CN114414530A - 一种生物分子自参考检测方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物分子自参考检测方法及装置，该方法采用具有不同光程差的两路干涉路径同步进行分子检测和环境干扰测量，通过同一个光谱仪同时记录两路干涉信号，并根据光程差的不同将两路干涉信号从叠加的干涉光谱中分离开来；分子检测及环境干扰测量的干涉信号相位变化分别被两路干涉信号记录，进而通过相位求解及差分运算的方式消除环境干扰；两个干涉路径通过采用两个不同厚度或不同折射率的传感芯片实现。该方法及装置有利于消除环境干扰，提高检测的鲁棒性和检测精度。

Description

一种生物分子自参考检测方法及装置
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种生物分子自参考检测方法及装置。
背景技术
生物分子检测作为一种基本研究工具，在疾病诊断、环境监测及药物筛选等领域应用广泛。非标记生物分子检测方法如表面等离子共振技术（SPR）、光波导、光纤传感等由于无需标记、实时等优势在分子检测特别是分子亲和力及动力学研究中具有重要意义。然而上述方法需要昂贵且定制的传感基底，如SPR的检测基底需要镀制金膜且膜层厚度需要nm级的精确控制。鉴于高精度相位测量能力，频域低相干干涉方法已被应用到生物分子检测中。该方法基于干涉原理，通过测量目标分子与传感表面探针分子结合引起的厚度和折射率变化，实现非标记分子检测。这种方法可以在普通玻璃上完成生物分子检测，因此造价低廉且系统简单。然而，样品中杂质分子的非特异性结合以及样品背底等都会干扰目标分子的检测，这都会降低分子检测的灵敏度和鲁棒性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物分子自参考检测方法及装置，该方法及装置有利于消除环境干扰，提高检测的鲁棒性和检测精度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种自参考生物分子检测方法，采用具有不同光程差的两路干涉路径同步进行分子检测和环境干扰测量，通过同一个光谱仪同时记录两路干涉信号，并根据光程差的不同将两路干涉信号从叠加的干涉光谱中分离开来；分子检测及环境干扰测量的干涉信号相位变化分别被两路干涉信号记录，进而通过相位求解及差分运算的方式消除环境干扰。
进一步地，环境干扰为样品中杂质分子的非特异性结合。
进一步地，两路干涉信号根据光程差的不同进行分解；两路干涉路径由一个单模光纤耦合器和两个具有不同厚度或不同折射率的传感芯片构成；两路干涉路径的光程差等于两路传感芯片的光学厚度，等价于传感芯片的厚度和折射率的乘积。
本发明还提供了一种用于实现上述方法的自参考生物分子检测装置，包括生物分子传感器、注射泵、三通阀、物镜、准直器、光纤转换件、2×2单模光纤耦合器、光源、光谱仪和计算机，所述生物分子传感器包括分设于左、右两侧的样品腔和参考腔，注射泵经三通阀同时连接生物分子传感器的样品腔和参考腔，所述样品腔和参考腔上分别依次设置物镜、准直器、光纤转换件，且两个光纤转换件分别经光纤连接单模光纤耦合器，所述单模光纤耦合器还与光源和光谱仪连接，以同时采集两路干涉信号。
进一步地，所述生物分子传感器由流体芯片和两个传感芯片构成，所述流体芯片上左、右两侧分别设有反应腔凹槽及与反应腔连接的弧形流道凹槽，所述两个传感芯片为两个不同厚度的玻璃片，所述两个不同厚度的传感芯片分别贴覆于左、右反应腔上，构成左、右两侧的样品腔和参考腔。
进一步地，所述传感芯片的厚度在0.04-2mm之间，折射率在1.34-2.3之间。
进一步地，样品腔的传感芯片为旭硝子玻璃片，参考腔的传感芯片为钠钙玻璃片，且样品腔的传感芯片采用探针分子进行表面修饰，而参考腔的传感芯片不进行处理，以使样品腔具有特异性捕获待测分子的能力。
进一步地，所述弧形流道凹槽中嵌套有中间连接管，用于传输溶液，以及将反应腔与外界隔离，防止溶液外溢；所述中间连接管经输液软管连接三通阀，进而连接注射泵，以将注射泵中溶液依次通过输液软管、中间连接管、流道，注入样品腔和参考腔。
进一步地，从光源发出的光经单模光纤耦合器分为两路分别照射到生物分子传感器的样品腔和参考腔，两路分别构成参考光和样品光共光路的干涉系统，其中样品光从传感芯片与腔内待测溶液接触的下表面反射，参考光从传感芯片的上表面反射；两路干涉信号的光程差都等于传感器芯片的光学厚度，即厚度与折射率的乘积；来自样品腔和参考腔的两路干涉信号最终被同一光谱仪同时记录，两路干涉信号根据光程差的不同进行区分；
根据光程差的不同，对两路干涉信号的叠加光谱进行分解，求取每路干涉信号的相位，进而通过差分的形式消除环境干扰，获得修正后的分子检测结果，具体方法为：对光谱仪记录的干涉光谱依次进行减直流量、插值、快速傅里叶变化，获得复数形式的空间域干涉信号；由于两路干涉信号的光程差不同，两路信号在空间域分开；分别提取对应光程差处干涉信号的相位，来自样品腔干涉信号的相位反映待测分子结合到芯片表面引入的厚度变化，该数值在一定浓度范围内与待测溶液的浓度成正比，可用来开展定量生物分子检测，而来自参考腔干涉信号的相位反映待测溶液中杂质分子非特异性结合引入的厚度变化，该数值表示杂质分子的干扰；最终通过两个相位的差分消除分子检测过程中杂质分子的影响，进而提高检测准确性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：提供了一种生物分子自参考检测方法及装置，该方法及装置能够实时监测分子检测过程中环境干扰的变化，因此可以消除环境干扰，从而实现高精度及高鲁棒性的分子传感检测。同时，本发明可以使用常规的低相干干涉测量仪及普通玻璃实现，无需定制昂贵的检测基底，也无需增加额外的检测元件，因此造价低廉且制作简单。鉴于上述优势，该自参考生物分子传感器在医学诊断、药物筛选等领域具有极高的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例中检测装置的解耦股示意图。
图2为本发明实施例中生物分子传感器的流体芯片示意图。
图3为本发明实施例中传感芯片的表面修饰过程。
图4为本发明实施例中采集到的原始干涉光谱。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本实施例提供了一种自参考生物分子检测方法，采用具有不同光程差的两路干涉路径同步进行分子检测和环境干扰测量，通过同一个光谱仪同时记录两路干涉信号，并根据光程差的不同将两路干涉信号从叠加的干涉光谱中分离开来；分子检测及环境干扰测量的干涉信号相位变化分别被两路干涉信号记录，进而通过相位求解及差分运算的方式消除环境干扰。
其中，环境干扰为样品中杂质分子的非特异性结合。
两路干涉信号根据光程差的不同进行分解。两路干涉路径由一个单模光纤耦合器和两个具有不同厚度或不同折射率的传感芯片构成；两路干涉路径的光程差等于两路传感芯片的光学厚度，等价于传感芯片的厚度和折射率的乘积。
如图1所示，本实施例还提供了用于实现上述方法的自参考生物分子检测装置，包括生物分子传感器1、注射泵2、三通阀3、物镜4、准直器5、光纤转换件6、2×2单模光纤耦合器7、光源8（在本实施例中采用超发光二极管）、光谱仪9和计算机10，所述生物分子传感器1包括分设于左、右两侧的样品腔11和参考腔12，注射泵2经三通阀3同时连接生物分子传感器1的样品腔11和参考腔12，所述样品腔11和参考腔12上分别依次设置物镜4、准直器5、光纤转换件6，且两个光纤转换件6分别经光纤连接单模光纤耦合器7，所述单模光纤耦合器7还与光源8和光谱仪9连接，以同时进行分子检测和环境干扰测量并采集两路干涉信号。
在本实施例中，所述生物分子传感器由流体芯片和两个传感芯片构成，所述流体芯片上左、右两侧分别设有反应腔凹槽及与反应腔连接的弧形流道凹槽，所述两个传感芯片为两个不同厚度的玻璃片，所述两个不同厚度的传感芯片分别贴覆于左、右反应腔上，构成左、右两侧的样品腔和参考腔。
如图2所示，所述流体芯片由有机玻璃制成，其长宽高尺寸为100mm×30mm×10mm；所述反应腔凹槽为长宽高尺寸为10mm×10mm×3mm的正方形凹槽，反应腔中心相距60mm；所述弧形流道凹槽为直径为3mm的半圆形凹槽，并连接反应腔，以作为溶液进出流道。
所述传感芯片的厚度在0.04-2mm之间，折射率在1.34-2.3之间。在本实施例中，样品腔的传感芯片为厚度0.20mm的旭硝子玻璃片，参考腔的传感芯片为厚度0.33mm的钠钙玻璃片，且样品腔的传感芯片采用探针分子进行表面修饰，而参考腔的传感芯片不进行处理，以使样品腔具有特异性捕获待测分子的能力。
在本实施例中，所述弧形流道凹槽中嵌套有中间连接管（在本实施例中采用高硬度透明四氟管），用于传输溶液，以及将反应腔与外界隔离，防止溶液外溢；所述高硬度透明四氟管经输液软管连接三通阀，进而连接注射泵，以将注射泵中溶液依次通过输液软管、高硬度透明四氟管、流道，注入样品腔和参考腔。
从光源发出的光经单模光纤耦合器分为两路分别照射到生物分子传感器的样品腔和参考腔，两路分别构成参考光和样品光共光路的干涉系统，其中样品光从传感芯片与腔内待测溶液接触的下表面反射，参考光从传感芯片的上表面反射；两路干涉信号的光程差都等于传感器芯片的光学厚度，即厚度与折射率的乘积；来自样品腔和参考腔的两路干涉信号最终被同一光谱仪同时记录，两路干涉信号根据光程差的不同进行区分。
根据光程差的不同，对两路干涉信号的叠加光谱进行分解，求取每路干涉信号的相位，进而通过差分的形式消除环境干扰，获得修正后的分子检测结果，具体方法为：对光谱仪记录的干涉光谱依次进行减直流量、插值、快速傅里叶变化，获得复数形式的空间域干涉信号；由于两路干涉信号的光程差不同（由传感芯片的几何厚度及折射率的乘积决定），两路信号在空间域分开；分别提取对应光程差处干涉信号的相位，来自样品腔干涉信号的相位反映待测分子结合到芯片表面引入的厚度变化，该数值在一定浓度范围内与待测溶液的浓度成正比，可用来开展定量生物分子检测，而来自参考腔干涉信号的相位反映待测溶液中杂质分子非特异性结合引入的厚度变化，该数值表示杂质分子的干扰；最终通过两个相位的差分消除分子检测过程中杂质分子的影响，进而提高检测准确性。
本实施例提供了一种用于特异性蛋白检测的生物分子传感器，下面对其制备方法及工作原理作进一步说明。
1）传感器的制备
两种不同初始厚度的传感芯片，分别为24mm×40mm×0.20mm的旭硝子玻璃片与24mm×40mm×0.33mm的普通钠钙玻璃片。
如图2所示，本实施例特制的流体芯片，流体芯片的材料为有机玻璃，其尺寸为100mm×30mm×10mm。芯片内置两个边长为10mm的反应腔凹槽，腔体中心相距60mm，与腔体相连接的直径为3mm的弧形凹槽用作溶液进出流道。
将环氧树脂AB胶搅拌均匀并涂抹在嵌套有高硬度透明四氟管的流体芯片上表面，随后迅速将表面经75%乙醇消毒液擦拭的传感芯片放置在涂有环氧树脂AB胶的流体芯片表面，其中左反应腔粘合厚度为0.20mm的传感芯片、右反应腔粘合厚度为0.33mm的传感芯片。左右反应腔分别构成样品腔和参考腔。
2）传感器的修饰
如图3所示，所述传感芯片的表面修饰，其具体实施步骤如下：往左、右反应腔中分别通入PBS（磷酸盐缓冲液）冲洗传感芯片与溶液结合表面，随后通入一定量新鲜制备的多巴胺溶液，使其在结合表面自聚合形成一层薄的粘附层，以提高结合表面的生物相容性，待30分钟后再次通入PBS冲洗。随后固定探针分子：往左反应腔通入足量的蛋白A（Protein A）溶液修饰多巴胺层，粘附在多巴胺层上的蛋白A分子作为探针分子，可以特异性地捕获目标分析物，待探针分子完全固定后，通入PBS冲洗；右反应腔不做固定探针分子处理。之后进行封闭。往左、右反应腔中分别通入无蛋白封闭液阻断多巴胺层上的非特异性结合位点，体积更小的阻断分子填补了蛋白A分子之间的多巴胺层，从而减少目标分析物与多巴胺层的非特异性结合，待封闭完成后，通入PBS冲洗。
3）光谱检测
如图1所示，本实施例搭建了用于实现本方法的检测装置，其具体搭建方案如下：
光源是中心波长为1310nm，带宽为75nm的超发光二极管光源。光源发出的光被2×2单模光纤耦合器分为两个等光强光束，两路光束经过相同准直器准直后，被两个显微物镜分别聚焦到所述的生物分子传感器的参考腔和样品腔上。两路光束构成两个通道，每个通道都可以看成是参考光和样品光共光路的干涉系统，其中参考光从传感芯片的上表面反射，样品光从传感芯片与腔内待测溶液接触的下表面反射。两个通道的两路干涉信号最终被同一个光谱仪记录，根据光程差的不同可以对两路干涉信号进行区分。光谱仪采集到的光谱在计算机中进行处理。图4展示了所述光谱仪采集到的原始干涉光谱。
4）开展生物分子检测
往左、右反应腔中分别注入5mL浓度为20μg/mL的兔IgG溶液，由于探针蛋白的存在，待测蛋白不断和左反应腔上的传感芯片表面的探针蛋白结合，引起传感芯片的厚度变化。与此同时，由于左、右反应腔上的传感芯片表面仍有一些尚未封闭完全的非特异性结合位点，待测蛋白与所述非特异性结合位点结合，引起传感芯片的厚度变化，光谱仪检测到的信号随之发生变化，通过解相位信息，探针蛋白与兔IgG之间的特异性、非特异性结合过程被实时记录下来。待信号趋于稳定，即可认定已完全反应，此时往反应腔中通入PBS溶液，冲洗残余待测蛋白分子。
5）数据处理
本发明提供了一种可降低非特异性结合的数据解析方法，其具体步骤如下：
1）获取原始干涉光谱信号：
每个生物传感器中不同厚度的传感芯片使得每个干涉通道中形成的干涉信号光谱条纹频率不同，分子结合等引入的传感器表面厚度变化反应在干涉信号的相位中。消除直流项后，每个干涉通道的原始干涉光谱信号由下列方程式决定：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(1)
其中，k为波数，β为光纤耦合器的分光比例，S(k)为高斯型光源的光谱密度，R r 和R S 分别为传感芯片上表面的反射率以及样品层的反射率，Z C (t)为各通道参考光与样品光的光程差，其被定义为：
Figure 269665DEST_PATH_IMAGE002
(2)
其中，n protein 代表分子层的等效折射率，我们通常假定分子层是单层蛋白质分子层，其折射率近似等于1.45；Z(t)是特异性结合引入的传感器表面分子层厚度变化函数，Z’(t)是非特异性结合引入的传感器表面分子层厚度变化函数。
2）提取相位：
对式（1）进行傅里叶变换可以得到路径长度解析的干涉信号I C (Z)，由此我们可以通过下式来提取相位：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
(3)
其中，k 0是光源的中心波数，由k 0 = 2π/λ 0定义，λ 0是宽带光源的中心波长。本发明搭建的系统可以同时获取两路相位，为了最小化相位噪声，每个相位值从500次测量中取平均值。
3）相位差分：
参考腔直接使用封闭液进行封闭，没有修饰探针分子，因此参考通道的相位变化可认为是来自样品杂质分子的非特异性结合。样品通道开展分子检测，虽然使用封闭液进行封闭，但仍无法完全消除样品杂质分子非特异性结合的影响。因此本发明中我们通过跟踪杂质分子的非特异性干扰的方式消除非特异性干扰的影响。对两路干涉信号的相位进行差分可以消除非特异性结合的干扰，进而提高检测精度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种自参考生物分子检测方法，其特征在于，采用具有不同光程差的两路干涉路径同步进行分子检测和环境干扰测量，通过同一个光谱仪同时记录两路干涉信号，并根据光程差的不同将两路干涉信号从叠加的干涉光谱中分离开来；分子检测及环境干扰测量的干涉信号相位变化分别被两路干涉信号记录，进而通过相位求解及差分运算的方式消除环境干扰。
2.根据权利要求1所述的一种自参考生物分子检测方法，其特征在于，环境干扰为样品中杂质分子的非特异性结合。
3.根据权利要求1所述的一种自参考生物分子检测方法，其特征在于，两路干涉信号根据光程差的不同进行分解；两路干涉路径由一个单模光纤耦合器和两个具有不同厚度或不同折射率的传感芯片构成；两路干涉路径的光程差等于两路传感芯片的光学厚度，等价于传感芯片的厚度和折射率的乘积。
4.一种用于实现如权利要求1-3任一项所述方法的自参考生物分子检测装置，其特征在于，包括生物分子传感器、注射泵、三通阀、物镜、准直器、光纤转换件、2×2单模光纤耦合器、光源、光谱仪和计算机，所述生物分子传感器包括分设于左、右两侧的样品腔和参考腔，注射泵经三通阀同时连接生物分子传感器的样品腔和参考腔，所述样品腔和参考腔上分别依次设置物镜、准直器、光纤转换件，且两个光纤转换件分别经光纤连接单模光纤耦合器，所述单模光纤耦合器还与光源和光谱仪连接，以同时采集两路干涉信号。
5.根据权利要求4所述的一种自参考生物分子检测装置，其特征在于，所述生物分子传感器由流体芯片和两个传感芯片构成，所述流体芯片上左、右两侧分别设有反应腔凹槽及与反应腔连接的弧形流道凹槽，所述两个传感芯片为两个不同厚度的玻璃片，所述两个不同厚度的传感芯片分别贴覆于左、右反应腔上，构成左、右两侧的样品腔和参考腔。
6.根据权利要求5所述的一种自参考生物分子检测装置，其特征在于，所述传感芯片的厚度在0.04-2mm之间，折射率在1.34-2.3之间。
7.根据权利要求5所述的一种自参考生物分子检测装置，其特征在于，样品腔的传感芯片为旭硝子玻璃片，参考腔的传感芯片为钠钙玻璃片，且样品腔的传感芯片采用探针分子进行表面修饰，而参考腔的传感芯片不进行处理，以使样品腔具有特异性捕获待测分子的能力。
8.根据权利要求5所述的一种自参考生物分子检测装置，其特征在于，所述弧形流道凹槽中嵌套有中间连接管，用于传输溶液，以及将反应腔与外界隔离，防止溶液外溢；所述中间连接管经输液软管连接三通阀，进而连接注射泵，以将注射泵中溶液依次通过输液软管、中间连接管、流道，注入样品腔和参考腔。
9.根据权利要求5所述的一种自参考生物分子检测装置，其特征在于，从光源发出的光经单模光纤耦合器分为两路分别照射到生物分子传感器的样品腔和参考腔，两路分别构成参考光和样品光共光路的干涉系统，其中样品光从传感芯片与腔内待测溶液接触的下表面反射，参考光从传感芯片的上表面反射；两路干涉信号的光程差都等于传感器芯片的光学厚度，即厚度与折射率的乘积；来自样品腔和参考腔的两路干涉信号最终被同一光谱仪同时记录，两路干涉信号根据光程差的不同进行区分；
根据光程差的不同，对两路干涉信号的叠加光谱进行分解，求取每路干涉信号的相位，进而通过差分的形式消除环境干扰，获得修正后的分子检测结果，具体方法为：对光谱仪记录的干涉光谱依次进行减直流量、插值、快速傅里叶变化，获得复数形式的空间域干涉信号；由于两路干涉信号的光程差不同，两路信号在空间域分开；分别提取对应光程差处干涉信号的相位，来自样品腔干涉信号的相位反映待测分子结合到芯片表面引入的厚度变化，该数值在一定浓度范围内与待测溶液的浓度成正比，可用来开展定量生物分子检测，而来自参考腔干涉信号的相位反映待测溶液中杂质分子非特异性结合引入的厚度变化，该数值表示杂质分子的干扰；最终通过两个相位的差分消除分子检测过程中杂质分子的影响，进而提高检测准确性。
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