CN114410746B - 一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用 - Google Patents

一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用，提供了一种东星斑分子溯源选择育种方法，结合国内东星斑等鱼类育种现状，实现对现存的连续多代样本进行低成本基因组重测序，通过分子溯源分析它们的亲缘关系，完成对连续多代鱼类亲缘关系的鉴定，综合多代间的优良性状，科学辅助鱼类新品种选育工作，为鱼类新品种培育提供了一种科学高效的育种方法；本发明的方法能够在性成熟周期长且已培育多代而未进行系统选育鱼类的育种工作中具有广阔的应用前景，能够成为鱼类良种培育的有力工具，对于东星斑、杉斑、虎斑以及老鼠斑等已培育多代而未科学地选育的鱼类等水产养殖品种的育种工作具有重要意义。

Description

一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用
技术领域
本发明涉及海洋鱼类遗传育种技术领域，特别涉及一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用。
背景技术
随着技术的不断进步，水产育种也不断进行着技术的更新迭代，从传统群体育种、杂交育种、分子标记辅助育种等，到现在全基因组选择育种，育种技术日趋成熟，已育成大黄鱼、半滑舌鳎等多种海水鱼类新品种。
东星斑因体色艳丽、肉质细嫩、营养丰富、经济价值和观赏价值高等特点，市场前景广阔，已成为我国南方各省陆基工厂化养殖的主要种类。但东星斑性成熟周期长，主要由养殖企业进行逐代群体筛选培育，种质资源较为混乱，谱系不清，缺乏系统的选育工作。因此，亟需建立东星斑有效、可靠的个体间亲缘关系鉴定技术。
高通量测序和基因分型技术的出现，利用SNP标记构建基因组亲缘关系矩阵，来替代传统的系谱记录亲缘关系已经展开了大量的研究，并证实可纠正谱系亲缘记录错误，比传统谱系记录更有效，但该技术对群体表型样品量要求高，且成本高。因此，建立全基因组分子溯源技术，对实现海洋鱼类亲缘关系鉴定、评估某动物品种的育成历史和品种纯度、保护地方特色品种、预测杂种优势（即评估杂交品种对特定生产环境的适应性），进而实现杂交计划和杂交育种方案的精准设计具有重要意义。
发明内容
鉴以此，本发明为已培育多代而未进行系统选育的东星斑提供一种高效、科学、系统的育种方法，所述方法首先分别提取各代个体的DNA并建库，进行全基因组重测序分析，建立该物种单倍型库，综合分析出每个个体所选育性状的基因型，并对不同代间的不同个体进行亲缘关系的确认，再鉴定出已有的连续多代个体间的亲缘关系后测定它们的目标性状，如生长、抗病、体色或耐寒等其它重要生产性状。随后，结合多代个体已测取的性状回溯优质子代群体的亲本及祖代信息，确定优质群体各代亲本的遗传信息，进而在对已培育的连续多代群体进行科学系统的鉴定和评估的基础上，指导下一步的育种工作，快速高效地培育出健康稳定的优质新品种。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种东星斑分子溯源选择育种方法，包括以下步骤：
S1.建立全基因重测序文库：测定已连续培育多代东星斑的各代个体生长相关性状，然后取各代个体的尾鳍或鳃丝组织，分别提取总DNA，利用实验室自主建立的低成本建库方法，利用诺唯赞DNA建库试剂盒（货号：ND617）建立全基因重测序文库，随后进行测序分析；
优选的，所述生长相关性状包括体重、体长、体高、体宽。
优选的，取尾鳍或鳃丝组织时，以不影响个体活力为前提，取后，用RNase-free的1×PBS缓冲液漂洗，置于90%酒精存样，4℃保存备用。
优选的，提取总DNA的方法为酚氯仿提取法。
S2.建立单倍型库：对步骤S1测序分析后的reads进行整理和裁剪，将处理后的reads比对到已有东星斑参考基因组上，对reads进行质量检测，删除掉低质量reads并对其进行多态性位点检测分型，确定单核苷酸多态性位点分型信息，合并前述处理产生的文件，对所有高深度测序个体多态性位点分型信息进行过滤，去除高缺失率的基因型和样本，构建单倍型数据库，对低深度测序个体进行基因型填充；
优选的，所述整理和裁剪为 (1) 测序质量质控，去除数据质量参数（quality，Q）小于30的碱基，即在SNP位点基因分型过程中，单位点分型正确率在99.9%以上；（2）去除带有部分接头的二聚体序列；（3）去除长度小于36 bp的reads。
其中，reads(读长)指的是测序仪单次测序所得到的碱基序列。
优选的，所述高深度测序的测序深度为20×的东星斑个体基因组。
优选的，所述低深度测序的测序深度为5×的东星斑个体基因组。
优选的，所述高缺失率为缺失率≥10%。
S3.亲缘关系的鉴定及回溯亲本及祖代信息：合并步骤S2处理后的各代测序个体的vcf文件，过滤数据，计算不同代个体间的亲缘关系指数，建立亲缘关系矩阵，推断不同代个体之间的亲缘关系，筛选出系谱关系可以溯源出F0祖本和F1父母本个体的F2代个体；
其中，vcf（variant call file，突变识别文件）文件是保存基因组上所有位置的突变信息的文件。
优选的，所述过滤数据为去除可信度低和质量低的SNP位点信息，即基因缺失率≥10%或次等位基因频率≤5%的SNP位点信息，其中SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的突变所引起的氨基酸序列多态性。
优选的，所述亲缘关系指数的计算为根据SNP位点的连锁不平衡，以基因频率、期望杂合度为基础计算个体间的亲缘关系。
S4.连续多代群体的鉴定评估及筛选：根据步骤S3溯源出F0、F1亲本个体和F2代个体的亲缘关系、基因型矩阵和表型性状进行育种值和遗传力评估；
优选的，包括育种值评估系统，所述育种值评估系统具体如下：首先构建评估群体亲缘关系矩阵，剔除环境效应和部分遗传效应的偏差，然后对动物个体加性效应即育种值做无偏估计，最后分别应用于BLUP（最佳线性无偏预测），GBLUP（基因组最佳线性无偏预测）和PGBLUP（整合先验生物学信息的全基因组最佳线性无偏预测）比较验证育种值和遗传力的准确度；
育种值评估系统的核心模型为：
Figure 786367DEST_PATH_IMAGE001
；
其中，y是观察值，即动物性状表型值，b是固定效应（环境效应），u是遗传效应，e是随机残差，X和Z分别为环境效应和遗传效应的关联矩阵；
育种值和遗传力的准确度评估核心模型：
Figure 53401DEST_PATH_IMAGE002
；
其中，a为评估的准确度；r为育种值（EBV）与实际测量表型值的相关性系数，y1和yz分别为个体性状的EBV和表型值；h为遗传力平方根。
优选的，所述遗传力评估为评估所筛选出来的F2代群体生长相关性状。
S5.筛选优质亲本：将步骤S4所得到的育种值与步骤S3得出的亲缘关系以及个体的生长相关性状一一关联对应，综合分析测序后的全基因重测序文库，筛选出性状优良且遗传稳定的F2代个体作为亲本繁育F3代群体。
优选的，本发明还提供了所述的东星斑分子溯源选择育种方法在鱼类选育工作中的应用。
优选的，所述鱼类包括：东星斑、杉斑、虎斑和老鼠斑等其他水产养殖鱼类。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种东星斑分子溯源选择育种方法，结合国内东星斑等鱼类育种现状，实现对现存的连续多代样本进行低成本基因组重测序，通过分子溯源分析它们的亲缘关系，完成对连续多代鱼类亲缘关系的鉴定，综合多代间的优良性状，科学辅助鱼类新品种选育工作，为鱼类的新品种培育提供了一种科学高效的育种方法，可应用于东星斑、杉斑、虎斑以及老鼠斑等已培育多代而未科学地选育的鱼类等其它水产养殖品种的培育工作，在性成熟周期长且已培育多代而未进行系统选育鱼类的育种工作中具有广阔的应用前景，能够成为鱼类良种培育的有力工具，对于东星斑、杉斑等已培育多代而未科学地选育的鱼类等水产养殖品种的育种工作具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的优选实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明分子溯源选择育种与传统育种技术路线的比较图；图中A部分为本发明分子溯源选择育种技术路线图；图中B部分为传统育种技术路线图；
图2为本发明DNA及重测序文库检测结果；图中A部分为部分个体的DNA凝胶电泳结果；图中B部分为重测序文库检测结果；
图3为本发明三代鱼亲缘关系鉴定中三个群体系谱关系鉴定结果；
图4为本发明三代鱼亲缘关系鉴定中具有三代亲缘关系个体间系谱关系；
图5为本发明图4育种值组图例的局部放大图；
图6为本发明群体遗传力估计及其准确度评估为东星斑体长、体高、体宽和体重遗传力估计结果；
图7为本发明群体遗传力估计及其准确度评估中分别应用PGBLUP、GBLUP和BLUP进行体重性状育种值和遗传力的准确度评估结果；
图8为筛选群体与普通群体体尺性状差异性分析结果。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制，实施例中所涉及的化学药品及工具如无特殊说明均为购买于市场商品。
实施例1
一种东星斑分子溯源选择育种方法，包括以下步骤：
S1.建立全基因重测序文库：测定东星斑F2代鱼160条，F1代亲本41条及F0代鱼21条，以及其它两个群体的鱼，共403条鱼的体重、体长、体高、体宽等生长相关性状，统计分析数据并做好记录；然后剪取测定的每个个体的尾鳍（以不影响个体活力为前提）对应着做好标记，用RNase-free的1×PBS缓冲液漂洗后，置于90%酒精存样，4℃保存备用，取50mg样品，用酚氯仿提取法提取各个个体样品的DNA，利用诺唯赞DNA建库试剂盒（货号：ND617）建立东星斑不同样品的全基因重测序文库（见图2），随后进行测序分析；
S2.建立单倍型库：
a.使用Trimmomatic对测序后获得的培育三代的东星斑不同个体生长相关性状测序reads进行整理和裁剪： (1) 去除数据质量参数Q小于30的碱基；（2）去除带有部分接头的二聚体序列；（3）去除长度小于36 bp的reads；
b.获取高质量的reads后，基于MEM (Burrows-Wheeler Transform)算法把它们比对到已有东星斑参考基因组上；
c.使用samtools对步骤b中产生的sam文件进行转化成为bam文件，采用GATK中的HaplotypeCaller对reads进行质量检测，删除掉低质量reads并对其进行多态性位点检测分型，确定单核苷酸多态性位点分型信息；再使用GATK 中的CombineGVCFs 对HaplotypeCaller单独call 出来的样本进行合并，随后用GATK 中的GenotypeGVCFs对所有高深度测序（20×）个体多态性位点分型信息进行过滤，使用plink去除高缺失率（缺失率≥10%）的基因型和样本，最后剩余8,735,699个有效SNP多态性位点，然后选择Shapeit 构建单倍型数据库，并对低深度测序个体（5×）进行基因型填充，获得每个低深度测序个体的单倍型和基因型，为后续亲缘关系鉴定和群体育种值和遗传力评估提供可靠数据；
S3.分子溯源鉴定亲缘关系：在完成步骤S2的基础上，对F0、F1和F2代测序个体vcf文件进行合并后，使用GATK和Vcftools对数据进行过滤，去除掉可信度低和质量低的SNP位点信息（基因缺失率≥10%或次等位基因频率≤5%），然后使用PLINK2将vcf文件转化为ped文件和map文件，进行不同代个体间的亲缘关系指数的计算，根据SNP位点的连锁不平衡，以基因频率、期望杂合度为基础计算个体间的亲缘关系指数，根据亲缘关系矩阵（表1），推断出不同代个体之间的亲缘关系，获得三代个体之间的系谱关系（图3），F0代筛选出21个，F1代筛选出40个，F2代筛选出82个（图4）；
S4.连续多代群体的鉴定评估及筛选：将步骤S3所筛选的连续多代鱼的亲本个体（F0、F1）和子代鱼（F2）的体重性状进行育种值和遗传力评估；
育种值的评估系统具体如下：首先构建评估群体亲缘关系矩阵，剔除环境效应和部分遗传效应的偏差，然后对动物个体加性效应即育种值做无偏估计，最后分别应用于BLUP，GBLUP和PGBLUP比较验证育种值和遗传力的准确度；
育种值的评估系统的核心模型为：
Figure 189984DEST_PATH_IMAGE003
；
其中，y是观察值，即动物性状表型值，b是固定效应（环境效应），u是加性遗传效应，符合u~N（0，
Figure 858863DEST_PATH_IMAGE004
），u~N（0，
Figure 789909DEST_PATH_IMAGE005
）或u~N（0，
Figure 544239DEST_PATH_IMAGE006
），其中
Figure 218934DEST_PATH_IMAGE007
是加性方差，A和G分别是系谱关系矩阵和基因型矩阵，H矩阵由G矩阵和A矩阵整合构建，分别应用于BLUP（最佳线性无偏预测），GBLUP（基因组最佳线性无偏预测，是在BLUP的基础上引入G矩阵，使用G矩阵来反映个体间的关系，各标记在G矩阵中的贡献基本相同）和PGBLUP（整合先验生物学信息的全基因组最佳线性无偏预测，基于GBLUP引入先验生物学信息，在本案例中为生长性状相关生物学信息）；e是随机残差，X和Z分别为环境效应和遗传效应的关联矩阵；
育种值和遗传力的准确度评估核心模型：
Figure 742319DEST_PATH_IMAGE008
；
其中，a为评估的准确度；r为育种值（EBV）与实际测量表型值的相关性系数，y1和yz分别为个体性状的EBV和表型值；h为遗传力平方根；
S5.把步骤S4所得到的育种值与步骤S3所述的亲缘关系以及个体的体尺性状一一关联对应，综合分析已获得的连续多代群体的遗传信息，筛选获得体重性状优且遗传稳定的东星斑F2代个体（表2），再应用PGBLUP得到的体重育种值，辅助对存在亲缘关系的个体做进一步的筛选，筛选出11条生长性状优的F2代个体，为后续F3代繁育提供可靠的亲本。
表1. 利用SNP 标记构建基因组亲缘关系矩阵
Figure 106917DEST_PATH_IMAGE009
表2 筛选出个体亲缘系数
Figure 348542DEST_PATH_IMAGE010
表3 F0、F1及F2代群体育种值
Figure 561349DEST_PATH_IMAGE011
Figure 142503DEST_PATH_IMAGE012
Figure 477669DEST_PATH_IMAGE013
验证分析：
（1）单倍型库质量评估：分别抽取0.1×、0.2×、0.3×、0.4×、0.5×、0.6×、0.8×、1.0×、2.0×、4.0×和8.0×数据通过GLIMPSE软件进行填充，最终评估数据量填充准确性高于90%，4×以上数据量填充准确性高于95%。
（2）验证育种值和遗传力的准确度：通过基因组育种值与性状表型值的相关性除以遗传力平方根来评估。检测过程中随机抽取部分个体进行评估，并进行多次重复分析。如图7所示分析显示应用PGBLUP的准确性要优于GBLUP和BLUP；育种值和遗传力的准确度评估核心模型如下：
Figure 206591DEST_PATH_IMAGE008
；
其中，a为评估的准确度；r为育种值（EBV）与实际测量表型值的相关性系数，y1和yz分别为个体性状的EBV和表型值；h为遗传力平方根。
（3）个体性状的分析：将筛选出来的F2代个体与未作选育的个体进行体尺性状（体重，体长，体高，体宽）的比较。其中，平均体重提升17.5%，平均体长提升8.0%，平均体高提升8.7%，平均体宽提升11.5%。由此可见通过分子溯源选择育种所筛选出来的F2代个体的体尺性状显著优于普通群体个体（图8），表明其生长相关性状显著优于未选育群体，并具有明显的遗传稳定优势。
（4）检测和验证筛选出的F2代：根据F3代个体生长性状及育种值具体情况对所筛选出的F2代进行验证，确定筛选出的F2代亲本生长性状优，且遗传稳定。
本发明可根据已有F2代群体溯源出其F0和F1亲本群体，鉴定它们三代的亲缘关系，并根据溯源结果结合育种值和相关性状，即可筛选出优质F2代个体。对筛选出的F2代个体遗传分析，同时结合建立的单倍型库，可大大降低全基因组选择育种的测序成本。
综上所述，基于本发明东星斑分子溯源选择育种方法，可快速回溯鉴定出优质子代群体的亲本及祖代信息，筛选出性状优良且遗传稳定的后代个体，缩短育种周期、加速东星斑良种培育工作、降低育种经济成本，为鱼类等水产养殖品种遗传育种提供一种高效可靠且价格低廉的育种方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种东星斑分子溯源选择育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.建立全基因重测序文库：测定已连续培育多代东星斑的各代个体生长相关性状，然后取各代个体的尾鳍或鳃丝组织，分别提取总DNA，建立全基因重测序文库，随后进行测序分析；
S2.建立单倍型库：对步骤S1测序分析后的reads进行整理和裁剪，然后比对到已有东星斑参考基因组上，对reads进行质量检测，删除掉低质量reads并对其进行多态性位点检测分型，确定单核苷酸多态性位点分型信息，合并前述处理产生的文件，对所有高深度测序个体多态性位点分型信息进行过滤，去除高缺失率的基因型和样本，构建单倍型数据库，对低深度测序个体进行基因型填充；
所述整理和裁剪为 (1)去除数据质量参数小于30的碱基；（2）去除带有部分接头的二聚体序列；（3）去除长度小于36 bp的reads；
所述高深度测序的测序深度为20×的东星斑个体基因组；所述高缺失率为缺失率≥10%；
所述低深度测序的测序深度为5×的东星斑个体基因组；
S3.分子溯源鉴定亲缘关系：合并步骤S2处理后的各代测序个体的vcf文件，过滤数据，计算不同代个体间的亲缘关系指数，推断不同代个体之间的亲缘关系，筛选出系谱关系可以溯源出F0祖本和F1父母本个体的F2代个体；
所述过滤数据为去除可信度低和质量低的SNP位点信息，即基因缺失率≥10%或次等位基因频率≤5%的SNP位点信息；
所述亲缘关系指数的计算为根据SNP位点的连锁不平衡，以基因频率、期望杂合度为基础计算个体间的亲缘关系；
S4.连续多代群体的鉴定评估及筛选：根据步骤S3溯源出F0、F1亲本个体和F2代个体的亲缘关系、基因型矩阵和表型性状进行育种值和遗传力评估；
育种值评估系统具体如下：首先构建评估群体亲缘关系矩阵，剔除环境效应和部分遗传效应的偏差，然后对动物个体加性效应即育种值做无偏估计，最后应用于PGBLUP比较验证育种值和遗传力的准确度；
育种值评估系统的核心模型为：
Figure 133003DEST_PATH_IMAGE001
；
其中，y是观察值，即动物性状表型值，b是固定效应，u是遗传效应，e是随机残差，X和Z分别为环境效应和遗传效应的关联矩阵；
育种值和遗传力的准确度评估核心模型：
Figure 975057DEST_PATH_IMAGE002
；
其中，a为评估的准确度；r为育种值与实际测量表型值的相关性系数，y1和yz分别为个体性状的育种值和表型值；h为遗传力平方根；
S5.筛选优质亲本：将步骤S4所得到的育种值与步骤S3得出的亲缘关系以及个体的生长相关性状一一关联对应，综合分析测序后的全基因重测序文库，筛选出性状优良且遗传稳定的F2代个体作为亲本繁育F3代群体。
2.如权利要求1所述的东星斑分子溯源选择育种方法，其特征在于，所述生长相关性状包括体重、体长、体高、体宽。
3.如权利要求1-2任一项所述的东星斑分子溯源选择育种方法在鱼类选育工作中的应用；所述鱼类包括：东星斑、杉斑、虎斑和老鼠斑。
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