CN114365686A - 一种生物监测用苔藓的培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物监测用苔藓的培育方法，包括：采集整块苔藓，剪去苔藓假根，对采集的整块苔藓进行第一次过筛后，进行第一次播种；剪去第一次播种后长出苔藓的假根，进行第二次过筛，准备进行第二次播种；制备苔藓培养液，使用苔藓培养液对苔藓进行第二次播种、培育，获得原丝体；制作苔藓附着基质和附着基质骨架；将步骤二获得的原丝体播种附着在苔藓附着基质上，原丝体在苔藓附着基质上分化产生配子体，配子体在苔藓附着基质上生长为目标苔藓。本发明培育的生物监测用苔藓，对环境中的微塑料敏感度高，可有效对环境中的微塑料进行监测，可以作为优先的环境微塑料污染指示植物。

Description

一种生物监测用苔藓的培育方法
技术领域
本发明属于环境保护和苔藓培植技术领域，更具体地说，本发明涉及一种生物监测用苔藓的培育方法。
背景技术
1907年贝克兰发现酚醛树脂，开启了塑料时代的大门，但同时伴随而来的是大量塑料垃圾在环境中堆积，潜在威胁着人类健康及生态系统的功能[1]。现有生产的塑料超过80％都是通过聚合低分子单体(如乙烯和丙烯)变成高分子量链的热塑性聚合物，常用的塑料极少是可生物降解的，因此它们可在填埋场或自然环境中积累可存在数百年甚至几千年，在大气、海洋、土壤、淡水等自然环境中广泛存在。在自然条件下，特别是太阳辐射、洋流及与船只和生物的相互作用，塑料制品会缓慢降解并破碎成较小的颗粒，通常将小于5mm的塑料颗粒、碎片、纤维、发泡、薄膜等称为微塑料，主要成分包括聚丙烯(Polypropylene，PP)、聚乙烯(Polyethylene,PE)、聚氯乙烯(Polyvinyl chloride,PVC)、聚苯乙烯(Polystyrene,PS)等，其中PP和PE微塑料的占比约一半。据估计，目前环境中已经大约存在83亿吨的原生塑料，到2050年将产生120亿吨的塑料垃圾将被填埋和释放至自然环境中。在海鲜食品、食用盐、饮用水及深海极地均有不同浓度的检出，甚至在人类胎盘中也发现微塑料的踪影。而现有大量研究表明，次生塑料在分解成微塑料的过程中常伴随着添加剂的释放，如增塑剂、双酚类、邻苯二甲酸酯类等，这些添加剂通常是有毒的亲脂性物质，能穿透细胞膜进入细胞，参与细胞内的生化反应，甚至对人体的生殖系统产生不可逆的影响。同时微塑料比表面积大、疏水性强，常作为环境中毒性污染物的载体，且微塑料携带的污染物浓度通常比环境中检测到的高几个数量级，形成毒性更强的复合污染物。微塑料由于粒径小极易被生物误食或吸收，进入到生物体内的微塑料可以将其携带的污染物和添加剂解吸并转移到生物的组织中，且浓度比实验沉积物的浓度高326％-3770％，此浓度足以破坏与健康和生物多样性有关的生态生理功能，微塑料的这种破坏程度高度依赖微塑料种类。微塑料污染已经成为当今世界亟待解决的全球性问题，因此对环境中微塑料的监测具有重要的战略意义。
苔藓植物常被用做环境中微量元素重金属、持久性有机污染物及颗粒物的生物监测，且苔藓植物对环境污的反应敏感程度是种子植物的10倍。最新两篇研究报道了苔藓植物可以吸收环境中的微塑料，为环境中微塑料的生物监测方法提供了新的应用前景。2018年，Capozzi首次展示了泥炭藓S.palustr在水环境中捕获和保留聚苯乙烯纳米颗粒的能力，且不论其活性如何。2020年，Roblin在所有塔藓Hylocomium splendens样品中都观察到了人为的微纤维(MF)，平均数量为24mf/g干重(范围15-30mf/g)，MF平均长度为1.02mm，其研究结果表明，苔藓可能是大气中MF(和微塑料)沉降的有用生物监测指标。然而，在自然环境及复杂基质中分离、提取及识别微塑料是一项极具挑战性的工作，目前仍无微塑料检测的统一方法，不同实验数据间的可比性小，且现有微塑料检测可能存在更多未被检测到的粒径较小的微塑料，但这些小粒径的微塑料颗粒可能更具有生物学意义。在这种情况下，利用苔藓植物的高敏感性，检测苔藓植物对微塑料的生理响应，以预警环境质量的变化，这对于环境微塑料污染的防治具有非常重要的意义。
生物监测可被定义为利用生物有机体和生物材料(生物监测器)来定量地反映了它们的环境条件，以获取关于环境的某些特征的信息[38]。目前已有多种生物监测材料用于环境污染物的监测，如苔藓、地衣、蕨类、草、树皮和年轮、树叶和针叶等。其中苔藓植物由于其独特的形态和生理特征，可以将污染物集中于它们的组织中，有效积累环境中的污染物，分析苔藓植物组织中污染物浓度，既可以估计污染物来源、种类、空间分布(局部和区域)，也可以评估污染物在大气中沉降的时间趋势，因此苔藓植物被广泛用作环境污染的生物传感器[41]。国内外研究应用于环境监测的苔藓植物主要包括大灰藓(Hypnum plumaeformeWils)、密叶绢藓(Entodon compressus)、短枝羽藓(Thuidium delicatulum)、山羽藓(Abietinella abietina)、泥炭藓(Sphagnum palustre)、塔藓(Hylocomium splendens)等，但不同的苔藓对污染物吸附能力存在差异，且苔藓植物的生长高度和形态的不同，对污染物的相对敏感度和滞留能力也不同。
为了提高苔藓对微塑料的监测能力，进而判断环境中有害微塑料污染的严重程度，需要培育一种敏感度高的生物监测苔藓。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种生物监测用苔藓的培育方法，包括：
步骤一、采集整块苔藓，剪去苔藓假根，对采集的整块苔藓进行第一次过筛后，进行第一次播种；剪去第一次播种后长出苔藓的假根，进行第二次过筛，准备进行第二次播种；
步骤二、制备苔藓培养液，使用苔藓培养液对苔藓进行第二次播种、培育，获得原丝体；
步骤三、制作苔藓附着基质和附着基质骨架；
步骤四、将步骤二获得的原丝体播种附着在苔藓附着基质上，原丝体在苔藓附着基质上分化产生配子体，配子体在苔藓附着基质上生长为目标苔藓。
优选的是，其中，所述步骤一中，苔藓为大灰藓；第一次过筛目数为300～500目，第二次过筛目数为500～600目；采集的整块苔藓的大小为25cm×30cm～60cm×90cm。
优选的是，其中，所述步骤二中，培养液的制备方法包括以下步骤：
步骤S21、按重量份，称取1～4份七水硫酸镁，12～15份四水硝酸钙，2～4份硝酸钾，1～2份五水β甘油磷酸钠，10～40份三羟甲基甲胺基丙磺酸，0.1～02份乙二胺四乙酸二钠，0.2份的六水氯化铁以及1～5份硼酸；将上述物质加入至110～150份的去离子水中，搅拌混合均匀，使用紫外线进行杀菌处理，杀菌时间为33～40min，得到培养液A；
步骤S22、按重量份，称取5～8份的干海藻，1～2份香樟叶和3～7份松针，用去离子水将干海藻、香樟叶和松针清洗干净后，混合粉碎，得到混合粉状物，加入36份的去离子水，将混合粉状物搅拌为糊状后，加入至培养液A中搅拌混合均匀，在20～28℃下保温24h，培养液制备完成。
优选的是，其中，所述步骤三中，苔藓附着基质的制作方法包括以下步骤：
步骤S31、按重量份，称取50～60份硅藻土，1.2～2份椰糠，10～13份泥炭土，2～4份苯甲酸钠，0.1～0.3份四水氯化锰，0.1～0.2份二水钼酸钠，18份三水磷酸氢二钾，22份碳酸钠15份五水硫酸铜；将硅藻土和泥炭土分别粉碎后，混合搅拌均匀，得到混合土，然后将椰糠、苯甲酸钠、四水氯化锰、二水钼酸钠、三水磷酸氢二钾、碳酸钠和五水硫酸铜分别与混合土混合搅拌均匀，得到基质土，将基质土压平为平板状，得到基质土层；
步骤S32、裁剪与基质土层尺寸相同的海绵层和毛毡布，将毛毡布置于海绵层的上表面，用针线将毛毡布和海绵层的四个对齐的边缘缝合，然后将步骤S31得到的基质土层放在毛毡布的上表面，得到苔藓附着基质；
步骤S33、使用致密的魔芋-三氧化二铝膜对苔藓附着基质的四个侧面和底面进行包裹，包裹苔藓附着基质底面的魔芋-三氧化二铝膜预先挖出多个小孔，小孔中漏出部分海绵层。
优选的是，其中，所述步骤三中，附着基质骨架的结构包括：
封闭结构的水槽，其侧面设置有注水口，所述水槽的上端开设有多个与苔藓附着基质的小孔等大的通孔；
苔藓放置台，其设置在所述水槽的上方，所述苔藓放置台与水槽之间固定设置有四根支撑柱；所述苔藓放置台的上开设有多个圆孔，所述苔藓附着基质放置在苔藓放置台上，且小孔、圆孔和通孔一一对齐；
所述水槽的通孔与苔藓放置台的圆孔之间设置有海绵柱，所述海绵柱的上端伸入至水槽中，海绵柱的上端与海绵层的底部相接触，所述海绵柱的外部套设有外壳，外壳的材质为魔芋-三氧化二铝膜。
优选的是，其中，所述魔芋-三氧化二铝膜的制备方法包括以下步骤：
步骤S41、按重量份，称取14～20份魔芋精粉，3.5～7份改性纳米三氧化二铝粉末，1～1.5份壳聚糖，2～3份蔗糖酯，将魔芋精粉溶解于200mL无水乙醇中，在150rpm的转速下搅拌40min得到悬浊液；
步骤S42、向悬浊液中加入壳聚糖和蔗糖酯，搅拌混合后得到混合悬浊液，对混合悬浊液进行离心，离心时间20～25min，离心转速为3200～6000rpm；离心后静置待混合悬浊液分层，从混合悬浊液中分离出上层液；
步骤S43、将改性纳米三氧化二铝粉末加入至90份的蒸馏水中，搅拌混合得到悬浮液，使用超声分散仪对混合悬浮液进行超声分散，分散时间设置在30min以上，得到混合添加液；将混合添加液与步骤S42得到的上层液进行混合，超声分散15min，得到魔芋-三氧化二铝膜粗液，将魔芋-三氧化二铝膜粗液涂覆在玻璃板表面，干固后得到魔芋-三氧化二铝膜；制得的魔芋-三氧化二铝膜裁切加工用于包裹苔藓附着基质和包裹海绵柱。
优选的是，其中，所述改性纳米三氧化二铝粉末的改性方法包括：称取10～15份三氧化二铝粉末，使用高能球磨机将三氧化二铝粉末研磨为0.1～0.8微米粒径的纳米粉末；将制得的纳米三氧化二铝粉末放入300～400份的去离子水中，搅拌3h后；向其中加入NaOH溶液和甲醇，调节溶液pH至10，然后倒入0.6～1.7份的乙烯基三乙氧基硅烷，混合搅拌4h后，使用高速剪切分散机对混合溶液进行高速分散，高速剪切分散机的转速设定为4200rpm，剪切分散时间为15～30min；
将高速剪切后的纳米三氧化二铝溶液进行加热，蒸发完其中的水分，得到纳米三氧化二铝固体颗粒，对纳米三氧化二铝固体颗粒在400～600℃下进行煅烧，煅烧时间为2h；
将煅烧后纳米三氧化二铝固体颗粒研磨粉碎为纳米三氧化二铝粉末，研磨粒径为13～50nm，研磨介质为石英砂。
优选的是，其中，所述步骤四中，配子体在苔藓附着基质上进行培育时，培养条件为白天光照培养10h，夜间培养14h，光照强度为3000lux，培养温度为20～22℃。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)本发明培育的生物监测用苔藓，在PE、PP、PVC影响下，测定苔藓(大灰藓)的MDA(丙二醛)含量、Pro(脯氨酸)含量、T-SOD(抗氧化酶)活力、POD(过氧化物酶)活力、CAT(过氧化氢酶)活力、GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)活力的变化，表面使用本发明培育的大灰藓对环境中的微塑料敏感度高，可有效对环境中的微塑料进行监测，可以作为优先的环境微塑料污染指示植物；
(2)本发明在用原丝体培育目标苔藓时，先对采集的苔藓进行了两次培育，并进行了过筛，以去除自然原生苔藓中的塑料颗粒，避免了塑料颗粒对原丝体、配子体以及后续苔藓生长过程中产生影响，确保了后续测定结果的准确性；同样，为了避免配子体培育过程中接触塑料微粒，对测定结果造成影响，本发明使用魔芋-三氧化二铝膜对苔藓附着基质进行包裹，使用魔芋-三氧化二铝膜制成的外壳对海绵柱进行包裹，这种设置方式在苔藓生长为成熟体前，有效隔绝了苔藓吸收、接触微塑料颗粒，确保了采用成熟体苔藓作为监测微塑料颗粒时测定结果的准确性；
(3)本发明在培育苔藓时，为了确保有效隔绝外界的微塑料颗粒，制备了不含高聚物塑料的魔芋-三氧化二铝膜，制备的魔芋-三氧化二铝膜具有致密、轻薄的优点，能够对苔藓附着基质和海绵柱进行有效包裹，对外界的微塑料进行有效隔绝。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明提供的苔藓附着基质和附着基质骨架的结构示意图；
图2为测定实施例1培养得到的大灰藓的MDA含量图；
图3为测定实施例1培养得到的大灰藓的Pro含量图；
图4为测定实施例2培养得到的大灰藓的T-SOD含量图；
图5为测定实施例2培养得到的大灰藓的POD含量图；
图6为测定实施例3培养得到的大灰藓的CAT含量图；
图7为测定实施例3培养得到的大灰藓的GSH-PX含量图；
图8为经对照组(去离子水)处理的大灰藓SEM扫描电镜图；
图9为经PE微塑料悬浮液处理的大灰藓SEM扫描电镜图；
图10为经PP微塑料悬浮液处理的大灰藓SEM扫描电镜图；
图11为经PVC微塑料悬浮液处理的大灰藓SEM扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本实施例的一种生物监测用苔藓的培育方法，包括以下步骤：
步骤一、采集尺寸大小为25cm×30cm的大灰藓，剪去大灰藓假根，对采集的大灰藓进行第一次过筛，过筛目数为300目，进行第一次播种；剪去第一次播种后长出大灰藓的假根，进行第二次过筛，过筛目数为500目；
步骤二、制备苔藓培养液，使用苔藓培养液对苔藓进行第二次播种、培育，获得原丝体；其中，苔藓培养液的制备方法包括以下步骤：
步骤S21、按重量份，称取1g七水硫酸镁，12g四水硝酸钙，2g硝酸钾，1g五水β甘油磷酸钠，10g三羟甲基甲胺基丙磺酸，0.1g乙二胺四乙酸二钠，0.2g的六水氯化铁以及1g硼酸；将上述物质加入至110mL的去离子水中，搅拌混合均匀，使用紫外线进行杀菌处理，杀菌时间为33min，得到培养液A；
步骤S22、按重量份，称取5g干海藻，1g香樟叶和3g松针，用去离子水将干海藻、香樟叶和松针清洗干净后，混合粉碎，得到混合粉状物，加入36mL的去离子水，将混合粉状物搅拌为糊状后，加入至培养液A中搅拌混合均匀，在20℃下保温24h，培养液制备完成；
步骤三、制作苔藓附着基质和附着基质骨架；其中苔藓附着基质的制作方法包括以下步骤：
步骤S31、按重量份，称取50g硅藻土，1.2g椰糠，10g泥炭土，2g苯甲酸钠，0.1g四水氯化锰，0.1g二水钼酸钠，18g三水磷酸氢二钾，22g碳酸钠15g五水硫酸铜；将硅藻土和泥炭土分别粉碎后，混合搅拌均匀，得到混合土，然后将椰糠、苯甲酸钠、四水氯化锰、二水钼酸钠、三水磷酸氢二钾、碳酸钠和五水硫酸铜分别与混合土混合搅拌均匀，得到基质土，将基质土压平为平板状，得到基质土层13；
步骤S32、裁剪与基质土层尺寸相同的海绵层10和毛毡布11，将毛毡布11置于海绵层的上表面，用针线缝合毛毡布11和海绵层10的四个对齐的边缘，然后将步骤S31得到的基质土层13放在毛毡布11的上表面，得到苔藓附着基质；
步骤S33、使用致密的魔芋-三氧化二铝膜12对苔藓附着基质的四个侧面和底面进行包裹，包裹苔藓附着基质底面的魔芋-三氧化二铝膜12预先挖出多个小孔121，小孔121中漏出部分海绵层；
如图1所示，附着基质骨架的结构包括：
封闭结构的水槽1，其侧面设置有注水口101，所述水槽1的上端开设有多个与苔藓附着基质的小孔121等大的通孔102；
苔藓放置台2，其设置在所述水槽1的上方，所述苔藓放置台2与水槽1之间固定设置有四根支撑柱3；所述苔藓放置台2的上开设有多个圆孔201，所述苔藓附着基质放置在苔藓放置台2上，且小孔121、圆孔201和通孔102一一对齐；
所述水槽1的通孔102与苔藓放置台2的圆孔201之间设置有海绵柱4，所述海绵柱4的上端伸入至水槽1中，海绵柱4的上端与海绵层10的底部相接触，所述海绵柱4的外部套设有外壳5，外壳5的材质为魔芋-三氧化二铝膜；
海绵柱4、海绵层10和毛毡布11构成了水槽1中的水向上流动的载体，为大灰藓生长适量的水分；同时，海绵层10和毛毡布11缝合为一个整体后，用于承载其上方的基质土层13和大灰藓，为大灰藓提供形成整块的生长区域；魔芋-三氧化二铝膜包裹苔藓附着基质和海绵柱，有效避免了大灰藓在长成成熟体前与微塑料进行接触，确保了测定结果的准确性。
魔芋-三氧化二铝膜的制备方法包括以下步骤：
步骤S41、按重量份，称取14g魔芋精粉，3.5g改性纳米三氧化二铝粉末，1g壳聚糖，2g蔗糖酯，将魔芋精粉溶解于200mL无水乙醇中，在150rpm的转速下搅拌40min得到悬浊液；
步骤S42、向悬浊液中加入壳聚糖和蔗糖酯，搅拌混合后得到混合悬浊液，对混合悬浊液进行离心，离心时间20min，离心转速为3200rpm；离心后静置待混合悬浊液分层，从混合悬浊液中分离出上层液；
步骤S43、将改性纳米三氧化二铝粉末加入至90mL的蒸馏水中，搅拌混合得到悬浮液，使用超声分散仪对混合悬浮液进行超声分散，分散时间设置在35min，得到混合添加液；将混合添加液与步骤S42得到的上层液进行混合，超声分散15min，得到魔芋-三氧化二铝膜粗液，将魔芋-三氧化二铝膜粗液涂覆在玻璃板表面，干固后得到魔芋-三氧化二铝膜；制得的魔芋-三氧化二铝膜裁切加工用于包裹苔藓附着基质和包裹海绵柱；
改性纳米三氧化二铝粉末的改性方法包括：称取10g三氧化二铝粉末，使用高能球磨机将三氧化二铝粉末研磨为0.1微米粒径的纳米粉末；将制得的纳米三氧化二铝粉末放入300mL的去离子水中，搅拌3h后；向其中加入NaOH溶液和甲醇，调节溶液pH至10，然后倒入0.6g的乙烯基三乙氧基硅烷，混合搅拌4h后，使用高速剪切分散机对混合溶液进行高速分散，高速剪切分散机的转速设定为4200rpm，剪切分散时间为15min；
将高速剪切后的纳米三氧化二铝溶液进行加热，蒸发完其中的水分，得到纳米三氧化二铝固体颗粒，对纳米三氧化二铝固体颗粒在400℃下进行煅烧，煅烧时间为2h；
将煅烧后纳米三氧化二铝固体颗粒研磨粉碎为纳米三氧化二铝粉末，研磨粒径为13nm，研磨介质为石英砂；
步骤四、将步骤二获得的大灰藓原丝体播种附着在苔藓附着基质上，原丝体在苔藓附着基质上分化产生配子体，配子体在苔藓附着基质上生长为目标苔藓，配子体在苔藓附着基质上进行培育时，培养条件为白天光照培养10h，夜间培养14h，光照强度为3000lux，培养温度为20℃。
实施例2
本实施例的一种生物监测用苔藓的培育方法，包括以下步骤：
步骤一、采集尺寸大小为30cm×70cm的大灰藓，剪去大灰藓假根，对采集的大灰藓进行第一次过筛，过筛目数为400目，进行第一次播种；剪去第一次播种后长出大灰藓的假根，进行第二次过筛，过筛目数为500目；
步骤二、制备苔藓培养液，使用苔藓培养液对苔藓进行第二次播种、培育，获得原丝体；其中，苔藓培养液的制备方法包括以下步骤：
步骤S21、按重量份，称取2g七水硫酸镁，13g四水硝酸钙，3g硝酸钾，2g五水β甘油磷酸钠，20g三羟甲基甲胺基丙磺酸，0.2g乙二胺四乙酸二钠，0.2g的六水氯化铁以及3g硼酸；将上述物质加入至130mL的去离子水中，搅拌混合均匀，使用紫外线进行杀菌处理，杀菌时间为38min，得到培养液A；
步骤S22、按重量份，称取6g的干海藻，2g香樟叶和5g松针，用去离子水将干海藻、香樟叶和松针清洗干净后，混合粉碎，得到混合粉状物，加入36mL的去离子水，将混合粉状物搅拌为糊状后，加入至培养液A中搅拌混合均匀，在25℃下保温24h，培养液制备完成；
步骤三、制作苔藓附着基质和附着基质骨架；其中苔藓附着基质的制作方法包括以下步骤：
步骤S31、按重量份，称取55g硅藻土，1.8g椰糠，10g泥炭土，3.5g苯甲酸钠，0.2g四水氯化锰，0.2g二水钼酸钠，18g三水磷酸氢二钾，22g碳酸钠15g五水硫酸铜；将硅藻土和泥炭土分别粉碎后，混合搅拌均匀，得到混合土，然后将椰糠、苯甲酸钠、四水氯化锰、二水钼酸钠、三水磷酸氢二钾、碳酸钠和五水硫酸铜分别与混合土混合搅拌均匀，得到基质土，将基质土压平为平板状，得到基质土层；
步骤S32、裁剪与基质土层尺寸相同的海绵层和毛毡布，将毛毡布置于海绵层的上表面，用针线将毛毡布和海绵层的四个对齐的边缘缝合，然后将步骤S31得到的基质土层放在毛毡布的上表面，得到苔藓附着基质；
步骤S33、使用致密的魔芋-三氧化二铝膜对苔藓附着基质的四个侧面和底面进行包裹，包裹苔藓附着基质底面的魔芋-三氧化二铝膜预先挖出多个小孔，小孔中漏出部分海绵层；
附着基质骨架的结构与实施例1相同；
魔芋-三氧化二铝膜的制备方法包括以下步骤：
步骤S41、按重量份，称取18g魔芋精粉，5g改性纳米三氧化二铝粉末，1.5g壳聚糖，3g蔗糖酯，将魔芋精粉溶解于200mL无水乙醇中，在150rpm的转速下搅拌40min得到悬浊液；
步骤S42、向悬浊液中加入壳聚糖和蔗糖酯，搅拌混合后得到混合悬浊液，对混合悬浊液进行离心，离心时间为25min，离心转速为4000rpm；离心后静置待混合悬浊液分层，从混合悬浊液中分离出上层液；
步骤S43、将改性纳米三氧化二铝粉末加入至90mL的蒸馏水中，搅拌混合得到悬浮液，使用超声分散仪对混合悬浮液进行超声分散，分散时间设置在38min，得到混合添加液；将混合添加液与步骤S42得到的上层液进行混合，超声分散15min，得到魔芋-三氧化二铝膜粗液，将魔芋-三氧化二铝膜粗液涂覆在玻璃板表面，干固后得到魔芋-三氧化二铝膜；制得的魔芋-三氧化二铝膜裁切加工用于包裹苔藓附着基质和包裹海绵柱；
改性纳米三氧化二铝粉末的改性方法包括：称取12g三氧化二铝粉末，使用高能球磨机将三氧化二铝粉末研磨为0.4微米粒径的纳米粉末；将制得的纳米三氧化二铝粉末放入350mL的去离子水中，搅拌3h后；向其中加入NaOH溶液和甲醇，调节溶液pH至10，然后倒入1.5g的乙烯基三乙氧基硅烷，混合搅拌4h后，使用高速剪切分散机对混合溶液进行高速分散，高速剪切分散机的转速设定为4200rpm，剪切分散时间为25min；
将高速剪切后的纳米三氧化二铝溶液进行加热，蒸发完其中的水分，得到纳米三氧化二铝固体颗粒，对纳米三氧化二铝固体颗粒在550℃下进行煅烧，煅烧时间为2h；
将煅烧后纳米三氧化二铝固体颗粒研磨粉碎为纳米三氧化二铝粉末，研磨粒径为30nm，研磨介质为石英砂；
步骤四、将步骤二获得的大灰藓原丝体播种附着在苔藓附着基质上，原丝体在苔藓附着基质上分化产生配子体，配子体在苔藓附着基质上生长为目标苔藓，配子体在苔藓附着基质上进行培育时，培养条件为白天光照培养10h，夜间培养14h，光照强度为3000lux，培养温度为22℃。
实施例3
本实施例的一种生物监测用苔藓的培育方法，包括以下步骤：
步骤一、采集尺寸大小为60cm×90cm的大灰藓，剪去大灰藓假根，对采集的大灰藓进行第一次过筛，过筛目数为500目，进行第一次播种；剪去第一次播种后长出大灰藓的假根，进行第二次过筛，过筛目数为600目；
步骤二、制备苔藓培养液，使用苔藓培养液对苔藓进行第二次播种、培育，获得原丝体；其中，苔藓培养液的制备方法包括以下步骤：
步骤S21、按重量份，称取4g七水硫酸镁，15g四水硝酸钙，4g硝酸钾，2g五水β甘油磷酸钠，40g三羟甲基甲胺基丙磺酸，0.2g乙二胺四乙酸二钠，0.2g的六水氯化铁以及5g硼酸；将上述物质加入至150mL的去离子水中，搅拌混合均匀，使用紫外线进行杀菌处理，杀菌时间为40min，得到培养液A；
步骤S22、按重量份，称取8g的干海藻，2g香樟叶和7g松针，用去离子水将干海藻、香樟叶和松针清洗干净后，混合粉碎，得到混合粉状物，加入36mL的去离子水，将混合粉状物搅拌为糊状后，加入至培养液A中搅拌混合均匀，在28℃下保温24h，培养液制备完成；
步骤三、制作苔藓附着基质和附着基质骨架；其中苔藓附着基质的制作方法包括以下步骤：
步骤S31、按重量份，称取60g硅藻土，2g椰糠，13g泥炭土，4g苯甲酸钠，0.3g四水氯化锰，0.2g二水钼酸钠，18g三水磷酸氢二钾，22g碳酸钠15g五水硫酸铜；将硅藻土和泥炭土分别粉碎后，混合搅拌均匀，得到混合土，然后将椰糠、苯甲酸钠、四水氯化锰、二水钼酸钠、三水磷酸氢二钾、碳酸钠和五水硫酸铜分别与混合土混合搅拌均匀，得到基质土，将基质土压平为平板状，得到基质土层；
步骤S32、裁剪与基质土层尺寸相同的海绵层和毛毡布，将毛毡布置于海绵层的上表面，用针线将毛毡布和海绵层的四个对齐的边缘缝合，然后将步骤S31得到的基质土层放在毛毡布的上表面，得到苔藓附着基质；
步骤S33、使用致密的魔芋-三氧化二铝膜对苔藓附着基质的四个侧面和底面进行包裹，包裹苔藓附着基质底面的魔芋-三氧化二铝膜预先挖出多个小孔，小孔中漏出部分海绵层；
附着基质骨架的结构与实施例1相同；
魔芋-三氧化二铝膜的制备方法包括以下步骤：
步骤S41、按重量份，称取20g魔芋精粉，7g改性纳米三氧化二铝粉末，1.5g壳聚糖，3g蔗糖酯，将魔芋精粉溶解于200mL无水乙醇中，在150rpm的转速下搅拌40min得到悬浊液；
步骤S42、向悬浊液中加入壳聚糖和蔗糖酯，搅拌混合后得到混合悬浊液，对混合悬浊液进行离心，离心时间25min，离心转速为6000rpm；离心后静置待混合悬浊液分层，从混合悬浊液中分离出上层液；
步骤S43、将改性纳米三氧化二铝粉末加入至90mL的蒸馏水中，搅拌混合得到悬浮液，使用超声分散仪对混合悬浮液进行超声分散，分散时间设置在40min，得到混合添加液；将混合添加液与步骤S42得到的上层液进行混合，超声分散15min，得到魔芋-三氧化二铝膜粗液，将魔芋-三氧化二铝膜粗液涂覆在玻璃板表面，干固后得到魔芋-三氧化二铝膜；制得的魔芋-三氧化二铝膜裁切加工用于包裹苔藓附着基质和包裹海绵柱；
改性纳米三氧化二铝粉末的改性方法包括：称取15g三氧化二铝粉末，使用高能球磨机将三氧化二铝粉末研磨为0.8微米粒径的纳米粉末；将制得的纳米三氧化二铝粉末放入400mL的去离子水中，搅拌3h后；向其中加入NaOH溶液和甲醇，调节溶液pH至10，然后倒入1.7g的乙烯基三乙氧基硅烷，混合搅拌4h后，使用高速剪切分散机对混合溶液进行高速分散，高速剪切分散机的转速设定为4200rpm，剪切分散时间为30min；
将高速剪切后的纳米三氧化二铝溶液进行加热，蒸发完其中的水分，得到纳米三氧化二铝固体颗粒，对纳米三氧化二铝固体颗粒在600℃下进行煅烧，煅烧时间为2h；
将煅烧后纳米三氧化二铝固体颗粒研磨粉碎为纳米三氧化二铝粉末，研磨粒径为50nm，研磨介质为石英砂；
步骤四、将步骤二获得的大灰藓原丝体播种附着在苔藓附着基质上，原丝体在苔藓附着基质上分化产生配子体，配子体在苔藓附着基质上生长为目标苔藓，配子体在苔藓附着基质上进行培育时，培养条件为白天光照培养10h，夜间培养14h，光照强度为3000lux，培养温度为20℃。
微塑料悬浮液制备：准备500ml锥形瓶，加入250ml去离子水，准确称取50mg PP/PE/PVC混合微塑料(粒径1-450um)，配制成200mg/L的悬浮液，每个处理做三个重复，共制备6瓶悬浮液备用。
微塑料处理：挑选表观生长状态一致的大灰藓，去除假根，用吸水纸吸干表面水分，准确称取3g大灰藓到250ml微塑料悬浮液中，以250ml去离子水作对照(CK)，每个处理三个重复，用3-4层纱布将其封口，以防止污染。随后将其放入光照培养箱及摇床中交替培养，培养条件为白天10h(光照培养箱，温度20℃，光照强度3000lux)，晚上14h(摇床，温度20℃，转速150r/min)，72h后，测定苔藓植物的各项生理指标。
丙二醛的测定采用硫代巴比妥酸法。
0.1g苔藓植物→1.67ml 5％TCA→冰浴研磨→离心4000r/min，10min→取上清液1ml→1ml 0.67％TBA→沸水浴60min→离心4000r/min，10min→酶标仪测定。
脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮法。
0.2g苔藓植物→3ml 3％磺基水杨酸→沸水浴提取10min→过滤→取提取液1ml→1ml冰醋酸+2ml酸性茚三酮→沸水浴30min→2ml甲苯，振荡→520nm波长光测定。
使用硫代巴比妥酸法和酸性茚三酮法分别测定实施例1培养得到的大灰藓的MDA含量和Pro含量，MAD含量测定结果如图2所示，Pro含量测定结果如图3所示。
抗氧化酶活测定分别采用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(A001-1羟胺法)、过氧化氢酶(CAT)测试盒(A007-1-1钼酸铵法)和过氧化物酶(POD)测试盒(A084-3-1测植物)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测试盒(A005-1)，SOD、CAT、POD、GSH-PX酶活力均用U/g来表示。
使用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(A001-1羟胺法)和过氧化物酶(POD)测试盒(A084-3-1测植物)测定实施例2培养得到的大灰藓的SOD含量和POD含量，SOD含量测定结果如图4所示，POD含量测定结果如图5所示。
使用过氧化氢酶(CAT)测试盒(A007-1-1钼酸铵法)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测试盒(A005-1)测定实施例3培养得到的大灰藓的CAT含量和GSH-PX含量，CAT含量测定结果如图6所示，GSH-PX含量测定结果如图7所示。
其中图2～图7中的CK表示空白对照组。
MDA是细胞膜脂质过氧化的毒性产物，其含量通常可作为逆境下植物细胞膜过氧化的重要指标]。实施例1培育得到的大灰藓中的MDA含量对PP、PE、PVC三种微塑料响应如图2所示，不同微塑料处理对大灰藓MDA含量影响存在极显著差异(P＝0.001)；与对照相比，PP和PVC微塑料胁迫下，大灰藓MDA含量均下降，其下降率分别为36.55％、51.97％；而在PE微塑料胁迫下，大灰藓MDA含量增加了9.50％，表明PE微塑料胁迫下可能会对大灰藓细胞膜造成损伤，但与对照相比无显著变化，说明脂质过氧化是通过调节一系列酶活性变化来平衡的，因而没有表现出明显的氧化损伤。
Pro通常会在非生物胁迫下的积累。如图3所示，实施例1培育得到的大灰藓中的脯氨酸含量对不同微塑料胁迫的响应存在极显著差异(P<0.001)；PP/PE微塑料处理下，Pro含量与对照组相比显著增加，其增长率分别为15.87％、18.46％，表明大灰藓可能受到了PP/PE微塑料的胁迫。有相关研究表明Pro上升可能参与了植物体内ROS的清除，以减少微塑料对细胞膜造成损伤[62]。而PVC微塑料胁迫下，大灰藓脯氨酸含量下降了4.40％，但与对照相比无显著性差异(P>0.05)。
超氧化物歧化酶(SOD)存在于多种生物体中，它能促进·O2 -自由基转化为H2O2和O2，保护细胞免受氧化损伤，在抗氧化平衡中起着重要作用。微塑料胁迫对实施例2培育得到的大灰藓T-SOD活力的影响如图4所示，大灰藓T-SOD含量对不同微塑料胁迫下响应存在极显著差异(P<0.001)。与对照相比，PE/PVC微塑料处理都会使大灰藓T-SOD酶活力极显著下降(P<0.001)，这可能是由于H2O2及其ROS衍生物的额外增加所致，其下降率分别为13.68％、13.78％；而PP微塑料胁迫下，大灰藓T-SOD酶活力上升，增长率为2.58％，但无显著差异(P>0.05)，研究发现T-SOD活性的增加可以认为是污染物直接作用的结果，也可能是·O2 -增加所介导的间接作用结果。
POD属于ROS清除同工酶，它可以利用H2O2作为底物来生成苯氧基化合物，其目的是维持细胞的正常生理活动，以提高植物抗逆性。然而，当环境压力超过生物体耐受阈值往往会导致酶活性不能提高甚至被抑制，从而导致ROS的积累，从而导致细胞的氧化损伤。微塑料胁迫对实施例2培育得到的大灰藓POD活力的影响如图5所示，大灰藓POD含量对不同微塑料胁迫下的响应存在极显著差异(P＝0.007)。与对照相比，PE/PP/PVC微塑料胁迫下大灰藓POD活力下降，其中PP微塑料胁迫下大灰藓POD酶活力显著被抑制(P<0.001)，其抑制率达14.75％，可能是因为200mg/l PP微塑料处理超出了大灰藓POD酶的耐受阈值；而PE/PVC微塑料胁迫下，大灰藓POD酶活力抑制率分别为3.46％、2.41％，但无显著性差异(P>0.05)。
CAT能将H2O2分解成H2O和O2，从而减少H2O2对植物体产生过氧化损伤。微塑料胁迫对实施例3培育得到的大灰藓CAT活力的影响如图6所示，大灰藓CAT含量对不同微塑料胁迫下响应存在极显著差异(P<0.001)。与对照相比，PP/PVC微塑料极显著抑制大灰藓CAT活力(P<0.001)，其抑制率分别为29.53％、21.28％，可能是由于污染物改变了酶的结构和活性，也可能是污染物胁迫下H2O2积累；而PE微塑料胁迫下，大灰藓CAT活力受到显著诱导(P<0.05)，其增长率为10.00％。
GSH-PX同CAT酶功能，是植物体内广泛存在的催化H2O2酶，可以保护细胞膜结构和功能完整[66]。微塑料胁迫对实施例3培育得到的大灰GSH-PX活力的影响如图7所示，大灰藓对GSH-PX活力不同微塑料胁迫下响应存在显著差异(P＝0.026)。与对照相比，PP/PVC微塑料胁迫下，大灰藓对GSH-PX活力均受到抑制，其抑制率分别为14.92％、1.64％，而PE微塑料胁迫下，大灰藓GSH-PX活力增加了2.13％。此项研究结果与Pignattelli等人相反，PP处理Lepidium sativum植物21d后表现出最高的GSH活力。
对实施例培育得到的大灰藓进行SEM分析，SEM扫描电镜图如图8～图11所示；其中，图8为经对照组(去离子水)处理的大灰藓SEM扫描电镜图；图9为经PE微塑料悬浮液处理的大灰藓SEM扫描电镜图；图10为经PP微塑料悬浮液处理的大灰藓SEM扫描电镜图；图11为经PVC微塑料悬浮液处理的大灰藓SEM扫描电镜图。
从图8～图11可以看出，与对照相比，PP/PE/PVC处理组SEM扫描图中存在一些有别于CK组的碎片或者颗粒状，这些碎片或者颗粒是微塑料，由此证明培育得到的苔藓可以吸附微塑料；将PP处理组的SEM扫描电镜图与其它组作对照，发现PP组叶片组织上存在密集的颗粒状小突起，而其它组叶片表面组织相对较光滑，这可能是PP微塑料胁迫作用或者是大灰藓吸收了PP微塑料，从而导致大灰藓表面微观结构发生了改变。
观察大灰藓叶片SEM扫描电镜图，研究发现大灰藓叶片表面吸附了大量的微塑料颗粒及碎片；PP微塑料胁迫下，大灰藓叶片表面出现颗粒状小突起，表面PP微塑料被大灰藓吸收到细胞内或者是PP微塑料对大灰藓的毒害作用所引起的表面结构变化。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种生物监测用苔藓的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采集整块苔藓，剪去苔藓假根，对采集的整块苔藓进行第一次过筛后，进行第一次播种；剪去第一次播种后长出苔藓的假根，进行第二次过筛，准备进行第二次播种；
步骤二、制备苔藓培养液，使用苔藓培养液对苔藓进行第二次播种、培育，获得原丝体；
步骤三、制作苔藓附着基质和附着基质骨架；
步骤四、将步骤二获得的原丝体播种附着在苔藓附着基质上，原丝体在苔藓附着基质上分化产生配子体，配子体在苔藓附着基质上生长为目标苔藓。
2.如权利要求1所述的生物监测用苔藓的培育方法，其特征在于，所述步骤一中，苔藓为大灰藓；第一次过筛目数为300～500目，第二次过筛目数为500～600目；采集的整块苔藓的大小为25cm×30cm～60cm×90cm。
3.如权利要求1所述的生物监测用苔藓的培育方法，其特征在于，所述步骤二中，培养液的制备方法包括以下步骤：
步骤S21、按重量份，称取1～4份七水硫酸镁，12～15份四水硝酸钙，2～4份硝酸钾，1～2份五水β甘油磷酸钠，10～40份三羟甲基甲胺基丙磺酸，0.1～02份乙二胺四乙酸二钠，0.2份的六水氯化铁以及1～5份硼酸；将上述物质加入至110～150份的去离子水中，搅拌混合均匀，使用紫外线进行杀菌处理，杀菌时间为33～40min，得到培养液A；
步骤S22、按重量份，称取5～8份的干海藻，1～2份香樟叶和3～7份松针，用去离子水将干海藻、香樟叶和松针清洗干净后，混合粉碎，得到混合粉状物，加入36份的去离子水，将混合粉状物搅拌为糊状后，加入至培养液A中搅拌混合均匀，在20～28℃下保温24h，培养液制备完成。
4.如权利要求1所述的生物监测用苔藓的培育方法，其特征在于，所述步骤三中，苔藓附着基质的制作方法包括以下步骤：
步骤S31、按重量份，称取50～60份硅藻土，1.2～2份椰糠，10～13份泥炭土，2～4份苯甲酸钠，0.1～0.3份四水氯化锰，0.1～0.2份二水钼酸钠，18份三水磷酸氢二钾，22份碳酸钠15份五水硫酸铜；将硅藻土和泥炭土分别粉碎后，混合搅拌均匀，得到混合土，然后将椰糠、苯甲酸钠、四水氯化锰、二水钼酸钠、三水磷酸氢二钾、碳酸钠和五水硫酸铜分别与混合土混合搅拌均匀，得到基质土，将基质土压平为平板状，得到基质土层；
步骤S32、裁剪与基质土层尺寸相同的海绵层和毛毡布，将毛毡布置于海绵层的上表面，用针线将毛毡布和海绵层的四个对齐的边缘缝合，然后将步骤S31得到的基质土层放在毛毡布的上表面，得到苔藓附着基质；
步骤S33、使用致密的魔芋-三氧化二铝膜对苔藓附着基质的四个侧面和底面进行包裹，包裹苔藓附着基质底面的魔芋-三氧化二铝膜预先挖出多个小孔，小孔中漏出部分海绵层。
5.如权利要求4所述的生物监测用苔藓的培育方法，其特征在于，所述步骤三中，附着基质骨架的结构包括：
封闭结构的水槽，其侧面设置有注水口，所述水槽的上端开设有多个与苔藓附着基质的小孔等大的通孔；
苔藓放置台，其设置在所述水槽的上方，所述苔藓放置台与水槽之间固定设置有四根支撑柱；所述苔藓放置台的上开设有多个圆孔，所述苔藓附着基质放置在苔藓放置台上，且小孔、圆孔和通孔一一对齐；
所述水槽的通孔与苔藓放置台的圆孔之间设置有海绵柱，所述海绵柱的上端伸入至水槽中，海绵柱的上端与海绵层的底部相接触，所述海绵柱的外部套设有外壳，外壳的材质为魔芋-三氧化二铝膜。
6.如权利要求5所述的生物监测用苔藓的培育方法，其特征在于，所述魔芋-三氧化二铝膜的制备方法包括以下步骤：
步骤S41、按重量份，称取14～20份魔芋精粉，3.5～7份改性纳米三氧化二铝粉末，1～1.5份壳聚糖，2～3份蔗糖酯，将魔芋精粉溶解于200mL无水乙醇中，在150rpm的转速下搅拌40min得到悬浊液；
步骤S42、向悬浊液中加入壳聚糖和蔗糖酯，搅拌混合后得到混合悬浊液，对混合悬浊液进行离心，离心时间20～25min，离心转速为3200～6000rpm；离心后静置待混合悬浊液分层，从混合悬浊液中分离出上层液；
步骤S43、将改性纳米三氧化二铝粉末加入至90份的蒸馏水中，搅拌混合得到悬浮液，使用超声分散仪对混合悬浮液进行超声分散，分散时间设置在30min以上，得到混合添加液；将混合添加液与步骤S42得到的上层液进行混合，超声分散15min，得到魔芋-三氧化二铝膜粗液，将魔芋-三氧化二铝膜粗液涂覆在玻璃板表面，干固后得到魔芋-三氧化二铝膜；制得的魔芋-三氧化二铝膜裁切加工用于包裹苔藓附着基质和包裹海绵柱。
7.如权利要求6所述的生物监测用苔藓的培育方法，其特征在于，所述改性纳米三氧化二铝粉末的改性方法包括：称取10～15份三氧化二铝粉末，使用高能球磨机将三氧化二铝粉末研磨为0.1～0.8微米粒径的纳米粉末；将制得的纳米三氧化二铝粉末放入300～400份的去离子水中，搅拌3h后；向其中加入NaOH溶液和甲醇，调节溶液pH至10，然后倒入0.6～1.7份的乙烯基三乙氧基硅烷，混合搅拌4h后，使用高速剪切分散机对混合溶液进行高速分散，高速剪切分散机的转速设定为4200rpm，剪切分散时间为15～30min；
将高速剪切后的纳米三氧化二铝溶液进行加热，蒸发完其中的水分，得到纳米三氧化二铝固体颗粒，对纳米三氧化二铝固体颗粒在400～600℃下进行煅烧，煅烧时间为2h；
将煅烧后纳米三氧化二铝固体颗粒研磨粉碎为纳米三氧化二铝粉末，研磨粒径为13～50nm，研磨介质为石英砂。
8.如权利要求1所述的生物监测用苔藓的培育方法，其特征在于，所述步骤四中，配子体在苔藓附着基质上进行培育时，培养条件为白天光照培养10h，夜间培养14h，光照强度为3000lux，培养温度为20～22℃。
9.一种如权利要求1～8任一项所述的生物监测用苔藓的培育方法，其培育得到的苔藓进行生物监测测定的方法包括：微塑料悬浮液制备，准备500ml锥形瓶，加入250ml去离子水，分别准确称取50mg PP、PE、PVC微塑料，微塑料粒径为1-450um，将每种微塑料配制成200mg/L的悬浮液，每种微塑料制备6瓶悬浮液备用；
微塑料处理，挑选表观生长状态一致的大灰藓，去除假根，用吸水纸吸干表面水分，准确称取3g大灰藓到250ml微塑料悬浮液中，以250ml去离子水作对照，每个处理三个重复，用3-4层纱布将其封口，以防止污染；随后将其放入光照培养箱及摇床中交替培养，培养条件为白天10h，培养箱为光照培养箱，温度20℃，光照强度3000lux，晚上14h，培养方式为摇床，培养温度20℃，转速150r/min，72h后，测定大灰藓的MDA含量、Pro含量、T-SOD活力、POD活力、CAT活力和GSH-PX活力的变化。
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