-CaMKII-δ9(MOI 50，48小时)并且有或没有UBE2T过表达的NRVM中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝5个生物独立样本。(h)，用加扰或UBE2T siRNA处理60小时的NRVM中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝5个生物独立样本。(i)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示在存在或不存在H2O2(200μM)的情况下，UBE2T在NRVM中的表达。n＝5个生物独立样本。(j)，在有或没有UBE2T过表达并暴露于H2O2(200μM)的NRVM中的细胞胱天蛋白酶3/7活性。n＝8个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。双因素方差分析(a、b、g、j)，单因素方差分析(c、d、e、h)或双侧学生t检验(f、i)。
图3说明CaMKII-δ9通过破坏UBE2T介导的DNA修复来诱导心肌细胞DNA损伤和基因组不稳定。(a)，感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ2或Ad-CaMKII-δ9(MOI 50，48小时)的γH2AX阳性NRVM的代表性免疫染色和统计数据。n＝6个生物独立样本。箭头指示γH2AX阳性细胞核。比例尺，20μm。(b)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示CaMKII-δ9在NRVM中剂量依赖性地增加γH2AX。n＝10个生物独立样本。(c)，通过彗星分析法评估的感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ2或Ad-CaMKII-δ9(MOI 50，48小时)的NRVM的DNA损伤。n＝6个生物独立样本。箭头指示具有DNA损伤的细胞核。比例尺，20μm。(d)、(e)，在存在或不存在H2O2(100μM，10分钟)的情况下，通过γH2AX免疫染色(d)和彗星分析法(e)评估的用加扰或CaMKII-δ9siRNA处理的NRVM的DNA损伤。n＝6个生物独立样本。(f)、(g)，通过γH2AX免疫染色(f)和彗星分析法(g)评估的感染了Ad-β-gal或Ad-UBE2T并且有或没有CaMKII-δ9过表达(MOI 50，48小时)的NRVM的DNA损伤。n＝6个生物独立样本。(h)、(i)，在存在或不存在H2O2(100μM，10分钟)的情况下，通过γH2AX免疫染色(h)和彗星分析法(i)评估的感染了Ad-β-gal或Ad-UBE2T的NRVM的DNA损伤。n＝6个生物独立样本。(j)、(k)，通过γH2AX免疫染色(j)和彗星分析法(k)评估的用加扰或UBE2T siRNA处理60小时的NRVM的DNA损伤。n＝6个生物独立样本。(l)、(m)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示感染了加扰、FANCD2(l)或FANCI(m)siRNA的NRVM中的γH2AX水平。n＝4个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析(a、b、c、j、k、l、m)，或双因素方差分析(d-i)。
图4说明心肌病和心力衰竭中CaMKII-δ9-UBE2T-DNA损伤信号传导的增强。(a-d)，wt和CaMKII-δ9tg小鼠的心肌CaMKII-δ9蛋白水平(a，n＝8只生物独立动物)、Kaplan-Meier生存曲线(b，n＝20只(wt)和22只(CaMKII-δ9tg)生物独立动物)、心脏总体形态(c，n＝15只(wt)和9只(CaMKII-δ9tg)生物独立动物)以及心脏TUNEL染色的统计数据(d，n＝5只生物独立动物)。比例尺，2mm。(e)、(f)，6周龄和10周龄wt和CaMKII-δ9tg小鼠的代表性超声心动图(e)和统计数据(f)。n＝13只(wt 6周)、15只(wt 10周)、15只(CaMKII-δ9tg 6周)和9只(CaMKII-δ9tg 10周)生物独立动物。EF，射血分数；FS，缩短分数；LVIDd和LVIDs，舒张期和收缩期左心室内径；LVPWd和LVPWs，舒张期和收缩期左心室后壁厚度。(g)，10周龄wt和CaMKII-δ9tg小鼠心脏γH2AX染色的统计数据。n＝6只生物独立动物。(h)，10周龄wt和CaMKII-δ9tg小鼠的心脏UBE2T蛋白水平。n＝5只(wt)和6只(CaMKII-δ9tg)生物独立动物。(i)，10周龄wt和CaMKII-δ9shRNA转基因(shRNA tg)小鼠心脏中的CaMKII-δ9蛋白水平。n＝14只(wt)和11只(shRNA tg)生物独立动物。(j-m)，TAC手术后4周wt和shRNA tg小鼠的EF和FS的统计数据(j，n＝10只(假手术)和16只(wt TAC)和9只(shRNA tgTAC)生物独立动物、Kaplan-Meier生存曲线(k，n＝17只(wt)和28只(shRNA tg)生物独立动物、心脏γH2AX(l，n＝5只生物独立动物)以及TUNEL(m，n＝5只生物独立动物)染色。数据为平均值±s.e.m.。双侧学生t检验(a、d、g-i、l、m)，对数秩(Mantel-Cox)检验(b、k)或双因素ANOVA(f、j)。
图5说明UBE2T的过表达减弱CaMKII-δ9诱导的DNA损伤、心肌细胞死亡和心肌病。(a)，UBE2Ttg小鼠的构建示意图。(b)，wt和CaMKII-δ9tg小鼠与wt和UBE2Ttg小鼠杂交的Kaplan-Meier生存曲线。n＝6只(wt+wt)、5只(wt+UBE2Ttg)、22只(CaMKII-δ9tg+wt)和8只(CaMKII-δ9tg+UBE2Ttg)生物独立动物。c，通过超声心动图评估的wt和CaMKII-δ9tg小鼠与wt和UBE2Ttg小鼠杂交的左心室射血分数(EF)和缩短分数(FS)。n＝6只(wt+wt)、5只(wt+UBE2Ttg)、10只(CaMKII-δ9tg+wt)和7只(CaMKII-δ9tg+UBE2T tg)生物独立动物。(d)、(e)，在wt和CaMKII-δ9tg小鼠与wt和UBE2Ttg小鼠杂交的心脏中，由TUNEL阳性细胞(d)所指示的细胞死亡和由γH2AX阳性细胞(e)所证明的DNA损伤的统计数据。n＝5只生物独立动物。(f),代表性蛋白质印迹和统计数据，显示wt和CaMKII-δ9tg小鼠与wt和UBE2Ttg小鼠杂交的心脏中的UBE2T水平。n＝4只生物独立动物。数据为平均值±s.e.m.。对数秩(Mantel-Cox)检验(b)或双因素ANOVA(c-f)。
图6说明肥厚型心肌病患者的心肌和用阿霉素处理的人心肌细胞中CaMKII-δ9-UBE2T-DNA损伤信号传导增加。(a-c)，患有肥厚型心肌病(HCM)的人或正常对照的心肌组织中裂解的胱天蛋白酶3(a)、UBE2T(b)和γH2AX(c)的代表性蛋白质印迹和统计数据。n＝4个(正常人)和8个(HCM)生物独立样本。(d-f)，通过胱天蛋白酶3/7活性分析的细胞活力(d)，以及代表性蛋白质印迹和统计数据，显示感染了Ad-β-gal、Ad-CAMKII-δ9或Ad-CAMKII-δ2(MOI 100，48小时)的人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞中的γH2AX(e)和UBE2T(f)水平。n＝4个生物独立样本。(g-i)，通过胱天蛋白酶3/7活性分析的细胞活力(g，n＝6个生物独立样本)，以及代表性蛋白质印迹和统计数据，显示感染了加扰或CaMKII-d9 siRNA并且经过或未经阿霉素(Dox)处理(1mM，24小时)的人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞中的γH2AX(h，n＝4个生物独立样本)和UBE2T(i，n＝4个生物独立样本)水平。数据为平均值±s.e.m.。双侧学生t检验(a-c)，单因素方差分析(d-f)或双因素方差分析(g-i)。
图7说明CaMKII-δ9增加UBE2T在Ser110处的磷酸化并促进其降解。(a)、(b)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示蛋白酶体抑制剂β-lac(a，5μM，n＝8个生物独立样本)和MG132(b，10μM，n＝6个生物独立样本)阻断NRVM中CaMKII-δ9介导的UBE2T降解和γH2AX上调。(c)，代表性免疫染色图像，显示在不存在和存在CaMKII-δ9以及具有或不具有MG132(10μM)的情况下，NRVM中带myc标签的UBE2T的位置。n＝6个生物独立样本。比例尺，20μm。(d)，在感染了Ad-Flag-CaMKII-δ9和Ad-UBE2T-myc的NRVM中，CaMKII-δ9与UBE2T的免疫共沉淀。IP(input)代表用于每次免疫沉淀的全细胞溶解物的6％。n＝4个生物独立样本。(e)、(f)，代表性蛋白质印迹，显示CaMKII-δ9增加了NRVM中UBE2T的丝氨酸磷酸化(e)，但没有增加苏氨酸磷酸化(f)。n＝4个生物独立样本。(g)，代表性蛋白质印迹和平均数据，显示UBE2T-S110A，而不是WT UBE2T或UBE2T-S193A突变体，抵抗CaMKII-δ9介导的降解(MOI 50，48小时)。n＝4个生物独立样本。(h)，典型的蛋白质印迹和平均数据，说明在无细胞系统中，在与或不与CaMKII-δ9或CaMKII-δ2蛋白共培育的情况下UBE2T重组蛋白的丝氨酸磷酸化和UBE2T总水平。n＝6个生物独立样本。(i)，UBE2T和CaMKII-δ2在感染了Ad-UBE2T-myc和Ad-HA-CaMKII-δ2的NRVM溶解物中的免疫共沉淀。n＝4个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。双因素方差分析(a、b)或单因素方差分析(g、h)。
图8说明CaMKII-δ9对UBE2T的特异性磷酸化。(a)，在感染了Ad-Flag-CaMKII-δ1和Ad-UBE2T-myc的NRVM中，CaMKII-δ1与UBE2T的免疫共沉淀。IP(input)代表用于每次免疫沉淀的全细胞溶解物的6％。n＝4个生物独立样本。(b)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示是CaMKII-δ9，而不是δ1，降低了NRVM中的UBE2T。n＝4个生物独立样本。(c)，在感染了Ad-HA-CaMKII-δ3和Ad-UBE2T-myc的NRVM中，CaMKII-δ3与UBE2T的免疫共沉淀。IP(input)代表用于每次免疫沉淀的全细胞溶解物的6％。n＝4个生物独立样本。(d)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示是CaMKII-δ9，而不是δ3，降低了NRVM中的UBE2T。n＝6个生物独立样本。(e)，在用相应外显子拼接体(带Flag-GFP标签)或UBE2T-myc的质粒转染的HEK293细胞中，CaMKII-δ外显子拼接体外显子13-16-17编码的肽与UBE2T的免疫共沉淀。n＝4个生物独立样本。(f)，显示CaMKII-δ9介导的心脏DNA损伤和心肌细胞死亡信号传导的示意图。在正常情况下，UBE2T保护基因组免受各种类型的DNA损伤，以维持心肌细胞的生存。当心肌细胞受到损伤时，CaMKII-δ9被上调和过度激活，这增强了UBE2T的Ser110磷酸化和后续降解。UBE2T水平降低会损害DNA修复机制，导致DNA损伤的积累、基因组不稳定和细胞死亡。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析。
图9说明CaMKII-δ9存在于心脏中。(a)，CaMKII-δ剪接变体的示意图。CaMKII-δ主要在两个可变域发生选择性剪接事件，一个在外显子13和17之间，另一个在外显子20之后。外显子被编号，全尺寸框代表编码外显子，而较小的绿色框代表非翻译区(UTR)，特殊外显子被着色。(b)，全长CaMKII-δ转录物的SMRT测序策略。CaMKII-δ转录物是从不同物种的心脏中分离出的总RNA逆转录而来。每个cDNA用成对的引物扩增，其位置用不同颜色的箭头标记。正向引物(左)位于外显子1上，反向引物(右)位于外显子22上。PCR产物经浓缩和纯化用于SMRT测序。(c-e)，通过RNA-seq分析人、恒河猴、狗、大鼠和小鼠心脏中可变域1(外显子13和17之间(c)和外显子14-17之间(d))和可变域2(外显子20和22之间)(e)的CaMKII-δ外显子拼接体的百分比。在e图中，在猴和人的心脏中，外显子20b是外显子20的另一种形式，它比经典的外显子20长147个碱基，以前没有描述过。数据为平均值±s.e.m.(n＝8个(人和大鼠)、7个(恒河猴)和6个(狗和小鼠)生物独立样本)。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析。
图10说明心脏中CaMKII-δ9蛋白的鉴定。(a)，用作产生抗体的抗原的外显子16和21的肽序列。(b)，用Ad-β-gal、Ad-HA-CaMKII-δ2、Ad-HA-CaMKII-δ3或Ad-Flag-CaMKII-δ9转染的NRVM与含有抗外显子16或抗外显子21的血清的免疫印迹。n＝3个生物独立样本。(c)、(d)，带Flag标签的CaMKII-δ9重组蛋白与抗外显子16(c)和抗外显子21(d)的蛋白质印迹，其中相应的抗原肽与CaMKII-δ9蛋白的比例增加。n＝4个生物独立样本。平均值±s.e.m.。单因素方差分析。(e)、(f)，用抗外显子21(e)或抗外显子16(f)免疫沉淀的10周龄小鼠心脏溶解物，然后进行SDS-PAGE和考马斯蓝染色。切割约50kD(框)处的条带进行MS分析。(g)、(h)，用抗外显子21(g)或抗外显子16(h)免疫沉淀的小鼠心脏的CaMKII-δ外显子13-16-17(g)和20-21(h)拼接体匹配的肽的LC-MS/MS谱。上面的肽序列是相应的外显子拼接体，具体的外显子16和21以粗体显示。bn离子是第n个肽键的片段，含有肽的氨基末端部分，而yn离子含有羧基末端部分。NL，归一化强度水平(每秒计数)。(i)、(j)，在恒河猴(i)和wt小鼠(j)中的CaMKII-δ9组织分布。n＝4个生物独立样本。CaMKII-δ9重组蛋白充当阳性对照(PC)。在这两个物种中，在脑中检测到分子量较高的条带，这是脑富集的剪接变体CaMKII-δ1(外显子13-15-16-17)。(k)、(l)，内源性CaMKII-δ9(灰色)在成年(左)和新生(右)大鼠心室心肌细胞中的胞质位置(k,n＝4个生物独立样本)，以及HA-CaMKII-δ3(灰色)在感染了Ad-HA-CaMKII-δ3的NRVM中的核位置(l,n＝6个生物独立样本)的免疫荧光共聚焦显微图像。比例尺，10μm。(m)，NRVM的细胞核和胞质部分的CaMKII-9蛋白水平。n＝6个生物独立样本。
图11说明CaMKII-δ9在心脏中的病理相关性。(a)、(b)，蛋白质印迹，显示经过或未经Dox处理(1μM，30和60分钟)的NRVM中CaMKII-δ9的磷酸化(a，n＝8个生物独立样本)和氧化(b，n＝7个生物独立样本)水平。NRVM用Ad-Flag-CaMKII-δ9感染，溶解物用Flag抗体免疫沉淀并进行蛋白质印迹分析。(c)、(d)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示有或没有I/R损伤的灌注小鼠心脏(30分钟局部缺血，然后60分钟再灌注)中CaMKII-δ9的磷酸化(c)和氧化(d)水平。n＝6个生物独立样本。心脏溶解物用外显子16抗体免疫沉淀并进行蛋白质印迹分析。(e)，CaMKII-δ9siRNA的序列。黑色序列是CaMKII-δ9的外显子16中的siRNA目标。siRNA序列在下方以灰色显示。(f)、(g)，由mRNA(f，n＝5个(加扰),和8个(CaMKII-δ9siRNA)生物独立样本)和蛋白质(g，n＝3个生物独立样本)水平证实的CaMKII-δ9siRNA的敲低效率。(h)，通过实时PCR分析的感染了加扰或CaMKII-δ9siRNA的NRVM中CaMKII-δ2和CaMKII-δ3的mRNA水平的平均数据。n＝18个(CaMKII-δ2)和15个(CaMKII-δ3)生物独立样本。(i)、(j)，在存在或不存在H2O2(200μM)(i)或Dox(1μM)(j)的情况下，在用加扰或CaMKII-δ9siRNA处理的NRVM的培养基中，通过LDH浓度评估的细胞活力。n＝6个生物独立样本。(k)，通过在以指定MOI感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ9和Ad-CaMKII-δ248小时的NRVM的培养基中的LDH评估的活力。n＝10个生物独立样本。(l)，感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ9或Ad-CaMKII-δ2(MOI50，48小时)的NRVM中CaMKII-δ表达的代表性蛋白质印迹和统计数据。n＝3个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析(a、b、g、k)，双侧学生t检验(c、d、f、h、l)或双因素方差分析(i、j)。
图12说明对CaMKII-δ9和CaMKII-δ2的基因表达谱的RNA-seq分析。(a)，基于Ad-β-gal和Ad-CaMKII-δ9之间差异表达的基因，表示感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ9或Ad-CaMKII-δ2(MOI 50，48小时)的NRVM中的基因表达特征的热图。每个基因的表达值以每百万定位片段每千碱基转录物的片段(FPKM)计算。列出了七十七个基因；相对于感染了Ad-β-gal的细胞，它们在感染了Ad-CaMKII-δ9的细胞中发生了有差异地显著变化(>1.5倍或<0.67倍，n＝3个生物独立样本)。在Ad-CaMKII-δ9和Ad-CaMKII-δ2中受到不同调控的15个基因为灰色。热图由R软件包“pheatmap”生成，选项为“scale＝row”，这意味着每个基因的表达值是由FPKM值归一化的z-score。(b)，在感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ9或Ad-CaMKII-δ2(MOI 50，48小时)的NRVM中，通过实时PCR分析的由RNA-seq鉴定的受CaMKII-δ9而非CaMKII-δ2调节的15个基因中12个的mRNA水平数据。n＝14个生物独立样本。(c)、(d)，在所培养的感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ9或Ad-CaMKII-δ2(如所指示的剂量，48小时)中，COX-2(c)和PAI-2(d)的蛋白水平。n＝4个生物独立样本。(e)，典型的蛋白质印迹和平均数据，显示用加扰或COX-2siRNA转染的NRVM中COX-2的蛋白水平。n＝4个生物独立样本。(f)、(g)，在存在或不存在COX-2siRNA的情况下，感染了Ad-β-gal或Ad-CaMKII-δ9的NRVM中，由胱天蛋白酶3/7活性(f)和培养基中的LDH浓度(g)所指示的细胞活力。n＝3个(f)和6个(g)生物独立样本。(h)，代表性蛋白质印迹和平均数据，显示用加扰或UBE2T siRNA转染的NRVM中UBE2T的蛋白水平。n＝4个生物独立样本。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析(b、c、d、e、h)或双因素方差分析(f、g)。
图13说明CaMKII-δ9诱发心肌细胞DNA损伤。(a)、(b)，在感染了Ad-β-gal、Ad-CaMKII-δ2或Ad-CaMKII-δ9(MOI 50，48小时)的NRVM中，γ-H2AX的完整代表性免疫染色(a)和彗星分析法(b)。比例尺，20μm。部分代表图像和平均数据显示在图3a、c中。(c-f)，代表性蛋白质印迹和统计数据，显示感染了加扰、FANCD2或FANCI siRNA的NRVM中FANCD2(c，n＝4个生物独立样本)和FANCI(d，n＝4个生物独立样本)的水平以及胱天蛋白酶3/7活性(e、f，n＝5个生物独立样本)。数据为平均值±s.e.m.。单因素方差分析。
图14说明CaMKII-δ9-UBE2T信号传导在心脏病理生理学中的作用。(a)，CaMKII-δ9tg小鼠的构建示意图。(b)，wt和CaMKII-δ9tg小鼠的PCR基因分型。(c)、(d)，10周龄wt和CaMKII-δ9tg小鼠的心脏重量与体重之比(c，n＝15个(wt)和9个(CaMKII-δ9tg)生物独立样本)和心室基因表达(d，n＝7个(wt)和6个(CaMKII-δ9tg)生物独立样本)。(e)，10周龄wt和CaMKII-δ9tg小鼠心脏γ-H2AX的免疫染色。箭头，γ-H2AX阳性细胞。右侧窗口，如所指示的视图的放大图像。平均数据在图4g中。比例尺，20μM。(f)，CaMKII-δ9shRNA转基因(shRNAtg)小鼠的构建示意图。(g)，wt和shRNA tg小鼠的PCR基因分型。(h)，10周龄wt和shRNA tg小鼠的心脏外显子21蛋白水平(n＝4个生物独立样本)。(i)、(j)，TAC手术后4周wt和shRNAtg小鼠的心脏重量与体重之比(i，n＝16个(wt)和8个(shRNA tg)生物独立样本)和心脏UBE2T蛋白水平(j，n＝4个生物独立样本)。(k)，10周龄CaMKII-δ9tg和CaMKII-δ2tg小鼠的心脏CaMKII-δ蛋白水平(n＝4个生物独立样本)。(l-q)，wt、CaMKII-δ9tg和CaMKII-δ2tg小鼠的心脏TUNEL染色(l，n＝8个生物独立样本)、超声心动图(m，n＝8个生物独立样本)、心脏重量与体重之比(n，n＝8个生物独立样本)、Kaplan-Meier生存曲线(o，n＝10个(wt)、19个(CaMKII-δ9tg)和12个(CaMKII-δ2tg)生物独立样本)、心脏γ-H2AX染色(p，n＝8个生物独立样本)以及心脏UBE2T蛋白水平(q，n＝4个生物独立样本)。数据为平均值±s.e.m.。双侧学生t检验(c、d、i)、单因素方差分析(k-n、p、q)、双因素方差分析(j)或对数秩(Mantel-Cox)检验(o)。
图15说明CaMKII-δ9使UBE2T在Ser110位点处磷酸化。(a)，质谱数据，显示由CaMKII-δ9介导的UBE2T的两个潜在磷酸化位点(Ser110和Ser193，圆圈)(n＝3个生物独立样本)。HEK293细胞在对照载体或或带Flag标签的CaMKII-δ9存在下用带myc标签的UBE2T转染，全细胞溶解物用myc抗体免疫沉淀，然后对免疫复合物进行翻译后修饰质谱分析。(b)，UBE2T蛋白的序列比对，显示12个物种中UBE2T的Ser110位点而非Ser193位点(箭头)的保守性。(c)，典型的蛋白质印迹和平均数据，显示在无细胞系统中，在与或不与CaMKII-δ9蛋白共培育的情况下UBE2T和UBE2T-S110A重组蛋白的丝氨酸磷酸化和总水平(n＝4个生物独立样本)。双因素方差分析。(d)，在感染了Ad-UBE2T、Ad-UBE2T-S110A或Ad-UBE2T-S193A的NRVM中，wt UBE2T、UBE2T-S110A和UBE2T-S193A(均带有myc标签)的代表性免疫荧光图像(n＝6个生物独立样本)。注意，UBE2T-S110A是抗降解的，并且分布在细胞质和细胞核中，表明UBE2T的Ser110位点负责其降解，而不是其亚细胞分布，比例尺，10μm。数据为平均值±s.e.m.。
图16说明由CaMKII-δ外显子拼接体编码的肽与UBE2T之间的相互作用。(a-c)，在用相应外显子拼接体(带Flag-GFP标签)或UBE2T-myc的质粒转染的HEK293细胞中，CaMKII-δ外显子拼接体外显子13-17(a)、13-14-17(b)和13-15-16-17(c)编码的肽与UBE2T的免疫共沉淀。(n＝4个生物独立样本)。
图17说明CaMKII-δ基因的外显子16的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)、CaMKII-δ基因的外显子13-16的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)、CaMKII-δ基因的外显子16-17的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)、CaMKII-δ基因的外显子13-16-17的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)和CaMKII-δ9的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图18说明人和大鼠CaMKII-δ基因外显子16的核酸序列(SEQ ID NO:6)、小鼠CaMKII-δ基因外显子16的核酸序列(SEQ ID NO:7)、人CaMKII-δ基因外显子13-16的核酸序列(SEQ ID NO:8)、大鼠CaMKII-δ基因外显子13-16的核酸序列(SEQ ID NO:9)、小鼠CaMKII-δ基因外显子13-16的核酸序列(SEQ ID NO:10)、人CaMKII-δ基因外显子16-17的核酸序列(SEQ ID NO:11)、大鼠CaMKII-δ基因外显子16-17的核酸序列(SEQ ID NO:12)、小鼠CaMKII-δ基因外显子16-17的核酸序列(SEQ ID NO:13)、人CaMKII-δ基因外显子13-16-17的核酸序列(SEQ ID NO:14)、大鼠CaMKII-δ基因外显子13-16-17的核酸序列(SEQ ID NO:15)、小鼠CaMKII-δ基因外显子13-16-17的核酸序列(SEQ ID NO:16)。
图19说明全长人CaMKII-δ9的核酸序列(SEQ ID NO:17)。
图20说明全长大鼠CaMKII-δ9的核酸序列(SEQ ID NO:18)。
图21说明全长小鼠CaMKII-δ9的核酸序列(SEQ ID NO:19)。
具体实施方式
在更详细地描述本发明之前，应理解本公开内容不限于所描述的特定实施方式，因此，当然可能会有变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值，到下限单位的十分之一，以及该规定范围内的任何其他规定值或中间值，都涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也涵盖在本发明内，受规定范围中任何具体排除的限制。当规定范围包括一个或两个限制时，不包括这些所包括的限制中的任何一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and MolecularBiology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)和March,Advanced OrganicChemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版,JohnWiley&Sons(New York,N.Y.1992)为本领域的技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般指南。尽管任何与本文所述相似或等效的方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利在此通过引用并入，就像每个单独的出版物或专利被具体和单独指明为通过引用并入一样，并且通过引用并入以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日期之前的公开内容，不应理解为承认本发明无权因在先公开而早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立确认。
如本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见的是，本文所描述和说明的各个实施方式中的每一个都具有离散的组件和特征，这些组件和特征可以容易地与其他几个实施方式中的任何一个的特征分离或组合，而不偏离本发明的范围或精神。任何叙述的方法都可以按照所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
除非另外指明，否则本发明的实施方式将采用化学、固态化学、无机化学、有机化学、物理化学、分析化学、材料化学、生物化学、生物学、分子生物学、重组DNA技术、药理学、影像学等技术，这些技术属于本领域的技能。这些技术在文献中得到了充分的解释，如“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)”，第二版(Sambrook等人,1989)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(M.J.Gait编,1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”(R.I.Freshney编,1987)；“酶学方法(Methods inEnzymology)”系列(Academic Press,Inc.)；“现代分子生物学实验技术(CurrentProtocols in Molecular Biology)”(F.M.Ausubel等人编,1987，并定期更新)；“PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)”(Mullis等人编,1994)。本发明采用的引物、多核苷酸和多肽可以使用本领域已知的标准技术产生。
提出以下实施方式是为了向本领域的技术人员提供关于如何执行本文公开和要求保护的方法和使用生物标志物和试剂盒的完整公开和描述。已努力确保数字(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑到一些误差和偏差。
必须指出，除非上下文另外明确规定，否则如说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括其复数形式。因此，举例来说，提及“一种化合物”包括多种化合物。在本说明书和所附权利要求书中，将提到一些术语，这些术语应被定义为具有以下含义，除非有明显的相反意图。
在一个方面，本发明公开了治疗或预防受试者的CaMKII介导的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。在另一个方面，本发明公开了CaMKII-δ9拮抗剂在制造用于治疗或预防受试者的CaMKII介导的疾病的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了一种CaMKII-δ9拮抗剂，其用于治疗或预防受试者的CaMKII介导的疾病。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指试图改变所治疗的受试者的疾病、病况或病症的自然进程的临床干预，并且可以为预防或在临床病理过程中进行。治疗的理想效果包括预防疾病、病况或病症的发生或复发，减轻症状，减少疾病、病况或病症的任何直接或间接病理后果，降低疾病、病况或病症的进展速度，改善或缓解疾病状态，以及缓解或改善预后。
如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指降低受试者罹患疾病、病况或病症的概率，所述受试者尚未罹患疾病、病况或病症，但有风险或容易罹患疾病、病况或病症。
如本文所用，术语“CaMKII介导的疾病”是指与CaMKII的异常水平和/或活性有关的疾病、病况或病症，由于受试者体内CaMKII的异常激活或破坏使得CaMKII的水平和/或活性异常高或低而导致或促进。在一些实施方式中，CaMKII介导的疾病与CaMKII-δ9的水平和/或活性增加有关。在一些实施方式中，CaMKII介导的疾病是心脏类疾病或代谢类疾病。在一些实施方式中，心脏类疾病选自由以下组成的组：心肌病、心肌炎、糖尿病性心脏病、心肌缺血、心脏缺血/再灌注损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂、心绞痛、心脏肥大、心脏损伤、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心绞痛、心肌炎、冠心病和心包炎。在一些实施方式中，心脏类疾病是肥厚型心肌病。在一些实施方式中，代谢类疾病选自由以下组成的组：胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病、高血压、血脂异常、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖症、高血脂症、痛风和高尿酸血症。
如本文所用，术语“施用(administer/administering/administered/administration)”是指将物质递送给有需要的受试者。施用途径可以是局部、口服、鼻内、肠胃外、肠内、直肠、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌内、经颊、舌下或眼部。在一些实施方式中，物质可以通过静脉内、腹膜内或皮下注射，使用外周全身递送施用于受试者。
如本文所用，术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物。“受试者”还可以是家畜，如牛、猪、羊、家禽和马；或啮齿动物，如大鼠、小鼠；或非人灵长类动物，如猿、猴、恒河猴；或家养动物，如狗或猫。术语“受试者”在任何方面都不以限制为目的，可以是任何年龄、性别和身体状况，例如可以是男性或女性，可以是老年人、成年人、青少年、儿童或婴儿。人类“受试者”可以是白种人、非洲人、亚洲人、闪米特人或其他种族，或上述种族背景的混血儿。在一些实施方式中，受试者是人类或非人灵长类动物。在一些实施方式中，非人灵长类动物是恒河猴。在一些实施方式中，受试者是人。
如本文所用，术语“有效量”是指通过抑制或减轻受试者的疾病、病况或病症，或通过预防性地抑制或预防疾病、病症或症状的发作而达到治疗效果或预防效果的药剂量。有效量可以是在一定程度上缓解受试者疾病或病症的一个或多个症状的药剂量；使与疾病或病症相关或导致疾病或病症的一个或多个生理或生化参数部分或完全恢复正常；和/或减少疾病或病症发作的可能性。本领域熟练的临床医生可以确定药剂的有效量，以便在施用时治疗或预防特定疾病或病症。有效所需的精确药剂量将取决于许多因素，例如活性物质的比活性、采用的递送装置、物质的物理特性、施用目的以及许多患者的具体考虑。确定作为有效量必须施用的药剂量是本领域的常规做法，属于普通熟练的临床医生的技能范围。
如本文所用，术语“拮抗剂”是指抑制蛋白质、多肽或肽的表达水平或活性的分子，从而减少蛋白质、多肽或肽的数量、形成、功能和/或下游信号传导。例如，本发明的“CaMKII-δ9的拮抗剂”是指抑制CaMKII-δ9的表达水平或活性的分子，从而减少CaMKII-δ9的数量、形成、功能和/或下游信号传导。
如果分子导致CaMKII-δ9的表达(无论是在转录或翻译水平)水平或活性显著降低，则认为该分子抑制了CaMKII-δ9的表达水平或活性。同样，如果分子导致CaMKII-δ9与其底物之间的结合显著减少，从而导致由CaMKII-δ9介导的下游信号传导和功能显著减少(例如，泛素结合酶的磷酸化减少)，则认为该分子抑制了CaMKII-δ9与其底物之间的结合。例如，如果减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，则认为减少是显著的。
结合拮抗剂可以两种方式起作用。在一些实施方式中，本发明的结合拮抗剂可以与CaMKII-δ9竞争结合其底物，从而干扰、阻断或以其他方式阻止CaMKII-δ9与其底物的结合。这种类型的拮抗剂，与底物结合但不触发预期的信号转导，也被称为“竞争性拮抗剂”，可以包括例如表达无磷酸化或无氧化功能的CaMKII-δ9的载体。在其他实施方式中，本发明的结合拮抗剂可以足够的亲和力和特异性结合和螯合CaMKII-δ9，以基本上干扰、阻断或以其他方式阻止CaMKII-δ9与其底物的结合。这种类型的拮抗剂也被称为“中和拮抗剂”，可以包括例如针对CaMKII-δ9的抗体或适体，其与CaMKII-δ9特异性结合。
在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制泛素结合酶磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，泛素结合酶是UBE2T。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制UBE2T在Ser110处磷酸化的拮抗剂。
泛素化通过泛素蛋白酶体系统调节细胞蛋白质的降解，控制蛋白质的半衰期和表达水平。这个过程涉及泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的顺序作用。泛素结合酶执行泛素化反应的第二步，靶向通过蛋白酶体降解的蛋白质。磷酸化是一种生化反应，其中磷酸基团被添加到蛋白质的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)残基上，并由蛋白激酶催化。例如，CaMKII-δ9在Ser110处将UBE2T磷酸化。磷酸化通常会修改目标蛋白的功能，往往会引起激活。作为细胞稳态机制的一部分，磷酸化只是一个短暂的过程，会被其他称为磷酸酶的酶逆转。因此，蛋白质磷酸化水平随着时间的推移而变化，并且可以通过许多众所周知的方式进行评估，包括例如通过免疫学方法。例如，磷酸化的UBE2T的量可通过免疫分析法确定，该方法使用的试剂可与磷酸化UBE2T特异性结合。这种免疫分析法可以具有许多众所周知的形式，包括但不限于放射免疫分析法、蛋白质印迹分析法、免疫荧光分析法、酶免疫分析法、免疫沉淀分析法、化学发光分析法、免疫组织化学分析法、斑点印迹分析法或狭缝印迹分析法。
在一些实施方式中，酶免疫分析法是夹心酶免疫分析法，使用与UBE2T特异性结合的捕获抗体或其片段和与磷酸化UBE2T特异性结合的检测抗体或其片段。这种酶免疫分析法是特别有利的，因为鉴定相关激酶家族成员或同种型之间的蛋白质水平差异给出了激酶本身之间以及它们的磷酸化形式之间相对高的同源性。
用于鉴定磷酸化和非磷酸化形式的UBE2T以及检测CaMKII-δ9的免疫试剂是本领域中众所周知的，可以使用标准技术产生，例如用适当的UBE2T片段接种宿主动物，产生针对CaMKII-δ9、UBE2T和/或磷酸化UBE2T的抗体(例如单克隆抗体)。此类抗CaMKII-δ9、抗UBE2T和/或抗磷酸化UBE2T抗体试剂可用于分离和/或确定各自蛋白质的量，如在细胞溶解物中。此类试剂也可用于监测细胞或组织例如白血球或淋巴细胞中的蛋白质水平，作为临床测试程序的一部分，例如为了监测抑制性药剂的最佳剂量。通过将抗体与可检测物质偶联(例如，物理连接)可以促进检测。可检测物质的实施例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实施例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实施例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实施例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实施例包括鲁米诺；生物发光材料的实施例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，以及合适的放射性材料的实施例包括125I、131I、35S或3H。
在一些实施方式中，拮抗剂是CaMKII-δ9的特异性拮抗剂。
如本文所用，术语“特异性拮抗剂”是指拮抗剂不应显著抑制除CaMKII-δ9以外的任何肽、多肽或物质。在一些实施方式中，特异性拮抗剂对CaMKII-δ9的抑制作用应比对任何其他相关肽或多肽的抑制作用至少高3倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。例如，拮抗剂对CaMKII-δ9的抑制作用比对CaMKII-δ2或CaMKII-δ3的抑制作用至少高3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍。在一些实施方式中，拮抗剂抑制CaMKII-δ9的水平或活性，但不显著抑制CaMKII-δ2或CaMKII-δ3的水平或活性。如本文所用，术语“显著”是指统计学上显著的差异，或本领域技术人员可以识别的显著差异。
在一些实施方式中，拮抗剂是特异性识别CaMKII-δ9的抗体。
除非本文另有说明，否则术语“抗体(antibody/antibodies)”广泛地涵盖天然存在形式的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体，如单链抗体、嵌合和人源化抗体和多特异性抗体，以及所有前述的片段和衍生物，所述片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体结合的蛋白质或化学部分。
如本文所用，术语“抗体”还包括抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)。如本文所用，术语“抗原结合部分”是指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如，生物标志物多肽或其片段)特异性结合的能力。已经证明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实施例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含两个在铰链区通过二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，使得它们能够作为单个蛋白质链形成，其中VL和VH区配对形成单价多肽(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Osbourn等人1998,NatureBiotechnology 16:778)。此类单链抗体也意图涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。特定scFv的任何VH和VL核酸序列可以与人类免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列连接，以产生编码完整IgG多肽或其他同型的表达载体。VH和VL也可用于使用蛋白质化学或重组DNA技术产生Fab、Fv或其他免疫球蛋白片段。还涵盖其他形式的单链抗体，如双功能抗体。双功能抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.等人,(1994)Structure 2:1121-1123)。
更进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是较大免疫粘附多肽的一部分，通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成。此类免疫粘附多肽的实施例包括使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scFv多肽(Kipriyanov,S.M.等人,(1995)HumanAntibodies andHybridomas 6:93-101)和使用半胱氨酸残基、生物标志物肽和C端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的ScFv多肽(Kipriyanov,S.M.等人,(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。抗体部分，如Fab和F(ab')2片段，可以使用常规技术由全抗体制备，如分别对全抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附多肽可以使用标准重组DNA技术获得，如本文所述。
抗体可以是多克隆的或单克隆的；异基因的、同种异基因的或同基因的；或其修饰形式(例如人源化的、嵌合的等)。抗体也可以是全人的。在一些实施方式中，本发明的抗体与CaMKII-δ9或其片段特异性或基本上特异性结合。
如本文所用，术语“单克隆抗体(monoclonal antibodies/monoclonalantibody)”是指仅含有一种能够与抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点的抗体多肽群，而术语“多克隆抗体(polyclonal antibodies/polyclonal antibody)”是指含有多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体多肽群。单克隆抗体通常对与其免疫反应的特定抗原显示单一的结合亲和力。在一些实施方式中，单克隆抗体通常包括包含结合目标的多肽序列的抗体，其中目标结合多肽序列是通过包括从多个多肽序列中选择单个目标结合多肽序列的过程获得。例如，选择过程可以是从多个克隆如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的池中选择独特的克隆。应理解，可以进一步改变选定的目标结合序列，例如提高对目标的亲和力，使目标结合序列人源化，提高其在细胞培养物中的产量，降低其在体内的免疫原性，创造多特异性抗体等，并且包含改变的目标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。为了筛选与感兴趣的抗体所结合的抗原上的表位结合的抗体，可以进行常规的交叉阻断分析法，如Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring HarborLaboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中所述。
抗体也可以是“人源化的”，其意在包括由非人细胞制备的抗体，其可变区和恒定区已经被改变以更接近于由人细胞制备的抗体。例如，通过改变非人抗体氨基酸序列以并入人种系免疫球蛋白序列中发现的氨基酸。本发明的人源化抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。如本文所用，术语“人源化抗体”还包括其中来源于另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人构架序列上的抗体。
如本文所用，术语“特异性识别”是指抗体不应与另一种肽、多肽或物质发生实质性结合(“交叉反应”)。在一些实施方式中，特异性识别的肽或多肽应以比任何其他相关肽或多肽高至少3倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍的亲和力结合。例如，拮抗剂与CaMKII-δ9特异性结合，其亲和力比CaMKII-δ2或CaMKII-δ3至少高3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍。在一些实施方式中，拮抗剂抑制CaMKII-δ9的活性，但不显著抑制CaMKII-δ2或CaMKII-δ3的活性。
如本文所用，术语“抑制(inhibit/inhibiting/inhibition)”是指生物活动或过程的基线活性的降低。“抑制CaMKII-δ9的活性”是指相对于不存在本发明的拮抗剂时CaMKII-δ9的水平或活性，作为对本发明的拮抗剂存在的直接或间接反应，CaMKII-δ9的水平或活性下降。在一些实施方式中，CaMKII-δ9的活性包括CaMKII-δ9的磷酸化和/或氧化活性，这可以由本领域的技术人员测量。
在一些实施方式中，抗体与CaMKII-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列结合。在一些实施方式中，抗体与CaMKII-δ基因的外显子13-16编码的氨基酸序列结合。在一些实施方式中，抗体与CaMKII-δ基因的外显子16-17编码的氨基酸序列结合。在一些实施方式中，抗体与CaMKII-δ基因的外显子13-16-17编码的氨基酸序列结合。在一些实施方式中，抗体与全长CaMKII-δ9的氨基酸序列结合。
如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上，是指可以并入多肽链的任何化合物和/或物质，例如通过形成一个或多个肽键。在一些实施方式中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是L-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是标准氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是非标准氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是以合成方式制备还是从天然来源获得。在一些实施方式中，氨基酸，包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，与上述通用结构相比，可以含有结构修饰。例如，在一些实施方式中，与通用结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或取代而被修饰。在一些实施方式中，与含有其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，此类修饰可以例如改变含有修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方式中，与含有其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，此类修饰不会显著改变含有修饰氨基酸的多肽的相关活性。从上下文可以看出，在一些实施方式中，术语“氨基酸”用于指游离氨基酸；在一些实施方式中，它用于指多肽的氨基酸残基。氨基酸的名称在本公开中也以标准的单字母或三字母代码表示，其概述如下。
名称 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 Asp D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Glu E
谷氨酰胺 Gln Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
如本文所用，术语“编码(encoded/encoding)”是指能够转录成mRNA和/或翻译成肽或蛋白质。术语“编码序列”或“基因”是指编码肽或蛋白质的多核苷酸序列。这两个术语在本发明中可以互换使用。在一些实施方式中，编码序列是由信使RNA(mRNA)逆转录的互补DNA(cDNA)序列。在一些实施方式中，编码序列是mRNA。
在一些实施方式中，CaMKII-δ基因的外显子16、外显子13-16、外显子16-17和外显子13-16-17，以及全长CaMKII-δ9的核酸序列包含与如SEQ ID NO:6-19所示的任何一个核酸序列具有至少70％同源性，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的核酸序列，并且仍然可以编码如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列之一。
在一些实施方式中，CaMKII-δ9具有如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，CaMKII-δ9的编码序列具有如SEQ ID No:6-19所示的核酸序列。在一些实施方式中，本发明提供了编码SEQ ID NO:1-5的核酸序列，但由于遗传密码的简并性，它们与如SEQ ID NO:6-19所示的任何一个核酸序列不同。
如本文所用，术语“遗传密码的简并性”是指一个氨基酸具有两个或更多个相应的遗传密码子的现象。例如，脯氨酸具有4个同义密码子CCU、CCC、CCA和CCG。本领域众所周知，由于遗传密码的简并性，有可能在不改变编码的氨基酸序列的情况下替换给定核酸序列中某些位置的核酸。对于本领域的技术人员来说，通过例如碱基的定点诱变来进行遗传密码的简并性的替换是微不足道的。不同的生物体对不同的密码子产生不同的偏好。为了在选定的生物细胞中表达本发明的多肽，可以选择生物细胞的优选密码子来获得相应的编码序列，并且可以通过重组表达获得本发明的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1-5)。
在一些实施方式中，拮抗剂是与CaMKII-δ9结合的小分子化合物。
如本文所用，术语“小分子化合物”是指可充当酶底物或生物过程调节剂的低分子量化合物。一般来说，“小分子化合物”是大小小于约5千道尔顿(kD)的分子。在一些实施方式中，小分子小于约4kD、3kD、约2kD或约1kD。在一些实施方式中，小分子小于约800道尔顿(D)、约600D、约500D、约400D、约300D、约200D或约100D。在一些实施方式中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、小于约800g/mol或小于约500g/mol。在一些实施方式中，小分子是非聚合的。在一些实施方式中，根据本发明，小分子不是蛋白质、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、多糖、糖蛋白、蛋白聚糖等。在一些实施方式中，小分子是治疗剂。在一些实施方式中，小分子是佐剂。在一些实施方式中，小分子是药物。
在一些实施方式中，拮抗剂是靶向CaMKII-δ9的编码序列的RNAi(RNA干扰)分子或靶向CaMKII-δ9的编码序列的反义核苷酸。在一些实施方式中，RNAi分子是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。
本发明的RNAi可以包括一种或多于一种类型的对CaMKII-δ9具有特异性的核酸分子。例如，仅一种类型的siRNA可用于下调CaMKII-δ9；两种类型的siRNA(例如，具有不同的序列)可组合使用以调节CaMKII-δ9的表达水平；反义寡核苷酸可与siRNA组合以降低CaMKII-δ9的水平。
本发明的RNAi在各种水平，如转录后水平、转录前水平或表观遗传水平下调CaMKII-δ9。在一个非限制性实施例中，本发明的RNAi分子对基因表达的表观遗传调控可以由RNAi介导的染色质结构的修饰来改变基因表达引起(参见例如Verdel等人,2004,Science,303,672-676；Pal-Bhadra等人,2004,Science,303,669-672；Allshire,2002,Science,297,1818-1819；Volpe等人,2002,Science,297,1833-1837；Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218；和Hall等人,2002,Science,297,2232-2237)。
本发明的RNAi分子可以是双链或单链的。当RNAi为双链时，一条链为有义链，另一条为反义链；反义链包含与CaMKII-δ9的编码序列或其一部分互补的核苷酸序列，有义链包含与CaMKII-δ9的编码序列或其一部分对应的核苷酸序列。或者，RNAi分子由单个寡核苷酸组装而成，其中RNAi分子的自互补有义和反义区域通过基于核酸或基于非核酸的接头连接。RNAi分子可以是具有双螺旋体、不对称双螺旋体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸。RNAi可以是环状单链多核苷酸，其具有两个或更多个环结构和包含自互补有义和反义区的茎。环状多核苷酸可以在体内或体外进行处理，以产生活性RNAi分子。
在一些实施方式中，RNAi分子具有10-100个碱基，例如可以具有约10至约100个碱基、约15至约90个碱基、约20至约80个碱基、约25至约70个碱基、约30至约60个碱基、约35至约50个碱基的长度。
小干扰RNA(siRNA)是一种双链RNA分子，其能够抑制或减少与之同源的基因的表达。siRNA的每条链可以具有约10至约100个碱基、约15至约90个碱基、约20至约80个碱基、约25至约70个碱基、约30至约60个碱基、约35至约50个碱基的长度。双链siRNA可以具有约10至约50个碱基对、约12至约45个碱基对、约15至约40个碱基对、约20至约35个碱基对、约20至约30个碱基对或约20至约25个碱基对。
小发夹RNA(shRNA)是具有紧密发夹弯的人工RNA分子，其可用于通过RNA干扰使目标基因表达沉默。在一些实施方式中，shRNA在细胞中的表达是通过质粒的递送或通过病毒或细菌载体来实现。shRNA通常具有约10至约100个碱基对的长度，例如约10至约100个碱基对、约15至约90个碱基对、约20至约80个碱基对、约25至约70个碱基对、约30至约60个碱基对或约35至约50个碱基对的长度。
微小RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，其通过降解其目标mRNA和/或抑制其翻译，在转录后水平参与基因表达的调节。miRNA通常具有约10至100个碱基的长度，例如约10至约100个碱基、约15至约90个碱基、约20至约80个碱基、约25至约70个碱基、约30至约60个碱基或约35至约50个碱基的长度。
如本文所用，术语“反义核苷酸”是指能够通过氢键与目标核酸杂交的寡聚化合物。例如，“靶向CaMKII-δ9的编码序列的反义核苷酸”是指能够与CaMKII-δ9的编码序列或其一部分杂交的核苷酸。
在一些实施方式中，反义核苷酸可经修饰以提高其稳定性。对反义核苷酸的修饰包括对核苷间键、糖部分或核碱基的取代或改变。经修饰的反义核苷酸通常优于原生形式，因为具有期望的特性，如增强细胞吸收，增强对核酸目标的亲和力，在核酸酶存在的情况下增加稳定性，或增加抑制活性。
在一些实施方式中，RNAi分子或反义核苷酸与CaMKII-δ基因的外显子16互补。在一些实施方式中，RNAi分子或反义核苷酸与CaMKII-δ基因的外显子13-16互补。在一些实施方式中，RNAi分子或反义核苷酸与CaMKII-δ基因的外显子16-17互补。在一些实施方式中，RNAi分子或反义核苷酸与CaMKII-δ基因的外显子13-17互补。在一些实施方式中，RNAi分子或反义核苷酸与全长CaMKII-δ9的编码序列互补。
如本文所用，术语“互补”或“互补性”是指第一核酸和第二核酸的核碱基之间配对的能力。在一些实施方式中，本文提供的RNAi分子或反义核苷酸与目标核酸至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补，其中目标核酸选自由以下组成的组：CaMKII-δ基因的外显子16、CaMKII-δ基因的外显子13-16、CaMKII-δ基因的外显子16-17、CaMKII-δ基因的外显子13-17和全长CaMKII-δ9的编码序列。RNAi分子或反义核苷酸与目标核酸的互补性百分比可以使用本领域的常规方法确定。
在一些实施方式中，拮抗剂是与CaMKII-δ9竞争结合其底物的药剂。
如本文所用，术语“竞争”或“与……竞争”是指药剂通过与CaMKII-δ9竞争结合其底物而部分或完全抑制其作用。抑制CaMKII-δ9与其底物的结合减少或改变了CaMKII-δ9与其底物结合而没有这种抑制时发生的细胞信号传导的正常水平或类型。抑制还意在包括当本文公开的拮抗剂与未接触拮抗剂的CaMKII-δ9相比，CaMKII-δ9与其底物的结合的任何可测量的减少，例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方式中，与CaMKII-δ9竞争结合其底物的药剂是表达无磷酸化或无氧化功能的CaMKII-δ9的载体。在一些实施方式中，本发明的载体可以是本领域已知的任何基因转移载体。在一些实施方式中，本发明的载体可以包含外源基因，所述外源基因包含CaMKII-δ9的编码基因、基本上由其组成或由其组成。在一些实施方式中，本文提供的载体所表达的CaMKII-δ9没有磷酸化或氧化功能，因为负责CaMKII-δ9的磷酸化或氧化功能的编码基因被突变、沉默或删除。在一些实施方式中，本文提供的载体所表达的CaMKII-δ9没有磷酸化或氧化功能，因为它经历了翻译后处理，使其磷酸化或氧化功能被消除。在一些实施方式中，载体是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或质粒。
AAV是细小病毒科的成员并且包含小于约5,000个核苷酸的线性单链DNA基因组。AAV需要与辅助病毒(即腺病毒或疱疹病毒)共同感染，或表达辅助基因，才能有效复制。用于施用治疗性核酸的AAV载体通常缺失大约96％的亲本基因组，从而仅保留了末端重复序列(ITR)，其含有用于DNA复制和包装的识别信号。这消除了由于病毒基因的表达而产生的免疫学或毒副作用。此外，如果需要，将特定的AAV蛋白递送到生产细胞中能够将包含AAVITR的AAV载体整合到细胞基因组的特定区域中(参见例如美国专利6,342,390和6,821,511)。包含整合的AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态上没有变化(参见例如美国专利4,797,368)。
AAV载体可以使用本领域中已知的任何AAV血清型产生。数种AAV血清型和超过100种AAV变体已经从腺病毒储备液或从人类或非人灵长类动物组织中分离出来(综述于例如Wu等人,Molecular Therapy,14(3):316-327(2006))。一般来说，AAV血清型的基因组序列在核酸序列和氨基酸序列水平上具有显著的同源性，因此不同的血清型具有一套相同的遗传功能，产生的病毒粒子在物理上和功能上基本等同，并且通过几乎相同的机制进行复制和组装。在一些实施方式中，本发明的AAV是AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9或AAVrh10。
在另一个方面，本发明公开了减轻受试者的心脏损伤的方法，其包括向受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。在又一个方面，本发明公开了CaMKII-δ9拮抗剂在制造用于减轻受试者的心脏损伤的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于减轻受试者的心脏损伤的CaMKII-δ9拮抗剂。
如本文所用，术语“减轻(alleviate/alleviating/alleviation)”包括减少、限制或阻断例如特定的作用、功能或相互作用。在一些实施方式中，如果心脏损伤的至少一个症状被终止、减缓或防止，则心脏损伤减轻。在一些实施方式中，如果与参考状态相比，可能导致心脏损伤的蛋白质(例如CaMKII-δ9)的水平或活性下降，则心脏损伤减轻。这种减轻可以是部分或完全的。
在另一个方面，本发明公开了刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的方法，其包括向受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。在又一个方面，本发明公开了CaMKII-δ9拮抗剂在制备用于刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的CaMKII-δ9拮抗剂。“泛素结合酶水平或活性”是指受试者的泛素结合酶的量，或受试者的泛素结合酶在泛素化反应过程中靶向通过蛋白酶体降解的蛋白质的能力。
在一些实施方式中，将测试生物样本中泛素结合酶的水平或活性与参考样本中泛素结合酶的参考水平或活性进行比较。如本文所用，术语“参考水平或活性”是指受试者体内物质的阈值水平或活性。例如，如果接受CaMKII-δ9拮抗剂的受试者的测试生物样本中泛素结合酶的水平或活性高于参考样本中泛素结合酶的参考水平或活性，则CaMKII-δ9拮抗剂可被认为是刺激受试者的泛素结合酶的水平或活性。泛素结合酶的参考水平或活性可以源自一个或多个参考样本，其中参考水平或活性是从与测试感兴趣样本的实验平行进行的实验中获得的。或者，参考水平或活性可以在参考数据库中获得，其中包括来自一个或多个参考样本或疾病参考样本的数据、标准、水平或活性的集合。在一些实施方式中，此类数据、标准、水平或活性的集合被归一化，以便它们可以用于与来自一个或多个样本的数据进行比较。“归一化(normalize/normalization)”是将测量的原始数据转换成可与其他如此归一化的数据直接比较的数据的过程。归一化用于克服由不同分析法之间变化的因素引起的分析法特异性误差，例如加载量的变化、结合效率、检测灵敏度和其他各种误差。在特定实施方式中，参考数据库包括来自一个或多个参考样本的泛素结合酶的浓度和/或其他实验室和临床数据。在一些实施方式中，参考数据库包括泛素结合酶的水平或活性，其各自归一化为在与参考样本相同的条件下测试的参考样本的泛素结合酶的水平或活性(例如泛素结合酶的已知量或活性)的百分比。为了与此类归一化的泛素结合酶的水平或活性进行比较，测试生物样本的泛素结合酶的水平或活性也被测量并计算为在与测试样本相同的条件下测试的参考样本的泛素结合酶的水平或活性的百分比。
不受任何理论的束缚，但预期受试者的泛素结合酶的水平或活性的增加对受试者有益。在一些实施方式中，在测试生物样本中检测到的泛素结合酶的水平或活性是泛素结合酶的参考水平或活性的至少2倍。在一些实施方式中，在测试生物样本中检测到的泛素结合酶的水平或活性是泛素结合酶的参考水平或活性的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍。
在一些实施方式中，参考样本来自健康受试者，或者是比测试生物样本更早或更晚从同一受试者获得的样本。
如本文所用，术语“健康受试者”是指已知或相信不受本发明的方法或组合物用于鉴定的疾病、病况或病症所困扰的受试者。在一些实施方式中，参考样本获自使用本发明的方法或组合物鉴定疾病或病况的同一受试者的身体的健康部分。在一些实施方式中，测试生物样本来自受试者的心脏。在一些实施方式中，受试者是人类或非人灵长类动物。
在另一个方面，本发明公开了防止受试者的泛素结合酶降解的方法，其包括向受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。在又一个方面，本发明公开了CaMKII-δ9拮抗剂在制造用于防止受试者的泛素结合酶降解的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于防止受试者的泛素结合酶降解的CaMKII-δ9拮抗剂。
如本文所用，“泛素结合酶的降解”是指与参考样本中泛素结合酶的参考水平或活性相比，测试生物样本中泛素结合酶的水平或活性降低。不受任何理论的束缚，但预期受试者的泛素结合酶的降解对受试者有害。在一些实施方式中，本文公开的CaMKII-δ9拮抗剂可以防止例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的测试生物样本中泛素结合酶的量或活性降解。
在另一个方面，本发明公开了防止样本中心肌细胞死亡的方法，其包括使样本与有效量的CaMKII-δ9拮抗剂接触。在又一个方面，本发明公开了CaMKII-δ9拮抗剂在制造用于防止样本中心肌细胞死亡的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于防止样本中心肌细胞死亡的CaMKII-δ9拮抗剂。在一些实施方式中，本文提供的方法或用途可以防止例如测试样本中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的心肌细胞死亡。
在另一个方面，本发明公开了减少细胞中DNA损伤的方法，其包括使细胞与有效量的CaMKII-δ9拮抗剂接触。在又一个方面，本发明公开了CaMKII-δ9拮抗剂在制造用于减少细胞中DNA损伤的药剂中的用途。在又一个方面，本发明公开了用于减少细胞中DNA损伤的CaMKII-δ9拮抗剂。如本文所用，术语“DNA损伤”是指DNA化学结构的改变，如DNA链的断裂、DNA骨架中的碱基缺失或碱基的化学变化。
细胞不断暴露于能够造成DNA损伤的各种因素，如细胞内反应性物种和环境因子。DNA损伤的潜在诱变后果通过DNA修复途径最小化，所述途径大致表征为三种形式：碱基切除修复(BER)、错配修复(MMR)和核苷酸切除修复(NER)(Wood等人,Science,291:1284-1289(2001))。在一些实施方式中，本发明的拮抗剂可以通过例如抑制细胞中CaMKII-δ9的水平和/或活性来激活DNA修复途径。
在另一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的方法，其包括：(a)获得受试者的测试生物样本；和(b)检测测试生物样本中CaMKII-δ9的水平或活性；其中在受试者的测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性指示受试者罹患CaMKII介导的疾病或罹患CaMKII介导的疾病的概率增加。
在又一个方面，本发明公开了药剂在制造用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的药剂中的用途，其中诊断包括(a)获得受试者的测试生物样本；和(b)检测测试生物样本中CaMKII-δ9的水平或活性；其中在受试者的测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性指示受试者罹患CaMKII介导的疾病或罹患CaMKII介导的疾病的概率增加。
在又一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的药剂，其中诊断包括(a)获得受试者的测试生物样本；和(b)检测测试生物样本中CaMKII-δ9的水平或活性；其中在受试者的测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性指示受试者罹患CaMKII介导的疾病或罹患CaMKII介导的疾病的概率增加。
如本文所用，术语“诊断(diagnosis/diagnosing)”是指鉴定病理状态、疾病或病况，如鉴定CaMKII介导的疾病，或指鉴定患有CaMKII介导的疾病且可能受益于特定治疗方案的受试者。在一些实施方式中，诊断含有鉴定CaMKII-δ9的异常水平或活性。在一些实施方式中，诊断是指鉴定受试者的心脏类疾病或代谢类疾病。
如本文所用，术语“生物样本”是指从感兴趣的受试者获得或衍生的生物组合物，其含有待表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体，例如基于物理、生化、化学和/或生理特征。生物样本包括但不限于通过本领域技术人员已知的任何方法获得的受试者的细胞、组织、器官和/或生物体液。在一些实施方式中，生物样本是体液样本。在一些实施方式中，体液样本是全血、血浆、血清、粘液(包括鼻腔引流物和痰)、腹膜液、胸膜液、胸水、唾液、尿液、滑液、脑脊液(CSF)、胸腔穿刺液、腹腔液、腹水或心包液。在一些实施方式中，生物样本是从受试者的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮肤或血管获得的组织或细胞。在一些实施方式中，生物样本从受试者的心脏获得。
根据本发明，检测测试生物样本中感兴趣的肽(例如泛素结合酶、CaMKII-δ9等)的水平或活性可以通过用于确定样本中肽的水平或活性的任何合适的手段实现。在一些实施方式中，检测方法包括免疫分析装置和方法，其可以各种夹心、竞争或其他分析形式利用标记分子。所述分析法将产生指示感兴趣的肽存在或不存在的信号。此外，信号强度可以与样本中存在的感兴趣的肽的量直接或间接相关(例如，成反比)。其他合适的方法包括测量感兴趣的肽特有的物理或化学性质，如其精确的分子质量或NMR谱。合适的检测方法还可以包括生物传感器、与免疫分析法耦合的光学装置、生物芯片、分析装置，如质谱仪、NMR分析仪或色谱装置。此外，合适的检测方法可包括基于微量板ELISA的方法、全自动或机器人免疫分析法(例如可在ELECSYS分析仪上使用)、CBA(酶促钴结合分析法，例如可在Roche-Hitachi分析仪上使用)和乳胶凝集分析法(例如可在Roche-Hitachi分析仪上使用)。在一些实施方式中，感兴趣的肽的水平或活性是通过测量可从样本中的肽获得的特定强度信号来检测。如上所述，此类信号可以是在感兴趣的肽特有的质谱或NMR谱中观察到的感兴趣的肽特有的m/z(质荷比)变量处观察到的信号强度。
在一些实施方式中，测试生物样本中CaMKII-δ9的水平或活性是通过使样本与特异性结合CaMKII-δ9的试剂接触来检测。试剂将产生强度信号。根据本发明的结合包括共价和非共价结合。与根据本发明的CaMKII-δ9结合的试剂可以是与本文所述的CaMKII-δ9结合的任何化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。在一些实施方式中，试剂包括抗体、核酸、肽或多肽，如肽或其含有肽结合域的片段的受体或结合配偶体，以及适体，例如核酸或肽适体。制备此类试剂的方法是本领域中众所周知的。例如，商业供应商也提供合适的抗体或适体的鉴定和生产。本领域的技术人员熟悉开发具有更高亲和力或特异性的此类试剂的衍生物的方法。例如，可以将随机突变引入核酸、肽或多肽中。然后可以根据本领域已知的筛选程序，例如噬菌体展示，对这些衍生物进行结合测试。
在一些实施方式中，非特异性结合可能是可容许的，如果它仍然可以被明确地区分和测量，例如根据其在蛋白质印迹上的大小，或通过其在样本中相对较高的丰度。试剂的结合可以通过本领域中已知的任何方法测量。在一些实施方式中，所述方法是半定量或定量的。合适的方法包括：(1)试剂的结合可以直接测量，例如通过NMR或表面等离子体共振；(2)如果试剂还充当感兴趣的肽的酶促活性的底物，则可以测量酶促反应产物(例如，可以通过测量裂解底物的量来测量蛋白酶的量，例如在蛋白质印迹上)。或者，试剂本身可以表现出酶促特性，并且与肽结合的试剂可以与合适的底物接触，从而允许通过产生强度信号进行检测。对于酶促反应产物的测量，在一些实施方式中，底物的量是饱和的。底物也可以在反应前用可检测标记进行标记。在一些实施方式中，样本与底物接触足够的时间段。足够的时间段是指产生可检测或可测量的产物量所需的时间。代替测量产物的量，可以测量出现给定(例如可检测)量的产物所需的时间；(3)试剂可以共价或非共价地与标记偶联，以便检测和测量试剂。标记可以通过直接或间接方法进行。直接标记涉及将标记直接(共价或非共价)与试剂偶联。间接标记涉及二级试剂与一级试剂的结合(共价或非共价)。二级试剂应与一级试剂特异性结合。所述二级试剂可以与合适的标记偶联和/或是三级试剂与二级试剂结合的目标(受体)。使用二级、三级或甚至更高级别的试剂通常是为了增加信号强度。合适的二级和更高级别的试剂可以包括抗体、二级抗体和众所周知的链霉亲和素-生物素系统(Vector Laboratories,Inc.)。试剂或底物也可以用本领域已知的一个或多个标签进行“加标签”。此类标签就可以成为更高级别的试剂的目标。合适的标签包括生物素、地高辛、His-Tag、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，标签位于N端和/或C端。
在一些实施方式中，与CaMKII-δ9特异性结合的试剂是抗体或抗体片段。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。
在一些实施方式中，将在测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性与在参考样本中检测到的CaMKII-δ9的参考水平或活性进行比较。
如本文所用，术语“比较”是指将待分析的测试生物样本所包含的目标蛋白(例如泛素结合酶、CaMKII-δ9等)的水平或活性与合适的参考样本的水平或活性进行比较。应理解，如本文所用的术语是指相应参数或值的比较，例如绝对量与绝对参考量进行比较，而浓度与参考浓度进行比较，或从测试样本中获得的强度信号与参考样本的相同类型的强度信号进行比较。可以手动或计算机辅助进行比较。对于计算机辅助比较，所确定的量的值可以与对应于通过计算机程序存储在数据库中的合适参考值的值进行比较。计算机程序可以进一步评估比较的结果，并以合适的输出格式自动提供所需的评估。基于检测到的CaMKII-δ9的水平或活性与合适的参考水平的比较，有可能诊断出所述受试者的CaMKII介导的疾病。
在一些实施方式中，在测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性高于CaMKII-δ9的参考水平或活性指示受试者罹患CaMKII介导的疾病或罹患CaMKII介导的疾病的概率增加。优选地，在测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性是CaMKII-δ9的参考水平或活性的至少2倍。更优选地，在测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性是CaMKII-δ9的参考水平或活性的至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍。
如本文所用，术语“概率增加”是指与获得参考样本的受试者相比，受试者将罹患CaMKII介导的疾病的可能性水平总体增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、1倍、2倍、3倍、5倍、8倍、10倍、20倍、50倍或更大。
在一些实施方式中，参考样本来自健康受试者，或者是比测试生物样本更早或更晚从同一受试者获得的样本。
在又一个方面，本发明公开了用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的试剂盒，其包含特异性识别CaMKII-δ9的抗体或抗体片段。在一些实施方式中，抗体或抗体片段与由CaMKII-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列特异性结合。试剂盒可以使用任何适合检测样本中CaMKII-δ9的含量或活性的手段。
在一些实施方式中，试剂盒可以额外包含用户手册，用于解释关于诊断本申请中定义的受试者的CaMKII介导的疾病的任何测量的结果。特别是，此类手册可以包括关于什么确定的水平对应于什么种类的诊断的信息。此外，此类用户手册可以提供关于正确使用试剂盒组件检测CaMKII-δ9水平的说明。在一些实施方式中，用于检测的构件和试剂盒的说明手册在单个容器内提供。
在一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制CaMKII-δ9活性的分子的方法，其包括使分子与包含(i)CaMKII-δ9和(ii)UBE2T的样本接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9的分子。
在另一个方面，本发明公开了用于鉴定抑制CaMKII-δ9磷酸化能力的分子的方法，其包括使分子与包含(i)CaMKII-δ9和(ii)UBE2T的样本接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9磷酸化能力的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定治疗或预防CaMKII介导的疾病的分子的方法，其包括使分子与包含(i)CaMKII-δ9和(ii)UBE2T的样本接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了治疗或预防CaMKII介导的疾病的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减轻心脏损伤的分子的方法，其包括使分子与包含(i)CaMKII-δ9和(ii)UBE2T的样本接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了减轻心脏损伤的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定防止心肌细胞死亡的分子的方法，其包括使分子与包含(i)CaMKII-δ9和(ii)UBE2T的样本接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了防止心肌细胞死亡的分子。
在又一个方面，本发明公开了用于鉴定减少DNA损伤的分子的方法，其包括使分子与包含(i)CaMKII-δ9和(ii)UBE2T的样本接触，并确定UBE2T磷酸化是否被抑制，其中抑制UBE2T磷酸化鉴定了减少DNA损伤的分子。
这些方法在本文中也称为药物筛选分析法，并且通常包括筛选候选/测试分子与CaMKII-δ9相互作用(例如结合)、调节CaMKII-δ9对UBE2T的磷酸化和/或调节UBE2T的可磷酸化残基与CaMKII-δ9介导的细胞内信号传导目标的相互作用的能力的步骤。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括确定所述分子是否直接结合所述CaMKII-δ9的步骤。
在一些实施方式中，UBE2T磷酸化的抑制是通过相对于对照比较样本中磷酸化UBE2T的量来确定。在一些实施方式中，对照是样本中磷酸化UBE2T的量相对于在分子不存在下或样本与分子接触后较早的时间点的所述量。在一些实施方式中，UBE2T磷酸化的抑制是通过将样本中UBE2T的磷酸化量相对于UBE2T的总量的比率与对照进行比较来确定。在一些实施方式中，对照是样本中磷酸化UBE2T的量的比率相对于在分子不存在下或样本与分子接触后较早的时间点的所述比率。
在一些实施方式中，样本选自由体外、离体和体内离体组成的组。在一些实施方式中，样本包含细胞(例如心脏细胞)。在一些实施方式中，细胞获自受试者。在一些实施方式中，样本选自由组织、全血、血清、血浆、口腔刮片、唾液、脑脊液、尿液、粪便和骨髓组成的组。
在一些实施方式中，用于药物筛选分析法的候选/测试分子是小分子化合物，或抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，候选/测试分子使磷酸化UBE2T的量减少至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。
待鉴定的本发明的候选/测试分子至少部分可以使用本领域已知的组合库方法中的多种方法中的任何一种获得，包括：生物库；空间可寻址的平行固相或溶液相库；需要解卷积的合成库方法；“一珠一化合物”库方法；以及使用亲和色谱选择的合成库方法。生物库方法限于肽库，而其他四种方法适用于化合物的肽、非肽寡聚物或小分子库(Lam,K.S.(1997)AnticancerDrugDes.12:145)。
用于合成分子库的方法的实施例可以在本领域中找到，例如在：DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422；Zuckermann等人(1994)J.Med.Chem.37:2678；Cho等人(1993)Science 261:1303；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；以及Gallop等人(1994)J.Med.Chem.37:1233。
化合物库可以呈现于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques 13:412-421)、或珠子上(Lam(1991)Nature 354:82-84)、芯片上(Fodor(1993)Nature 364:555-556)、细菌上(Ladner USP 5,223,409)、孢子上(Ladner USP'409)、质粒上(Cull等人(1992)ProcNatlAcad Sci USA 89:1865-1869)或噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249:386-390)；(Devlin(1990)Science 249:404-406)；(Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)；(Ladner见上文)。
在一些实施方式中，UBE2T磷酸化是在任何丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)或酪氨酸(Tyr)位置处。在一些实施方式中，UBE2T磷酸化是在Ser5、Ser81、Ser82、Ser101、Ser110、Ser129、Ser130、Ser165、Ser166、Ser172、Ser174、Ser176、Ser177、Ser193或Ser204处。在一些实施方式中，UBE2T磷酸化是在Ser110处。在一些实施方式中，UBE2T磷酸化是在Thr23、Thr44、Thr52、Thr72、Thr106、Thr109、Thr147、Thr177或Thr178处。在一些实施方式中，UBE2T磷酸化是在Tyr46、Tyr61、Tyr74或Tyr134处。本文提及的氨基酸的位置是指例如人、小鼠和大鼠的野生型UBE2T中丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的位置。
在一个方面，本发明公开了一种分离的CaMKII-δ多肽，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离的CaMKII-δ多肽不是全长天然多肽。在一些实施方式中，分离的CaMKII-δ多肽的长度为14个氨基酸、27个氨基酸、30个氨基酸、43个氨基酸或513个氨基酸。
在一些实施方式中，本发明公开了一种分离的CaMKII-δ多肽，其具有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:1-5所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“分离的”是指物质(如多肽或核酸)从其在自然界中通常存在的环境或与其在自然界中通常存在的环境不同的环境中分离出来。
如本文所用，“序列同源性”的百分比(％)是指对于氨基酸序列，在比对候选序列和参考序列并且必要时引入间隙，以达到最大数量的相同氨基酸后，两个氨基酸序列之间的同一性百分比；对于核苷酸序列，在比对候选序列和参考序列并且必要时引入间隙，以达到最大数量的相同核苷酸后，两个核苷酸序列之间的同一性百分比。
同源性百分比可以通过本领域中各种众所周知的方法来确定。例如，序列的比较可以通过以下公开可用的工具来实现：BLASTp软件(可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站上获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，另见Altschul SF等人,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)；Stephen F.等人,NucleicAcids Res.,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可从欧洲生物信息学研究所的网站获得：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，参见Higgins DG等人,Methods in Enzymology,266:383-402(1996)；Larkin MA等人,Bioinformatics(Oxford,England),23(21):2947-8(2007))和TCoffee(可从瑞士生物信息学研究所网站获得，另见Poirot O.等人,NucleicAcidsRes.,31(13):3503-6(2003)；Notredame C.等人,J.Mol.Boil.,302(1):205-17(2000))。如果使用软件对序列进行比对，可以使用软件中可用的默认参数，或者可以自定义参数以适应比对目的。所有这些都在本领域技术人员的知识范围内。
氨基酸残基的保守取代是指具有相似特征的氨基酸之间的取代，如极性氨基酸之间的取代(例如谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代)、疏水性氨基酸之间的取代(例如精氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸之间的取代)以及具有相同电荷的氨基酸之间的取代(例如精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的取代，或谷氨酸和天冬氨酸之间的取代)等。
在另一个方面，本发明公开了一种分离的CaMKII-δ核酸，其包含编码CaMKII-δ多肽的核酸序列，所述多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核苷-脱氧核糖核酸的混合物，如DNA-RNA杂交体。核酸或多核苷酸可以是单链或双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体。核酸或多核苷酸可以是线性或环状的。
在一些实施方式中，CaMKII-δ核酸包含选自由以下组成的组的核酸序列之一：SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19以及与SEQ ID NO:6-19具有至少80％同源性的核酸序列。
在一些实施方式中，本文提供的分离的CaMKII-δ核酸包含与如SEQ ID NO:6-19所示的任何一个核酸序列具有至少70％同源性，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同源性的核酸序列，并且仍然可以编码CaMKII-δ多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供了编码CaMKII-δ多肽的核酸序列，所述多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列，但由于遗传密码的简并性，它们与如SEQ ID NO:6-19所示的任何一个核酸序列不同。
在另一个方面，本发明公开了能够抑制CaMKII-δ9活性的CaMKII拮抗剂。
在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制CaMKII-δ9对泛素结合酶进行磷酸化的拮抗剂。在一些实施方式中，泛素结合酶是UBE2T。在一些实施方式中，拮抗剂是用于抑制UBE2T在Ser110处磷酸化的拮抗剂。
在一些实施方式中，拮抗剂是与CaMKII-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列结合的抗体、靶向CaMKII-δ基因的外显子16的RNAi分子、靶向CaMKII-δ基因的外显子16的反义核苷酸。
在另一个方面，本发明公开了一种药物组合物，其包含本发明所公开的能够抑制CaMKII-δ9活性的拮抗剂。
在一些实施方式中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。
如本文所用，短语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触使用，而不会产生过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，并与合理的益处/风险比相称。在一些实施方式中，药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型是指经监管机构(如美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)、中国食品和药物管理局(China Food and DrugAdministration)或欧洲药物管理局(European MedicinesAgency))批准或公认药典(如美国药典(U.S.Pharmacopoeia)、中国药典(China Pharmacopoeia)或欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia))中所列的可用于动物且特别是人类的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体可包括但不限于例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒剂(例如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer'sinjection)、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液或葡萄糖和乳酸盐林格氏注射液)、非水性媒剂(例如植物来源的非挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油)、抗微生物剂、等渗剂(如氯化钠或右旋糖)、缓冲剂(如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、抗氧化剂(如硫酸氢钠)、麻醉剂(如盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride))、悬浮/分散剂(如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸))、乳化剂(如聚山梨醇酯80(TWEEN-80))、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其他组分，或其各种组合。合适的组分可包括例如填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。
在一些实施方式中，药物组合物是口服制剂。口服制剂包括但不限于胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(用于味道基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、散剂、颗粒剂、或水性或非水性溶液或悬浮液、或油包水或水包油乳液、或酏剂或糖浆、或糖果口含锭(用于惰性基料，如明胶和甘油、或蔗糖或阿拉伯胶)和/或漱口水和其类似物。
在一些实施方式中，口服固体制剂(例如胶囊、片剂、丸剂、糖衣药丸、散剂、颗粒剂等)包括活性物质和一种或多种药学上可接受的载体，如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下各项：(1)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)裂解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)缓凝剂溶液，如石蜡；(6)加速吸收剂，如季铵化合物；(7)润滑剂，如乙酰醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。
在一些实施方式中，口服液体制剂包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂等。除活性物质外，液体剂型还可含有常规的惰性稀释剂，如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、(甲基)丙烯酸苯酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可含有佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、调味剂和防腐剂。
在一些实施方式中，药物组合物可以是可注射制剂，包括无菌水溶液或分散液、悬浮液或乳液。在所有情况下，可注射制剂应该是无菌的并且应该是液体，以便于注射。它在制造和储存条件下应是稳定的，并应能抵抗微生物(如细菌和真菌)的感染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物和/或植物油。可注射制剂应保持适当的流动性，这可以通过多种方式保持，例如使用卵磷脂等包衣，使用表面活性剂等。抗微生物污染可以通过添加各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。
在一些实施方式中，药物组合物是口腔喷雾制剂或鼻腔喷雾制剂。此类喷雾制剂包括但不限于水性气溶胶、非水性悬浮液、脂质体制剂或固体颗粒制剂等。水性气溶胶是通过将药剂的水溶液或悬浮液与传统的药学上可接受的载体和稳定剂组合来配制。载体和稳定剂可根据具体化合物的需要而变化，但一般包括非离子表面活性剂(Tweens或聚乙二醇)、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、缓冲剂、盐、糖或糖醇。气溶胶通常由等渗溶液制备，并且可以由雾化器输送。
在一些实施方式中，药物组合物可与一种或多种其他药物组合使用。在一些实施方式中，组合物包含至少一种其他药物。在一些实施方式中，其他药物是心血管药物、用于治疗肾脏疾病的药物、用于细胞膜修复的药物等。
在一些实施方式中，药物组合物可以通过合适的途径递送给受试者，包括但不限于口服途径、注射途径(例如，静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、心内注射、鞘内注射、胸膜内注射、腹膜内注射等)、粘膜途径(例如，鼻内施用、口服施用等)、舌下途径、直肠途径、透皮途径、眼内途径、肺途径。在一些实施方式中，药物组合物可以通过注射途径施用。
实施方式
所有实施例中使用的生物材料、各种克隆和表达质粒、培养基、酶、缓冲液，以及各种培养方法、蛋白质提取和纯化方法，以及其他分子生物学操作方法，都是本领域技术人员所熟知的。关于更多详情，请参考Sambrook等人编的“Molecular Cloning:ALaboratoryManual”(Cold Spring Harbor,1989)和“Short Protocols in Molecular Biology”(Frederick M.Ausubel等人,Yan Ziying等人翻译,SciencePress(Beijing),1998)。
一般方法和材料
1.1动物
动物被饲养在中国北京大学的实验动物中心(实验室动物护理评估和认证协会认证的实验动物设施)。将动物随机分配到实验组。只使用雄性动物。在我们的研究中，没有使用非纳入或排除参数。研究人员没有对处理不知情，但没有进行主观评估。所有涉及实验动物(小鼠、大鼠和恒河猴)的程序均遵循北京大学动物研究委员会批准的方案，并符合《实验动物护理和使用指南》。
成年C57BL/6小鼠和Sprague-Dawley大鼠来自中国北京维通利华实验室(VitalRiver Laboratories,Beijing,China)。恒河猴来自我们的内部群组，如先前所报告(Zhang,X.等人,Circulation 124,77-86,doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.110.990333(2011))。通过静脉内注射过量的戊巴比妥钠对动物实施安乐死，并将组织在液氮中快速冷冻以提取蛋白质和总RNA。
1.2动物手术和处理
在6周龄雄性小鼠中进行横向主动脉缩窄(TAC)。通过插管在3％异氟醚下对小鼠进行麻醉，打开胸腔，观察主动脉弓，并在无名动脉和左颈总动脉之间的弓下进行7-0丝线缝合。将缝合线固定在主动脉和28号针头周围，取出针头，关闭胸腔，并为小鼠拔管。除主动脉结扎外，假手术的小鼠经历了相同的程序。在恢复期间，通过腹膜内注射给予小鼠丁丙诺啡。
1.3库制备、测序和SMRT测序的数据收集
正常小鼠、大鼠和恒河猴左心室的总RNA用RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit(Qiagen，目录号：74704)制备。正常成人左心室的总RNA来自MYBiosource(目录号：MBS537570)、Biological(目录号：T5595-7325)和Biochain(目录号：R1234138-50)。两微克的总RNA用于第一链的合成。在第一个和最后一个编码外显子退火的CaMKII-δ特异性引物被用于cDNA扩增(图9b)。使用PCR生产纯化试剂盒(Qiagen，目录号：28004)浓缩与全长CaMKII-δ对应的PCR产物(约1600bp)。SMRTbell测序库是按照标准的PacBio指南制备的。测序是在武汉生物技术研究所公共技术服务平台的Pacific Biosciences实时测序仪上使用C2测序试剂进行的。使用Pacific Biosciences的SMRT分析软件(v2.2)进行子读段过滤。使用GMAP(2014-09-29版)将FASTQ格式的循环共识(CCS)读段定位到所有样本物种的CaMKII-δ基因座，参数如下：--format＝1-batch＝2-nthreads＝6-trimendexons＝4--ordered。同时，使用flexbar(2.5版)检测引物/条形码，参数如下：--threads 6--barcode-min-overlap 8--barcode-threshold 2--log-level TAB--barcode-keep--barcode-unassigned。如最佳定位和引物所指示，仅当比对来自相同物种时才被保留。后续分析参考了Treutlein等人PNAS 111,E1291-1299,doi:10.1073/pnas.1403244111(2014)。比对被解析到剪接点(即，变体结构)，具有3-bp间隙容差。仅保留解析到明确和一致的剪接点的CCS读段。然后计算剪接点的频率。
引物如下：
Figure BDA0003510516500000411
Figure BDA0003510516500000421
1.4人体样本
在中国北京阜外医院进行肥厚型室间隔肌切除术时，从肥厚型心肌病患者中获取人心室组织，该方案经阜外医院、中国医学科学院和北京协和医学院伦理委员会的批准。我们的研究符合所有的伦理法规。所有患者均提供了书面知情同意书。正常人心室组织来自马里兰州巴尔的摩马里兰大学的NIH NeuroBioBank。
1.5RNA-seq(第二代测序)和CaMKII-δ外显子拼接体分析
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen目录号：74104)制备小鼠组织的总RNA，测序过程如之前所报道(Liu,F.等人Circulation 131,795-804,doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.114.012285(2015))。其他物种的RNA-seq数据来自美国国家生物技术信息中心(NCBI)序列读段档案数据库，具体如下：人左心室(SRR830965、SRR830966、SRR830967、SRR830968、SRR830969、SRR830970、SRR830971和SRR830972)，恒河猴心脏(SRX196319、SRX196328、SRX196337、SRX081927、SRX081928、SRX494639和SRX066573)，狗左心室(SRR1735880、SRR1735881、SRR1735882、SRR1735883、SRR1735884和SRR1735885)和大鼠心脏(SRX471444、SRX471445、SRX471446、SRX471447、SRX471460、SRX471461、SRX471462和SRX471463)。图9a所示的CaMKII-δ剪接变体的外显子结构是从RefSeq、Uniprot和UCSCKnownGene数据库中总结出来的。CaMKII-δ的分类参考了Mayer(Mayer,P.等人,TheBiochemicaljournal 298Pt 3,757-758(1994))。小鼠CaMKII-δ的结构是使用LiftOver以默认参数检索的。通过多序列比对，本发明人发现了两个主要的选择性剪接域，一个在外显子13和17之间，另一个在外显子20和22之间。使用TopHat-2.0.8以默认参数将RNA-seq读段定位至小鼠(mm9)、大鼠(rn4)、狗(canFam2)、恒河猴(rheMac2)或人类基因组(hg19)。计数所有可能的拼接体读段，并通过大小因子(目标组织的唯一定位读段和最小测序的组织的比率)进行归一化。
1.6对CaMKII-δ的外显子16或外显子21具有特异性的抗体的产生
为了在兔中产生抗体，肽被商业合成和纯化(Abcam,USA)。抗原表位包含以下氨基酸序列：对应于外显子21的PPCIPNGKENFSGGTSLW(SEQ ID NO:28)、CaMKII-δ剪接变体亚类独有的C端和对应于CaMKII-δ外显子16的CEPQTTVIHNPDGNK(SEQ ID NO:29)。内部半胱氨酸用于与三种不同的载体蛋白结合。每个肽与钥孔血蓝蛋白或卵白蛋白结合，用于免疫两只3月龄新西兰白兔。使用5-6次注射的定制方案对兔进行免疫。将原始抗原与预活化基质(琼脂糖珠，1.5ml)结合以制备用于纯化的亲和柱。收集所有抗血清并加载到制备好的肽亲和柱上，用洗脱缓冲液(pH 2.7)洗脱。收集洗脱的多抗体，并基于UV280吸收进行中和。
1.7通过质谱法对CaMKII-δ剪接变体的绝对定量
人左心室用RIPA缓冲液均质化，且将溶解物在13,000rpm下离心10分钟。用识别外显子21或外显子16的抗体使CaMKII-δ免疫沉淀，然后洗涤琼脂糖球粒并洗脱。对洗脱的蛋白质进行SDS-PAGE，并切出对应于CaMKII-δ的条带进行质谱分析。CaMKII-δ剪接变体的绝对定量如先前所报告的那样进行(Gerber,S.A.等人,Proceedings ofthe NationalAcademy of Sciences of the United States of America 100,6940-6945,doi:10.1073/pnas.0832254100(2003)；Kawakami,H.等人Journal ofpharmaceuticalsciences100,341-352,doi:10.1002/jps.22255(2011))。具体来说，为了测试最佳工作条件，用胰蛋白酶(400ng)进行不同时间(0.5小时、1小时、2小时或4小时)的凝胶内消化，然后进行质谱分析。选择2小时胰蛋白酶消化，因为在此条件下观察到最独特的肽，其中从每个目标变体中选择几个独特的肽作为标准肽进行定量(表1)。合成肽含有13C和15N标记的赖氨酸。通过将合成肽的连续稀释液(0.78、1.56、3.31、6.25、12.5、25、50、100和200fmol)与胰蛋白酶消化的免疫沉淀的心脏样本混合，随后进行质谱分析来制备校准曲线。基于加载量和峰面积，每个合成肽都有线性校准曲线，R2高于0.992。通过计算峰面积与同位素标记肽(50fmol加标标准)的峰面积的比值来确定每个目标肽的定量值。在外显子21免疫沉淀样本中，外显子13-17的平均肽量为2.32±0.27fmol，外显子13-14的平均肽量为4.02±1.50fmol，外显子13-16的平均肽量为9.52±0.88fmol。在外显子16免疫沉淀样本中，外显子20-21的平均肽量为11.87±3.73fmol，外显子20-22的平均肽量为1.73±0.71fmol。相对数据显示在图1c中。
表1.鉴定的用于心脏定量质谱分析的蛋白原型胰蛋白酶肽
Figure BDA0003510516500000441
所有样本均使用Q-Exactive HF(Thermo)质谱仪和E-nLC1000液相色谱系统(Thermo)进行分析。肽从100-μm ID×2cm,C18捕集柱中洗脱，并在自制的150μm ID×15cm柱(C18树脂，1.9μm，
Figure BDA0003510516500000442
Dr.Maisch GmbH)上以600nL/min进行75分钟线性5-35％乙腈梯度分离。Q-Exactive HF的MS分析在自动增益控制目标3e6离子下进行一次全扫描(300-1400m/z，R＝120,000，200m/z)，然后在Orbitrap(R＝15,000，200m/z)中检测的更高能量的碰撞解离(AGC目标2e4离子，最大注入时间40ms，隔离窗口1.6m/z，归一化碰撞能量为27％)下进行的至多20次数据依赖性MS/MS扫描。先前获得的前体离子的动态排除在12秒时启用。
使用适合Mascot软件(2.3.01版，Matrix Science)的Proteome Discoverer软件(1.4.1.14版，Thermo)鉴定肽，以实现<1％的错误发现率。前体的质量容差被设定为20ppm，产物离子的容差被设定为50mmu。选择氧化(M)、乙酰(蛋白质-N端)和DeStreak(C)作为可变修饰；并允许在胰蛋白酶上遗漏两次裂解。
1.8质谱分析
为了分析UBE2T磷酸化，在对照载体或带flag标签的CaMKII-δ9质粒的存在下，用带myc标签的UBE2T转染HEK293细胞。在细胞收获前12小时加入蛋白酶体抑制剂MG132，然后用RIPA缓冲液提取总蛋白。用抗myc抗体使总UBE2T免疫沉淀，然后洗涤琼脂糖球粒并洗脱。对洗脱的蛋白质进行SDS-PAGE，并切出对应于UBE2T的条带进行质谱分析。
在LC-MS/MS分析中，消化产物通过Dionex 3000纳米HPLC系统以0.3μL/min的流速进行65分钟梯度洗脱分离，所述系统直接与Thermo LTQ Orbitrap Velos Pro质谱仪对接。分析柱是熔融石英毛细管柱(75μm ID，150mm长；用C18树脂填充)。流动相A由0.1％甲酸组成，流动相B由80％乙腈和0.08％甲酸组成。质谱仪使用Xcalibur2.1.3软件在数据依赖性采集模式下操作，在Orbitrap中有单个全扫描质谱(400-1800m/z，30,000分辨率)，然后进行10次数据依赖性MS/MS扫描。使用Proteome Discovery搜索算法(1.3版)针对所选数据库搜索每次LC-MS/MS运行的MS/MS谱。
1.9彗星分析法
按照彗星分析法试剂盒(Trevigen，目录号：4250-050-K)的方案，在碱性条件下，按指示处理培养的新生大鼠心室心肌细胞(NRVM)，然后用冷PBS洗涤。用彗星分析法软件项目(v1.2.3b1)对每个实验中每个样本的300-500个细胞的平均尾矩进行量化。
1.10CaMKII-δ9 tg小鼠的产生
将具有N端Flag标签的全长人CaMKII-δ9cDNA编码序列克隆到含有α-MHC启动子的表达载体的HindIII和EcoRV位点。用XhoI和NotI线性化后，进行凝胶纯化。将该构建体显微注射到受精C57BL/6J小鼠卵子的原核中。PCR用于基因分型。引物序列为5'-GTATCGATAAGCTTGCCACCATGG-3'(正向)(SEQ ID NO:35)和5'-CATGAAGTCGCACAATATTAGG-3'(反向)(SEQ ID NO:36)。
1.11CaMKII-δ9 shRNA tg小鼠的产生
基于miR30的CaMKII-δ9shRNA的序列为5'-GAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCAATCCACAACCCTGACGGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCCGTCAGGGTTGTGGATTATGCCTACTGCCTCGG-3'(SEQ ID NO:37)。将具有N端EGFP标签和C端BGH聚A序列的shRNA克隆到含有U6启动子的pLKO.1质粒中。在线性化后，进行凝胶纯化。将该构建体显微注射到受精C57BL/6J小鼠卵子的原核中。PCR用于基因分型。引物序列为5'-CTTCACCGAGGGCCTATTTCC-3'(正向)(SEQ IDNO:38)和5'-CCGTAGGTGGCATCGCCCTC-3'(反向)(SEQ ID NO:39)。
1.12CaMKII-δ2 tg小鼠的产生
将具有N端HA标签的全长人CaMKII-δ2cDNA编码序列克隆到含有α-MHC启动子的表达载体的HindIII和EcoRV位点。用XhoI和NotI线性化后，进行凝胶纯化。将该构建体显微注射到受精C57BL/6J小鼠卵子的原核中。PCR用于基因分型。引物序列为5'-CGGTATCGATAAGCTTGGCC-3'(正向)(SEQ ID NO:40)和5'-TCACAATATTGGGGTGCTTC-3'(反向)(SEQ ID NO:41)。
1.13UBE2T tg小鼠的产生
将具有C端myc标签的全长大鼠UBE2T cDNA编码序列克隆到含有α-MHC启动子的表达载体的HindIII和EcoRV位点。用XhoI和NotI线性化后，进行凝胶纯化。将该构建体显微注射到受精C57BL/6J小鼠卵子的原核中。PCR用于基因分型。引物序列为5'-ATAGAAGCCTAGCCCACACC-3'(正向)(SEQ ID NO:42)和5'-GATCTGTGGTGGCTCAAATG-3'(反向)(SEQ ID NO:43)。
1.14超声心动图
在6周龄和10周龄时，在1％异氟醚下使用Vevo2100数字成像系统(VisualSonics,Toronto,ON,Canada)进行超声心动图分析，在乳头肌水平的胸骨旁短轴视图中获得心室中部M和B模式测量。一旦小鼠适应了所述程序，图像就会以数字格式存储在磁光盘上，以便审查和分析。LV舒张末期内径(LVIDd)的测量是在表观最大LV舒张尺寸时进行，而L收缩末期内径(LVIDs)的测量是在最前收缩期偏移时进行。LV射血分数(EF)用立方法计算：LVEF(％)＝{(LVIDd)3-(LVIDs)3}/(LVIDd)3×100，而LV缩短分数(FS)的计算方法是FS(％)＝(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100。数据是5个心动周期的平均数。
1.15组织学分析
心脏组织的组织学分析如先前所述(Zhang,T.等人Nature medicine 22,175-182,doi:10.1038/nm.4017(2016))。CardioTACSTM原位凋亡检测试剂盒(RocheAppliedScience，目录号：11684795910)用于TUNEL染色，如先前所述(Zhang,T.等人Naturemedicine 22,175-182,doi:10.1038/nm.4017(2016))。
1.16基因表达分析和引物
用于定量实时PCR的引物对在表2中。扩增如下进行：95℃3秒和40个循环，95℃15秒和60℃30秒。数据为至少三个独立实验的平均值。
表2.用于基因表达定量实时PCR分析的引物对
Figure BDA0003510516500000461
Figure BDA0003510516500000471
1.17质粒构建
从人左心室的cDNA克隆表达CaMKII-δ9的载体。从大鼠心脏的cDNA克隆大鼠UBE2T；使用Stratagene QuikChange II定点诱变试剂盒生成具有大鼠UBE2T的S110A点突变或S913A突变的质粒。将表达外显子13-15-16-17、13-17、13-14-17和13-16-17，分别为CaMKII-δ1、δ2、δ3和δ9的特征序列的质粒与GFP标签克隆到pcDNA5/flag质粒。当HEK 293细胞达到80％汇合时转染质粒。
表达人CaMKII-δ9、大鼠UBE2T、大鼠UBE2T-S110A或大鼠UBE2T-S193A的腺病毒载体由Sino Geno Max有限公司构建。表达CaMKII-δ2的腺病毒载体如先前所述(Zhu,W.等人,The Journal of biological chemistry 282,10833-10839,doi:10.1074/jbc.M611507200(2007))。
表达人UBE2T的质粒来自OriGene(目录号：TP300748的表达质粒)，并且使用Stratagene QuikChange II定点诱变试剂盒产生S110A点突变。通过测序确认具有S110A点突变的阳性克隆，然后扩增质粒进行蛋白质纯化。
1.18心室肌细胞的分离、培养和腺病毒感染
从1日龄Sprague-Dawley大鼠中分离出NRVM，并使用先前描述的方法实施腺病毒介导的基因转移(Zhang,T.等人,Nature medicine 22,175-182,doi:10.1038/nm.4017(2016))。NRVM暴露于H2O2(200μM)或Dox(1μM)24小时。
1.19分离的小鼠心脏灌注
成年小鼠(10-12周龄)通过腹腔注射戊巴比妥(70mg/kg)进行麻醉。将心脏切除并在Langendorff仪器上以55mmHg的恒定压力灌注。用95％O2/5％CO2(pH 7.4)对缓冲液进行连续充气，并通过加热浴/循环器升温。持续监测心脏温度并维持在37±0.5℃。通过停止灌注30分钟，然后进行再灌注来诱导整体缺血。
1.20亚细胞分级分离
用核/胞质分级分离试剂盒(Biovision Research Products，目录号：K266，USA)按照制造商的说明书分离胞质蛋白和核蛋白。
1.21细胞活力分析
如先前所述，通过胱天蛋白酶3/7活性和培养基中的LDH浓度来分析心肌细胞活力(Zhang,T.等人,Nature medicine 22,175-182,doi:10.1038/nm.4017(2016))。用来自Promega的试剂盒(目录号：G8091)根据制造商的说明书测量胱天蛋白酶3/7活性。使用来自Sigma的试剂盒(目录号：MAK066)通过分光光度法分析培养基中的LDH浓度。
1.22心脏和心肌细胞组织学
将心脏在4％多聚甲醛(pH 7.4)中固定过夜，包埋在石蜡中，并以5μm连续切片。对这些切片进行标准苏木精和伊红染色或免疫组织化学处理。
如先前所述测量心肌细胞免疫荧光(Erickson,J.R.等人,Physiologicalreviews 91,889-915,doi:10.1152/physrev.00018.2010(2011))。
1.23蛋白质印迹和免疫共沉淀
如先前所述进行蛋白质印迹和免疫共沉淀(Zhang,T.等人,Nature medicine 22,175-182,doi:10.1038/nm.4017(2016))。
1.24RNA干扰介导的基因沉默
对于基因沉默分析法，使用Invitrogen网站设计了长度为19个核苷酸、在3'末端具有dTdT突出端的siRNA。使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)按照制造商的说明书用siRNA转染心肌细胞(Erickson,J.R.等人,Physiological reviews 91,889-915,doi:10.1152/physrev.00018.2010(2011))。在siRNA转染后72小时通过蛋白质印迹评估基因敲低的效率。siRNA的序列在表3中。
表3.siRNA的目标序列.
Figure BDA0003510516500000491
1.25CaMKII-δ的无细胞激酶分析法
人CaMKII-δ2蛋白来自Abcam(目录号：ab84552)，人UBE2T蛋白来自OriGene(目录号：TP300748)，人CaMKII-δ9和UBE2T-S110A蛋白由OriGene生产。无细胞激酶分析法在含有100mM Tris-HCl pH 7.5、20mM MgCl2和4mM DTT的激酶缓冲液中进行。将CaMKII-δ9或δ2蛋白与200μM CaCl2和1μM CaM(Sigma)在冰上培育1分钟，然后在UBE2T蛋白存在下，在30℃下暴露于1mMATP 30分钟。通过加入SDS加载缓冲液停止反应。将样本煮沸5分钟并在SDS-PAGE上分离。使用针对磷酸化丝氨酸和UBE2T的市售抗体进行免疫印迹分析。
1.26人胚胎干细胞诱导成心肌细胞
人胚胎干细胞H9使用如先前所报告的化学成分确定的、无异种的、基于小分子的方法分化为心肌细胞(Burridge,P.W.等人,Nature methods 11,855-860,doi:10.1038/nmeth.2999(2014))。简而言之，将H9细胞维持在预涂有Matrigel(BD Biosciences，目录号：354277)的6孔板上的E8培养基(Life Technologies，目录号：A1517001)中。当细胞生长到70％汇合时，将培养基更换为补充有6μM CHIR99021(Selleckchem，目录号：S1263-25mg)的基础培养基；48小时后，将培养基更换为补充有2μM Wnt-C59(Biorbyt，目录号：orb181132)的基础培养基，再持续48小时。然后将细胞维持在基础培养基中，每48小时更换一次新鲜培养基。跳动的心肌细胞在约第8天出现。在第10天，将基础培养基更换为不含葡萄糖的RPMI 1640(Life Technologies，目录号：11879020)以纯化心肌细胞。两天后，心肌细胞与TrypLETM Express Enzyme(Life Technologies)关联10分钟，并传代到Matrigel预涂孔板。
1.27材料
使用了针对以下蛋白质的抗体：大鼠/人UBE2T和p-苏氨酸(Cell SignalingTechnology，12992(批号：1；1:1000)和9381(批号：22；1:1000))；小鼠UBE2T(AvivaSystems Biology，ARP-43145(批号：QC13585-40506；1:1000))；p-CaMKII(Thermo，MA1-047(批号：QC207772；1:1000))；t-CaMKII-δ(GeneTex，GTX111401(批号：40058；1:1000))；Myc和Flag(Sigma，SAB4700447(批号：522137；1:5000用于蛋白质印迹，1:200用于免疫组织化学)和F1804(批号：SLBR7936V；1:5000用于蛋白质印迹，1:200用于免疫组织化学))；γH2AX、p-丝氨酸和ox-CaMKII(Millipore，05-636，克隆JBW301(批号：2884537；1:1000用于蛋白质印迹，1:200用于免疫组织化学)，05-1000，克隆4A4(批号：2691195；1:1000)和07-1387(批号：2739150；1:1,000))；COX-2、HA和核纤层蛋白A/C(Santa Cruz，sc-1747(批号：H1911；1:1000)、sc-7392(批号：L1115；1:1000用于蛋白质印迹，1:200用于免疫组织化学)和sc-6215(批号：J2615；1:1000))；PAI-2(Bioworld，BS3702(批号：CA36131；1:1000))；β-肌动蛋白(EARTHOX，E021070-01(批号：0a1401，1:100用于免疫组织化学))；FANCD2和FANCI(abcam，ab108928(批号：GR130039-32；1:1000)和ab74332(批号：GR251812-8；1:1000))；以及GAPDH(EASYBIO，BE0023，克隆2B8(1:10000))。MG132、clasto-乳胞素β-内酯(β-lac)、阿霉素和H2O2均来自Sigma-Aldrich。
1.28统计和再现性
数据表示为平均值±s.e.m。用GraphPad Prism 5.01版(GraphPad Software,Inc.)和SPSS 18.0软件包(SPSS Inc.)进行统计分析。用Kolmogorov-Smirnov检验测试数据集的分布正态性。使用双侧未配对学生t检验比较具有正态分布的数据组(两组)。Mann-Whitney U检验用于非参数数据。多组之间的比较通过单因素或双因素方差分析与Tukey多重比较检验来评估。没有使用统计方法来预先确定样本量。
实施例1.人心脏中CaMKII-δ9的存在
本发明人对小鼠、大鼠、恒河猴和人类的心肌组织进行了单分子实时(SMRT)测序(Pacific Biosciences)(Sharon,D.等人,Nature biotechnology 31,1009-1014,doi:10.1038/nbt.2705(2013))，以检测CaMKII-δ的剪接变体的浓度。库制备、测序和SMRT测序的数据收集在一般方法和材料的第1.3节中描述。CaMKII-δ剪接变体的定量根据一般方法和材料的第1.7节中描述的方法进行。
令人惊讶的是，本发明人发现，经过充分研究的剪接变体CaMKII-δ2在恒河猴(3.1％)和人(6.3％)的心脏中含量极低，尽管它在小鼠和大鼠的心脏CaMKII-δ总转录物中分别占29％和22.5％。先前报道但在功能上被忽视的CaMKII-δ9成为一种非常丰富的剪接变体，在恒河猴、人、小鼠和大鼠中分别占33.5％、31.9％、32.9％和14.9％，在所有情况下与CaMKII-δ3相当，在灵长类动物中远远高于δ2(图1a)。
此外，蛋白质水平下的心脏CaMKII-δ9表达是由两种定制的抗体检测的，它们分别与对应于外显子16(抗外显子16)和外显子21(抗外显子21)的肽反应。所述抗体根据一般方法和材料的第1.6节中描述的方法制备。通过用任一抗体免疫沉淀小鼠心肌蛋白，然后用另一抗体进行免疫印迹分析，显露出接近50kD的单条带。对用抗外显子21免疫沉淀的小鼠心脏的50kD左右的条带进行质谱分析，鉴定了由外显子13-16-17编码的肽，这是CaMKII-δ9的特征序列(图10e、g)。或者，在由抗外显子16免疫沉淀的样本中检测到由外显子20-21编码的肽(图10f、h)。重要的是，本发明人进行了人心肌组织的绝对定量MS分析(Gerber,S.A.等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 100,6940-6945,doi:10.1073/pnas.0832254100(2003)；Kawakami,H.等人Journal of pharmaceutical sciences 100,341-352,doi:10.1002/jps.22255(2011))(表1)，发现当用抗外显子21免疫沉淀时，含有外显子13-16(δ9)和外显子13-14(δ3和δ11)的肽的水平是外显子13-17(δ2)的4.1和1.7倍(图1c)。类似地，当用抗外显子16免疫沉淀时，外显子20-21(δ1、δ9和δ11)编码的肽水平是外显子20-22(δ5和δ10)编码的肽水平的9.2倍(图1c)，将CaMKII-δ9与δ10区分开。因此，本发明人得出结论，在mRNA和蛋白质水平下，CaMKII-δ9在哺乳动物中构成主要的心脏CaMKII-δ剪接变体，特别是在非人灵长类动物和人类中。
为了确定CaMKII-δ9的组织分布，使用抗外显子16，本发明人发现在恒河猴的横纹肌(心脏和骨骼肌)中检测到CaMKII-δ9(图10i)。然而，在小鼠中，CaMKII-δ9在心脏中特异性表达(图10j)。免疫荧光成像显示心肌细胞中CaMKII-δ9的胞质分布模式(图1d和图10k)，与CaMKII-δ2部分重叠(图1d)，而CaMKII-δ3富集在核区室(图10l)。通过对培养的新生大鼠心室心肌细胞(NRVM)的亚细胞级分的蛋白质印迹(根据一般方法和材料的第1.20节中描述的方法进行)，证实了CaMKII-δ9的胞质分布(图10m)。因此，本发明人得出结论，CaMKII-δ9构成重要的CaMKII-δ剪接变体，在哺乳动物，特别是非人灵长类动物和人类的心脏中具有胞质分布。
实施例2.CaMKII-δ9的上调与各种心脏类疾病有关
为了研究CaMKII-δ9的病理相关性，本发明人首先评估了其在几种心脏损伤模型中的水平。为了模拟血流动力学压力超负荷，本发明人对小鼠进行了横向胸廓收缩(TAC)手术。本实施例中使用的实验方法、动物和材料在一般方法和材料的第1.1、1.2、1.4、1.15、1.18、1.19、1.26和1.27节中描述。
在暴露于化疗药物阿霉素(Dox；1μM)或H2O2(200μM)氧化应激下的NRVM中，CaMKII-δ9的表达显著升高(图1e、f)。相对于假手术组，TAC心脏中CaMKII-δ9的蛋白质水平明显增加(图1g)。更重要的是，在肥厚型心肌病(HCM)患者的心肌组织中，CaMKII-δ9相对于对照明显升高(图1h)。已知CaMKII通过磷酸化和氧化被激活(Erickson,J.R.等人,Physiologicalreviews 91,889-915,doi:10.1152/physrev.00018.2010(2011)；Erickson,J.R.等人,Cell 133,462-474,doi:10.1016/j.cell.2008.02.048(2008))。急性Dox处理增加了心肌细胞中CaMKII-δ9的磷酸化和氧化水平(图11a、b)。此外，在受到急性缺血-再灌注损伤(30分钟缺血，然后60分钟再灌注)的小鼠心脏中，CaMKII-δ9的磷酸化和氧化也增加(图11c、d)。因此，心脏CaMKII-δ9在响应于各种病理应激时被上调和过度激活，强调了心脏中CaMKII-δ9的病理相关性。
实施例3.增强的CaMKII-δ9信号传导触发心肌细胞死亡
接下来，本发明人试图确定CaMKII-δ9在调节心肌细胞命运中的可能作用。本发明人设计了靶向CaMKII-δ的外显子16的siRNA，以特异性降低CaMKII-δ9水平(图11e-g)，而不改变心肌细胞中CaMKII-δ2或δ3的表达水平(图11h)。siRNA根据一般方法和材料的第1.24节中描述的方法进行设计。细胞活力分析根据一般方法和材料的第1.21节中描述的方法进行。
发现敲低CaMKII-δ9显著减轻H2O2和Dox诱导的心肌细胞死亡，如由胱天蛋白酶3/7活性和培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)浓度所指示(图2a、b和图11i、j)，表明CaMKII-δ9参与由氧化应激和Dox诱导的心脏损伤。此外，CaMKII-δ9的腺病毒基因转移足以以滴度依赖性方式引起强烈的心肌细胞死亡(图11k)。同样值得注意的是，当以匹配的水平过度表达时(图11l)，CaMKII-δ9比CaMKII-δ2更有力地诱导心肌细胞死亡(图11k)，标志着CaMKII-δ9是参与氧化损伤和肥厚型心肌病的一个重要致病因素。
实施例4.CaMKII-δ9通过下调UBE2T触发心肌细胞DNA损伤和细胞死亡
为了破译导致CaMKII-δ9诱发的心肌细胞死亡的机制并将其与CaMKII-δ2的机制区分开，本发明人对以匹配的蛋白质水平过量表达CaMKII-δ9或CaMKII-δ2的培养的NRVM进行RNA-seq分析。RNA-seq分析根据一般方法和材料的第1.5节中描述的方法进行。
在相对于对照组(Ad-β-gal)归一化后，15个基因因CaMKII-δ9而非δ2的过表达而改变(图12a和表4)。使用实时PCR(根据一般方法和材料的第1.16节中描述的方法进行)，本发明人验证了CaMKII-δ9与CaMKII-δ2对基因表达的差异调节。特别是，UBE2T(泛素结合酶E2T)、COX-2(前列腺素G/H合成酶2)和PAI-2(A型纤溶酶原激活物抑制剂2)被CaMKII-δ9而非δ2上调(图2d和图12b)。在蛋白质水平上，COX-2因CaMKII-δ9而非δ2增加，与其mRNA水平一致(图12c)，而PAI-2蛋白水平未因CaMKII-δ9或δ2过表达而改变(图12d)。
表4.感染Ad-CaMKII-d9或Ad-CaMKII-d2的心肌细胞相比于对照组Ad-b-gal的基因表达谱
Figure BDA0003510516500000541
CaMKII-δ9的过表达显著降低培养的心肌细胞中UBE2T的蛋白水平(图2e)，尽管其mRNA水平有所增加(图2d)；而CaMKII-δ9的敲低能够提高UBE2T的蛋白水平(图2f)。相比之下，在相同的实验环境下，另一种胞质剪接变体CaMKII-δ2的过表达并没有改变UBE2T的蛋白水平(图2e)。此外，UBE2T的过表达使心肌细胞免于CaMKII-δ9诱发的细胞死亡，如由胱天蛋白酶3/7活性所证明(图2g)，而UBE2T的敲低足以触发心肌细胞死亡(图2h和图12h)。此外，在受到氧化应激的NRVM中，UBE2T蛋白水平降低(图2i)，而UBE2T的过表达减少了H2O2诱导的心肌细胞死亡(图2j)。因此，本发明人提供了多条证据，证明UBE2T的下调在介导CaMKII-δ9诱导的心肌细胞死亡中起关键作用。
UBE2T是范可尼贫血症(FA)DNA修复途径中的泛素结合酶(E2)，它是FANCL对FANCD2和FANCI的单泛素化以及随后的DNA修复所必需的。本发明人研究了CaMKII-δ9对心肌细胞命运的调节是否归因于UBE2T依赖性DNA修复途径的损害和由此导致的DNA损伤的增加。通过彗星分析法评估DNA损伤，彗星分析法根据一般方法和材料的第1.9节中描述的方法进行。
发现心肌细胞中CaMKII-δ9而非δ2的过表达会引起DNA损伤，如DNA双链断裂标志物γH2AX增加(Kuo,L.J.和Yang,L.X.,In Vivo 22,305-309(2008))和彗星分析法(Olive,P.L.和Banath,J.P.Nature protocols 1,23-29,doi:10.1038/nprot.2006.5(2006))所证明(图3a-c和图13a、b)。相反，CaMKII-δ9的敲低减轻了氧化应激诱导的培养心肌细胞的DNA损伤(图3d、e)，同样，CaMKII-δ9缺乏使得心肌细胞死亡减少(图2a、b)。此外，UBE2T过表达减少了由CaMKII-δ9和氧化应激诱导的心脏基因组不稳定(图3f-i)，而UBE2T的敲低导致心肌细胞的DNA深度损伤(图3j、k)。此外，本发明人发现，用siRNA使UBE2T的两个下游分子FANCD2和FANCI沉默会明显增加DNA损伤，并伴随着心肌细胞死亡的增加(图3l、m和图13c-f)。因此，本发明人证明，CaMKII-δ9对心肌细胞命运的调节主要归因于UBE2T的下调和随后DNA损伤的增加。
实施例5.心肌病和心力衰竭中CaMKII-δ9-UBE2T-DNA损伤信号传导的增强
为了进一步评估CaMKII-δ9在心脏损伤和心力衰竭中的作用，本发明人产生了心脏特异性过表达CaMKII-δ9(CaMKII-δ9tg)的转基因小鼠(图14a、b)。CaMKII-δ9tg小鼠和UBE2T tg小鼠根据一般方法和材料的第1.10和1.13节中描述的方法分别产生。
发现与野生型(wt)同窝仔鼠相比，tg小鼠的CaMKII-δ9蛋白水平增加了约8倍(图4a)，这与HCM患者中这种剪接变体的增加相似。tg小鼠在2周龄时开始死亡，到15周时全部死亡，而同期wt小鼠均未死亡(图4b)。10周龄时，tg小鼠表现出严重的心肌病，表现为心脏肥大、心室扩张和心肌细胞死亡(图4c、d)。心肌病还表现为心脏重量与体重之比升高和肥大基因表达谱(图14c、d)。因此，tg小鼠的心脏功能随年龄增长而恶化(图4e、f)。到10周龄时，tg小鼠出现了严重的心力衰竭，如与wt小鼠相比，射血分数(EF)和缩短分数(FS)均极度低下所证明(图4e、f)。tg小鼠的心室扩张和心壁变薄也通过超声心动图所证实(图4e、f，根据一般方法和材料的第1.14节中描述的方法进行)。重要的是，在CaMKII-δ9 tg小鼠的心脏中，DNA损伤明显增加(图4g和图14e)，与wt动物相比，这伴随着UBE2T蛋白丰度的降低(图4h)。相比之下，通过转基因表达靶向CaMKII-δ外显子16的shRNA(根据一般方法和材料的第1.11节中描述的方法进行)对CaMKII-δ9的心脏特异性敲低明显减弱了TAC诱导的小鼠心脏肥大、收缩功能障碍和过早死亡(图4i-k和图14f-i)。TAC诱导的心脏DNA损伤和心肌细胞死亡也因CaMKII-δ9的敲低而减少(图4l、m)。同时，在CaMKII-δ9缺陷型小鼠心脏中，UBE2T蛋白丰度增加(图14j)。虽然心脏特异性过表达UBE2T本身没有显示出明显可辨别的表型(图5)，但小鼠与CaMKII-δ9 tg小鼠杂交有效地改善了CaMKII-δ9诱导的心脏损伤和功能障碍，并明显提高了动物的存活率(图5)。因此，CaMKII-δ9诱导的UBE2T下调是多重刺激诱导的心脏DNA损伤、细胞死亡和心肌病的关键机制，导致心力衰竭和动物死亡。
为了进一步比较和对比CaMKII-δ9和CaMKII-δ2在体内的功能和信号传导机制，本发明人构建了心脏特异性过表达CaMKII-δ2的转基因小鼠，其表达量是wt动物的约8倍，正如CaMKII-δ9 tg小鼠的情况(图14k)。CaMKII-δ2 tg小鼠根据一般方法和材料的第1.12节中描述的方法产生。
发现CaMKII-δ2 tg小鼠表现出心肌细胞死亡、心脏肥大和功能障碍以及动物死亡；但根据所有参数判断，其有害影响远没有CaMKII-δ9 tg动物严重(图14l-o)。此外，本发明人在CaMKII-δ2 tg心脏中既没有检测到UBE2T丰度的减少，也没有检测到DNA损伤的任何增加(图14p、q)。这些结果表明，两种胞质CaMKII剪接变体激活不同的信号通路，并在心脏生理和病理中发挥不同的作用。
在HCM患者的心肌中，CaMKII-δ9升高(图1h)，同时UBE2T丰度降低，DNA损伤增加(由γH2AX指示)，伴随着心肌细胞凋亡的增加(由裂解的胱天蛋白酶3指示)(图6a-c)。此外，在来源于人胚胎干细胞的心肌细胞中(根据一般方法和材料的第1.26节中描述的方法获得)，CaMKII-δ9的过表达比CaMKII-δ2的过表达导致更严重的细胞死亡(图6d)。同时，CaMKII-δ9而非δ2触发UBE2T降解和随后的DNA损伤(图6e、f)。相比之下，CaMKII-δ9敲低有效地改善了这些人类细胞中Dox诱导的UBE2T降解、DNA损伤和细胞死亡(图6g-i)。
实施例6.CaMKII-δ9在Ser110处磷酸化UBE2T并促进其降解
由于UBE2T的mRNA水平因CaMKII-δ9的过表达而增加，所以UBE2T在蛋白水平的下调可能是由蛋白质降解的增强而介导的。为了验证这一假设，本发明人使用了蛋白酶体抑制剂β-lac和MG132，并发现两者都完全消除了CaMKII-δ9诱导的UBE2T蛋白水平的降低(图7a、b)。UBE2T主要位于心肌细胞的细胞核中(图7c)。在过表达CaMKII-δ9的细胞中，UBE2T仍富集在细胞核中，但其丰度降低(图7c)。值得注意的是，蛋白酶体抑制剂MG132使UBE2T同时存在于细胞核和胞质区室中(图7c)。这些结果表明，UBE2T分布在心肌细胞的细胞质和细胞核中，它在细胞核中的明显富集是CaMKII-δ9介导的UBET2在细胞质中降解的结果。CaMKII-δ9诱导的UBE2T mRNA水平的增加可能是由细胞对其蛋白质丰度降低的补偿引起的。
本发明人检查了心肌细胞中CaMKII-δ9和UBE2T之间潜在的物理相互作用。免疫共沉淀分析显示，CaMKII-δ9和UBE2T形成了蛋白质复合物(图7d)。CaMKII-δ9在NRVM中的过表达特异性地提高UBE2T的丝氨酸磷酸化(图7e)，但不提高苏氨酸磷酸化(图7f)。为了定位出UBE2T对CaMKII-δ9的磷酸化位点，本发明人用带myc标签的UBE2T和CaMKII-δ9质粒转染无CaMKII-δ9的HEK 293细胞(人胚肾细胞)。细胞溶解物用myc抗体免疫沉淀，然后进行MS分析。MS分析根据一般方法和材料的第1.8节中描述的方法进行。UBE2T的两个丝氨酸位点(Ser110和Ser193)被鉴定为CaMKII-δ9的潜在目标(图15a)。本发明人发现，UBE2T-S110A而非UBE2T-S193A突变体对CaMKII-δ9介导的降解具有抗性(图7g)，表明UBE2T在Ser110处磷酸化对于CaMKII-δ9介导的UBE2T降解至关重要，Ser110是多个物种中高度保守的位点(图15b)。
接下来，本发明人使用重组UBE2T蛋白在CaMKII-δ9存在或不存在的情况下进行无细胞激酶分析法(根据一般方法和材料的第1.25节中描述的方法进行)，确定UBE2T是否是CaMKII-δ9的直接底物。重组CaMKII-δ9蛋白的存在显著提高了wt UBE2T而非其S110A突变体的丝氨酸磷酸化水平(图7h和图15c)。这一结果提供了CaMKII-δ9介导UBE2T在Ser110处磷酸化的直接证据。此外，破坏S110(UBE2T-S110A)而非S193(UBE2T-S193A)处的磷酸化允许UBE2T驻留在细胞质以及细胞核中(图15d)，证实CaMKII-δ9使UBE2T在Ser110处磷酸化，促进细胞质中蛋白酶体依赖性UBE2T降解，导致UBE2T在细胞核中富集。综上所述，体内和体外的数据显示，在心脏损伤后，CaMKII-δ9被激活和上调，这增强了UBE2T的Ser110磷酸化和随后的降解，最终导致心肌DNA损伤、基因组不稳定和细胞死亡。
实施例7.UBE2T不受CaMKII-δ1、δ2或δ3调节
CaMKII-δ2，次要胞质CaMKII-δ剪接变体，既不与UBE2T相互作用(图7i)，也不增加其丝氨酸磷酸化(图7h)，意味着UBE2T是CaMKII-δ9而非δ2的特定底物。此外，CaMKII-δ1和δ3都没有与UBE2T相互作用或诱导其降解(图8a-d)，再次证实UBE2T是CaMKII-δ9的选择性目标。为了确定CaMKII-δ9对UBE2T的剪接变体特异性调节的分子基础，本发明人构建了表达由外显子13-15-16-17、13-17、13-14-17和13-16-17编码的肽的质粒，这些外显子分别是CaMKII-δ1、δ2、δ3和δ9的特征序列(图9a)。质粒根据一般方法和材料的第1.17节中描述的方法构建。由外显子13-16-17而非其他外显子编码的肽与UBE2T相互作用(图8e和图16)，表明CaMKII-δ9的特征序列(外显子13-16-17)负责其底物选择性。
序列表
<110> 北京大学
张茂
张岩
肖瑞平
高华
<120> CAMKII-δ9拮抗剂及其用途
<130> 066467-8003WO03
<160> 98
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 智人
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Ile
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aataaaccaa tccacacgat catcctcaac ccacacgttc acctggtagg ggatgacgca 1320
gcctgcatcg catacattcg gctcacacag tacatggacg gaagcgggat gccaaagacc 1380
atgcagtcag aagagacgcg cgtgtggcac cgccgtgatg ggaagtggca gaatgttcac 1440
tttcaccgtt cggggtcccc cacagtaccc atcaagccac cctgtattcc aaatgggaaa 1500
gagaacttct caggaggcac ctctttgtgg caaaacatct ga 1542
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_人
<400> 20
gccagggcac agcccggacc g 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_人
<400> 21
gagaatgcag aagtggcact g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_恒河猴
<400> 22
gggcacagcc cggaccaagg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_恒河猴
<400> 23
atgcagaagt ggcactgttg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_大鼠
<400> 24
gggcacagcc cggaccaagg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_大鼠
<400> 25
atgcagaagt ggcactgttg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_小鼠
<400> 26
ggcgagctac tttcggacac 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_小鼠
<400> 27
gaagaagtgg cactgttgac 20
<210> 28
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原表位_外显子21
<400> 28
Pro Pro Cys Ile Pro Asn Gly Lys Glu Asn Phe Ser Gly Gly Thr Ser
1 5 10 15
Leu Trp
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原表位_外显子16
<400> 29
Cys Glu Pro Gln Thr Thr Val Ile His Asn Pro Asp Gly Asn Lys
1 5 10 15
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白原型胰蛋白酶肽_e20-21
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> 这个氨基酸用重同位素标记
<400> 30
Ser Gly Ser Pro Thr Val Pro Ile Lys Pro Pro Cys Ile Pro Asn Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白原型胰蛋白酶肽_e20-22
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 这个氨基酸用重同位素标记
<400> 31
Ser Gly Ser Pro Thr Val Pro Ile Lys
1 5
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白原型胰蛋白酶肽_e13-17
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> 这个氨基酸用重同位素标记
<400> 32
Lys Pro Asp Gly Val Lys Glu Ser Thr Glu Ser Ser Asn Thr Thr Ile
1 5 10 15
Glu Asp Glu Asp Val Lys
20
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白原型胰蛋白酶肽_e13-14
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 这个氨基酸用重同位素标记
<400> 33
Ser Leu Leu Lys Lys Pro Asp Gly Val Lys Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蛋白原型胰蛋白酶肽_e13-16
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> 这个氨基酸用重同位素标记
<400> 34
Lys Pro Asp Gly Val Lys Glu Pro Gln Thr Thr Val Ile His Asn Pro
1 5 10 15
Asp Gly Asn Lys
20
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 35
gtatcgataa gcttgccacc atgg 24
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 36
catgaagtcg cacaatatta gg 22
<210> 37
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于miR30的CaMKII-δ9 shRNA
<400> 37
gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgca atccacaacc ctgacggaaa tagtgaagcc 60
acagatgtat ttccgtcagg gttgtggatt atgcctactg cctcgg 106
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 38
cttcaccgag ggcctatttc c 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 39
ccgtaggtgg catcgccctc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 40
cggtatcgat aagcttggcc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 41
tcacaatatt ggggtgcttc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 42
atagaagcct agcccacacc 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 43
gatctgtggt ggctcaaatg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_18S
<400> 44
ggaagggcac caccaggagt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_18S
<400> 45
tgcagccccg gacatctaag 20
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_a-MHC
<400> 46
atcattccca acgagcgaaa g 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_a-MHC
<400> 47
aagtccccat agagaatgcg g 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_ANP
<400> 48
ttcttcctcg tcttggcctt t 21
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_ANP
<400> 49
gacctcatct tctaccggca tct 23
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_ATF3
<400> 50
catcaacaac agacctct 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_ATF3
<400> 51
cattcacact ctccagtt 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Bdkrb1
<400> 52
ccttctacgc tctgttaa 18
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Bdkrb1
<400> 53
ccaggatgtg atagttgaa 19
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_b-MHC
<400> 54
atgtgccgga ccttggaa 18
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_b-MHC
<400> 55
cctcgggtta gctgagagat ca 22
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_BNP
<400> 56
aagtcctagc cagtctccag a 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_BNP
<400> 57
gagctgtctc tgggccattt c 21
<210> 58
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_CaMKII-d2
<400> 58
ccagatgggg taaaggagtc aactgagagc t 31
<210> 59
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_CaMKII-d2/3/9
<400> 59
tcagatgttt tgccacaaag aggtgcctcc t 31
<210> 60
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_CaMKII-d3
<400> 60
aaaaggaagt ccagttcgag tgttcagatg at 32
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_CaMKII-d9
<400> 61
gtaaaggagc cccaaactac tgtaa 25
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Cdo1
<400> 62
gacctcatcc gaatcttg 18
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Cdo1
<400> 63
cagcacagaa tcatcaga 18
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Chac1
<400> 64
gctacgacac taaggaag 18
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Chac1
<400> 65
cgcaacaagt attcaagg 18
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_COX-2
<400> 66
ggcacaaata tgatgttcgc a 21
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_COX-2
<400> 67
cctcgcttct gatctgtctt ga 22
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_CSF2
<400> 68
ctatacaagc agggtctac 19
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_CSF2
<400> 69
ctatttcaca gtcagtttcc 20
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Ccna2
<400> 70
gaaggtctca ggttatcag 19
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Ccna2
<400> 71
gtctggtcat tctgtctc 18
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Ereg
<400> 72
agagaaggat ggagactt 18
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Ereg
<400> 73
gctgataact gcttgtaga 19
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Has1
<400> 74
aactggctgc taactatg 18
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Has1
<400> 75
agtctcctta cacctacc 18
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Hpgd
<400> 76
caggagtgaa caatgaga 18
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Hpgd
<400> 77
ataaggttag cagccatc 18
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_LIF
<400> 78
gatttcccac ctttccat 18
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_LIF
<400> 79
ctgtagtcgc attgagtt 18
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_PAI-2
<400> 80
aatccattca gccttctc 18
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_PAI-2
<400> 81
cagcgttgta tgtattcttc 20
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Plk1
<400> 82
tattacctgc ctcaccat 18
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Plk1
<400> 83
cttgtccgaa tagtctacc 19
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_Reg3b
<400> 84
aatatacctg gattggactc 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_Reg3b
<400> 85
caatgtggac tgtagataga 20
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物_UBE2T
<400> 86
agccaataca ccttatgag 19
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物_UBE2T
<400> 87
tccttccact agaatcaatg 20
<210> 88
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA_Scrambled的序列
<400> 88
ucccaauccu agggacaaa 19
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA_CaMKII-d9的序列
<400> 89
uccacaaccc ugauggaaa 19
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX-2 siRNA1
<400> 90
ccuuccuucg gaauucaau 19
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX-2 siRNA2
<400> 91
ccaugggugu gaaaggaaa 19
<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> COX-2 siRNA3
<400> 92
ccaguaucag aaccgcauu 19
<210> 93
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UBE2T siRNA1
<400> 93
ccacuguauu gaccucuau 19
<210> 94
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UBE2T siRNA2
<400> 94
ccaugcagcg auucuuuaa 19
<210> 95
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FANCD2 siRNA1
<400> 95
gcggcugaac auaaggcuu 19
<210> 96
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FANCD2 siRNA2
<400> 96
gcugucaucu guccgucua 19
<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FANCI siRNA1
<400> 97
ccugagagcc auccucaaa 19
<210> 98
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FANCI siRNA2
<400> 98
ccaucauccu uacugccuu 19

Claims (47)

1.一种治疗或预防受试者的CaMKII介导的疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。
2.一种减轻受试者的心脏损伤的方法，其包括向所述受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。
3.一种刺激受试者的泛素结合酶水平或活性的方法，其包括向所述受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。
4.一种防止受试者的泛素结合酶降解的方法，其包括向所述受试者施用有效量的CaMKII-δ9拮抗剂。
5.一种防止样本中心肌细胞死亡的方法，其包括使所述样本与有效量的CaMKII-δ9拮抗剂接触。
6.一种减少细胞中DNA损伤的方法，其包括使所述细胞与有效量的CaMKII-δ9拮抗剂接触。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是用于抑制泛素结合酶磷酸化的拮抗剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述泛素结合酶是泛素结合酶2T。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述拮抗剂是用于抑制泛素结合酶2T在Ser110处磷酸化的拮抗剂。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是CaMKII-δ9的特异性拮抗剂。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂抑制CaMKII-δ9的水平或活性，但不显著抑制CaMKII-δ2或CaMKII-δ3的水平或活性。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂是特异性识别CaMKII-δ9的抗体、与CaMKII-δ9结合的小分子化合物、靶向CaMKII-δ9编码序列的RNAi分子、靶向CaMKII-δ9编码序列的反义核苷酸或与CaMKII-δ9竞争结合其底物的药剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体、嵌合抗体或全人类抗体。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述抗体与CaMKII-δ基因的外显子16编码的氨基酸序列结合。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述RNAi分子是小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述RNAi分子具有10-100个碱基。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述反义核苷酸经修饰以提高其稳定性。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述RNAi分子和所述反义核苷酸与CaMKII-δ基因的外显子16结合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述RNAi分子和所述反义核苷酸与CaMKII-δ基因的外显子13和外显子16，或CaMKII-δ基因的外显子16和外显子17，或CaMKII-δ基因的外显子13和外显子16和外显子17结合。
21.根据权利要求12所述的方法，其中所述与CaMKII-δ9竞争结合其底物的药剂是表达无磷酸化或无氧化功能的CaMKII-δ9的载体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或质粒。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述AAV是AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9或AAVrh10。
24.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类或非人灵长类动物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述非人灵长类动物是恒河猴。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述CaMKII介导的疾病与CaMKII-δ9的水平或活性增加有关。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述CaMKII介导的疾病是心脏类疾病或代谢类疾病。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述心脏类疾病选自由以下组成的组：心肌病、心肌炎、糖尿病性心脏病、心肌缺血、心脏缺血/再灌注损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂、心绞痛、心脏肥大、心脏损伤、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心绞痛、心肌炎、冠心病和心包炎。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述代谢类疾病选自由以下组成的组：胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病、高血压、血脂异常、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖症、高血脂症、痛风和高尿酸血症。
30.一种用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的方法，其包括：
a)获得所述受试者的测试生物样本，
b)检测所述测试生物样本中CaMKII-δ9的水平或活性；其中在所述受试者的所述测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性指示所述受试者罹患CaMKII介导的疾病或其罹患CaMKII介导的疾病的概率增加。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述测试生物样本中CaMKII-δ9的水平或活性是通过使所述样本与特异性结合CaMKII-δ9的试剂接触来检测。
32.根据权利要求30所述的方法，其中将在所述测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性与在参考样本中检测到的CaMKII-δ9的参考水平或活性进行比较。
33.根据权利要求32所述的方法，其中在所述测试生物样本中检测到的CaMKII-δ9的水平或活性高于所述CaMKII-δ9的参考水平或活性指示所述受试者罹患CaMKII介导的疾病或罹患CaMKII介导的疾病的概率增加。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述参考样本来自健康受试者，或者是比所述测试生物样本更早或更晚从同一受试者获得的样本。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述测试生物样本来自所述受试者的心脏。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述受试者是人类或非人灵长类动物。
37.一种用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的试剂盒，其包含特异性识别CaMKII-δ9的抗体或抗体片段。
38.一种用于鉴定抑制CaMKII-δ9活性的分子的方法，其包括使所述分子与CaMKII-δ9和泛素结合酶2T接触，并确定泛素结合酶2T磷酸化是否被抑制，其中抑制泛素结合酶2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9的分子。
39.一种用于鉴定抑制CaMKII-δ9磷酸化的分子的方法，其包括使所述分子与CaMKII-δ9和泛素结合酶2T接触，并确定泛素结合酶2T磷酸化是否被抑制，其中抑制泛素结合酶2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9的分子。
40.一种用于鉴定治疗或预防CaMKII介导的疾病的分子的方法，其包括使所述分子与CaMKII-δ9和泛素结合酶2T接触，并确定泛素结合酶2T磷酸化是否被抑制，其中抑制泛素结合酶2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9的分子。
41.一种用于鉴定减轻心脏损伤的分子的方法，其包括使所述分子与CaMKII-δ9和泛素结合酶2T接触，并确定泛素结合酶2T磷酸化是否被抑制，其中抑制泛素结合酶2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9的分子。
42.一种用于鉴定防止心肌细胞死亡的分子的方法，其包括使所述分子与CaMKII-δ9和泛素结合酶2T接触，并确定泛素结合酶2T磷酸化是否被抑制，其中抑制泛素结合酶2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9的分子。
43.一种用于鉴定减少DNA损伤的分子的方法，其包括使所述分子与CaMKII-δ9和泛素结合酶2T接触，并确定泛素结合酶2T磷酸化是否被抑制，其中抑制泛素结合酶2T磷酸化鉴定了抑制CaMKII-δ9的分子。
44.根据权利要求38-43中任一项所述的方法，其中泛素结合酶2T磷酸化是在Ser110处。
45.一种用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的生物标志物，其中所述生物标志物包括CaMKII-δ9的全长蛋白质序列或其片段。
46.根据权利要求45所述的生物标志物，其中所述生物标志物包括如SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列。
47.CaMKII-δ9作为用于诊断受试者的CaMKII介导的疾病的生物标志物的用途。
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