CN114364797A - 衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子-衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法 - Google Patents

Abstract

更简便且切实地使生物分子在纳米孔内往复运动。一种衔接子分子，其与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。

Description

衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子- 衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法

技术领域

本发明涉及在核酸等生物分子的分析中使用的衔接子分子、结合有该衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法。

背景技术

蛋白质、核酸分子等生物分子分别具有氨基酸、核苷酸这样的单体连接而成的结构。对于这些生物分子的蛋白质，使用自动进行埃德曼法的装置(被称为肽测序仪或蛋白质测序仪)来确定单体序列。作为确定核酸分子的单体序列(碱基序列)的装置，已知采用桑格法、Maxam-Gilbert法的第一代测序仪；使用将焦磷酸测序法、桥式PCR法与边合成边测序(sequence-by-synthesis，SBS)技术组合的方法的第2代测序仪。

另一方面，在下一代DNA测序仪的领域中，不进行延伸反应、荧光标记，以电的方式对DNA的碱基序列直接进行测定的方法受到关注。具体而言，关于不使用试剂而直接测定DNA链来确定碱基序列的所谓纳米孔DNA测序方式的研究开发正在活跃地进行近。

该纳米孔DNA测序方式中，对由于DNA链穿过在薄膜中形成的细孔(以下称为“纳米孔”。)而产生的封闭电流进行测定，从而测定碱基序列。即，由于封闭电流随着DNA链所含的各个碱基种类的不同而变化，因此可以通过测定封闭电流量来依次鉴定碱基种类。在该方式中，与上述各种测序仪不同，不需要进行基于以DNA链为模板的酶的扩增反应、附加荧光体等标记物。因此，纳米孔DNA测序方式与以往的各种测序仪相比，为高通量、低运行成本，并且能够进行长碱基的DNA解读。

该纳米孔DNA测序方式通常通过生物分子分析用设备来实现，该生物分子分析用设备具备：充满电解质溶液的第1液槽和第2液槽、分隔该第1液槽和第2液槽且具有纳米孔的薄膜、以及设于第1液槽和第2液槽的第1电极和第2电极。生物分子分析用设备也可以构成为阵列设备。阵列设备是指具备多个由薄膜分隔的液室组的设备。例如可以将第1液槽设为公共槽，将第2液槽设为多个独立槽。这种情况下，在公共槽和独立槽中分别配置电极。

在该构成中，在第1液槽与第2液槽之间施加电压，且使与纳米孔径相对应的离子电流流过纳米孔。另外，在纳米孔中形成与施加的电压相对应的电位梯度。如果将生物分子导入第1液槽中，则基于扩散效应和其产生的电位梯度，生物分子经由纳米孔而被送往第2液槽。关于离子电流的大小，作为一次近似，与纳米孔的截面积成比例。如果DNA穿过纳米孔，则DNA将纳米孔封闭，有效截面积减小，因此离子电流减小。该电流称为封闭电流。基于封闭电流的大小来判断DNA的单链和双链的差异、碱基的种类。

另外，此外还已知如下方式：将探针电极对相对地设置在纳米孔的内侧面等，并对电极间施加电压，从而测定穿过纳米孔时的DNA与探针电极间的隧道电流，根据隧道电流的大小来判断碱基的种类。

作为纳米孔DNA测序方式的课题之一，可列举穿过纳米孔的DNA的运送控制。为了通过封闭电流量测定DNA链所含的各个碱基种类的不同，认为需要根据测定时的电流噪音和DNA分子的波动的时间常数，将DNA的纳米孔穿过速度设为每个碱基100μs以上。但是，DNA的纳米孔通过速度通常较快，为每个碱基1μs以下，难以充分测定来自各碱基的封闭电流。

作为运送控制法之一，有利用在DNA聚合酶进行互补链合成反应时、解旋酶解开双链DNA时对作为模板的单链DNA进行运送、控制的力的方法(例如参照非专利文献1)。DNA聚合酶结合于作为模板的DNA，从互补结合于模板DNA的引物的端部开始进行互补链合成反应。第1液槽中，通过DNA聚合酶在纳米孔附近进行互补链合成反应，从而将模板DNA经由纳米孔运送至第2液槽。将该DNA聚合酶、解旋酶称为分子马达。

另外，如专利文献1记载的那样，通过使分析对象的单链DNA经由纳米孔在第1液槽与第2液槽之间往复运动，从而能够提高测定精度。即，使分析对象的单链DNA在第1液槽与第2液槽之间往复运动并进行多次测定，从而能够补正单次测定中产生的误差。此时，如专利文献1所记载的那样，通过在分析对象的单链DNA中的一个端部结合第一阻断分子(大于纳米孔径)，从而使得单链DNA从该单链DNA的另一个端部经由纳米孔而移动至第2液槽，在第2液槽内使第二阻断分子(大于纳米孔径)结合于单链DNA的另一个端部。由此，能够使单链DNA的一个端部留在第1液槽内，另一个端部留在第2液槽内，能够在往复运动时防止单链DNA从纳米孔掉落。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Gerald M Cherf等、Nat.Biotechnol.30，No.4，p.349-353、2012

专利文献

专利文献1：日本专利第5372570号

发明内容

发明要解决的课题

如上所述，通过使生物分子在第1液槽和第2液槽间经由纳米孔而往复运动，从而实现了读取精度的提高。然而，经由纳米孔的往复运动、即生物分子的运送控制在技术上非常困难，需要更简便且切实地使生物分子往复运动的技术。

在此，鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种能够使分析对象的生物分子更简便且切实地经由纳米孔进行往复运动的衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子-衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法。

用于解决课题的手段

达成上述目的的本发明包含以下内容。

(1)一种衔接子分子，其能与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。

(2)如(1)记载的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与上述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于上述一个端部的另一个端部连接、且具有上述立体结构形成区域。

(3)如(1)记载的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与上述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于上述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，上述立体结构形成区域位于这一对单链核酸区域中具有5’末端的单链核酸区域内。

(4)如(1)记载的衔接子分子，其特征在于，具备相对于上述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。

(5)如(4)记载的衔接子分子，其特征在于，上述立体结构形成抑制寡聚体与上述立体结构形成区域的至少一部分进行了杂交，相比于立体结构形成抑制寡聚体进行了杂交的部分更靠近末端的一侧为单链。

(6)如(3)记载的衔接子分子，其特征在于，上述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备与上述生物分子的分析装置中的纳米孔的直径相比直径更大的防脱落部。

(7)如(6)记载的衔接子分子，其特征在于，上述防脱落部为能与上述单链核酸区域结合的分子或在上述单链核酸区域内的互补区域中形成的发夹结构。

(8)如(3)记载的衔接子分子，其特征在于，上述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备可结合分子马达的分子马达结合部。

(9)如(8)记载的衔接子分子，其特征在于，具备上述分子马达结合部的单链核酸区域具备使引物可在比该分子马达结合部更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部。

(10)如(9)记载的衔接子分子，其特征在于，在上述分子马达结合部与上述引物结合部之间，具有无法结合上述分子马达的间隔区。

(11)一种衔接子分子，其为能与分析对象的生物分子直接或间接地结合、且由单链核苷酸构成的衔接子分子，具备多个如下的组，所述组为可结合分子马达的分子马达结合部和使引物可在比该分子马达结合部更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部的组。

(12)如(11)记载的衔接子分子，其特征在于，在上述分子马达结合部与上述引物结合部之间，具有无法结合上述分子马达的间隔区。

(13)如(11)记载的衔接子分子，其特征在于，在与上述生物分子直接或间接地结合的端部的相反侧的端部，具备与上述生物分子的分析装置中的纳米孔的直径相比直径更大的防脱落部。

(14)如(13)记载的衔接子分子，其特征在于，上述防脱落部为能与上述单链核酸区域结合的分子或在上述单链核酸区域内的互补区域中形成的发夹结构。

(15)如(11)记载的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与上述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于上述一个端部的另一个端部连接、末端为3’末端、且具有上述分子马达结合部和上述引物结合部的多个组。

(16)如(11)记载的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与上述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于上述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，上述分子马达结合部和上述引物结合部的多个组位于这一对单链核酸区域中具有3’末端的单链核酸区域内。

(17)如(16)记载的衔接子分子，其特征在于，上述一对单链核酸区域中具有5’末端的单链核酸区域具有立体结构形成区域。

(18)如(17)记载的衔接子分子，其特征在于，具备相对于上述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。

(19)如(18)记载的衔接子分子，其特征在于，上述立体结构形成抑制寡聚体与上述立体结构形成区域的至少一部分进行了杂交，相比于立体结构形成抑制寡聚体进行了杂交的部分更靠近末端的一侧为单链。

(20)如(16)记载的衔接子分子，其特征在于，上述一对单链核酸区域中具有5’末端的单链核酸区域具有与分子马达的结合力比上述生物分子低的分子马达脱离诱导部。

(21)一种衔接子分子，其能与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有与分子马达的结合力比上述生物分子低的分子马达脱离诱导部。

(22)如(21)记载的衔接子分子，其特征在于，上述分子马达脱离诱导部为不具有磷酸二酯键的碳链或脱碱基序列部。

(23)如(21)记载的衔接子分子，其特征在于，在相比于上述分子马达脱离诱导部更靠近5’末端的一侧进一步具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。

(24)如(21)记载的衔接子分子，其特征在于，具备：

双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与上述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及

单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于上述一个端部的另一个端部连接、末端为5’末端、且具有上述分子马达脱离诱导部。

(25)如(21)记载的衔接子分子，其特征在于，具备：双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与上述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于上述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，上述分子马达脱离诱导部位于这一对单链核酸区域中具有5’末端的单链核酸区域内。

(26)如(23)记载的衔接子分子，其特征在于，具备相对于上述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。

(27)如(26)记载的衔接子分子，其特征在于，上述立体结构形成抑制寡聚体与上述立体结构形成区域的至少一部分进行了杂交，相比于立体结构形成抑制寡聚体进行了杂交的部分更靠近末端的一侧为单链。

(28)如(25)记载的衔接子分子，其特征在于，上述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备与上述生物分子的分析装置中的纳米孔的直径相比直径更大的防脱落部。

(29)如(28)记载的衔接子分子，其特征在于，上述防脱落部为能与上述单链核酸区域结合的分子或在上述单链核酸区域内的互补区域中形成的发夹结构。

(30)如(25)记载的衔接子分子，其特征在于，上述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备可结合分子马达的分子马达结合部。

(31)如(30)记载的衔接子分子，其特征在于，具备上述分子马达结合部的单链核酸区域具备使引物可在比该分子马达结合部更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部。

(32)如(31)记载的衔接子分子，其特征在于，在上述分子马达结合部与上述引物结合部之间，具有无法结合上述分子马达的间隔区。

(33)如(25)记载的衔接子分子，其特征在于，上述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备多个如下的组，所述组为可结合分子马达的分子马达结合部和使引物可在比该分子马达结合部更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部的组。

(34)如(33)记载的衔接子分子，其特征在于，在上述分子马达结合部与上述引物结合部之间，具有无法结合上述分子马达的间隔区。

(35)一种生物分子-衔接子分子复合体，包括：分析对象的生物分子、以及与该生物分子的至少一个末端直接或间接地结合的(1)至(10)中任一项记载的衔接子分子。

(36)一种生物分子-衔接子分子复合体，包括：分析对象的生物分子、以及与该生物分子的至少一个末端直接或间接地结合的(11)至(20)中任一项记载的衔接子分子。

(37)一种生物分子-衔接子分子复合体，包括：分析对象的生物分子、以及与该生物分子的至少一个末端直接或间接地结合的(21)至(34)中任一项记载的衔接子分子。

(38)一种生物分析装置，其具备：具有纳米孔的薄膜；隔着上述薄膜相对的第1液槽和第2液槽；在上述第1液槽中填充有包含上述(35)、(36)或(37)记载的生物分子-衔接子分子复合体的电解质溶液并且在上述第2液槽中填充有电解质溶液的状态下向第1液槽与第2液槽之间施加电压的电压源；以及控制上述电压源以在上述第1液槽与上述第2液槽之间形成期望的电位梯度的控制装置。

(39)一种生物分子的分析方法，其特征在于，具备：形成电位梯度的工序，在隔着具有纳米孔的薄膜相对的第1液槽与第2液槽中在第1液槽内填充有包含上述(35)记载的生物分子-衔接子分子复合体的电解质溶液且在第2液槽内填充有电解质溶液的状态下，向第1液槽与第2液槽之间施加电压，使第1液槽侧为负电位或接地电位，使第2液槽为正电位；在上述第2液槽内上述衔接子分子的立体结构形成区域形成立体结构的工序；以及对上述生物分子-衔接子分子复合体经由上述纳米孔在上述第2液槽与上述第1液槽之间移动时产生的信号进行测定的工序，

上述形成电位梯度的工序中，生物分子-衔接子分子复合体中的立体结构形成区域经由上述纳米孔被导入上述第2液槽内，上述生物分子-衔接子分子复合体由于电位梯度而从上述第1液槽向上述第2液槽移动。

(40)一种生物分子的分析方法，其特征在于，具备：形成电位梯度的工序，在隔着具有纳米孔的薄膜相对的第1液槽与第2液槽中在第1液槽内填充有包含上述(36)记载的生物分子-衔接子分子复合体、可与衔接子分子中的分子马达结合部结合的分子马达和可与衔接子分子中的引物结合部进行杂交的引物的电解质溶液并且在第2液槽内填充有电解质溶液的状态下，向第1液槽与第2液槽之间施加电压，使第1液槽侧为负电位或接地电位，使第2液槽为正电位；以及对上述生物分子-衔接子分子复合体经由上述纳米孔在上述第2液槽与上述第1液槽之间移动时产生的信号进行测定的工序，

对上述信号进行测定的工序中，离纳米孔最近的上述分子马达从与上述引物结合部进行了杂交的引物开始合成互补链，从而使上述生物分子-衔接子分子复合体从上述第2液槽向上述第1液槽移动，对上述生物分子-衔接子分子复合体穿过上述纳米孔时产生的信号进行测定，然后，通过使具有互补链的上述生物分子-衔接子分子复合体从上述第1液槽向上述第2液槽移动从而将该互补链拉开，离纳米孔最近的上述分子马达再次合成互补链，从而使上述生物分子-衔接子分子复合体从上述第2液槽向上述第1液槽移动，并对信号进行测定，重复以上操作。

(41)一种生物分子的分析方法，其特征在于，具备：形成电位梯度的工序，在隔着具有纳米孔的薄膜相对的第1液槽与第2液槽中在第1液槽内填充有包含上述(37)记载的生物分子-衔接子分子复合体、可与该生物分子-衔接子分子复合体中的分子马达结合部结合的分子马达和可与该生物分子-衔接子分子复合体中的引物结合部进行杂交的引物的电解质溶液并且在第2液槽内填充有电解质溶液的状态下，向第1液槽与第2液槽之间施加电压，使第1液槽侧为负电位或接地电位，使第2液槽为正电位；以及对上述生物分子-衔接子分子复合体经由上述纳米孔在上述第2液槽与上述第1液槽之间移动时产生的信号进行测定的工序，

对上述信号进行测定的工序中，上述分子马达从与上述引物结合部进行了杂交的引物开始合成互补链，从而使上述生物分子-衔接子分子复合体从上述第2液槽向上述第1液槽移动，该分子马达在上述生物分子-衔接子分子复合体中的分子马达脱离诱导部解离。

发明效果

根据本发明涉及的衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子-衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法，通过使用特征性的衔接子分子，能够切实地使生物分子-衔接子分子在纳米孔内往复运动。由此，能够进行生物分子的准确分析。

附图说明

[图1]为概略性示出利用适用本发明的衔接子分子的生物分子分析装置的构成图。

[图2]为示出包括适用本发明的衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体的构成的构成图。

[图3]为示意性示出对图2所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图4]为示意性示出作为图3所示工序的后续、对包括适用本发明的衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图5]为示意性示出作为图4所示工序的后续、对包括适用本发明的衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图6]为示意性示出使用分子马达对包括适用本发明的衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图7]为示意性示出作为图6所示工序的后续、使用分子马达对包括适用本发明的衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图8]为示意性示出作为图7所示工序的后续、使用分子马达对包括适用本发明的衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图9]为示出包括适用本发明的其他衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体的构成的构成图。

[图10]为示意性示出对图9所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图11]为示意性示出作为图10所示工序的后续、对包括适用本发明的其他衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图12A]为示意性示出作为图11所示工序的后续、对包括适用本发明的其他衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图12B]为示意性示出从图12A所示的状态使生物分子-衔接子分子复合体向相反方向移动的状态的构成图。

[图13]为示出适用本发明的进一步其他的衔接子分子的构成的构成图。

[图14A]为示意性示出对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图14B]为示意性示出作为图14A所示工序的后续、对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图15A]为示意性示出作为图14B所示工序的后续、对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图15B]为示意性示出作为图15A所示工序的后续、对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图15C]为示意性示出作为图15B所示工序的后续、对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图15D]为示意性示出作为图15C所示工序的后续、对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图15E]为示意性示出作为图15D所示工序的后续、对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图15F]为示意性示出作为图15E所示工序的后续、对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图15G]为示意性示出作为图15F所示工序的后续、对图13所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图16]为概略性示出利用适用本发明的其他衔接子分子的生物分子分析装置的构成图。

[图17]为示出包括适用本发明的其他衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体的构成的构成图。

[图18]为示意性示出对图17所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图19]为示意性示出作为图18所示工序的后续、对图17所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图20]为示意性示出作为图19所示工序的后续、对图17所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图21]为示意性示出作为图20所示工序的后续、对图17所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图22]为示出适用本发明的进一步其他的衔接子分子的构成的构成图。

[图23]为示意性示出对图22所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图24]为示意性示出作为图23所示工序的后续、对图22所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图25]为示意性示出作为图24所示工序的后续、对图22所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图26]为示意性示出作为图25所示工序的后续、对图22所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图27]为示意性示出作为图26所示工序的后续、对图22所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图28]为示意性示出对包括适用本发明的进一步其他的衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图29]为示意性示出作为图28所示工序的后续、对生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图30]为示意性示出作为图29所示工序的后续、对生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图31]为示意性示出作为图30所示工序的后续、对生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图32]为示意性示出作为图31所示工序的后续、对生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图33]为示意性示出作为图32所示工序的后续、对生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图34]为示意性示出作为图33所示工序的后续、对生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图35]为概略性示出利用适用本发明的进一步其他的衔接子分子的生物分子分析装置的构成图。

[图36]为示出包括适用本发明的进一步其他的衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体的构成的构成图。

[图37]为示意性示出对图36所示的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图38]为示意性示出作为图37所示工序的后续、对图36所示的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图39]为示意性示出作为图38所示工序的后续、对图36所示的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图40]为示出适用本发明的进一步其他的衔接子分子的构成的构成图。

[图41]为示意性示出对图40所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图42]为示意性示出作为图41所示工序的后续、对图40所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图43]为示意性示出作为图42所示工序的后续、对图40所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图44]为示意性示出作为图43所示工序的后续、对图40所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图45]为示意性示出作为图44所示工序的后续、对图40所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图46]为示出适用本发明的进一步其他的衔接子分子的构成的构成图。

[图47]为示意性示出对图46所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图48]为示意性示出作为图47所示工序的后续、对图46所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图49]为示意性示出作为图48所示工序的后续、对图46所示的包括衔接子分子的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的工序的构成图。

[图50]为示出适用本发明的进一步其他的衔接子分子的构成的构成图。

[图51]为示出参考例1中测定的经过时间与封闭电流之间的关系的特性图。

[图52]为示出测定不具有端粒结构的衔接子和具有端粒结构的衔接子时的离子电流变化的特性图。

[图53]为示出使具有端粒结构的单链溶解于测定溶液而测定纳米孔的封闭电流的结果的特性图。

[图54]为示出使用将具有端粒结构的衔接子分子连接(ligation)于生物分子、在另一末端具有链霉亲和素的样品测定封闭电流的结果的特性图。

[图55]为示出使用将具有端粒结构的衔接子分子连接于生物分子、在另一末端具有链霉亲和素的其他样品测定封闭电流的结果的特性图。

[图56a]为示出在分子马达的存在下使用具有分子马达脱离诱导部的模板(无SA)观察纳米孔穿过信号的结果的特性图。

[图56b]为示出在分子马达的存在下使用具有分子马达脱离诱导部的模板(有SA)观察纳米孔穿过信号的结果的特性图。

[图57]为示出对于改变了相邻的引物结合部位的间隔的衔接子分子在分子马达的存在下/非存在下进行电泳的结果的照片。

[图58]为示出使用具有多组引物结合部和分子马达结合部的衔接子分子，在分子马达存在下观察纳米孔穿过信号的结果的特性图，(a)为测定到的封闭信号的代表图，(b)为示出点图(Dotplot)分析的结果的特性图。

具体实施方式

以下，参照附图对本发明涉及的衔接子分子、生物分子-衔接子分子复合体、生物分子的分析装置和分析方法详细进行说明。但是，这些附图示出的是符合本发明原理的具体实施方式，它们用于理解本发明，绝不是用于限定性地解释本发明。

需说明的是，以下，所有实施方式中说明的生物分子分析装置能够应用以所谓封闭电流方式在生物分子的分析中使用的该领域公知的生物分子分析装置。作为以往公知的生物分子分析装置，可列举例如美国专利第5795782号、“Scientific Reports 4,5000,2014,Akahori等”、“Nanotechnology 25(27):275501,2014,Yanagi等”、“ScientificReports,5,14656,2015,Goto等”、“Scientific Reports 5,16640,2015”等中公开的装置。

[第1-1实施方式]

图1中，示出对衔接子分子与分析对象的生物分子直接或间接地连接而成的生物分子-衔接子分子复合体进行分析的生物分子分析装置100的一个构成例。图1所示的生物分子分析装置100为通过封闭电流方式测定离子电流的生物分子分析用设备，具备：形成有纳米孔101的基板102、按照夹着基板102而与基板102相接的方式配置且在其内部充满电解质溶液103的一对液槽104(第1液槽104A和第2液槽104B)、以及分别与第1液槽104A和第2液槽104B相接的一对电极105(第1电极105A和第2电极105B)。测定时，从电压源107向一对电极105之间施加规定的电压，在一对电极105之间流过电流。在电极105之间流过的电流大小由电流计106测定，其测定值由计算机108进行分析。

电解质溶液103中，可使用例如KCl、NaCl、LiCl、CsCl。电解质溶液103在第1液槽104A和第2液槽104B中可以为相同的组成，也可以为不同的组成。需说明的是，第1液槽104A中，填充有包括在后文中详述的生物分子-衔接子分子复合体等的电解质溶液103。另外，第1液槽104A和第2液槽104B内的电解质溶液103中，为了生物分子的稳定化，也能够使缓冲剂混合存在。作为缓冲剂，可使用Tris、EDTA、PBS等。第1电极105A和第2电极105B可以由例如Ag、AgCl、Pt那样具有导电性的材料制作。

在填充于第1液槽104A内的电解质溶液103中，包含第1衔接子分子110和第2衔接子分子111与分析对象的生物分子109结合而成的生物分子-衔接子分子复合体112。第1衔接子分子110和第2衔接子分子111为能够与分析对象的生物分子109的端部连接的由核苷酸、拟核苷酸、肽核酸等构成的核酸分子。第1衔接子分子110与分析对象的生物分子109的一个端部连接，在第2液槽104B内形成立体结构。第2衔接子分子111在与生物分子109连接的端部的相反侧的端部具备防脱落部113。

此处，所谓第1衔接子分子110在第2液槽104B内形成的立体结构，没有特别限定，意思是具有比纳米孔101的直径大的外形的立体结构。作为立体结构的具体例，没有特别限定，可列举发夹结构、鸟嘌呤四链体(G-四链体或者G4、G四分体)结构(例如端粒结构)、DNA纳米球结构、DNA折纸结构等。另外，该立体结构也可以是在一分子内进行杂交、形成螯合结构而得的结构。进一步，在后文中会详述，由于在纳米孔101附近对该立体结构施加测定电压，因此维持立体结构的耐压优选设为测定电压以上。但是，即使维持立体结构的耐压低于测定电压，通过使蛋白质等结合也能强化耐压。

图1所示那样的由单链DNA构成的生物分子-衔接子分子复合体112可以通过将分析对象的双链DNA改性为单链后，分别将单链的第1衔接子分子110和第2衔接子分子111连接来制备。或者，如图2(A)所示，也可以在分析对象的双链DNA的一个端部连接第1衔接子分子110并且在另一个端部连接第2衔接子分子111，然后对双链DNA进行改性，从而制备由单链DNA构成的生物分子-衔接子分子复合体112(图2(C))。此时，第1衔接子分子110在分子中具有形成上述立体结构的立体结构形成区域114。即，立体结构形成区域114为包含对于形成上述那样的发夹结构、鸟嘌呤四链体结构、DNA纳米球结构或者DNA折纸结构等立体结构而言必需的碱基序列的区域。

另外，如图2(C)所示，立体结构形成区域114优选具有用于防止在导入至第2液槽104B内而形成立体结构之前的期间形成立体结构的立体结构形成抑制寡聚体115。立体结构形成抑制寡聚体115能够通过与立体结构形成区域114的至少一部分杂交，来防止立体结构形成区域114形成立体结构。立体结构形成抑制寡聚体115可以是能够与立体结构形成区域114整体进行杂交的核苷酸链，也可以是能够与作为立体结构形成区域114的一部分且足以防止立体结构形成的部分进行杂交的核苷酸链。例如立体结构形成区域114为G四链体结构的情况下，可以将能够与构成四链体的鸟嘌呤残基进行杂交的核苷酸链作为立体结构形成抑制寡聚体115。作为立体结构形成抑制寡聚体115的碱基长度，可以设为10几个～百个程度，更优选设为15～60个碱基长度。

另外，第1衔接子分子110和第2衔接子分子111也可以如图2(B)所示，为至少在与分析对象的双链DNA连接的端部分别具备双链区域116和117的构成。需说明的是，虽然图中未示出，第1衔接子分子110和第2衔接子分子111可以整体设为双链。在这任一种情况下，通过将第1衔接子分子110和第2衔接子分子111连接于分析对象的双链DNA后改性为单链，能够制备由单链DNA构成的生物分子-衔接子分子复合体112(图2(C))。

虽然图2(B)中未示出，第1衔接子分子110和第2衔接子分子111中的双链区域116和117中，与生物分子109连接的端部优选设为3’突出末端(例如dT突出末端)。通过将该端部设为3’dT突出末端，能够在将衔接子分子110与生物分子109连接时，防止第1衔接子分子110和第2衔接子分子111的异二聚体、同二聚体的形成。

进一步另外，在第1衔接子分子110和第2衔接子分子111中，双链区域116和117的长度和碱基序列没有特别限定，可以设为任意的长度和任意的碱基序列。例如作为双链区域116和117的长度，可以设为5～100个碱基长度，可以设为10～80个碱基长度，可以设为15～60个碱基长度，可以设为20～40个碱基长度。

另外，虽然图中未示出，第1衔接子分子110和第2衔接子分子111与生物分子109也可以间接地连接。所谓间接地连接，意思是包括：第1衔接子分子110和第2衔接子分子111隔着规定碱基长度的核酸片段而与生物分子109连接的情况、第1衔接子分子110和第2衔接子分子111隔着根据生物分子109的种类所导入的官能团而与生物分子109连接的情况。

需说明的是，分析对象的生物分子109为双链DNA片段的情况下，以双链DNA片段的一个链为基准，在作为基准的链的5’末端结合第1衔接子分子110，在该链的3’末端结合第2衔接子分子111。但是，也可以反之，在该链的3’末端结合第1衔接子分子110，在该链的5’末端结合第2衔接子分子111。

此处，所谓第2衔接子分子111中的防脱落部113，意思是具有防止第1液槽104A中存在的单链的生物分子-衔接子分子复合体112经由纳米孔101掉落至第2液槽104B的功能的构成。因而，作为能用作防脱落部113的分子，例如可使用抗生物素蛋白、链霉亲和素、针对地高辛(DIG)的抗DIG抗体与珠粒的复合体等。

另外，防脱落部113优选设为充分大于纳米孔101的大小(直径)。例如作为相对于纳米孔101的直径的、防脱落部113的大小，只要是能阻止生物分子109行进的大小即可，例如优选设为1.2～50倍程度。更详细而言，作为生物分子109而测定单链DNA的情况下，其直径为大约1.5nm，因此作为纳米孔101的直径，只要设为1.5nm～2.5nm程度，就能够将链霉亲和素(直径为大约5nm)作为防脱落部113使用。需说明的是，使链霉亲和素结合于末端时，预先使生物素结合于该末端。末端的生物素化可以使用市售的试剂盒。另外，作为链霉亲和素，没有特别限定，例如可以是按照使与生物素的结合部位为1个部位的方式导入了突变的突变型链霉亲和素。

基板102由基材120、以及在基材120的一个主面形成的薄膜121构成。纳米孔101在薄膜121中形成。另外，虽然图中未示出，基板203还可具有绝缘层。基材120可以由电绝缘体的材料例如无机材料和有机材料(包括高分子材料)形成。作为构成基材120的电绝缘体材料的例子，可列举硅(silicon)、硅化合物、玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为硅化合物，可列举氮化硅、氧化硅、碳化硅等、氮氧化硅。特别地，基材120可以由这些任意材料制作，例如可以为硅或硅化合物。需说明的是，纳米孔101可以是在中心具有细孔、由嵌入了蛋白质的两亲性分子层构成的双层脂质(生物孔)。

关于基板102的尺寸和厚度，只要能设置纳米孔101，则没有特别限定。基板102能够通过本技术领域公知的方法制作，或也可作为市售品而获得。例如基板102可以采用光刻或电子束光刻和蚀刻、激光烧蚀、注射成型、铸造、分子束外延、化学蒸镀(CVD)、介电击穿、电子束或者聚焦离子束等技术来制作。需说明的是，为了避免目标以外的分子吸附于表面，基板102也可以进行涂覆。

基板102具有至少1个纳米孔101。纳米孔101具体而言设于薄膜121，但根据情况，也可以设于薄膜121和基材120。此处，“纳米孔”和“孔”是指纳米(nm)尺寸(即，具有1nm以上、小于1μm的直径)的贯通孔，是贯通基板102而将第1液槽104A与第2液槽104B连通的孔。

基板102优选具有用于设置纳米孔101的薄膜121。即，通过在基板120上形成适合形成纳米尺寸的孔的材料和厚度的薄膜121，能够简便且高效地在基板102中设置纳米孔101。从形成纳米孔101的容易性考虑，薄膜121的材料优选为例如氧化硅(SiO₂)、氮化硅(SiN)、氮氧化硅(SiON)、金属氧化物、金属硅酸盐、二硫化钼(MoS₂)、石墨烯等。薄膜121的厚度为

(埃)～200nm、优选

更优选

作为例子为约5nm。另外，薄膜121(以及根据情况的基板102整体)可以实质上透明。这里所谓“实质上透明”，意思是外部光可透过约50％以上、优选80％以上。此外薄膜可以为单层也可以为多层。

需说明的是，薄膜121上还优选设置绝缘层。绝缘层的厚度优选为5nm～50nm。绝缘层中可使用任意的绝缘体材料，优选使用例如硅或硅化合物(氮化硅、氧化硅等)。

纳米孔101的尺寸可根据分析对象的生物高分子的种类来选择合适的尺寸。纳米孔可以具有均匀的直径，也可以根据部位不同而具有不同的直径。在基板102的薄膜121中设置的纳米孔的最小直径部、即纳米孔101所具有的最小直径为直径100nm以下，例如0.9nm～100nm，优选0.9nm～50nm、例如为0.9nm～10nm，具体而言优选为1nm以上5nm以下，3nm以上5nm以下等。需说明的是，纳米孔101可以与在基材120中形成的具有1μm以上直径的孔连接。

另外，分析对象的生物分子为单链核酸(DNA)的情况下，单链DNA的直径为大约1.4nm，因此作为纳米孔101的直径，优选为1.4nm～10nm程度，更优选为1.4nm～2.5nm程度，具体而言可以设为约1.6nm。分析对象的生物分子为双链核酸(DNA)的情况下，双链DNA的直径为大约2.6nm，因此作为纳米孔101的直径，优选为3nm～10nm程度，更优选为3nm～5nm程度。进一步，纳米孔101的直径可以根据分析对象的生物高分子(例如蛋白质、多肽、糖链等)的外径尺寸来适当设定。

纳米孔101的深度(长度)可通过调整薄膜121或基板102整体的厚度来调整。纳米孔101的深度优选与构成分析对象的生物分子的单体单元的长度一致。例如选择核酸作为分析对象的生物分子的情况下，纳米孔101的深度优选设为1个碱基左右的大小、例如约0.3nm左右。另一方面，纳米孔的深度可以设为构成生物分子的单体单元的2倍以上、3倍以上、5倍以上的大小。例如生物分子由核酸构成的情况下，纳米孔的深度即使为3个碱基以上的大小、例如约1nm以上，也能进行分析。由此，能够维持纳米孔的稳健性并且进行高精度的分析。另外，纳米孔的形状基本上为圆形，但也可设为椭圆形、多边形。

进一步，纳米孔101可在基板102中设置至少1个，设置多个纳米孔101的情况下，可规则排列也可无规排列。纳米孔101可采用本技术领域公知的方法，通过例如照射透射型电子显微镜(TEM)的电子束，通过使用纳米光刻技术或离子束光刻技术等来形成。

需说明的是，图1中例示的装置在一对液槽104A与104B之间具有1个纳米孔101，但这仅为一例，也可以设为在一对液槽104A与104B之间具有多个纳米孔101的构成。另外，作为其他例，也可以设为在基板102中形成多个纳米孔101且由隔壁将多个纳米孔101的各个区域分离而构成的阵列设备。该阵列设备中，可以将第1液槽104A设为公共槽，将第2液槽104B设为多个独立槽。这种情况下，可以分别在公共槽和独立槽中配置电极。

在具备多片具有纳米孔的薄膜的阵列型的装置构成的情况下，优选将具有纳米孔的薄膜规则排列。关于配置多个薄膜的间隔，根据所使用的电极、电测定系统的能力，可以设为0.1μm～10μm、优选0.5μm～4μm。

需说明的是，在薄膜中形成纳米孔的方法没有特别限定，可以采用例如基于透射型电子显微镜等的电子束照射、基于电压施加的绝缘击穿等。例如可以使用“Itaru Yanagi等,Sci.Rep.4,5000(2014)”中记载的方法。

另一方面，作为第1电极105A和第2电极105B，没有特别限定，例如可以由铂、钯、铑、钌等铂族、金、银、铜、铝、镍等；石墨、例如石墨烯(可以为单层或多层中的任一者)、钨、钽等制作。

在以上那样构成的生物分子分析装置中，在第1液槽104A内填充有包含生物分子-衔接子分子复合体112的电解质溶液103的状态下，在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，使第1液槽104A侧为负电位或接地电位，使第2液槽104B为正电位而形成电位梯度时，如图3所示，第1衔接子110的末端(5’末端)向纳米孔101方向移动(图3中箭头A的方向)。并且，如图4所示，由于第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，使得生物分子-衔接子分子复合体112经由(穿过)纳米孔101向第2液槽104B移动(图4中箭头A的方向)。从该图3的状态向图4的状态推移时，与立体结构形成区域114进行了杂交的立体结构形成抑制寡聚体115无法穿过纳米孔101而被拉开(Unziped)。其结果是，导入至第2液槽104B内的立体结构形成区域114形成立体结构(图4的例子中为G四链体结构)。

另外，生物分子分析装置中，使在第1衔接子110形成了立体结构的生物分子-衔接子分子复合体112经由纳米孔101从第1液槽104A向第2液槽104B移动，而通过反转电压梯度，如图5所示，能够使该生物分子-衔接子分子复合体112经由纳米孔101从第2液槽104B向第1液槽104A移动(图5中箭头B的方向)。即，如图4所示，利用使第1液槽104A为负电位或接地电位、使第2液槽104B为正电位而形成的电压梯度，能够使生物分子-衔接子分子复合体112在图中箭头[A]所示的方向上移动。反之，如图5所示，利用使第2液槽104B为负电位或接地电位、使第1液槽104A为正电位而形成的电压梯度，能够使生物分子-衔接子分子复合体112在图中箭头[B]所示的方向上移动。以这种方式，生物分子分析装置能够使在第1衔接子110形成了立体结构的生物分子-衔接子分子复合体112在第1液槽104A与第2液槽104B之间往复运动。此时，由于在第1衔接子110形成有立体结构，因此生物分子-衔接子分子复合体112在图5中箭头B的方向上移动时，能够利用该立体结构来防止生物分子-衔接子分子复合体112从纳米孔101脱落。

需说明的是，在第1液槽104A和第2液槽104B之间形成的电压梯度，为了使带负电的核酸分子移动，只要使任意一方为正电位即可，另一方设为负电位或接地电位即可。在以下的说明中，记载为使第1液槽104A和第2液槽104B的任意一方为正电位、使另一方为负电位的情况下，设为负电位的一侧当然也可以设为接地电位。

另外，图1的生物分子分析装置中，利用测定部106测定流过一对电极105A和105B之间的离子电流(封闭信号)，计算机108可基于测定到的离子电流(封闭信号)的值来获取生物分子-衔接子分子复合体112的序列信息。需说明的是，虽然图1未示出，但可以通过在纳米孔101内设置电极而获取隧道电流并基于隧道电流而获取序列信息，或通过检测晶体管特性变化也能够获得生物分子109的序列信息。

此处，更详细地说明碱基序列信息的确定方法。碱基有ATGC这4个种类，这些碱基穿过纳米孔101时，对于每个种类会观测到固有的离子电流(封闭电流)的值。因此，预先使用已知的序列来测定穿过纳米孔101时的离子电流，将对应于该已知序列的电流值事先存储于计算机108的存储器中。然后，将构成分析对象的生物-衔接子分子复合体111的碱基依次穿过纳米孔101时测定到的电流值与存储于存储器的与已知序列相对应的电流值进行比较，从而能够依次确定构成分析对象的生物-衔接子分子复合体111的碱基种类。此处，预先测定离子电流的已知序列可以设为与纳米孔101的深度(长度)相当的碱基数(例如2个碱基的序列、3个碱基的序列、或5个碱基的序列)。

另外，作为生物分子109的碱基序列确定方法，也可以在生物分子109上标记荧光体，在纳米孔101附近使其激发，检测其发光荧光。进一步，还可采用参考文献1(NANOLETTERS(2005)，Vol.5，pp.421-424)中记载的利用杂交碱基来确定生物分子109的碱基序列的方法。

通过上述碱基序列信息的确定方法，按照从图4所示的状态变成图5所示的状态的方式，在使生物分子-衔接子分子复合体112经由纳米孔101从第1液槽104A向第2液槽104B移动时，能够获取生物分子109的碱基序列信息。另外，在使生物分子-衔接子分子复合体112经由纳米孔101在第1液槽104A与第2液槽104B之间往复运动时，能够获取生物分子109的碱基序列信息。

需说明的是，使生物分子-衔接子分子复合体111往复运动时，可以仅在图4的箭头[A]方向上移动时获取生物分子109的碱基序列信息，也可以仅在图5的箭头[B]方向上移动时获取生物分子109的碱基序列信息，还可以在图4的箭头[A]方向和图5的箭头[B]方向这两者上获取生物分子109的碱基序列信息。在图4的箭头[A]方向上移动时，从生物分子109的5’末端朝着3’末端确定碱基序列信息，在图5的箭头[B]方向上移动时，从生物分子109的3’末端朝着5’末端确定碱基序列信息。任一种情况下，都能够针对生物分子109获取多组碱基序列信息，能够提高碱基序列信息的准确性。换言之，通过使生物分子-衔接子分子复合体111往复运动，能够多次读取生物分子109的碱基序列，能够提高读取精度。

另外，关于上述往复运动中的施加电压的切换，可列举例如在一定时间内自动切换的方法。这种情况下，在计算机108中事先对电压切换的时机进行编程，按照该编程来控制电压源107，从而能够在该时机切换施加电压，进行上述那样的往复运动。

或者，也可以在上述往复运动时使用读取到的碱基序列信息来进行施加电压的切换。可列举例如在第1衔接子分子110中组入特征序列、产生与碱基(AGCT)不同的封闭电流的区域，在读取该特征序列、该区域的信号的阶段切换电压的方法。所谓产生与碱基不同的封闭电流的区域，可列举例如包含肽核酸、人工核酸等拟核酸的区域。通过读取上述特征序列、产生与碱基不同的封闭电流的区域的信号，从而对生物分子109结束碱基序列的读取，能够识别到生物分子-衔接子分子复合体112的端部接近纳米孔101。由此，通过在该时机切换施加电压，能够在生物分子-衔接子分子复合体112的端部与纳米孔101相接前，使生物分子-衔接子分子复合体112向相反方向移动。特别是在第2液槽104B内，由于在生物分子-衔接子分子复合体112的末端附近形成有立体结构，因此能够切实地防止当生物分子-衔接子分子复合体112在图5的箭头B方向上移动时从纳米孔101脱落。由此，随着上述往复运动，能够多次读取生物分子109的碱基序列，能够切实地提高读取精度。

如以上那样，通过使用第1衔接子分子110，利用在第1液槽104A与第2液槽104B之间形成的电压梯度，能够使生物分子-衔接子分子复合体112切实地在第1液槽104A与第2液槽104B之间往复运动。需说明的是，上述例子中，例示了双链核酸(DNA、RNA)作为生物分子109，但作为生物分子109，即便是蛋白质(肽链)、糖链，也可以基于同样的原理而设为分析对象。

需说明的是，以上的说明中，如图3～5所示，通过控制在第1液槽104A与第2液槽104B之间形成的电压梯度，从而使生物分子-衔接子分子复合体112往复运动，但生物分子-衔接子分子复合体112的移动控制不限定于该方式。通过使用所谓的分子马达，能够使生物分子-衔接子分子复合体112在第1液槽104A与第2液槽104B之间移动。此处，所谓分子马达，意思是能够在生物分子-衔接子分子复合体112上移动的蛋白质分子。作为具有这样功能的分子马达，没有特别限定，可列举DNA聚合酶、RNA聚合酶、核糖体和解旋酶。特别是在本实施方式中，作为分子马达，优选使用以单链DNA为模板、从5’末端向3’末端方向合成互补链的DNA聚合酶。

具体而言，如图6所示，如果使包含生物分子-衔接子分子复合体112的第1液槽104A内存在分子马达130和引物131，则引物131与第2衔接子分子111进行杂交并且分子马达130在其下游结合。换言之，引物131按照与第2衔接子分子111进行杂交的方式设计。此处，引物131没有特别限定，例如可以设为5～40个碱基长度、优选15～35个碱基长度、更优选18～25个碱基长度的单链核苷酸。

接下来，如图7所示，利用在第1液槽104A与第2液槽104B之间形成的电压梯度，生物分子-衔接子分子复合体112在箭头A的方向上移动，分子马达130到达纳米孔101。这里，分子马达130的尺寸Dm大于纳米孔101的直径Dn(Dm>Dn)，因此若分子马达130到达纳米孔101的入口(第1液槽104A侧)，则无法穿过纳米孔101并进入出口侧(第2液槽104B侧)，止于纳米孔101的入口。

并且，如图8所示，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。如果基于分子马达130的互补链合成反应进行，则生物分子-衔接子分子复合体112被分子马达130上提的力强于生物分子-衔接子分子复合体112因电位梯度而向第2液槽104B侧移动的力，因此生物分子-衔接子分子复合体112逆着电位梯度向第1液槽104A方向(图8中箭头B的方向)被运送。此时，如上述那样，能够获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体112的碱基序列信息。

通过这样使用分子马达130来控制生物分子-衔接子分子复合体112的运送，能够使纳米孔穿过速度为每个碱基100μs以上，能够充分测定来自各碱基的封闭电流。

以这种方式，如图6～8所示，在利用分子马达130控制生物分子-衔接子分子复合体112的运送的方法中，由于在生物分子-衔接子分子复合体112的端部附近形成有立体结构，因此能够切实地防止当生物分子-衔接子分子复合体112在图8的箭头B方向上移动时从纳米孔101脱落。

[第1-2实施方式]

本实施方式中，对不同于图1等所示的第1衔接子分子110和第2衔接子分子111的、如图9所示的衔接子分子200进行说明。需说明的是，图9中示例性示出的衔接子分子200和使用其的生物分子分析装置中，对于与图1等所示的第1衔接子分子110和第2衔接子分子111相同的构成附以相同的符号，从而省略该项目中的详细说明。

图9所示的衔接子分子200具备：与生物分子109直接结合的双链核酸区域201；以及与双链核酸区域201中的不同于与生物分子109结合的端部的端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成的一对单链核酸区域202A和202B。需说明的是，单链核酸区域202A具有结合于3’末端的防脱落部113，单链核酸区域202B具有5’末端。另外，图9所示的衔接子分子200在单链核酸区域202B具有立体结构形成区域114。进一步，图9所示的衔接子分子200优选具有与立体结构形成区域114进行了杂交的立体结构形成抑制寡聚体115。图9所示的例子中，防脱落部113配置于具有3’末端的单链核酸区域202A的端部，在单链核酸区域202B中配置有立体结构形成区域114。但是，防脱落部113也可以不配置于单链核酸区域202A的端部而配置于具有5’末端的单链核酸区域202B的端部，且在单链核酸区域202A配置立体结构形成区域114。

需说明的是，通过在填充于第1液槽104A内的电解质溶液103中添加生物分子109、衔接子分子200和DNA连接酶，能够在填充于第1液槽104A内的电解质溶液103内形成生物分子-衔接子分子复合体203。

另外，虽然图中未示出，衔接子分子200与生物分子109也可以间接地连接。所谓间接地连接，是指包含：将衔接子分子200与生物分子109隔着规定的碱基长度的核酸片段连接、以及将衔接子分子200与生物分子109隔着根据生物分子109的种类所导入的官能团连接。

进一步，衔接子分子200中，双链核酸区域201中的与生物分子109连接的端部优选设为3’突出末端(例如dT突出末端)。通过将该端部设为3’dT突出末端，能够防止当衔接子分子200与生物分子109连接时形成衔接子分子200的二聚体。

进一步另外，衔接子分子200中，双链核酸区域201的长度和碱基序列没有特别限定，可以设为任意的长度和任意的碱基序列。例如作为双链核酸区域201的长度，可以设为5～100个碱基长度，可以设为10～80个碱基长度，可以设为15～60个碱基长度，也可以设为20～40个碱基长度。

进一步另外，衔接子分子200中，单链核酸区域202A和202B的长度和碱基序列没有特别限定，可以设为任意的长度和任意的碱基序列。需说明的是，单链核酸区域202A和202B彼此可以为相同的长度，也可以为不同的长度。单链核酸区域202A和202B可以具有彼此公共的碱基序列，如果彼此不互补则也可以具有完全不同的碱基序列。所谓为不互补，意思是在单链核酸区域202A和202B的碱基序列整体中互补序列的比例为30％以下，优选为20％以下，更优选为10％以下，进一步优选为5％以下，最优选为3％以下。

作为单链核酸区域202A和202B的长度，例如可以设为10～200个碱基长度，可以设为20～150个碱基长度，可以设为30～100个碱基长度，也可以设为50～80个碱基长度。另外，具有立体结构形成区域114的单链核酸区域202B中，可以将相比于立体结构形成区域114更靠近5’末端侧的碱基序列(例如20个碱基长度)设为90％以上由胸腺嘧啶构成的碱基序列、优选100％由胸腺嘧啶构成的碱基序列。通过将相比于立体结构形成区域114更靠近5’末端侧的碱基序列中的胸腺嘧啶比例设为该范围，能防止高次结构的形成，能够制成容易导入至纳米孔101的形状。

如以上那样构成的图9所示的具有衔接子分子200的生物分子-衔接子分子复合体203可利用图1所示的生物分子分析装置来进行分析。首先，如图10所示，如果在第1液槽104A内填充有包含生物分子-衔接子分子复合体203的电解质溶液103的状态下在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，使第1液槽104A侧为负电位、使第2液槽104B为正电位而形成电位梯度，则不具有防脱落部113的单链核酸区域202B的端部临近纳米孔101内。并且，进一步通过电压梯度，如图11所示，生物分子-衔接子分子复合体203经由(穿过)纳米孔101而向第2液槽104B移动。从该图10的状态向图11的状态推移时，生物分子-衔接子分子复合体203中的双链核酸(衔接子分子200中的双链核酸区域201和生物分子109、立体结构形成区域114和立体结构形成抑制寡聚体115)被拉开(Unziped)。

以这种方式，通过使用衔接子分子200，不对作为双链核酸的生物分子109进行繁杂的改性处理(例如热处理)，就能够设为可穿过纳米孔101的单链核酸。即，能够通过使用衔接子分子202而容易地拉开双链核酸。并且，如果具有立体结构形成区域114的单链核酸区域202B被导入第2液槽104B中，则在立体结构形成区域114中形成立体结构。

另外，如图11所示，生物分子分析装置能够使成为单链的生物分子-衔接子分子复合体203经由纳米孔101从第1液槽104A向第2液槽104移动，而通过反转电压梯度，能够使成为单链的生物分子-衔接子分子复合体203经由纳米孔101从第2液槽104B向第1液槽104A移动。即，如图12A所示，利用使第1液槽104A为负电位、使第2液槽104B为正电位而形成的电压梯度，能够使生物分子-衔接子分子复合体203在图中箭头[A]所示的方向上移动。反之，如图12B所示，利用使第2液槽104B为负电位、使第1液槽104A为正电位而形成的电压梯度，能够使生物分子-衔接子分子复合体203在图中箭头[B]所示的方向上移动。以这种方式，生物分子分析装置通过控制第1液槽104A与第2液槽104B之间的电压梯度，能够使成为单链的生物分子-衔接子分子复合体203在第1液槽104A与第2液槽104B之间往复运动。

特别是在第2液槽104B内，由于在生物分子-衔接子分子复合体203的末端附近形成有立体结构，因此能够切实地防止当生物分子-衔接子分子复合体203在图12B的箭头B方向上移动时从纳米孔101脱落。由此，伴随上述往复运动，能够多次读取生物分子109的碱基序列，能够切实地提高读取精度。

[第1-3实施方式]

本实施方式中，对于与图1和图9等所示的第1衔接子分子110、第2衔接子分子111和衔接子分子200不同的、如图13所示的衔接子分子300进行说明。需说明的是，图13中例示性示出的衔接子分子300和使用其的生物分子分析装置中，对于与图1和图9等所示的第1衔接子分子110、第2衔接子分子111和衔接子分子200相同的构成，赋予相同的符号，从而在本项目中省略详细说明。

图13所示的衔接子分子300具备结合于生物分子109的双链核酸区域201、在双链核酸区域201中的与结合生物分子109的端部不同的端部连接且由彼此不互补的碱基序列构成的一对单链核酸区域301A和301B、以及在单链核酸区域301A的末端配置的防脱落部113。需说明的是，单链核酸区域301A具有3’末端，单链核酸区域301B具有5’末端。另外，图13所示的衔接子分子300在单链核酸区域301B具有立体结构形成区域114。进一步，图13所示的衔接子分子300优选具有与立体结构形成区域114进行了杂交的立体结构形成抑制寡聚体115。

图13所示的衔接子分子300中的单链核酸区域301A具有可结合分子马达的分子马达结合部302。另外，图13所示的衔接子分子300中的单链核酸区域301A具有使引物可在分子马达结合部302的3’末端侧进行杂交的引物结合部303。引物结合部303只要具有与所使用的引物的碱基序列互补的序列即可，不限定于具体的碱基序列。此处，所谓引物，没有特别限定，例如可以设为5～40个碱基长度、优选15～35个碱基长度、更优选18～25个碱基长度的单链核苷酸。因而，引物结合部303可以设为作为10～40个碱基长度、优选15～35个碱基长度、更优选18～25个碱基长度的区域的、由与引物的碱基序列互补的碱基序列构成的区域。

进一步，图13所示的衔接子分子300中的单链核酸区域301A在分子马达结合部302与引物结合部303之间具有间隔区304。这里所谓间隔区304，意思是分子马达无法结合的区域、即不包含由AGCT构成的碱基的区域。作为间隔区304，没有特别限定，可以设为不含碱基的直链状连接体。特别地，间隔区304的长度优选设为相当于至少2个碱基的长度、即约0.6×2nm以上。换言之，通过间隔区304，能够将分子马达结合部302与引物结合部303之间隔开2个碱基以上(约0.6×2nm以上)。作为构成间隔区304的材料，可列举Integrated DNATechnologies公司提供的C3 Spcer、PC spacer、Spacer9、Spacer18和dSpacer等能够在DNA链中配置的材料。除此之外，作为间隔区304，还可以使用直链状碳链、直链状氨基酸、直链脂肪酸和直链状糖链等。

进一步另外，图13所示的衔接子分子300中，可以将双链核酸区域201中的规定区域设为标识序列(未图示)。所谓标识序列，也称为条码序列、索引序列，意思是衔接子分子300中固有的碱基序列。例如通过预先准备仅标识序列不同的多个衔接子分子300，能够基于标识序列来确定所使用的衔接子分子300的种类。

使用图14A和图14B以及图15A～图15G对使用了以上那样构成的衔接子分子300的生物分子109的分析方法进行说明。

首先，准备在生物分子109的两端部分别结合了衔接子分子300的生物分子-衔接子分子复合体305。在第1液槽104A内，填充包含该生物分子-衔接子分子复合体305、分子马达130、引物131和立体结构形成抑制寡聚体115的电解质溶液。由此，如图14A所示，分子马达130结合于衔接子分子300中的分子马达结合部302，引物131在引物结合部303进行杂交，立体结构形成抑制寡聚体115在单链核酸区域301B的立体结构形成区域114进行杂交。

接下来，在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，形成以第1液槽104A侧为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度。由此，单链核酸区域301B向纳米孔101方向移动，立体结构形成抑制寡聚体115未杂交的5’末端区域被导入纳米孔101内。并且，如图14B所示，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，生物分子-衔接子分子复合体305经由(穿过)纳米孔101向第2液槽104B移动。此时，生物分子-衔接子分子复合体305中的双链核酸(衔接子分子300中的双链核酸区域201与生物分子109、立体结构形成抑制寡聚体115与立体结构形成区域114)被拉开(Unziped)。

以这种方式，即使在使用衔接子分子300的情况下，不对作为双链核酸的生物分子109进行繁杂的改性处理(例如热处理)，也能够得到可穿过纳米孔101的单链核酸。即，即使在使用衔接子分子300的情况下，也能容易地拉开双链核酸。需说明的是，在图14A和图14B所示的状态下，由于引物131与分子马达130分开了间隔区304的长度，因此以引物131的3’末端为起点的由分子马达130进行的互补链合成反应不会开始。并且，如果具有立体结构形成区域114的单链核酸区域301B被导入第2液槽104B中，则在立体结构形成区域114中形成立体结构。

并且，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，如图15A所示，成为单链的生物分子-衔接子分子复合体305穿过纳米孔101，然后，分子马达130到达纳米孔101。成为单链的生物分子-衔接子分子复合体305由于带负电荷，因此进一步向下游方向行进，以间隔区304为中心引起形状变化。这样一来，分子马达130与引物131的3’末端接触、结合(图15B)。由此，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。需说明的是，图15A～图15H中白色空心的箭头是指从负极朝着正极的电位梯度。

并且，如图15C所示，如果基于分子马达130的互补链合成反应进行，则相比于成为单链的生物分子-衔接子分子复合体305因电位梯度而向第2液槽104B侧移动的力，成为单链的生物分子-衔接子分子复合体305被分子马达130提起的力更强，因此成为单链的生物分子-衔接子分子复合体305逆着电位梯度向第1液槽104A方向(图15C中箭头M的方向)被运送。此时，能够获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体305的碱基序列信息。

并且，如图15D所示，如果在生物分子-衔接子分子复合体305的单链核酸区域301B形成的立体结构到达纳米孔101，则基于分子马达130的运送动作和测序停止。在基于分子马达130的运送动作和测序停止的阶段，使第2液槽104B内为更强的正电位。其结果是，如图15E所示，生物分子-衔接子分子复合体305因电位梯度而向第2液槽104B侧移动(图15E中箭头M的方向)。此时，通过分子马达130合成的生物分子-衔接子分子复合体305的互补链306从生物分子-衔接子分子复合体305被拉开(Unziped)，同时分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体305解离。

需说明的是，关于使第2液槽104B内为更强的正电位的时机，还可以设为在一定时间自动切换的方法、使用读取到的碱基序列信息进行切换的方法。或者，由于立体结构接近纳米孔101时能够测定封闭电流的减少，因此也可以在检测到封闭电流减少的阶段使第2液槽104B内为更强的正电位。利用这些中的任一方法，通过在单链核酸区域301B形成立体结构，能够防止成为单链的生物分子-衔接子分子复合体305整体穿过纳米孔101。

并且，接下来，如图15F所示，将施加于第1电极105A和第2电极105B的电压反转，形成以第1液槽104A为正电位、以第2液槽104B为负电位的电位梯度。由此，能够使成为单链的生物分子-衔接子分子复合体305经由纳米孔101从第2液槽104B向第1液槽104A方向移动。

然后，如图15G所示，在填充于第1液槽104A的电解质溶液103中添加分子马达130和引物131，使引物131在引物结合部303进行杂交，使分子马达130与分子马达结合部302结合。然后，再次将施加于第1电极105A和第2电极105B的电压反转，形成以第1液槽104A为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度。由此，使引物131进行了杂交、结合了分子马达130的生物分子-衔接子分子复合体305向第2液槽104B方向移动。并且，如图15B所示，产生以间隔区304为中心的形状变化，形成引物131的3’末端与分子马达130接触的状态。即，通过重复图15A～图15G，能够在基于分子马达130的每次运送动作中进行测序。

需说明的是，根据参考文献(Nat Nanotechnol.2010.November；5(11)：798-806)，教导了在使用分子马达130的测定(纳米孔101的直径1.4nm)中，一边施加至少80mV以上的电压一边测定。这种情况下，根据参考文献(Nature physics，5，347-351，2009.)，教导了施加大约24pN的力。因而，本实施方式中，防脱落部113在以80mV的电压测定的情况下优选以24pN以上的结合力结合于单链核酸区域301A。

特别是在第2液槽104B内，由于在生物分子-衔接子分子复合体305的末端附近形成了立体结构，因此能够切实地防止生物分子-衔接子分子复合体305从第2液槽104B向第1液槽104A的方向移动时从纳米孔101脱落。由此，伴随上述往复运动，能够多次读取生物分子109的碱基序列，能够切实地提高读取精度。

[第2-1实施方式]

本实施方式中，对于与第1-1～3实施方式中所示的衔接子分子不同、具有多个引物结合部位和对应于该引物结合部位的分子马达结合部的衔接子分子进行说明。本实施方式中说明的衔接子分子等中，对于与第1-1～3的实施方式中所示的衔接子分子相同的构成，赋予相同的符号，从而在本项目中省略详细说明。

图16示出了对具有本实施方式涉及的衔接子分子400的生物分子-衔接子分子复合体401进行分析的生物分子分析装置100。生物分子分析装置100为对生物分子-衔接子分子复合体401进行分析的装置，为采用封闭电流方式测定离子电流的生物分子分析用设备。生物分子分析装置100具备形成有纳米孔101的基板102、按照夹着基板102而与基板102相接的方式配置且在其内部充满电解质溶液103的一对液槽104(第1液槽104A和第2液槽104B)、以及分别与第1液槽104A和第2液槽104B相接的一对电极105(第1电极105A和第2电极105B)。测定时，从电压源107向一对电极105之间施加规定的电压，电流流过一对电极105之间。在电极105之间流过的电流大小利用电流计106测定，其测定值利用计算机108进行分析。

如图17(A)和(B)所示，本实施方式所示的衔接子分子400具有多个如下的组，所述组为分子马达130可结合的分子马达结合部402、与使引物131可在相比于该分子马达结合部402更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部403的组。需说明的是，作为衔接子分子400，可以如图17(A)所示由单链DNA构成，也可以如图17(B)所示，在分析对象的生物分子109为双链DNA的情况下，将与该生物分子109连接的端部设为双链DNA。另外，衔接子分子400优选在一个端部(例如3’末端)具备防脱落部113。

此处，分子马达结合部402与引物结合部位403的组合的数量只要为多个(2个以上)则没有特别限定，例如可以设为2～10组，更优选设为2～5组。这些分子马达结合部402与引物结合部位403的组合的数量对应于读取生物分子109的碱基序列的次数。因此，也可以预先确定读取生物分子109的碱基序列的次数，按照与该次数对应的方式，设定分子马达结合部402与引物结合部位403的组合的数量。

使用图18～图21对使用以上那样构成的衔接子分子400的生物分子109的分析方法进行说明。

首先，准备在生物分子109的一个端部结合了衔接子分子400的生物分子-衔接子分子复合体401。在第1液槽104A内，填充包含该生物分子-衔接子分子复合体401、分子马达130和引物131的电解质溶液。由此，分子马达130分别结合在衔接子分子400中的多个分子马达结合部402，引物131分别在多个引物结合部403进行杂交。

接下来，在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，形成以第1液槽104A侧为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度。由此，如图18所示，生物分子-衔接子分子复合体401中的衔接子分子400未结合的端部向纳米孔101方向移动，被导入纳米孔101内。并且，由于第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，使生物分子-衔接子分子复合体401经由(穿过)纳米孔101向第2液槽104B移动。虽然图中未示出，通过在第2液槽104B的电解质溶液103中添加防脱落部113，能够在移动至第2液槽104B的生物分子-衔接子分子复合体401的端部附加防脱落部113。

并且，由于第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，如图19所示，生物分子-衔接子分子复合体401穿过纳米孔101，然后，位于与生物分子109最接近的位置的分子马达130到达纳米孔101。在该状态下，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。

并且，如图20所示，如果基于分子马达130的互补链合成反应进行，则相比于生物分子-衔接子分子复合体401因电位梯度而向第2液槽104B侧移动的力，生物分子-衔接子分子复合体401被分子马达130提起的力更强，因此生物分子-衔接子分子复合体401逆着电位梯度向第1液槽104A方向(图20中箭头B的方向)被运送。此时，能够获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体401的碱基序列信息。

并且，如图20所示，如果生物分子-衔接子分子复合体401中的与位于第2液槽104B的端部结合的防脱落部113到达纳米孔101，则基于分子马达130的运送动作和测序停止。在基于分子马达130的运送动作和测序停止的阶段，使第2液槽104B内为更强的正电位。其结果是，如图21所示，生物分子-衔接子分子复合体401因电位梯度而向第2液槽104B侧移动(图21中箭头A的方向)。此时，通过分子马达130合成的生物分子-衔接子分子复合体401的互补链404从生物分子-衔接子分子复合体401被拉开(Unziped)，同时分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体401解离。

需说明的是，关于使第2液槽104B内为更强的正电位的时机，还可以设为在一定时间自动切换的方法、使用读取到的碱基序列信息进行切换的方法。或者，由于防脱落部113接近纳米孔101时能够测定封闭电流的减少，因此也可以在检测到封闭电流减少的阶段使第2液槽104B内为更强的正电位。利用这些中的任一方法，能够利用防脱落部113防止生物分子-衔接子分子复合体401整体穿过纳米孔101并脱落。

并且，互补链404和分子马达130被拉开后，如图21所示，位于与生物分子109最接近的位置的下一个分子马达130到达纳米孔101。在该状态下，分子马达130从引物131的3’末端开始互补链合成反应。即，如图20所示，利用下一个分子马达130，生物分子-衔接子分子复合体401逆着电位梯度再次向第1液槽104A方向被运送。此时，能够再次获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体401的碱基序列信息。

如上述那样，能够根据结合于衔接子分子400的分子马达130和引物131的组的数量，多次获取碱基序列信息。使用该衔接子分子400的情况下，不进行使施加于第1液槽104A与第2液槽104B之间的电压反转的控制、一次测定后再次使分子马达130和引物131结合的工序，也能够通过上述一系列处理，多次获取生物分子109的碱基序列信息。即，在使用该衔接子分子400的情况下，伴随基于非常简便操作的往复运动，能够切实地提高对于生物分子109的碱基序列的读取精度。

[第2-2实施方式]

本实施方式中，对于与图16等所示的衔接子分子400不同的、图22所示的衔接子分子500进行说明。衔接子分子500中，对于与第1-1～3的实施方式所示的衔接子分子、衔接子分子400相同的构成，赋予相同的符号，从而在本项目中省略详细说明。

图22所示的衔接子分子500具备：直接结合于生物分子109的双链核酸区域501、以及与双链核酸区域501中的结合于生物分子109的端部不同的端部连接且由彼此不互补的碱基序列构成的一对单链核酸区域502A和502B。另外，图22所示的衔接子分子500在单链核酸区域502A具有多个组的分子马达结合部503和引物结合部504。单链核酸区域502B具有5’末端，单链核酸区域502A具有3’末端。需说明的是，优选在单链核酸区域502A的末端具备防脱落部113。

另外，单链核酸区域502B的长度和碱基序列没有特别限定，可以设为任意的长度和任意的碱基序列。需说明的是，单链核酸区域502A和502B彼此可以为相同的长度，也可以为不同的长度。此处，所谓单链核酸区域502A和502B彼此不互补，是指在单链核酸区域502A和502B的碱基序列整体中互补序列的比例为30％以下，优选为20％以下，更优选为10％以下，进一步优选为5％以下，最优选为3％以下。

作为单链核酸区域502B的长度，例如可以设为10～200个碱基长度，可以设为20～150个碱基长度，可以设为30～100个碱基长度，可以设为50～80个碱基长度。作为一例，特别是具有5’末端的单链核酸区域502B可以设为90％以上由胸腺嘧啶构成的碱基序列、优选100％由胸腺嘧啶构成的碱基序列。通过将具有5’末端的单链核酸区域502B中的胸腺嘧啶比例设为该范围，能够防止高次结构的形成，能够维持容易导入至纳米孔101的形状。

需说明的是，也可以通过在填充于第1液槽104A内的电解质溶液103中添加生物分子109、衔接子分子500和DNA连接酶，从而如图23所示在填充于第1液槽104A内的电解质溶液103内形成生物分子-衔接子分子复合体505。

另外，虽然图中未示出，衔接子分子500与生物分子109也可以间接地连接。所谓间接地连接，是指包含：将衔接子分子500与生物分子109隔着规定碱基长度的核酸片段连接的情况、以及将衔接子分子500与生物分子109隔着根据生物分子109的种类所导入的官能团进行连接的情况。

进一步，衔接子分子500中，双链核酸区域501中的与生物分子109连接的端部优选设为3’突出末端(例如dT突出末端)。通过将该端部设为3’dA突出末端，能够防止在将衔接子分子500与生物分子109连接时形成衔接子分子500的二聚体。

进一步另外，衔接子分子500中，双链核酸区域501的长度和碱基序列没有特别限定，可以设为任意的长度和任意的碱基序列。例如作为双链核酸区域501的长度，可以设为5～100个碱基长度，可以设为10～80个碱基长度，可以设为15～60个碱基长度，可以设为20～40个碱基长度。

如以上那样构成的具有图22所示的衔接子分子500的生物分子-衔接子分子复合体505可以利用图16所示的生物分子分析装置进行分析。首先，虽然图中未示出，在第1液槽104A内填充包含生物分子-衔接子分子复合体505、分子马达130和引物131的电解质溶液103。由此，如图23所示，在第1液槽104A内中，多个组的分子马达130和引物131结合于生物分子-衔接子分子复合体505。在该状态下，如果在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，形成以第1液槽104A侧为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度，则单链核酸区域502B的端部(单链核酸)临近纳米孔101内。并且，进一步由于电压梯度，如图24所示，生物分子-衔接子分子复合体505经由(穿过)纳米孔101而向第2液槽104B移动。从该图23的状态向图24的状态推移时，生物分子-衔接子分子复合体505中的双链核酸(衔接子分子500中的双链核酸区域501和生物分子109)被拉开(Unziped)。

以这种方式，通过使用衔接子分子500，不对作为双链核酸的生物分子109进行繁杂的改性处理(例如热处理)，也能够得到可穿过纳米孔101的单链核酸。即，通过使用衔接子分子500，能够容易地拉开双链核酸。并且，如图24所示，通过在第2液槽104B的电解质溶液103中添加防脱落部113，能够在移动至第2液槽104B的生物分子-衔接子分子复合体505的端部附加防脱落部113。

并且，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，如图24所示，成为单链的生物分子-衔接子分子复合体505穿过纳米孔101，然后，位于与生物分子109最接近的位置的分子马达130到达纳米孔101。在该状态下，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。

并且，如果基于分子马达130的互补链合成反应进行，则相比于成为单链的生物分子-衔接子分子复合体505因电位梯度而向第2液槽104B侧移动的力，生物分子-衔接子分子复合体505被分子马达130提起的力更强，因此生物分子-衔接子分子复合体505逆着电位梯度向第1液槽104A方向被运送。此时，能够获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体505的碱基序列信息。

并且，如图25所示，如果生物分子-衔接子分子复合体505中的与位于第2液槽104B的端部结合的防脱落部113到达纳米孔101，则基于分子马达130的运送动作和测序停止。在基于分子马达130的运送动作和测序停止的阶段，使第2液槽104B内为更强的正电位。其结果是，如图26所示，生物分子-衔接子分子复合体50因电位梯度而向第2液槽104B侧移动。此时，通过分子马达130合成的生物分子-衔接子分子复合体505的互补链506从生物分子-衔接子分子复合体505被拉开(Unziped)，同时分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体505解离。

需说明的是，关于使第2液槽104B内为更强的正电位的时机，还可以设为在一定时间自动切换的方法、使用读取到的碱基序列信息进行切换的方法。或者，由于在防脱落部113接近纳米孔101时能够测定封闭电流的减少，因此也可以在检测到封闭电流减少的阶段使第2液槽104B内为更强的正电位。利用这些中的任一方法，能够利用防脱落部113防止生物分子-衔接子分子复合体505整体穿过纳米孔101并脱落。

并且，互补链506和分子马达130被拉开后，如图26所示，位于与生物分子109最接近的位置的下一个分子马达130到达纳米孔101。在该状态下，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。即，如图27所示，利用下一个分子马达130，生物分子-衔接子分子复合体505逆着电位梯度再次向第1液槽104A方向被运送。此时，能够再次获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体505的碱基序列信息。

如上述那样，根据结合于衔接子分子500的分子马达130和引物131的组的数量，能够多次获取生物分子109的碱基序列信息。使用该衔接子分子500的情况下，不进行使施加于第1液槽104A与第2液槽104B之间的电压反转的控制、一次测定后再次使分子马达130和引物131结合的工序，也能够通过上述一系列处理，多次获取生物分子109的碱基序列信息。即，在使用该衔接子分子500的情况下，伴随基于非常简便操作的往复运动，能够切实地提高对于生物分子109的碱基序列的读取精度。

[第2-3实施方式]

本实施方式中，对于与图16等所示的衔接子分子400、图22等所示的衔接子分子500不同的衔接子分子进行说明。本项目中，对于与第1-1～3的实施方式所示的衔接子分子、衔接子分子400或500相同的构成，赋予相同的符号，从而省略其详细说明。

如图28所示，衔接子分子600具备：结合于生物分子109的双链核酸区域601、以及与双链核酸区域601中的结合于生物分子109的端部不同的端部连接且由彼此不互补的碱基序列构成的一对单链核酸区域601A和601B。单链核酸区域601A具有3’末端，单链核酸区域601B具有5’末端。需说明的是，单链核酸区域601A的3‘末端优选具备防脱落部113。另外，图28所示的衔接子分子600在单链核酸区域601B具有立体结构形成区域114。进一步，图28所示的衔接子分子600优选具有在立体结构形成区域114进行了杂交的立体结构形成抑制寡聚体115。

图28所示的衔接子分子600中的单链核酸区域601A具有分子马达130可结合的多个分子马达结合部602。另外，图28所示的衔接子分子600中的单链核酸区域601A具有使引物131可在分子马达结合部602的3’末端侧进行杂交的多个引物结合部603。即，图28所示的衔接子分子600在单链核酸区域601A具有多个组的分子马达结合部602和引物结合部503。

进一步，图28所示的衔接子分子600中的单链核酸区域601A在多个组的分子马达结合部602与引物结合部603之间分别具有间隔区604。这里所谓间隔区604，是指分子马达130无法结合的区域、即不含由AGCT构成的碱基的区域。作为间隔区604，没有特别限定，可以设为不含碱基的直链状连接体。特别是，间隔区604的长度优选设为相当于至少2个碱基的长度、即约0.6×2nm以上。换言之，利用间隔区604，能够将分子马达结合部602与引物结合部603之间隔开2个碱基以上(约0.6×2nm以上)。作为构成间隔区604的材料，可列举Integrated DNA Technologies公司提供的C3 Spcer、PC spacer、Spacer9、Spacer18和dSpacer等能在DNA链中配置的材料。除此之外，作为间隔区604，还可以使用直链状碳链、直链状氨基酸、直链脂肪酸和直链状糖链等。

进一步另外，图28所示的衔接子分子600中，可以将双链核酸区域601中的规定区域设为标识序列(未图示)。所谓标识序列，也称为条码序列、索引序列，是指衔接子分子600中固有的碱基序列。例如通过事先准备仅标识序列不同的多个衔接子分子600，能够基于标识序列来确定所使用的衔接子分子600的种类。

需说明的是，图28所示的衔接子分子600示出了已形成与生物分子109连接的生物分子-衔接子分子复合体605、且分子马达130和引物131结合的状态。在图28所示的状态下，在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，形成以第1液槽104A侧为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度。由此，如图29所示，单链核酸区域601B向纳米孔101方向移动，立体结构形成抑制寡聚体115未杂交的5’末端区域被导入纳米孔101内。并且，如图30所示，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，生物分子-衔接子分子复合体605经由(穿过)纳米孔101向第2液槽104B移动。此时，生物分子-衔接子分子复合体605中的双链核酸(衔接子分子600中的双链核酸区域601与生物分子109、立体结构形成抑制寡聚体115与立体结构形成区域114)被拉开(Unziped)。

以这种方式，即使在使用了衔接子分子600的情况下，不对作为双链核酸的生物分子109进行繁杂的改性处理(例如热处理)，也能够得到可穿过纳米孔101的单链核酸。即，即使在使用衔接子分子600的情况下，也能容易地拉开双链核酸。需说明的是，在图30所示的状态下，引物131与分子马达130隔开了间隔区604的长度，因此从引物131的3’末端开始的基于分子马达130的互补链合成反应不会开始。并且，具有立体结构形成区域114的单链核酸区域601B被导入第2液槽104B时，在立体结构形成区域114中形成立体结构。

并且，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，如图30所示，成为单链的生物分子-衔接子分子复合体605穿过纳米孔101，然后，分子马达130到达纳米孔101。由于成为单链的生物分子-衔接子分子复合体605带负电荷，因此进一步向下游方向行进，以间隔区604为中心引起形状变化。这样一来，分子马达130与引物131的3’末端接触、结合(图31)。由此，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。

并且，如图32所示，如果基于分子马达130的互补链合成反应进行，则相比于成为单链的生物分子-衔接子分子复合体605因电位梯度而向第2液槽104B侧移动的力，成为单链的生物分子-衔接子分子复合体605被分子马达130提起的力更强，因此生物分子-衔接子分子复合体605逆着电位梯度向第1液槽104A方向(图32中箭头B的方向)被运送。此时，能够获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体605的碱基序列信息。

并且，如图32所示，如果在生物分子-衔接子分子复合体605的单链核酸区域601B形成的立体结构到达纳米孔101，则基于分子马达130的运送动作和测序停止。在基于分子马达130的运送动作和测序停止的阶段，使第2液槽104B内为更强的正电位。其结果是，如图33所示，生物分子-衔接子分子复合体605因电位梯度而向第2液槽104B侧移动(图33中箭头A的方向)。此时，通过分子马达130合成的生物分子-衔接子分子复合体605的互补链606从生物分子-衔接子分子复合体605被拉开(Unziped)，同时分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体605解离。

需说明的是，关于使第2液槽104B内为更强的正电位的时机，还可以设为在一定时间自动切换的方法、使用读取到的碱基序列信息进行切换的方法。或者，由于在立体结构接近纳米孔101时能够测定封闭电流的减少，因此也可以在检测到封闭电流减少的阶段使第2液槽104B内为更强的正电位。利用这些中的任一方法，通过在单链核酸区域601B形成立体结构，能够防止成为单链的生物分子-衔接子分子复合体605整体穿过纳米孔101。

并且，如图33所示，位于与生物分子109最接近的位置的下一个分子马达130到达纳米孔101。并且，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，带负电荷的生物分子-衔接子分子复合体605进一步向下游方向行进，以间隔区604为中心引起形状变化。这样一来，分子马达130与引物131的3’末端接触、结合(图31参照)。由此，分子马达130从引物131的3’末端再次开始互补链合成反应。即，如图34所示，利用下一个分子马达130，生物分子-衔接子分子复合体605逆着电位梯度再次向第1液槽104A方向被运送。此时，能够再次获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体605的碱基序列信息。

如上述那样，根据结合于衔接子分子600的分子马达130和引物131的组的数量，能够多次获取生物分子109的碱基序列信息。使用该衔接子分子600的情况下，不进行使施加于第1液槽104A与第2液槽104B之间的电压反转的控制、一次测定后再次使分子马达130和引物131结合的工序，也能够通过上述一系列处理，多次获取生物分子109的碱基序列信息。即，使用该衔接子分子600的情况下，伴随基于非常简便操作的往复运动，能够切实地提高对于生物分子109的碱基序列的读取精度。

特别是在使用该衔接子分子600的情况下，在第2液槽104B内，由于在生物分子-衔接子分子复合体605的末端附近形成了立体结构，因此能够切实地防止生物分子-衔接子分子复合体605从第2液槽104B向第1液槽104A的方向移动时从纳米孔101脱落。由此，伴随上述往复运动，能够切实地提高生物分子109的碱基序列的读取精度。

[第3-1实施方式]

本实施方式中，对于与第1-1～3实施方式所示的衔接子分子和第2-1～3实施方式所示的衔接子分子不同的、具有与生物分子与分子马达的结合力相比与分子马达的结合力低的分子马达脱离诱导部的衔接子分子进行说明。本实施方式中说明的衔接子分子等中，对于与第1-1～3实施方式所示的衔接子分子和第2-1～3实施方式所示的衔接子分子相同的构成，赋予相同的符号，从而在本项目中省略详细说明。

图35示出了对具有本实施方式涉及的衔接子分子700的生物分子-衔接子分子复合体701进行分析的生物分子分析装置100。生物分子分析装置100为对生物分子-衔接子分子复合体701进行分析的装置，为采用封闭电流方式测定离子电流的生物分子分析用设备。生物分子分析装置100具备：形成有纳米孔101的基板102、按照夹着基板102而与基板102相接的方式配置且在其内部充满电解质溶液103的一对液槽104(第1液槽104A和第2液槽104B)、以及分别与第1液槽104A和第2液槽104B相接的一对电极105(第1电极105A和第2电极105B)。测定时，从电压源107向一对电极105之间施加规定的电压，电流流过一对电极105之间。在电极105之间流过的电流大小利用电流计106测定，其测定值利用计算机108进行分析。

如图36(A)和(B)所示，衔接子分子700在分子中具有分子马达脱离诱导部702。分子马达脱离诱导部702为和分子马达130的结合力与生物分子109和分子马达130的结合力相比低这样的特征区域。作为分子马达脱离诱导部702，没有特别限定，可以设为由不具有磷酸二酯键的碳链或脱碱基序列构成的区域。这里，DNA聚合酶等分子马达130结合于核苷酸通过磷酸二酯键结合而成的核酸。由此，作为分子马达脱离诱导部702，可以设为与核酸不同的结构，即作为一例，为除了单体通过磷酸二酯键连接而成的结构之外的链状结构。作为分子马达脱离诱导部702，更优选设为不具有碱基的结构。作为一例，分子马达脱离诱导部702可以由iSpC3系的脱碱基构成。这种情况下，为了以分子马达结合(例如聚合酶)的大小以下配置磷酸基，优选以平均的分子马达的物理尺寸以上的长度具有无磷酸基区域。作为例子，可使用iSp9、iSp18。另外，分子马达脱离诱导部702可以是这些中的多种有规则或无规地连接而成的。进一步，分子马达脱离诱导部702不限于上述那样由脱碱基构成的情况，也可以是任意长度的碳链、任意长度的聚乙二醇(PEG)。另外，分子马达脱离诱导部702只要能抑制和脱离基于聚合酶的延伸反应，则也可以是具有磷酸基的修饰碱基。作为这样的例子，可列举硝基吲哚(Nitroindole)。通过在分子马达脱离诱导部702使用硝基吲哚，能够停止聚合酶的延伸反应。

需说明的是，作为衔接子分子700，可以如图36(A)所示由单链DNA构成，也可以如图36(B)所示，当分析对象的生物分子109为双链DNA时，将与该生物分子109连接的端部设为双链DNA。

衔接子分子700连接于分析对象的生物分子109的一个端部。在生物分子109的另一个端部，可连接具备能够使分子马达130结合的分子马达结合部703、以及能够使引物131杂交的引物结合部704的衔接子分子705(以下，称为分子马达结合用衔接子分子705)。分子马达结合用衔接子分子705优选在与生物分子109连接的端部的相反侧的端部(例如3’末端)具备防脱落部113。

图36(A)和图36(B)所示的例子中，设为在生物分子109的5’末端连接衔接子分子700、在生物分子109的3’末端连接分子马达结合用衔接子分子705的构成。可以使用图36(A)和图36(B)所示的任一衔接子分子700和分子马达结合用衔接子分子705，通过使双链区域成为单链，从而能够如图36(C)所示，制作单链的生物分子-衔接子分子复合体701。

使用图37～图39对使用了以上那样构成的衔接子分子700的生物分子109的分析方法进行说明。

首先，准备在生物分子109的一个端部结合了衔接子分子700、在另一个端部结合了分子马达结合用衔接子分子705的生物分子-衔接子分子复合体701。在第1液槽104A内，填充包含该生物分子-衔接子分子复合体701、分子马达130和引物131的电解质溶液。由此，分子马达130在分子马达结合用衔接子分子705中的分子马达结合部703结合，引物131在引物结合部704进行杂交。

接下来，在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，形成以第1液槽104A侧为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度。由此，生物分子-衔接子分子复合体701中的衔接子分子700的端部向纳米孔101方向移动，被导入纳米孔101内。并且，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，生物分子-衔接子分子复合体701经由(穿过)纳米孔101向第2液槽104B移动。虽然图中未示出，通过在第2液槽104B的电解质溶液103中添加防脱落部113，能够在移动至第2液槽104B的生物分子-衔接子分子复合体401的端部附加防脱落部113。

并且，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，如图37所示，生物分子-衔接子分子复合体701穿过纳米孔101，然后，结合于分子马达结合部703的分子马达130到达纳米孔101。在该状态下，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。

并且，如图38所示，在基于分子马达130的互补链合成反应进行时，相比于生物分子-衔接子分子复合体701因电位梯度而向第2液槽104B侧移动的力，生物分子-衔接子分子复合体701被分子马达130提起的力更强，因此生物分子-衔接子分子复合体701逆着电位梯度向第1液槽104A方向(图38中箭头B的方向)被运送。此时，能够获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体701的碱基序列信息。

并且，分子马达130将生物分子-衔接子分子复合体701向第1液槽104A方向持续运送，如图39所示，如果分子马达130来到分子马达脱离诱导部702的位置，则分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体701解离。如果分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体701解离，则利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，具有互补链706的生物分子-衔接子分子复合体701向第2液槽104B方向移动，互补链706从生物分子-衔接子分子复合体701被拉开(Unzipped)。

如以上那样，通过使用衔接子分子700，分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体701容易地解离，因此不需要使第2液槽104B内为更强的正电位而将分子马达130强制解离的同时将合成的互补链拉开这样的处理。进一步，通过使用衔接子分子700，分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体701容易地解离，然后，生物分子-衔接子分子复合体701向第2液槽104B方向移动，因此即使在衔接子分子700的端部不具有防脱落部113，也能防止生物分子-衔接子分子复合体701的脱落。

另外，虽然图中未示出，通过将合成的互补链706拉开后，使第1液槽104A与第2液槽104B之间为相反的电位梯度(使第1液槽104A为正电位、第2液槽104B为负电位)，从而能够使生物分子-衔接子分子复合体701向第1液槽104A方向移动，再次使分子马达130和引物131结合于分子马达结合用衔接子分子705的规定位置。然后，按照图37～39所示的工序，能够再次获取生物分子109的碱基序列信息。

如以上那样使用了衔接子分子700的情况下，不需要控制第1液槽104A与第2液槽104B之间的电压梯度而使分子马达130解离、将互补链706拉开的处理，伴随基于非常简便操作的往复运动，能够切实地提高对于生物分子109的碱基序列的读取精度。

[第3-2实施方式]

本实施方式中，说明与图36(A)和(B)所示的衔接子分子700和分子马达结合用衔接子分子705不同的、如图40所示的衔接子分子800。需说明的是，图40中例示性示出的衔接子分子800和使用其的生物分子分析装置中，对于与图36(A)和图36(B)所示的衔接子分子700和分子马达结合用衔接子分子705相同的构成，赋予相同的符号，从而在本项目中省略详细说明。

图40所示的衔接子分子800具备：直接结合于生物分子109的双链核酸区域801、以及与双链核酸区域801中的结合于生物分子109的端部不同的端部连接且由彼此不互补的碱基序列构成的一对单链核酸区域802A和802B。需说明的是，单链核酸区域802A具有在3’末端结合的防脱落部113，单链核酸区域802B具有5’末端。另外，图40所示的衔接子分子800在单链核酸区域802B具有立体结构形成区域114。进一步，图40所示的衔接子分子800优选具有在立体结构形成区域114进行了杂交的立体结构形成抑制寡聚体115。进一步另外，衔接子分子800在单链核酸区域801B中，在相比于立体结构形成区域114更靠近双链核酸区域801的位置具有分子马达脱离诱导部702。

图40所示的衔接子分子800中的单链核酸区域801A具有可结合分子马达的分子马达结合部803。另外，图40所示的衔接子分子800中的单链核酸区域801A具有使引物可在分子马达结合部803的3’末端侧进行杂交的引物结合部804。引物结合部804只要具备与所使用的引物的碱基序列互补的序列即可，具体的碱基序列没有限定。此处，所谓引物，没有特别限定，例如可以设为10～40个碱基长度、优选15～35个碱基长度、更优选18～25个碱基长度的单链核苷酸。因而，引物结合部303可以设为作为10～40个碱基长度、优选15～35个碱基长度、更优选18～25个碱基长度的区域的、由与引物的碱基序列互补的碱基序列构成的区域。

进一步，图40所示的衔接子分子800中的单链核酸区域802A在分子马达结合部803与引物结合部804之间具有间隔区805。这里所谓间隔区805，是指分子马达无法结合的区域、即不含由AGCT构成的碱基的区域。作为间隔区805，没有特别限定，可以设为不含碱基的直链状连接体。特别是间隔区805的长度优选设为相当于至少2个碱基的长度、即约0.6×2nm以上。换言之，利用间隔区805，能够将分子马达结合部803与引物结合部804之间隔开2个碱基以上(约0.6×2nm以上)。作为构成间隔区805的材料，可列举Integrated DNATechnologies公司提供的C3 Spcer、PC spacer、Spacer9、Spacer18和dSpacer等能在DNA链中配置的材料。除此之外，作为间隔区805，还可以使用直链状碳链、直链状氨基酸、直链脂肪酸和直链状糖链等。

进一步另外，图40所示的衔接子分子800中，可以将双链核酸区域801中的规定区域设为标识序列(未图示)。所谓标识序列，也称为条码序列、索引序列，是指衔接子分子800中固有的碱基序列。例如通过事先准备仅标识序列不同的多个衔接子分子800，能够基于标识序列来确定所使用的衔接子分子800的种类。

使用图41～图45，对使用了以上那样构成的衔接子分子800的生物分子109的分析方法进行说明。

首先，准备在生物分子109的两端部分别结合了衔接子分子800的生物分子-衔接子分子复合体806。在第1液槽104A内，填充包含该生物分子-衔接子分子复合体806、分子马达130、引物131和立体结构形成抑制寡聚体115的电解质溶液。由此，如图41所示，分子马达130结合于衔接子分子800中的分子马达结合部803，引物131在引物结合部804进行杂交，立体结构形成抑制寡聚体115在单链核酸区域802B的立体结构形成区域114进行杂交。

接下来，在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，形成以第1液槽104A侧为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度。由此，单链核酸区域802B的前端向纳米孔101方向移动，立体结构形成抑制寡聚体115未杂交的5’末端区域被导入纳米孔101内。并且，如图42所示，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，生物分子-衔接子分子复合体806经由(穿过)纳米孔101向第2液槽104B移动。此时，生物分子-衔接子分子复合体806中的双链核酸(衔接子分子800中的双链核酸区域801与生物分子109、立体结构形成抑制寡聚体115与立体结构形成区域114)被拉开(Unziped)。

以这种方式，即使在使用了衔接子分子800的情况下，不对作为双链核酸的生物分子109进行繁杂的改性处理(例如热处理)，就能够设为可穿过纳米孔101的单链核酸。即，即使在使用了衔接子分子800的情况下，也能容易地拉开双链核酸。需说明的是，在图41和42所示的状态下，引物131与分子马达130分隔了间隔区805的长度，因此通过以引物131的3’末端为起点的分子马达130进行的互补链合成反应不会开始。并且，如果具有立体结构形成区域114的单链核酸区域802B被导入第2液槽104B中，则在立体结构形成区域114中形成立体结构。

并且，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，如图42所示，成为单链的生物分子-衔接子分子复合体806穿过纳米孔101，然后，分子马达130到达纳米孔101。成为单链的生物分子-衔接子分子复合体806由于带负电荷，因此进一步向下游方向行进，以间隔区805为中心引起形状变化。这样一来，分子马达130与引物131的3’末端接触、结合(图43)。由此，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。

并且，如图44所示，如果基于分子马达130的互补链合成反应进行，则相比于成为单链的生物分子-衔接子分子复合体805因电位梯度而向第2液槽104B侧移动的力，成为单链的生物分子-衔接子分子复合体805被分子马达130提起的力更强，因此成为单链的生物分子-衔接子分子复合体805逆着电位梯度向第1液槽104A方向被运送。此时，能够获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体806的碱基序列信息。

并且，分子马达130将生物分子-衔接子分子复合体806向第1液槽104A方向持续运送，如图45所示，如果形成于单链核酸区域802B的立体结构到达纳米孔101的同时分子马达130来到分子马达脱离诱导部702的位置，则分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体806解离。并且，虽然图中未示出，如果分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体806解离，则利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，具有互补链807的生物分子-衔接子分子复合体806向第2液槽104B方向移动，互补链807从生物分子-衔接子分子复合体805被拉开(Unzipped)。

使用衔接子分子800的情况下，由于分子马达130也从生物分子-衔接子分子复合体806容易地解离，因此无需使第2液槽104B内成为更强的正电位而将分子马达130强制解离的同时将合成的互补链807拉开那样的处理。进一步，使用衔接子分子800的情况下，由于在生物分子-衔接子分子复合体806中的第2液槽104B内的端部附近形成立体结构，因此能够更切实地防止生物分子-衔接子分子复合体806从纳米孔101的脱落。

另外，虽然图中未示出，将合成的互补链807拉开后，将施加于第1电极105A和第2电极105B的电压反转，形成以第1液槽104A为正电位、以第2液槽104B为负电位的电位梯度。由此，能够使成为单链的生物分子-衔接子分子复合体806经由纳米孔101从第2液槽104B向第1液槽104A方向移动。然后，在填充于第1液槽104A的电解质溶液103中添加分子马达130和引物131，使引物131在引物结合部804杂交，使分子马达130在分子马达结合部803结合。然后，再次将施加于第1电极105A和第2电极105B的电压反转，形成以第1液槽104A为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度。由此，使引物131进行了杂交且结合了分子马达130的生物分子-衔接子分子复合体806向第2液槽104B方向移动。并且，如图43所示，以间隔区805为中心产生形状变化，形成在分子马达130与引物131的3’末端接触的状态。即，通过重复图41～图45，能够在基于分子马达130的每次运送动作中进行测序。

如以上那样使用衔接子分子800的情况下，无需控制第1液槽104A与第2液槽104B之间的电压梯度而使分子马达130解离、将互补链807拉开的处理，伴随基于非常简便操作的往复运动，能够切实地提高对于生物分子109的碱基序列的读取精度。

[第3-3实施方式]

本实施方式中，对于与图36(A)和(B)所示的衔接子分子700和图40所示的衔接子分子800不同的、如图46所示的衔接子分子900进行说明。需说明的是，图46中例示性示出的衔接子分子900和使用其的生物分子分析装置中，对于与图36(A)和(B)所示的衔接子分子700和图40所示的衔接子分子800相同的构成，赋予相同的符号，从而在本项目中省略详细说明。

图46所示的衔接子分子900具备：结合于生物分子109的双链核酸区域901、以及与双链核酸区域901中的与生物分子109结合的端部不同的端部连接且由彼此不互补的碱基序列构成的一对单链核酸区域901A和901B。单链核酸区域901A具有3’末端，单链核酸区域901B具有5’末端。需说明的是，虽然图中未示出，也能够在单链核酸区域901A的末端具备防脱落部(图40等中的防脱落部113)。需说明的是，图46所示的衔接子分子900中，单链核酸区域901B具有分子马达脱离诱导部702。

图46所示的衔接子分子900中的单链核酸区域901A具有可结合分子马达130的多个分子马达结合部902。另外，图46所示的衔接子分子900中的单链核酸区域901A具有使引物131可在分子马达结合部902的3’末端侧进行杂交的多个引物结合部903。即，图46所示的衔接子分子900在单链核酸区域901A具有多个组的分子马达结合部902和引物结合部903。

进一步，图46所示的衔接子分子900中的单链核酸区域901A在多个组的分子马达结合部902与引物结合部903之间分别具有间隔区904。这里所谓间隔区904，是指无法结合分子马达130的区域、即不含由AGCT构成的碱基的区域。作为间隔区904，没有特别限定，可以设为不含碱基的直链状连接体。特别是间隔区904的长度优选设为相当于至少2个碱基的长度、即约0.6×2nm以上。换言之，利用间隔区904，能够使分子马达结合部902与引物结合部903之间隔开2个碱基以上(约0.6×2nm以上)。作为构成间隔区904的材料，可列举Integrated DNA Technologies公司提供的C3 Spcer、PC spacer、Spacer9、Spacer18和dSpacer等能在DNA链中配置的材料。除此之外，作为间隔区904，还可以使用直链状碳链、直链状氨基酸、直链脂肪酸和直链状糖链等。

进一步另外，图46所示的衔接子分子900中，可以将双链核酸区域901中的规定区域设为标识序列(未图示)。所谓标识序列，也称为条码序列、索引序列，是指衔接子分子900中固有的碱基序列。例如通过事先准备仅标识序列不同的多个衔接子分子900，能够基于标识序列来确定所使用的衔接子分子900的种类。

使用图47～图49，对于使用了以上那样构成的衔接子分子900的生物分子109的分析方法进行说明。

首先，准备将图46所示的衔接子分子900分别结合于生物分子109的两端部而成的生物分子-衔接子分子复合体905。将生物分子-衔接子分子复合体905与分子探针130和引物131一起填充至第1液槽10A。在该状态下，在第1电极105A和第2电极105B之间施加电压，形成以第1液槽104A侧为负电位、以第2液槽104B为正电位的电位梯度。由此，如图47所示，单链核酸区域901B向纳米孔101方向移动，双链核酸(衔接子分子900中的双链核酸区域901与生物分子109)被拉开(Unziped)。另外，如图47所示，生物分子-衔接子分子复合体905中的位于与生物分子109最接近的位置的分子马达130到达纳米孔101。在该状态下，分子马达130以引物131的3’末端为起点，从5’末端向3’末端的方向开始互补链合成反应。

以这种方式，即使在使用了衔接子分子900的情况下，不对作为双链核酸的生物分子109进行繁杂的改性处理(例如热处理)，也能够得到可穿过纳米孔101的单链核酸。即，即使在使用衔接子分子900的情况下，也能容易地拉开双链核酸。

并且，如果基于分子马达130的互补链合成反应进行，则成为单链的生物分子-衔接子分子复合体905逆着电位梯度向第1液槽104A方向被运送。此时，能够获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体905的碱基序列信息。

并且，分子马达130将生物分子-衔接子分子复合体905向第1液槽104A方向持续运送，如图48所示，如果分子马达130来到形成于单链核酸区域901B的分子马达脱离诱导部702的位置，则分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体905解离。并且，虽然图中未示出，如果分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体905解离，则利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，具有互补链906的生物分子-衔接子分子复合体905向第2液槽104B方向移动，互补链906从生物分子-衔接子分子复合体905被拉开(Unzipped)。

即使在使用了衔接子分子900的情况下，利用分子马达脱离诱导部702，分子马达130从生物分子-衔接子分子复合体905容易地脱离，因此无需使第2液槽104B内成为更强的正电位而将分子马达130强制解离的同时将合成的互补链906拉开那样的处理。

并且，位于与生物分子109最接近的位置的下一个分子马达130到达纳米孔101。并且，利用第1液槽104A与第2液槽104B之间的电位梯度，带负电荷的生物分子-衔接子分子复合体905进一步向下游方向行进，如图49所示，以间隔区904为中心引起形状变化，分子马达130与引物131的3’末端接触、结合。由此，分子马达130从引物131的3’末端再次开始互补链合成反应。即，利用下一个分子马达130，生物分子-衔接子分子复合体905逆着电位梯度再次向第1液槽104A方向被运送。此时，能够再次获取穿过纳米孔101的生物分子-衔接子分子复合体905的碱基序列信息。

如上述那样，根据结合于衔接子分子900的分子马达130和引物131的组的数量，能够多次获取生物分子109的碱基序列信息。在使用了该衔接子分子900的情况下，不进行使施加于第1液槽104A与第2液槽104B之间的电压反转的控制、一次测定后再次使分子马达130和引物131结合的工序，也能够通过上述一系列处理，多次获取生物分子109的碱基序列信息。即，在使用了该衔接子分子900的情况下，伴随基于非常简便操作的往复运动，能够切实地提高对于生物分子109的碱基序列的读取精度。

另外，以上说明的衔接子分子900也可以如图50所示，在单链核酸区域901B具有立体结构形成区域114、以及在立体结构形成区域114进行了杂交的立体结构形成抑制寡聚体115。立体结构形成区域114在单链核酸区域901B中位于相比于分子马达脱离诱导部702更靠近末端的一侧。使用了具有立体结构形成区域114和立体结构形成抑制寡聚体115的衔接子分子900的情况下，在图47～图49所示的状态下，在第2液槽104B内立体结构形成区域114形成立体结构。如果在生物分子-衔接子分子复合体905中的第2液槽104B内的端部附近形成立体结构，则能够更切实地防止生物分子-衔接子分子复合体905从纳米孔101的脱落。

实施例

以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明的技术范围不限定于以下的实施例。

〔参考例〕

如日本特开2010-230614公报中公开的那样，也有时采取基于如下操作的手段：使比链霉亲和素(SA)那样的纳米孔径大的分子结合于分析对象的DNA链的两末端，进行电压控制。但是，该方式的情况下，第2液槽104B(也称为反式腔室)侧的SA需要在使DNA链穿过纳米孔后结合。为了使穿过纳米孔的一分子的DNA链与在第2液槽104B侧溶解的一分子SA结合，需要在结合之前等待足够的时间，或将足够浓度的SA溶解。

本参考例中，示出进行在第2液槽104B内使SA结合于DNA链的实验的结果。关于第2液槽104B的盐浓度，以1M的KCl和3M的KCl来实施。作为生物分子，使用在单链DNA80mer的两末端进行了生物素修饰的生物分子。预先以SA能够仅结合于单侧的生物素的浓度比使单链DNA与SA反应，使其穿过纳米孔。

将在生物分子109不存在的状态下测定的电流值作为基准(孔电流)，根据电流值有无减少来判断纳米孔中的DNA的捕获、穿过、脱离。图51的上段示出在第2液槽104B侧仅放入测定溶液时的结果。将结合SA的ssDNA导入腔室，在开始测定后，立刻确认到来自DNA的离子电流的减少(封闭电流)。该封闭电流不被消除而继续堵塞纳米孔。这表示结合于DNA末端的SA由于具有纳米孔径以上的直径而无法通过并被纳米孔捕获。此处，如果将电压反转，则恢复至来自孔径的电流值。认为：由于在第2液槽104B中存在的DNA的末端保持为单链，因此通过电泳而到达了第1液槽104A侧。

此处，在第2液槽104B中，按照终浓度成为9μM的方式将SA溶解。DNA同样地在结合有一个SA的浓度下反应，用于纳米孔测定。如果将DNA导入第1液槽104A中，则同样确认到孔的堵塞现象。这里，如果在堵塞后立即进行电压反转，则与在第2液槽104B中未导入SA时同样地观察到恢复至孔电流的现象。另一方面，如果在堵塞确认后等待10分钟后将电压反转，则确认到测定的离子电流不恢复为孔电流而继续堵塞(图51下段)。

改变从确认到来自带有SA的DNA的堵塞到进行电压反转为止的时间，结果，需要至少10分钟的等待时间，另外即使等待10分钟以上也未必能够结合。即，可知，用于在第2液槽104B内使SA结合于DNA链的末端的时间长，是阻碍测定的高效化的主要原因。另外判明了，判断SA与DNA链末端的结合是否完成的基准也是模糊的。

〔实施例1〕

本实施例中，实际设计图13所示的衔接子分子300，对基于立体结构形成区域114的立体结构的有效性进行评价。

具体而言，作为生物分子109和引物131，设计表1所示的序列的DNA。在“Z”所表示的位置，配置iSpC3作为间隔区304。另外，作为防脱落部113，使用链霉亲和素。此外，立体结构形成区域114的序列使用表1所示的端粒序列。如表中那样设计双链区域201和随后的单链核酸区域301A和301B。

[表1]

图52示出了用于确认以下事项的实验数据：在结合有如以上那样设计的衔接子分子300的生物分子109中，通过立体结构形成区域114形成立体结构，能否在防脱落部113与该立体结构之间往复运送生物分子109。该实验中，纳米孔测定通常使用的盐浓度的溶液，设定为由具有纳米孔101的薄膜102分离的第1液槽104A、第2液槽104B内的缓冲溶液。这里，未进行聚合酶和引物的结合。

这里，通过结合SA而导致纳米孔被堵塞，这通过上述〔参考例〕所示的实验进行了确认，因此确认到纳米孔101被端粒结构堵塞。图52示出测定不具有立体结构形成区域114的端粒结构的衔接子和具有端粒结构的衔接子时的离子电流变化。图52(a)中示出没有端粒结构的情况下获取的信号，图52(b)中示出有端粒结构的情况下获取的信号。没有端粒结构时，观察到穿过信号、即封闭信号自发恢复至基电流的情形。另一方面，使用具有端粒结构的样品时，确认封闭信号后，没有自发地恢复至基电流。另外，然后，将电压反转后确认到恢复至基电流。

图53中示出使作为单链且具有端粒结构的样品溶解于测定溶液并进行纳米孔测定的结果。结果，0.1V时确认到持续堵塞的信号。图52(b)中确认到的纳米孔的堵塞可以说是来自在衔接子分子内形成的端粒结构。另一方面，如果使测定电压逐渐上升，则还确认到成为穿过信号的情形。这表示端粒结构的耐压在0.2V附近。

基于以上的结果，在确认以SA和端粒结构作为防脱落部113的生物分子能够被纳米孔捕获的实验中，使用0.1V施加电压。

图54中，示出使用将具有端粒结构作为立体结构形成区域114的衔接子分子连接于生物分子而得的样品，确认生物分子是否能够被纳米孔捕获的结果。按照SA能够在单链核酸区域301A的末端结合的方式，在上述连接后使SA混合存在，并在37度孵育。导入样品后约25秒后，确认到在离子电流减少的状态下不恢复至基电流的现象。等待30秒后，将施加电压反转，但电流值并未恢复至基电流。进一步约5秒后，恢复施加电压，但没有恢复至基电流，获取了电压反转前的电流值。将这些动作重复三次，但并没有恢复至基电流。

图55中也揭露了同样的由不同孔和不同样品实施的实施例。同样地，即使在导入的样品发生堵塞前进行电压反转，也只是基电流被确认(<30秒)，但一旦堵塞被确认，堵塞电流不会恢复至基电流而是得到维持。

基于以上的情况，可推测出以下的内容。如图54上段的示意图所示，可认为表明了：在结合于单链核酸区域301A的SA与单链核酸区域301B穿过纳米孔101从而形成的立体结构之间，单链DNA(生物分子109)持续留在纳米孔内。根据以上的内容可得到如下的结论：在结合于第一控制链的防脱落部113与在立体结构形成区域114形成的立体结构之间，能够实现可迅速地往复运动的构成。

〔实施例2〕

本实施例中，设计了具有与分子马达的结合力相比于生物分子与分子马达的结合力低的分子马达脱离诱导部的衔接子分子，并研究了利用该分子马达脱离诱导部是否能够使分子马达解离。

具体而言，如表2所示，设计“Primer Oligo 23nt”作为引物131，设计了具有3种分子马达脱离诱导部的衔接子分子。

[表2]

表2中，X表示分子马达脱离诱导部。Z所表示的位置为由iSpC3构成的间隔区。

使用表2中记载的引物131和衔接子分子，在分子马达存在下观察纳米孔穿过信号，将结果示于图56a和图56b。另外，本实施例中，作为代表性模板，使用iSp18x4_T20_Deb18。衔接子分子中，在X示出的位置存在分子马达脱离诱导部。与使用不具有分子马达脱离诱导部的模板来观察纳米孔穿过信号时同样，确认到：被认为是引物的unzip信号的、阻断时间为1ms以下的快速穿过信号；以及被认为是来自基于聚合酶的运送的信号的、阻断时间为1～100ms的穿过信号。此处，没有确认到如下的信号：在不存在dNTP的情况下被确认的信号、即在聚合酶结合于模板的状态下由纳米孔捕获的信号、换言之纳米孔被聚合酶堵塞且该状态被维持的信号。使用在图56a所用的单链上附加结合SA而成的分子进行同样的测定，结果确认到堵塞被维持的信号(图56b)。

根据这些结果，推测出以下的内容。图56a的结果如示意图所示，认为是如下的状态：从引物使延伸反应开始的分子马达到达分子马达脱离诱导链时从单链脱离，开始拉开合成链，模板穿过纳米孔。根据图56b的结果认为，由于SA结合于模板的末端，因此根据图56a的结果设想的模板穿过纳米孔时，被SA捕获而并未实现穿过。需说明的是，由于已经确认了在堵塞确认后将电压反转时会恢复至基电流，由此可认为，利用SA实现了单链被捕获的状态。

根据以上的内容表明，通过配设分子马达脱离诱导部，能够停止从模板对分子马达的积极运送，能够解除与作为模板的单链DNA的结合。

〔实施例3〕

本实施例中，研究了如图17所示的衔接子分子400那样，在具有引物结合部位和分子马达结合部的多个组的情况下，相邻的引物结合部位的优选间隔。

具体而言，在具备引物结合部位和位于其下游的间隔区(由脱碱基构成的区域)的构成中，将相邻的引物结合部位的间隔设为15个碱基长度、25个碱基长度、35个碱基长度或75个碱基长度，设计了衔接子分子。制备包含所设计的衔接子分子和分子马达(聚合酶)的缓冲溶液，在使分子马达结合于衔接子分子后进行电泳。

其结果示于图57。图57中、“聚合酶：+”“聚合酶：-”表示是在缓冲溶液中存在作为分子马达的聚合酶的状态下的实验(+)还是不存在的状态下的实验(-)。当聚合酶在任一条件下结合于衔接子分子时，新的条带出现在与仅在退火时出现的条带位置不同的位置。如图57所示，对于本实施例中设计的全部衔接子分子，均在聚合酶存在下观察到新的条带。由此可知，即使将相邻的引物结合部位的间隔设为15个碱基长度、25个碱基长度、35个碱基长度或75个碱基长度，作为分子马达的聚合酶也能够结合。

〔实施例4〕

本实施例中，如图46所示的衔接子分子900那样，设计了具有与分子马达的结合力相比于生物分子与分子马达的结合力低的分子马达脱离诱导部、且具有多个如下的组合的衔接子分子，确认能否进行对象分子的重复运送控制，所述组合为具有引物结合部、分子马达结合部、在引物结合部与分子马达结合部之间的间隔区的组合。

具体而言，如表3所示，作为引物131，设计了“Primer Oligo 23nt”，作为衔接子分子，按照“Primer Oligo 23nt”在3个部位结合的方式设计了“串联引物模板”(序列编号10)。分析对象分子的长度设为69mer。另外，相邻的引物结合部位的间隔设为15mer。

[表3]

表3中，X表示分子马达脱离诱导部。Z所表示的位置为由iSpC3构成的间隔区。

使用表3中记载的引物131和衔接子分子，在分子马达存在下观察纳米孔穿过信号，将结果示于图58。图58(a)为测定到的封闭信号的代表图。认为电流值变得特别高的部分表示纳米孔的电阻变得最低，表示“串联引物模板”中的iSpC3的部分。

此处，为了调查读取同一区域得到的波形反映在获取的波形中，而进行点图(Dotplot)分析。点图中，对于在各级所对应的电流值下形成的波形的、例如每10级的波形划分通过动态伸缩法进行分析，其结果是，相似度越高则越输出高分(图58(b))。图58(b)中，对角线表示同一部位的相似度，因此输出的是完全一致的分数。另一方面，例如80～100级与120～140级，表明虽然在不同的位置之间但充分地一致。

对获取的波形进行级别提取，使用前述方法，在每30级的波形划分中对彼此相似度高的位置进行探索。关于级别提取，将任意时间窗口中的电流值的平均值定义为代表电流值。获取的点图如图58(b)所示。图58(b)中示出的是，相对于总级别数200，粗略显示了0～60级、60～120级、120～200级是相似的。另外，还显示第二轮的级别80～110、110～140也相似。

如果根据目的重复分析此次设计的序列，则读取对象区域会被重复3次。此外，第3次重复时，会读取引物部分2次，因此作为相似波形输出的第二根线会偏离。实际上，如图58(b)所示，在此次的点图分析中，成为反应了这一情况的输出。根据该结果，表示实现了符合设计的3次重复分析。

根据以上内容表明，通过准备多个引物结合部、且配置分子马达脱离诱导部，能够在不进行电压控制的情况下，将利用聚合酶的运送以及聚合酶的脱离和unzip的重复操作按照引物结合的数量自动进行重复，能够进行对象分子的高精度分析。

〔参考例2〕

本参考例2中，对通过半导体微细加工技术制作本发明适用的纳米孔的步骤进行说明。首先，在厚度725μm的8英寸Si晶圆的表面，使Si₃N₄/SiO₂/Si₃N₄分别以膜厚12nm/250nm/100nm依次成膜。另外，在Si晶圆的背面，使Si₃N₄以112nm成膜。

接下来，对于Si晶圆表面最上部的Si₃N₄，在500nm见方中，通过反应性离子蚀刻而除去。同样地，对于Si晶圆背面的Si₃N₄，在1038μm见方中，通过反应性离子蚀刻而除去。对于背面，进一步，对通过蚀刻而露出的Si基板，利用TMAH(Tetramethylammonium hydroxide，四甲基氢氧化铵)进一步蚀刻。Si蚀刻期间，为了防止表面侧的SiO蚀刻，优选用保护膜(ProTEKTMB3primer and ProTEKTMB3,Brewer Science,Inc.)覆盖晶圆表面。中间层的SiO可以为多晶硅。

接下来，去除该保护膜后，将在500nm见方中露出的SiO层用BHF溶液(HF/NH₄F＝1/60、8分钟)去除。由此，得到露出了膜厚12nm的薄膜Si₃N₄的分隔体。牺牲层选择多晶硅的情况下，通过利用KOH的蚀刻使薄膜露出。在该阶段，薄膜中未设置纳米孔。

纳米孔的形成例如可通过以下的步骤进行。将分隔体设置于生物分子分析用设备等之前，利用Ar/O2等离子体(SAMCO Inc.,日本)，以10W、20sccm、20Pa、45sec的条件，使Si₃N₄薄膜亲水化。接下来，在生物分子分析用设备中设置分隔体。然后，用1M的KCl、1mMTris-10mM EDTA、pH7.5溶液充满夹着薄膜的上下液槽，在各液槽中分别导入电极。

电压的施加不仅在纳米孔的形成时进行，也在纳米孔形成后测定穿过纳米孔而流动的离子电流时进行。这里，将位于下侧的液槽称为cis槽，将位于上侧的液槽称为trans槽。另外，将施加于cis槽侧的电极的电压Vcis设定为0V，向trans槽侧的电极施加电压Vtrans。电压Vtrans通过脉冲发生器(例如41501B SMU AND Pulse Generator Expander,Agilent Technologies,Inc.)产生。

脉冲施加后的电流值可通过电流计(例如4156B PRECISION SEMICONDUCTORANALYZER,Agilent Technologies,Inc.)读取。可以根据在施加脉冲电压前形成的纳米孔的直径来选择电流值条件(阈值电流)，依次增大纳米孔的直径并且得到目标直径。

纳米孔的直径根据离子电流值进行估算。条件选择的基准如表4所示。

[表4]

电压施加条件

施加脉冲电压前的纳米孔径	不开口～0.7nmΦ	～1.4nmΦ	～1.5nmΦ
				施加电压(V<sub>Cis</sub>)[V]	10	5	3
初期施加时间[s]	0.001	0.01	0.001
				阈值电流	0.1nA/0.4V	0.6nA/0.1V	0.75nA/0.1V

此处，第n次的脉冲电压施加时间tn(其中，n>2的整数。)由下式确定。

[数1]

t_n＝10^{-3+(1/6)(n-1)}-10^{-3+(1/6)(n-2)}其中n＞2

如以上那样，表明通过具体的方法，能够适当制作具有期望的开口直径的纳米孔。关于纳米孔的形成，除了施加脉冲电压的方法以外，还可通过基于TEM的电子束照射来进行(A.J.Storm等,Nat.Mat.2(2003))。

Claims (41)

1.一种衔接子分子，其能够与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。

2.根据权利要求1所述的衔接子分子，其特征在于，具备：

双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及

单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、且具有所述立体结构形成区域。

3.根据权利要求1所述的衔接子分子，其特征在于，具备：

双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及

一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，

所述立体结构形成区域位于这一对单链核酸区域中具有5’末端的单链核酸区域内。

4.根据权利要求1所述的衔接子分子，其特征在于，具备相对于所述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。

5.根据权利要求4所述的衔接子分子，其特征在于，所述立体结构形成抑制寡聚体与所述立体结构形成区域的至少一部分进行了杂交，相比于立体结构形成抑制寡聚体进行了杂交的部分更靠近末端的一侧为单链。

6.根据权利要求3所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备与所述生物分子的分析装置中的纳米孔的直径相比直径更大的防脱落部。

7.根据权利要求6所述的衔接子分子，其特征在于，所述防脱落部为能与所述单链核酸区域结合的分子或在所述单链核酸区域内的互补区域形成的发夹结构。

8.根据权利要求3所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备可结合分子马达的分子马达结合部。

9.根据权利要求8所述的衔接子分子，其特征在于，具备所述分子马达结合部的单链核酸区域具备使引物可在比该分子马达结合部更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部。

10.根据权利要求9所述的衔接子分子，其特征在于，在所述分子马达结合部与所述引物结合部之间，具有无法结合所述分子马达的间隔区。

11.一种衔接子分子，其为能与分析对象的生物分子直接或间接地结合、且由单链核苷酸构成的衔接子分子，具有多个如下的组，所述组为可结合分子马达的分子马达结合部与使引物可在比该分子马达结合部更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部的组。

12.根据权利要求11所述的衔接子分子，其特征在于，在所述分子马达结合部与所述引物结合部之间，具有无法结合所述分子马达的间隔区。

13.根据权利要求11所述的衔接子分子，其特征在于，在与所述生物分子直接或间接地结合的端部的相反侧的端部，具备与所述生物分子的分析装置中的纳米孔的直径相比直径更大的防脱落部。

14.根据权利要求13所述的衔接子分子，其特征在于，所述防脱落部为能与所述单链核酸区域结合的分子或在所述单链核酸区域内的互补区域形成的发夹结构。

15.根据权利要求11所述的衔接子分子，其特征在于，具备：

双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及

单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、末端为3’末端、且具有所述分子马达结合部和所述引物结合部的多个组。

16.根据权利要求11所述的衔接子分子，其特征在于，具备：

双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及

一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，

所述分子马达结合部和所述引物结合部的多个组位于这一对单链核酸区域中具有3’末端的单链核酸区域内。

17.根据权利要求16所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中具有5’末端的单链核酸区域具有立体结构形成区域。

18.根据权利要求17所述的衔接子分子，其特征在于，具备相对于所述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。

19.根据权利要求18所述的衔接子分子，其特征在于，所述立体结构形成抑制寡聚体与所述立体结构形成区域的至少一部分进行了杂交，相比于立体结构形成抑制寡聚体进行了杂交的部分更靠近末端的一侧为单链。

20.根据权利要求16所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中具有5’末端的单链核酸区域具有与分子马达的结合力比所述生物分子低的分子马达脱离诱导部。

21.一种衔接子分子，其能与分析对象的生物分子直接或间接地结合，且具有与分子马达的结合力比所述生物分子低的分子马达脱离诱导部。

22.根据权利要求21所述的衔接子分子，其特征在于，所述分子马达脱离诱导部为不具有磷酸二酯键的碳链或脱碱基序列部。

23.根据权利要求21所述的衔接子分子，其特征在于，在相比于所述分子马达脱离诱导部更靠近5’末端的一侧进一步具有由单链核苷酸构成的立体结构形成区域。

24.根据权利要求21所述的衔接子分子，其特征在于，具备：

双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及

单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、末端为5’末端、且具有所述分子马达脱离诱导部。

25.根据权利要求21所述的衔接子分子，其特征在于，具备：

双链核酸区域，其由彼此互补的碱基序列构成、且具有与所述分析对象的生物分子直接或间接地结合的一个端部；以及

一对单链核酸区域，其与该双链核酸区域中的不同于所述一个端部的另一个端部连接、且由彼此不互补的碱基序列构成，

所述分子马达脱离诱导部位于这一对单链核酸区域中具有5’末端的单链核酸区域内。

26.根据权利要求23所述的衔接子分子，其特征在于，具备相对于所述立体结构形成区域的至少一部分具有互补的碱基序列的立体结构形成抑制寡聚体。

27.根据权利要求26所述的衔接子分子，其特征在于，所述立体结构形成抑制寡聚体与所述立体结构形成区域的至少一部分进行了杂交，相比于立体结构形成抑制寡聚体进行了杂交的部分更靠近末端的一侧为单链。

28.根据权利要求25所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备与所述生物分子的分析装置中的纳米孔的直径相比直径更大的防脱落部。

29.根据权利要求28所述的衔接子分子，其特征在于，所述防脱落部为能与所述单链核酸区域结合的分子或在所述单链核酸区域内的互补区域形成的发夹结构。

30.根据权利要求25所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具备可结合分子马达的分子马达结合部。

31.根据权利要求30所述的衔接子分子，其特征在于，具备所述分子马达结合部的单链核酸区域具备使引物可在比该分子马达结合部更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部。

32.根据权利要求31所述的衔接子分子，其特征在于，在所述分子马达结合部与所述引物结合部之间，具有无法结合所述分子马达的间隔区。

33.根据权利要求25所述的衔接子分子，其特征在于，所述一对单链核酸区域中端部为3’末端的单链核酸区域具有多个如下的组，所述组为可结合分子马达的分子马达结合部与使引物可在比该分子马达结合部更靠近3’末端的一侧进行杂交的引物结合部的组。

34.根据权利要求33所述的衔接子分子，其特征在于，在所述分子马达结合部与所述引物结合部之间，具有无法结合所述分子马达的间隔区。

35.一种生物分子-衔接子分子复合体，包括：分析对象的生物分子、以及与该生物分子的至少一个末端直接或间接地结合的权利要求1至10中任一项所述的衔接子分子。

36.一种生物分子-衔接子分子复合体，包括：分析对象的生物分子、以及与该生物分子的至少一个末端直接或间接地结合的权利要求11至20中任一项所述的衔接子分子。

37.一种生物分子-衔接子分子复合体，包括：分析对象的生物分子、以及与该生物分子的至少一个末端直接或间接地结合的权利要求21至34中任一项所述的衔接子分子。

38.一种生物分析装置，其具备：

具有纳米孔的薄膜；

隔着所述薄膜相对的第1液槽和第2液槽；

电压源，在所述第1液槽中填充有包含权利要求35、36或37所述的生物分子-衔接子分子复合体的电解质溶液并且在所述第2液槽中填充有电解质溶液的状态下，向第1液槽与第2液槽之间施加电压；以及

控制装置，控制所述所述电压源以在所述第1液槽与所述第2液槽之间形成期望的电位梯度。

39.一种生物分子的分析方法，其特征在于，具备：

形成电位梯度的工序，在隔着具有纳米孔的薄膜相对的第1液槽与第2液槽中在第1液槽内填充有包含权利要求35所述的生物分子-衔接子分子复合体的电解质溶液且在第2液槽内填充有电解质溶液的状态下，向第1液槽与第2液槽之间施加电压，使第1液槽侧为负电位或接地电位，使第2液槽为正电位；

在所述第2液槽内所述衔接子分子的立体结构形成区域形成立体结构的工序；以及

对所述生物分子-衔接子分子复合体经由所述纳米孔在所述第2液槽与所述第1液槽之间移动时产生的信号进行测定的工序，

在所述形成电位梯度的工序中，生物分子-衔接子分子复合体中的立体结构形成区域经由所述纳米孔被导入所述第2液槽内，所述生物分子-衔接子分子复合体由于电位梯度而从所述第1液槽向所述第2液槽移动。

40.一种生物分子的分析方法，其特征在于，具备：

形成电位梯度的工序，在隔着具有纳米孔的薄膜相对的第1液槽与第2液槽中在第1液槽内填充有包含权利要求36所述的生物分子-衔接子分子复合体、可与衔接子分子中的分子马达结合部结合的分子马达和可与衔接子分子中的引物结合部进行杂交的引物的电解质溶液且在第2液槽内填充有电解质溶液的状态下，向第1液槽与第2液槽之间施加电压，使第1液槽侧为负电位或接地电位，使第2液槽为正电位；以及

对所述生物分子-衔接子分子复合体经由所述纳米孔在所述第2液槽与所述第1液槽之间移动时产生的信号进行测定的工序，

对所述信号进行测定的工序中，离纳米孔最近的所述分子马达从与所述引物结合部进行了杂交的引物开始合成互补链，从而使所述生物分子-衔接子分子复合体从所述第2液槽向所述第1液槽移动，对所述生物分子-衔接子分子复合体穿过所述纳米孔时产生的信号进行测定，然后，通过使具有互补链的所述生物分子-衔接子分子复合体从所述第1液槽向所述第2液槽移动从而将该互补链拉开，离纳米孔最近的所述分子马达再次合成互补链，从而使所述生物分子-衔接子分子复合体从所述第2液槽向所述第1液槽移动，并对信号进行测定，重复以上操作。

41.一种生物分子的分析方法，其特征在于，具备：

形成电位梯度的工序，在隔着具有纳米孔的薄膜相对的第1液槽与第2液槽中在第1液槽内填充有包含权利要求37所述的生物分子-衔接子分子复合体、可与该生物分子-衔接子分子复合体中的分子马达结合部结合的分子马达和可与该生物分子-衔接子分子复合体中的引物结合部进行杂交的引物的电解质溶液且在第2液槽内填充有电解质溶液的状态下，向第1液槽与第2液槽之间施加电压，使第1液槽侧为负电位或接地电位，使第2液槽为正电位；以及

对在所述生物分子-衔接子分子复合体经由所述纳米孔在所述第2液槽与所述第1液槽之间移动时产生的信号进行测定的工序，

对所述信号进行测定的工序中，所述分子马达从与所述引物结合部进行了杂交的引物开始合成互补链，从而使所述生物分子-衔接子分子复合体从所述第2液槽向所述第1液槽移动，并且该分子马达在所述生物分子-衔接子分子复合体中的分子马达脱离诱导部解离。

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