CN114397347B - 一种金刚石生物传感器及其检测ca19-9抗原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及一种利用金刚石生物传感器检测CA19‑9抗原的方法，包括下步骤：S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在0‑10℃下浸泡金刚石生物传感器10min～5h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层；S2、在源极和漏极之间的特异性抗体层上滴加缓冲溶液稀释后的CA19‑9抗原，并在0‑10℃下培养，CA19‑9抗原和特异性抗体在缓冲溶液中进行反应；S3、给参比电极施加栅源电压，给漏极施加漏源电压，测试并对比特异性抗体层表面上滴加抗原前后场效应晶体管的转移特性曲线。解决了ELISA法成本高昂，反应过程复杂，检测时间长的问题。

Description

一种金刚石生物传感器及其检测CA19-9抗原的方法
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及一种金刚石生物传感器及其检测CA19-9抗原的方法。
背景技术
糖类抗原19-9(Carbohydrate antigen19-9，CA19-9)作为一种低聚糖肿瘤相关抗原，是胰腺癌敏感性最高，特异性最好的血清肿瘤标志物，对胰腺癌的早期诊断具有良好的临床价值，人体的正常参考范围为0～37U/mL。传统的电化学发光免疫分析(ECLIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)法，存在反应步骤冗杂、检测效率低下等不足，因此，迫切需要一种简单高效，结果准确，特异性强的检测机制来探测人体血液中CA19-9的含量，从而对胰腺癌的早期预诊做出判断。
对于酶联免疫吸附测定法(ELISA)而言，通过抗原与抗体的特异性反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。作为一项免疫检验技术，其具有一定的局限性，不但所检测的生物学体液样本如血清中有可能存在各种干扰实验的因素，而且在实验过程中，尤其是进行手工的ELISA测定时，涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断等，其中任一步骤的操作不当都会影响测定结果，尤其是加样、温育和洗板等步骤。此外，在定性ELISA测定中，阳性判定值(CUT-OFF)的建立，是在一定的统计学基础上的，相对于某个具体的受检者来说，其有可能并不具备正确性。且在现有技术下，酶联免疫吸附测定法(ELISA)成本高昂，反应过程复杂，需要医护人员花费大量时间去处理待测样本，检测时间长，得出结果慢。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金刚石生物传感器及其检测CA19-9抗原的方法，解决了ELISA法成本高昂，反应过程复杂，检测时间长的问题。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在0-10℃下浸泡金刚石生物传感器10min～5h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层；
S2、在金刚石生物传感器的源极和漏极之间的特异性抗体层上滴加缓冲溶液稀释后的CA19-9抗原，并在0-10℃下培养，CA19-9抗原和特异性抗体在缓冲溶液中进行反应；
S3、给参比电极施加栅源电压，给漏极施加漏源电压，测试并对比特异性抗体层表面上滴加抗原前后金刚石生物传感器的转移特性曲线。
进一步，特异性抗体为1-100μg/mL的CA19-9抗体，CA19-9抗原的浓度为0.001U/mL-1000U/mL。
进一步，S1中的缓冲溶液为保持酶活性的中性磷酸盐溶液。
进一步，金刚石生物传感器是利用金刚石场效应晶体管制备得到，金刚石场效应晶体管包括源极和漏极，金刚石生物传感器的制备包括以下步骤：
S1.1、从金刚石场效应晶体管的源极和漏极引出导线，并利用绝缘材料对源极和漏极进行包裹，在源极和漏极上形成绝缘层；
S1.2、用偶联试剂在0～10℃下浸泡金刚石场效应晶体管1h～2h，完成偶联分子在金刚石表面的固定，得到金刚石生物传感器。
进一步，S1.2中的偶联试剂是用甲醇溶解的Pyr-NHS溶液。
进一步，金刚石场效应晶体管的制备具体包括以下步骤：
在金刚石衬底表面沉积金属层，形成源极和漏极；
遮盖位于金刚石衬底表面上源极和漏极之间的部分，并进行电学隔离，然后清洗，得到金刚石场效应晶体管。
进一步，依次利用图形化处理、金属沉积及剥离沉积金属层。
进一步，源极和漏极的材质为Pt、Pd、Ir、Au和Ti其中的一种金属或多种金属的组合。
进一步，源极和漏极的厚度大于10nm；
源极和漏极之间的导电通道宽度大于1μm，长度为大于1μm；
金刚石衬底为氢终端金刚石，厚度大于10nm，隔离后的金刚石衬底为电阻率大于1MΩ·cm的相对绝缘体。
本发明还公开了实现所述检测方法的一种金刚石生物传感器，包括金刚石衬底、参比电极、源极和漏极，源极和漏极对称设置在金刚石衬底表面上；源极和漏极分别引出，参比电极用于施加栅压；
源极和漏极之间形成导电通道；
源极和漏极外包裹有绝缘层；
在导电通道上包覆有偶联层，在偶联层上包覆有特异性抗体层。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开了一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9的方法，在源极和漏极之间的特异性抗体层上滴加缓冲溶液稀释后的CA19-9抗原，并在低温条件下培养，使得CA19-9抗原和特异性抗体在缓冲溶液中进行充分反应；特异性抗体为1-100μg/mL的CA19-9抗体，CA19-9抗原浓度为0.001U/mL-1000U/mL；一般从患者血清中提取的抗原浓度较高，需要稀释；其次本发明的生物传感器可以检测很低浓度的抗原，所以需要稀释不同数量级的浓度的抗原；给参比电极施加栅源电压，给漏极施加漏源电压，能够保证器件正常工作，且表面的抗原抗体不会失活。
由于抗原抗体在器件表面发生特异性反应，影响场效应晶体管(FET)的载流子浓度，最终器件的电学特性发生偏移，通过偏移来确定CA19-9的浓度，不像ELISA法，还需要等待显色反应的进行，以及比色的过程，才能确定待测物的浓度。本发明所提出的检测方法，不仅具有灵敏度高，反应时间短，操作简单等优点，且具有良好的重复性，可以进行多次检测，大大降低了成本。
进一步，本发明的金刚石生物传感器是利用金刚石场效应晶体管制备得到的，首次将偶联试剂作为偶联分子来修饰金刚石表面，偶联分子与金刚石表面结合，并和抗体分子链接在一起。此过程将偶联分子和抗体分子较为均匀地修饰在了金刚石表面，引起金刚石表面在原子力显微镜(AFM)下的形貌发生明显变化。AFM测试中器件表面Rq随着偶联分子的修饰和抗体分子的固定逐渐增大，表面突起的小颗粒表明偶联试剂和抗体在金刚石表面较为均匀的分布。本发明将抗原抗体的特异性反应和金刚石电子器件结合起来，通过偶联试剂将抗体分子固定在器件表面，由于抗原抗体在器件表面发生特异性反应，影响场效应晶体管(FET)的载流子浓度，最终器件的电学特性发生偏移，通过偏移来确定CA19-9的浓度。
进一步，偶联分子采用1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯(Pyr-NHS)，偶联分子Pyr-NHS通过π-π键与金刚石表面结合，并通过自身的氨基官能团和抗体分子的羧基官能团通过脱水缩合反应链接在一起。该偶联分子处理方式简单，而且从AFM结果来看，修饰效果较好，表面修饰比例高，分布均匀。
本发明公开了一种金刚石场效应晶体管生物传感器，包括金刚石衬底和参比电极；金刚石衬底上设有源极和漏极，并用环氧树脂包裹；源漏电极之间的导电通道被偶联试剂修饰：偶联试剂上方固定有特异性抗体，CA19-9抗原和特异性抗体发生特异性反应后联接在抗体上；参比电极，CA19-9抗原和特异性抗体，源漏之间的导电通道，均浸入在缓冲溶液中；源极、漏极分别引出，参比电极用来施加栅压。本发明采用金刚石场效应晶体管，实现CA19-9抗原的检测，为胰腺癌的早期诊断提供了一种新的生物传感器。
附图说明
图1为一种基于金刚石的CA19-9抗原的检测原理图；
图2-1为在衬底上沉积金属后的结构图；
图2-2为图2-1的俯视图；
图3为电学隔离后的金刚石场效应晶体管的结构示意图；
图4-1为在源级和漏极上包裹环氧树脂的结构示意图；
图4-2为图4-1的俯视图；
图5为偶联分子在金刚石表面固定的结构示意图；
图6为特异性抗体在偶联层表面修饰后的结构示意图；
图7为抗原滴加后的结构示意图；
图8为不同阶段金刚石FET表面的AFM表征图，(a)图中裸露的金刚石表面均方根粗糙度Rq＝1.00nm；(b)图中修饰完偶联试剂Pyr-NHS后Rq＝9.55nm；图(c)固定完抗体后Rq＝10.3nm；
图9为金刚石FET用于CA19-9的检测：图9(a)50μg/mL抗体修饰后金刚石FET的输出特性曲线；图9(b)不同浓度的CA19-9和50μg/mL抗体特异性结合后金刚石FET的转移特性曲线；图9(c)当IDS＝-120μA，CA19-9的浓度为0.001U/mL～1000U/mL时，转移特性曲线中的VGS变化；图9(d)VGS与CA19-9浓度对数的线性拟合。
其中，1为金刚石衬底，2为源极，3为漏极，4为参比电极，5为缓冲溶液，6为绝缘层，7为CA19-9抗原，8为偶联层，9为特异性抗体层。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
如图1所示，本发明提供了一种金刚石生物传感器，包括金刚石衬底1、参比电极4、源极2和漏极3，源极2和漏极3对称设置在金刚石衬底1表面上；源极2和漏极3分别引出，参比电极4用于施加栅压；源极2和漏极3之间形成导电通道；源极2和漏极3外包裹有绝缘层6；在导电通道上包覆有偶联层8，在偶联层8上包覆有特异性抗体层9。
衬底为氢终端金刚石衬底1；表面空穴迁移率为50-3000cm2/Vs，空穴浓度为1012-1014cm-2。
金刚石作为新型半导体材料的代表，具有其他半导体材料不可比拟的优异性质。金刚石的禁带宽度5.5eV、击穿电压大于10MV/cm、电子迁移率为2200cm2/V﹒s、空穴迁移率1600cm2/V﹒s；此外，金刚石具有耐腐蚀性强、化学稳定性高、良好的生物兼容性、宽的电位窗口，较低的背景电流，以及丰富的表面终端。因此，金刚石非常适宜于制备生物传感器用于生物分子的检测。和Si-基离子敏感型场效应晶体管(Si-ISFET)相比，金刚石FET的固液界面之间不需要厚重的介质层来抵挡溶液中杂质离子的入侵，待测溶液和金刚石表面直接接触，因此极大的提高了检测灵敏度。
源极2和漏极3的材质为Pt、Pd、Ir、Au、Ti等一种金属及多种金属的组合；源极2和漏极3的厚度为10nm-1000nm；源极2和漏极3可与金刚石衬底1形成欧姆接触；源极2和漏极3分别用环氧树脂包裹。
源极2和漏极3之间的导电通道宽度大于1μm，长度大于1μm。
偶联试剂可固定在金刚石表面，并通过化学键的形成来连接金刚石和特异性抗体。
本发明提供了一种金刚石生物传感器的制备方法，参照图2至图7，包括以下步骤：
1)对金刚石衬底1进行清洗，并吹干；
2)依次利用图形化技术、金属沉积技术、剥离技术在金刚石衬底1表面形成源极2和漏极3，如图2-1和图2-2所示；
3)遮盖金刚石衬底1表面源极2和漏极3之间的部分，并进行电学隔离，阻止溶液中的杂质离子对电极的破坏，然后清洗样品，得到隔离后的金刚石场效应晶体管，如图3所示；
4)利用导电银胶分别从源极2和漏极3引出导线，并用绝缘材料对源极2、漏极3进行包裹，如图4-1和图4-2所示；
绝缘材料可采用环氧树脂胶、丙烯酸酯树脂胶或有机硅胶。
5)用偶联试剂在0-7℃下浸泡金刚石场效应晶体管1-2h，完成偶联分子在金刚石表面的固定，如图5所示，得到所述的金刚石生物传感器。
偶联试剂是用甲醇溶解的Pyr-NHS溶液。
其中，步骤3)所述的电学隔离是对氢终端金刚石衬底1的裸露表面处理，并使其绝缘电阻率大于1MΩ·cm。
其中，步骤6)中的缓冲溶液为保持酶活性的中性缓冲盐溶液(pH 6-8)，偶联试剂可固定在金刚石表面，并通过化学键的形成来连接金刚石和特异性抗体。
该生物传感器用于检测CA19-9抗原，具体过程为：
如图6所示，用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在0-10℃下浸泡金刚石生物传感器10min～5h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层9；
在源极2和漏极3之间的部分滴加缓冲溶液稀释后的CA19-9抗原7，并在0-7℃下培养，使得CA19-9抗原7和特异性抗体进行充分反应，如图7所示；
如图1所示，给参比电极4施加200mV至-800mV的栅源电压，给漏极3施加-500～-1000mV的漏源电压，测试并对比场效应晶体管滴加抗原前后的转移特性曲线来检测CA19-9抗原7的含量。
缓冲溶液为保持酶活性的中性缓冲盐溶液(pH 6-8)，特异性抗体为1-100μg/mL的CA19-9抗体，CA19-9抗原7浓度为0.001U/mL-1000U/mL。
实施例1
一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在0℃下浸泡金刚石生物传感器10min，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层9；
S2、在源极2和漏极3之间的部分滴加磷酸盐溶液稀释后的CA19-9抗原7，该抗原浓度为0.001U/mL，并在0℃条件下培养，使得CA19-9抗原7和特异性抗体进行充分反应；
S3、给参比电极4施加200mV至-800mV的栅源电压，给漏极3施加-800mV的漏源电压，测试并对比样品表面滴加抗原前后场效应晶体管的转移特性曲线来检测CA19-9抗原7。
实施例2
一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在4℃下浸泡金刚石生物传感器30min，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层9；
S2、在源极2和漏极3之间的部分滴加磷酸盐溶液稀释后的CA19-9抗原7，该抗原浓度为0.01U/mL，并在4℃条件下培养，使得CA19-9抗原7和特异性抗体进行充分反应；
S3、给参比电极4施加200mV至-800mV的栅源电压，给漏极3施加-800mV的漏源电压，测试并对比样品表面滴加抗原前后场效应晶体管的转移特性曲线来检测CA19-9抗原7。
实施例3
一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在7℃下浸泡金刚石生物传感器1h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层9；
S2、在源极2和漏极3之间的部分滴加磷酸盐溶液稀释后的CA19-9抗原7，该抗原浓度为0.1U/mL，并在7℃条件下培养，使得CA19-9抗原7和特异性抗体进行充分反应；
S3、给参比电极4施加200mV至-800mV的栅源电压，给漏极3施加-800mV的漏源电压，测试并对比样品表面滴加抗原前后场效应晶体管的转移特性曲线来检测CA19-9抗原7。
实施例4
一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在10℃下浸泡金刚石生物传感器2h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层9；
S2、在源极2和漏极3之间的部分滴加磷酸盐溶液稀释后的CA19-9抗原7，该抗原浓度为1U/mL，并在10℃条件下培养，使得CA19-9抗原7和特异性抗体进行充分反应；
S3、给参比电极4施加200mV至-800mV的栅源电压，给漏极3施加-800mV的漏源电压，测试并对比样品表面滴加抗原前后场效应晶体管的转移特性曲线来检测CA19-9抗原7。
实施例5
一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在4℃下浸泡金刚石生物传感器3h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层9；
S2、在源极2和漏极3之间的部分滴加磷酸盐溶液稀释后的CA19-9抗原7，该抗原浓度为10U/mL，并在4℃条件下培养，使得CA19-9抗原7和特异性抗体进行充分反应；
S3、给参比电极4施加200mV至-800mV的栅源电压，给漏极3施加-800mV的漏源电压，测试并对比样品表面滴加抗原前后场效应晶体管的转移特性曲线来检测CA19-9抗原7。
实施例6
一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在4℃下浸泡金刚石生物传感器4h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层9；
S2、在源极2和漏极3之间的部分滴加磷酸盐溶液稀释后的CA19-9抗原7，该抗原浓度为100U/mL，并在4℃条件下培养，使得CA19-9抗原7和特异性抗体进行充分反应；
S3、给参比电极4施加200mV至-800mV的栅源电压，给漏极3施加-800mV的漏源电压，测试并对比样品表面滴加抗原前后场效应晶体管的转移特性曲线来检测CA19-9抗原7。
实施例7
一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在4℃下浸泡金刚石生物传感器5h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层9；
S2、在源极2和漏极3之间的部分滴加磷酸盐溶液稀释后的CA19-9抗原7，该抗原浓度为1000U/mL，并在4℃条件下培养，使得CA19-9抗原7和特异性抗体进行充分反应；
S3、给参比电极4施加200mV至-800mV的栅源电压，给漏极3施加-800mV的漏源电压，测试并对比样品表面滴加抗原前后场效应晶体管的转移特性曲线来检测CA19-9抗原7。
如图9所示，(a)图为金刚石FET器件表面抗体浓度为50μg/mL时器件的输出特性曲线，表明器件在修饰完成后具有良好的场效应晶体管特性，最大输出电流为-454.6μA；(b)图为不同浓度的CA19-9抗原7在金刚石表面和抗体发生特异性反应后，金刚石FET的转移曲线向负方向偏移，当抗原浓度分别为0.001U/mL，0.01U/mL，0.1U/mL；1U/mL；10U/mL；100U/mL；1000U/mL时，转移曲线偏移量为142.27mV，174.88mV，266.76mV，-308.26mV，-355.68mV，-382.35mV，-542.41mV，此时所对应的VGS的值分别为-372.18mV，-404.79mV，-496.67mV，-538.17mV，-585.59mV，-612.26mV，-772.32mV，这些值被总结在了图(c)中，固定IDS＝-120μA，分析VGS与CA19-9抗原7浓度的对数之间的关系。由图(d)中VGS与CA19-9抗原7浓度对数的拟合曲线可以得到，转移曲线中的VGS与Log(CA19-9浓度)呈现良好的线性关系，拟合优度R2＝0.97，曲线斜率为-50.98mV/Log(CA19-9浓度)。
结果表明：金刚石FET对于CA19-9抗原7的检测可由式：VGS＝-50.98Log(CA19-9浓度)-680.04(mV)得到。综上，该器件不仅具有宽的检测范围0.001U/mL～1000U/mL，极低的检测浓度0.001U/mL，且具有良好的重复性，可在实际应用中多次重复利用。

Claims (7)

1.一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，其特征在于，包括下步骤：
S1、用缓冲溶液稀释后的特异性抗体在0-10℃下浸泡金刚石生物传感器10min～5h，完成特异性抗体在金刚石表面的修饰，得到特异性抗体层(9)；
S2、在金刚石生物传感器的源极(2)和漏极(3)之间的特异性抗体层(9)上滴加缓冲溶液稀释后的CA19-9抗原(7)，并在0-10℃下培养，CA19-9抗原(7)和特异性抗体在缓冲溶液中进行反应；
金刚石生物传感器是利用金刚石场效应晶体管制备得到，金刚石场效应晶体管包括源极(2)和漏极(3)，金刚石生物传感器的制备包括以下步骤：
S1.1、从金刚石场效应晶体管的源极(2)和漏极(3)引出导线，并利用绝缘材料对源极(2)和漏极(3)进行包裹，在源极(2)和漏极(3)上形成绝缘层(6)；
S1.2、用偶联试剂在0～10℃下浸泡金刚石场效应晶体管1h～2h，完成偶联分子在金刚石表面的固定，得到金刚石生物传感器；
S1.2中的偶联试剂是用甲醇溶解的Pyr-NHS溶液；偶联分子通过π-π键与金刚石表面结合，并通过自身的氨基官能团和抗体分子的羧基官能团通过脱水缩合反应链接在一起；
S3、给参比电极(4)施加栅源电压，给漏极(3)施加漏源电压，测试并对比特异性抗体层(9)表面上滴加抗原前后金刚石生物传感器的转移特性曲线；
金刚石场效应晶体管的制备具体包括以下步骤：
在金刚石衬底(1)表面沉积金属层，形成源极(2)和漏极(3)；
遮盖位于金刚石衬底(1)表面上源极(2)和漏极(3)之间的部分，并进行电学隔离，然后清洗，得到金刚石场效应晶体管；
金刚石衬底(1)为氢终端金刚石。
2.根据权利要求1所述的一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，其特征在于，特异性抗体为1-100μg/mL的CA19-9抗体，CA19-9抗原(7)的浓度为0.001U/mL-1000U/mL。
3.根据权利要求1所述的一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，其特征在于，S1中的缓冲溶液为保持酶活性的中性磷酸盐溶液。
4.根据权利要求1所述的一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，其特征在于，依次利用图形化处理、金属沉积及剥离沉积金属层。
5.根据权利要求1所述的一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，其特征在于，源极(2)和漏极(3)的材质为Pt、Pd、Ir、Au和Ti其中的一种金属或多种金属的组合。
6.根据权利要求1所述的一种利用金刚石生物传感器检测CA19-9抗原的方法，其特征在于，源极(2)和漏极(3)的厚度大于10nm；
源极(2)和漏极(3)之间的导电通道宽度大于1μm，长度为大于1μm；
金刚石衬底(1)厚度大于10nm，隔离后的金刚石衬底(1)为电阻率大于1MΩ·cm的相对绝缘体。
7.实现权利要求1～6任意一项所述检测方法的一种金刚石生物传感器，其特征在于，包括金刚石衬底(1)、参比电极(4)、源极(2)和漏极(3)，源极(2)和漏极(3)对称设置在金刚石衬底(1)表面上；源极(2)和漏极(3)分别引出，参比电极(4)用于施加栅压；
源极(2)和漏极(3)之间形成导电通道；
源极(2)和漏极(3)外包裹有绝缘层(6)；
在导电通道上包覆有偶联层(8)，在偶联层(8)上包覆有特异性抗体层(9)。
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