CN114364693A - 代谢性疾病的治疗和预防 - Google Patents

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Abstract

公开了通过抑制白介素11(IL‑11)介导的信号传导来治疗和预防代谢性疾病的方法，以及用于此类方法的药物。

Description

代谢性疾病的治疗和预防
本申请要求于2019年5月3日提交的GB 1906291.8、2019年5月10日提交的GB1906597.8、2020年1月24日提交的GB 2001013.8、2020年2月12日提交的GB 2001896.6，以及2020年2月14日提交的GB 2002030.1的优先权，为了所有目的，通过引用将其内容和要素并入本文。
发明领域
本发明涉及代谢性疾病的诊断、治疗和预防。
发明背景
肥胖、糖尿病及相关疾病
肥胖(Obesity)被世界卫生组织定义为可能损害健康的过度脂肪堆积，并在BMI≥30kg/m2时诊断为肥胖。肥胖会显著增加代谢性疾病(包括2型糖尿病(Type 2 diabetesmellitus,T2D)和脂肪肝)、心血管疾病(包括高血压、心肌梗塞和中风)、肌肉骨骼疾病(例如骨关节炎)、阿尔茨海默病、抑郁症和某些类型癌症(乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肾癌和结肠癌)的风险——参见例如Bluher等人，《自然综述内分泌学》“Nat RevEndocrinol”.(2019)15:288-298和前瞻性研究协作(Prospective StudiesCollaboration)，《柳叶刀》“Lancet”.(2009)373(9669):1083-96。此外，肥胖可能会导致生活质量下降、失业、生产力下降和社会弊端，Berrington de Gonzalez等人，《新英格兰医学杂志》“N Engl J Med”(2010)363:2211-2219。肥胖还与预期寿命缩短有关，根据病情和共病障碍的严重程度，估计会减少5-20年，Fontaine等人，《美国医学会杂志》“JAMA”(2003)289:187-193。
在过去的50年里，肥胖的流行率已经上升到大流行的水平。1975年至2016年期间，全球儿童和青少年的肥胖患病率也以惊人的速度从男孩的0.7％增加到5.6％，女孩的从0.9％增加到7.8％(非传染性疾病风险控制协作组织(NCD-RisC)，《柳叶刀》“Lancet”(2017)390(10113):26227-2642)。生活方式的“西方化”和高热量食物已被证明是肥胖的主要原因。
全球人类健康面临的另一个最重要威胁是肥胖伴2型糖尿病(Type 2diabeteswith obesity)的发病率不断增加。Menke等人，《美国医学会杂志》“JAMA”(2015)314:1021-1029按BMI分类调查了趋势，糖尿病仅在肥胖受试者中增加了(18.0％至20.1％)，这表明糖尿病患病率的增加在很大程度上是由于肥胖患病率的增加。特别值得关注的是亚洲人糖尿病的高患病率，尽管他们的BMI较低，但他们患糖尿病的可能性比白人高30％-50％(Lee等人，《糖尿病护理》“Diabetes Care”(2011)34,353-357)。
二甲双胍(Metformin)已显示出治疗潜力，并已被用作糖尿病的一线治疗，同时让患者采用健康的生活方式，还包括定期锻炼以获得其抗肥胖的益处(Yerevanian等人，《当前肥胖报告》“Curr Obes Rep”(2019))。最近，白介素-1(Interleukin-1)也被证明是糖尿病的治疗靶点，可调节T2D中的低度炎症(Kataria等人，《免疫病理学研讨会》“SeminImmunopathol”.(2010))。
非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)
非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的全球患病率估计为25％(Friedman等人，《自然医学》“Nat Med”.(2018)24(7):908-922)，虽然NAFLD是可逆的，但它可以发展为非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)。NASH的特点是脂肪变性驱动的炎症、肝细胞死亡和肝纤维化，最终导致肝功能衰竭。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)在NASH的发病机制中起着关键作用，并产生高达95％的肝脏肌成纤维细胞(Liver myofibroblasts)(Mederacke等人，《自然通讯》“Nat Commun”(2013)4:2823)，它驱动了NASH中的许多关键病理，即肝纤维化、炎症和实质功能障碍(Friedman，《生理学综述》“Physiol Rev”(2008)88:125-172；Friedman，《生物化学杂志》“JBiol Chem”(2000)275:2247-2250；Higashi等人，《先进药物输送综述》“Adv Drug DelivRev”(2017)121:27-42)。
许多因素与HSC的激活和转化有关，包括典型的促纤维化因子转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGFβ1)和血小板衍生生长因子(Platelet-derivedgrowth factor,PDGF；Hellerbrand，《肝病学杂志》“J Hepatol”(1999)30:77-87；Tsuchida和Friedman，《自然综述：胃肠病学与肝脏病学》“Nat Rev Gastroenterol Hepatol”(2017)14:397-411)以及促炎因子，如CCL2、TNFα和CCL5(Friedman，《生物化学杂志》“J BiolChem”(2000)275:2247-2250；Tsuchida和Friedman，《自然综述：胃肠病学与肝脏病学》“NatRev Gastroenterol Hepatol”(2017)14:397-411；Kim等人，《科学报告》“Sci Rep”(2018)8:7499)。也许反映了这种复杂性和隐式冗余，在NASH中没有单一的上游启动因子能被成功靶向，也没有获批的NASH药物。目前，有许多药物正在进行NASH的临床试验，但其中许多药物都以代谢为靶点，尚不清楚它们是否能改善肝纤维化从而预测临床结果(Friedman等人，《自然医学》“Nat Med”.(2018)24(7):908-922；Banini等人，《胃肠病学最新观点》“CurrOpin Gastroenterol”(2017)33:134-141)。
静止期的HSC是储存维生素A的细胞，与成纤维细胞截然不同。然而，共同因素会将这两种细胞类型都激活并刺激它们向具有共同特征的肌成纤维细胞转变(Mederacke等人，《自然通讯》“Nat Commun”(2013)4:2823；Iwaisako等人，《美国科学院院报》“Proc NatlAcad Sci USA”2014；111:E3297-305)。IL-11(Interleukin11)最近被确定为心血管和肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的关键因素(Schafer等人，《自然》“Nature”2017；552:110-115；Cook等人，(2018)https://doi.org/10.1101/336537)。对肝脏中IL-11的了解非常有限，但据报道，当它以非常高的剂量注射给啮齿动物时，重组人IL-11具有保护作用(Zhu等人，《公共科学图书馆：综合》“PLoS One”(2015)10:e0126296；Yu等人，《肝病和胃肠病的临床与研究》“Clin Res Hepatol Gastroenterol”(2016)40:562-570)并在人类中进行了试验，试图减少晚期肝炎的炎症(Lawitz等人，《美国胃肠病学杂志》“Am J Gastroenterol”2004；99:2359-2364)。
消耗性疾病
消瘦可以定义为肌肉减少，伴有或不伴有脂肪量的减少，可表现为体重减轻。各种急性和慢性疾病以及衰老经常与消瘦有关。消瘦可能导致营养状况恶化、肌肉量和功能丧失、生活质量下降以及发病率和死亡率风险增加。肌肉消瘦是消瘦的最大共同点，尽管脂肪组织消瘦也可能单独发生或与肌肉消瘦结合发生。消耗性疾病的例子包括恶病质(Cachexia)、肌肉减少症(Sarcopenia)(例如与衰老相关的或缺乏使用的骨骼肌量和力量的减少)、厌食症(Anorexia)(对食物缺乏或失去食欲)、肌肉减少(Myopenia)(一般建议用于描述肌肉萎缩的术语)、脂肪营养不良(Lipodystrophy)(脂肪沉积的特定消耗)和脂肪萎缩(Lipoatrophy)。目前公认的恶病质定义是：“一种多因素综合征，其特征是骨骼肌量持续减少(伴有或不伴有脂肪量的减少)，无法通过常规营养支持完全逆转并导致进行性功能障碍”(Evans等人，《临床营养》“Clin Nutr”.2008(6):793-9)。
消瘦在晚期慢性病患者中非常普遍。根据肌肉减少症、恶病质和消耗性疾病协会(Society on Sarcopenia,Cachexia and Wasting Disorders,SCWS)的数据，大约5-15％的慢性心力衰竭或慢性阻塞性肺疾病患者表现出消耗性疾病，而60-80％的晚期癌症患者患有消耗性疾病)。20％的癌症死亡直接归因于恶病质(Skipworth等人，《临床营养》“ClinNutr”.2007；26:667-76)。在感染性疾病(例如HIV/AIDS、疟疾和肺结核)以及慢性疾病(例如囊性纤维化、肝硬化、肾功能衰竭、克罗恩病、类风湿性关节炎、中风和神经退行性疾病)患者中已经注意到消瘦。外伤、手术后、失重、慢性酒精中毒和败血症也与消瘦的发生有关(Farkas等人，《恶病质肌肉减少症和肌肉杂志》“J Cachexia Sarcopenia Muscle”(2013)4:173-178)。
消瘦和消耗性疾病通常对基础疾病的治疗产生负面影响：它们会损害患者对基础疾病治疗的应答，损害免疫系统并导致基础疾病的症状恶化。因此，改善消瘦的治疗可能会提高对基础疾病/病症的治疗效果，并改善患者的预后。
例如，晚期癌症相关恶病质通常会导致抗癌治疗的预后不良。与体重稳定的患者相比，在化疗前和化疗期间经历体重减轻的癌症患者接受较低的初始剂量，并经历更频繁和更严重的剂量限制毒性，因此接受的治疗显著减少，或者事实上从一开始就可能被排除在治疗方案之外(Vaughan等人，《恶病质肌肉减少症和肌肉杂志》“J Cachexia SarcopeniaMuscle”(2013)4:95-109)。对消瘦的有效治疗将为此类患者带来更积极的效果。
目前，消瘦的治疗包括食欲兴奋剂和锻炼以增加肌肉量。然而，单独的营养补充或药物控制食欲通常无法逆转消瘦过程，特别是在严重或晚期时。二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA；一种来自鱼油的欧米伽3(Omega-3)脂肪酸)已在改善癌症背景下的恶病质方面进行了测试，但试验结果相互矛盾(Jatoi等人，《临床肿瘤学杂志》“JClin Oncol”.2004；22:2469-76)。抗氧化剂和非甾体抗炎药已经进行了试验，这些治疗与EPA、氧化应激抑制剂和/或食欲刺激剂的组合被认为在治疗消瘦方面具有潜力。泛素蛋白水解途径(Ubiquitin proteolytic pathway,UPP)的抑制是特别令人感兴趣的。对肌肉抑制物质如肌肉生长抑制素的抑制在临床试验中并未成功。
消瘦与基础疾病相结合的多因素性质意味着没有全球有效或公认的消瘦治疗方法，甚至没有任何获批的药物疗法。事实上，人们普遍认为，治疗与疾病相关的消瘦的唯一方法是治愈基础疾病(Vaughan等人，《恶病质肌肉减少症和肌肉杂志》“JCachexiaSarcopenia Muscle”(2013)4:95-109)。因此，需要新的消瘦疗法。
发明概述
本发明提供了一种能够抑制白介素11(IL-11)介导的信号传导的试剂，以便用于治疗或预防代谢性疾病的方法。
还提供了一种能够抑制白介素11(IL-11)介导的信号传导的试剂在制备用于治疗或预防代谢性疾病的方法的药物中的用途。
还提供了一种治疗或预防代谢性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的能够抑制白介素11(IL-11)介导的信号传导的试剂。
在一些实施例中，所述代谢性疾病为，或包括：肥胖、2型糖尿病(T2D)、1型糖尿病(Type 1diabetes,T1D)、糖尿病前期(Pre-diabetes)、超重(Being overweight)、代谢综合征(Metabolic syndrome)、妊娠相关高血糖症(Pregnancy-associated hyperglycemia)、胆汁淤积性肝病(Cholestatic liver disease)、高血糖症(Hyperglycaemia)、高脂血症(Hyperlipidaemia)、高甘油三酯血症(Hypertriglyceridemia)、高胆固醇血症(Hypercholesterolemia)、消瘦、恶病质、化疗相关的体重减轻(Chemotherapy-associatedweight loss)、胰腺功能不全(Pancreatic insufficiency)、胰腺炎(Pancreatitis)、急性胰腺炎(Acute pancreatitis)、慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis)、脂肪变性(Steatosis)、脂毒性(Lipotoxicity)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪营养不良、脂肪增生(Lipohypertrophy)、脂肪萎缩、胰岛素抵抗(Insulin resistance)或高血糖素血症(Hyperglucagonemia)。
在一些实施例中，所述试剂为能够防止或减少白介素11(IL-11)与白介素11受体(Receptor for interleukin 11,IL-11R)结合的试剂。
在一些实施例中，所述试剂能够结合白介素11(IL-11)或白介素11受体(IL-11R)。
在一些实施例中，所述试剂选自下组：抗体或其抗原结合片段、多肽、肽、核酸、寡核苷酸、适体或小分子。
在一些实施例中，所述试剂为抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，所述试剂为诱捕受体。
在一些实施例中，所述试剂为IL-11介导的信号传导的抗IL-11抗体拮抗剂或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述试剂为IL-11介导的信号传导的抗IL-11Rα抗体拮抗剂或其抗原结合片段。
在一些实施例中，所述试剂为IL-11的诱捕受体。在一些实施例中，IL-11的诱捕受体包括：(i)对应于gp130的细胞因子结合模块的氨基酸序列，和(ii)对应于IL-11Rα的细胞因子结合模块的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述试剂为IL-11突变蛋白。在一些实施例中，所述IL-11突变蛋白为W147A。
在一些实施例中，所述试剂能够阻止或降低白介素11(IL-11)或白介素11受体(IL-11R)的表达。
在一些实施例中，所述试剂为寡核苷酸或小分子。
在一些实施例中，所述试剂为能够阻止或降低IL-11表达的反义寡核苷酸。在一些实施例中，能够阻止或降低IL-11表达的反义寡核苷酸为靶向IL11的siRNA，所述siRNA包含SEQ ID NO:12、13、14或15的序列。在一些实施例中，所述试剂为能够阻止或降低IL-11Rα表达的反义寡核苷酸。在一些实施例中，能够阻止或降低IL-11Rα表达的反义寡核苷酸为靶向IL11RA的siRNA，所述siRNA包含SEQ ID NO:16、17、18或19的序列。
在一些实施例中，白介素11受体为IL-11Rα或包含IL-11Rα。
在一些实施例中，所述方法包括向受试者施用所述试剂，所述受试者其体内白介素11(IL-11)或IL-11受体(IL-11R)的表达上调。
在一些实施例中，所述方法包括向受试者施用所述试剂，所述受试者其体内白介素11(IL-11)或IL-11受体(IL-11R)的表达已被确定上调。
在一些实施例中，所述方法包括确定受试者体内白介素11(IL-11)或IL-11受体(IL-11R)的表达是否上调，并向体内白介素11(IL-11)或IL-11受体(IL-11R)表达上调的受试者施用所述试剂。
发明详述
白介素11和IL-11受体
白介素11(IL-11)，也称为脂肪生成抑制因子，是一种多效性细胞因子，是IL-6细胞因子家族的成员，所述IL-6细胞因子家族包括IL-6、IL-11、IL-27、IL-31、抑癌素(Oncostatin)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)、心肌营养素-1(Cardiotrophin-1,CT-1)、心肌营养素样细胞因子(Cardiotrophin-like cytokine,CLC)、睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)和神经生成素(Neuropoetin,NP-1)。
白介素11(IL-11)在多种间充质细胞类型中表达。IL-11基因组序列已被定位到19号染色体和7号染色体的着丝粒区域，并且使用标准信号肽进行转录，以确保从细胞中有效分泌。IL-11的激活蛋白复合物cJun/AP-1位于其启动子序列内，对于IL-11的基础转录调控至关重要(Du和Williams.，《血液》“Blood”，1997年，第89卷：3897-3908页)。人IL-11的未成熟形式为199个氨基酸的多肽，而IL-11的成熟形式编码178个氨基酸残基的蛋白质(Gabers和Scheller.，《生化与分子生物学》“Biol.Chem.”,2013；394(9):1145-1161)。人IL-11氨基酸序列可在UniProt登录号P20809(P20809.1GI:124294；SEQ ID NO:1)下获得。重组人IL-11(奥普瑞白介素，oprelvekin)也有市售。来自其他物种的IL-11，包括小鼠、大鼠、猪、牛、几种硬骨鱼和灵长类动物，也已被克隆和测序。
在本说明书中，“IL-11”是指来自任何物种的IL-11并且包括来自任何物种的IL-11的同种型、片段、变体或同源物。在优选的实施例中，物种为智人(Homo sapiens)。IL-11的同种型、片段、变体或同源物可以任选地表征为与来自给定物种，例如人类的未成熟或成熟IL-11的氨基酸序列具有至少70％，优选地为具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同源性。IL-11的同种型、片段、变体或同源物可以任选地以结合IL-11Rα(优选地为来自同一物种)和刺激表达IL-11Rα和gp130的细胞中的信号转导的能力为特征(例如，如Curtis等人所述，《血液》“Blood”，1997,90(11)；或Karpovich等人，《分子人类生殖学》“Mol.Hum.Reprod.”2003 9(2):75-80)。IL-11的片段可以是任何长度(按氨基酸数量计)，尽管可以任选地为成熟IL-11长度的至少25％，并且其最大长度为成熟IL-11长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。IL-11片段的最小长度为10个氨基酸，最大长度为15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或195个氨基酸。
IL-11通过广泛表达的糖蛋白130(Glycoprotein 130,gp130；也称为糖蛋白IL-6ST、IL-6-β或CD130)的同源二聚体发出信号。Gp130是一种跨膜蛋白，与IL-6受体家族形成I型细胞因子受体的一个亚基。特异性是通过单个白介素11受体亚基α(IL-11Rα)获得的，IL-11Rα不直接参与信号转导，尽管与α受体的初始细胞因子结合事件导致最终与gp130形成复合物。
人gp130(包括22个氨基酸的信号肽)是一个918个氨基酸的蛋白质，成熟形式为866个氨基酸，包括一个597个氨基酸的胞外域、一个22个氨基酸的跨膜域和一个277个氨基酸的胞内域。该蛋白质的胞外域包含gp130的细胞因子结合模块(Cytokine-bindingmodule,CBM)。gp130的CBM包含gp130的Ig样结构域D1和纤连蛋白III型结构域D2和D3。人gp130的氨基酸序列可在UniProt登录号P40189-1(SEQ ID NO:2)下获得。
人IL-11Rα是一种422个氨基酸的多肽(UniProt Q14626；SEQ ID NO:3)，与鼠IL-11Rα具有约85％的核苷酸和氨基酸序列同源性。已经报道了IL-11Rα的两种同种型，它们的胞质结构域有所不同(Du和Williams，同上)。IL-11受体α链(IL-11Rα)与IL-6受体α链(IL-6Rα)有许多结构和功能相似之处。胞外域显示24％的氨基酸同源性，包括特征性保守的Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS)基序。短胞质结构域(34个氨基酸)缺少激活JAK/STAT信号通路所需的Box 1和Box 2区域。
鼠IL-11上的受体结合位点已经被定位出来，并且确定了三个位点——位点I、II和III。与gp130的结合由于位点II区域中的置换和位点III区域中的置换而减少。位点III突变体显示没有可检测的激动剂活性，并且具有IL-11Rα拮抗剂活性(《细胞因子抑制剂》“Cytokine Inhibitors”第8章；由Gennaro Ciliberto和Rocco Savino编辑，MarcelDekker公司2001年出版)。
在本说明书中，IL-11受体(IL-11R)是指能够结合IL-11的多肽或多肽复合物。在一些实施例中，IL-11受体能够结合IL-11并在表达受体的细胞中诱导信号转导。
IL-11受体可以来自任何物种并且包括来自任何物种的IL-11受体的同种型、片段、变体或同源物。在优选的实施例中，物种为智人(Homo sapiens)。
在一些实施例中，IL-11受体可以为IL-11Rα。在一些实施例中，IL-11的受体可以为包含IL-11Rα的多肽复合物。在一些实施例中，IL-11受体可以为包含IL-11Rα和gp130的多肽复合物。在一些实施例中，IL-11受体可以为gp130或包含结合IL-11的gp130复合物。
IL-11Rα的同种型、片段、变体或同源物可以任选地表征为与来自给定物种，例如人的IL-11Rα的氨基酸序列具有至少70％、优选地为具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同源性。IL-11Rα的同种型、片段、变体或同源物可以任选地以结合IL-11(优选地为来自同一物种)并刺激表达IL-11Rα和gp130的细胞中的信号转导的能力为特征(例如，如Curtis等人所述，《血液》“Blood”,1997,90(11)；或Karpovich等人，《分子人类生殖学》“Mol.Hum.Reprod.”2003 9(2):75-80)。IL-11受体片段可以是任何长度(按氨基酸数量计)，尽管可以任选地为成熟IL-11Rα长度的至少25％，并且其最大长度为成熟IL-11Rα长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。IL-11受体片段的最小长度为10个氨基酸，最大长度为15、20、25、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或415个氨基酸。
IL-11信号传导
IL-11与IL-11Rα结合的亲和力较低(Kd～10nmol/L)，仅这些结合配体之间的相互作用不足以转导生物信号。产生能够进行信号转导的高亲和力受体(Kd～400至800pmol/L)需要IL-11Rα和gp130的共表达(Curtis等人，《血液》“Blood”；90(11):4403-12；Hilton等人，《欧洲分子生物学组织杂志》“EMBO J”13:4765,1994；Nandurkar等人，《癌基因》“Oncogene”12:585,1996)。IL-11与细胞表面IL-11Rα的结合，主要通过丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联激活与Janus激酶/信号转导和转录激活因子(Jak/STAT)通路，诱导异二聚化、酪氨酸磷酸化、gp130的激活和下游信号传导(Gabers和Scheller，同上)。
原则上，可溶性IL-11Rα也可以与IL-11形成具有生物活性的可溶性复合物(Pflanz等人，1999年《欧洲生化学会联合会快报》“FEBS Lett”,450,117-122)由此提出了与IL-6类似的可能性，即IL-11可在某些情况下，在结合细胞表面gp130之前结合可溶性IL-11Rα(Gabers和Scheller，同上)。Curtis等人(《血液》“Blood”1997年12月1日；90(11):4403-12)描述了可溶性鼠IL-11受体(Soluble murine IL-11receptor,sIL-11R)α链的表达并检测了表达gp130的细胞中的信号传导。在存在gp130但不存在跨膜IL-11R的情况下，sIL-11R介导M1白血病细胞的IL-11依赖性分化和Ba/F3细胞的增殖和早期细胞内事件，包括gp130、STAT3和SHP2的磷酸化，类似于通过跨膜IL-11R的信号传导。最近已经证明，IL-11通过细胞膜结合gp130激活信号传导至可溶性IL-11Rα(Lokau等人，2016年《细胞报告》“Cell Reports”14,1761-1773)。这种所谓的IL-11反式信号传导可能对疾病发病机制很重要，但尚未研究其在人类疾病中的作用。
如本文所用，“IL-11反式信号传导”用于指代由结合IL-11Rα的IL-11与gp130结合触发的信号传导。所述IL-11可以作为非共价复合物与IL-11Rα结合。所述gp130与膜结合并由细胞表达，在细胞中IL-11:IL-11Rα复合物与gp130结合后发生信号传导。在一些实施例中，IL-11Rα可为可溶性IL-11Rα。在一些实施例中，可溶性IL-11Rα是IL-11Rα的可溶性(分泌)同种型(例如缺乏跨膜结构域)。在一些实施例中，可溶性IL-11Rα是细胞膜结合的IL-11Rα其胞外域蛋白裂解的释放产物。在一些实施例中，IL-11Rα可为细胞膜结合的，并且经由gp130的信号传导可以通过结合IL-11与细胞膜结合的IL-11Rα来触发，称为“IL-11顺式信号传导”。在优选的实施例中，通过破坏IL-11介导的顺式信号传导来实现对IL-11介导的信号传导的抑制。
IL-11介导的信号传导已被证明可刺激造血和血小板生成，刺激破骨细胞活性，刺激神经发生，抑制脂肪生成，减少促炎细胞因子的表达，调节细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)代谢，并可介导胃肠道上皮细胞的正常生长控制(Du和Williams，同上)。
白介素11(IL-11)的生理作用仍不清楚。IL-11与造血细胞的激活和血小板的产生密切相关。IL-11也已被证明可以预防移植物抗宿主病、炎症性关节炎和炎症性肠病，导致IL-11被认为是一种抗炎细胞因子(Putoczki和Ernst，《白细胞生物学期刊》“J LeukocBiol”2010,88(6):1109-1117)。然而，有人认为IL-11具有促炎性和抗炎性以及促血管生成作用，并且对瘤形成很重要。最近的研究表明，在小鼠关节炎模型和在癌症中，于病毒诱导的炎症期间很容易检测到IL-11，这表明病理刺激可以诱导IL-11的表达。IL-11还与肿瘤性胃肠上皮中促肿瘤靶基因的Stat3依赖性激活有关(Putoczki和Ernst，同上)。
如本文所用，“IL-11信号传导”和“IL-11介导的信号传导”是指由IL-11或其具有成熟IL-11分子功能的片段与IL受体结合介导的信号传导。应当理解，“IL-11信号传导”和“IL-11介导的信号传导”是指由IL-11/其功能片段引发的信号传导，例如通过与IL-11受体结合。“信号传导”又指信号转导和其他控制细胞活动的细胞过程。
代谢性疾病
本发明涉及代谢性疾病的治疗和/或预防。
如本文所用，“代谢性疾病”是指由异常代谢引起或以异常代谢为特征的任何疾病或病症。在本文中，“代谢”是指身体将能量来源(例如为提供营养而消耗的物质)转换/加工为能量和/或储备能量。
“正常代谢”可为没有疾病的健康受试者的代谢，例如没有代谢性疾病，或没有代谢性疾病的症状/相关性。
患有代谢性疾病的受试者可能表现出异常代谢。患有代谢性疾病的受试者可能具有异常代谢的症状/相关因素。患有代谢性疾病的受试者可能已被诊断为患有代谢性疾病。受试者可能满足诊断代谢性疾病的诊断标准。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括(例如特征在于)肥胖、2型糖尿病(T2D)、1型糖尿病(T1D)、糖尿病前期、超重、代谢综合征、妊娠相关高血糖症(即妊娠期糖尿病)、胆汁淤积性肝病、高血糖症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、消瘦、恶病质、化疗相关的体重减轻、胰腺功能不全、胰腺炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、脂肪变性、脂毒性、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪营养不良、脂肪增生、脂肪萎缩、胰岛素抵抗或高血糖素血症。
本发明的各方面涉及治疗和/或预防在代谢中起作用的细胞/组织/器官/器官系统的异常和/或功能不足。特别地，本文考虑了治疗和/或预防胰腺细胞/胰腺组织/胰腺的异常功能和/或功能不足，以及治疗和/或预防肝脏细胞/肝组织/肝脏的异常功能和/或功能不足。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括肥胖。肥胖的特点是体内脂肪过多。例如，Orzano和Scott，在《美国家庭实践委员会杂志》“J Am Board Fam Pract”(2004)17(5):359-369中，对肥胖的诊断进行了综述，将其全文通过引用并入本文。肥胖受试者的体重指数(Body mass index,BMI；通过将一个人的体重除以身高的平方计算)超过30kg/m2。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括超重。超重的特征是BMI大于25kg/m2和小于30kg/m2(《情况说明书N°311"》(Fact sheet N°311")，世界卫生组织“WHO”(2015))。肥胖和超重通常是由食物摄入过多、缺乏体力活动和遗传易感性共同引起的。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括糖尿病(Diabetes mellitus)(通常也简称为“糖尿病”(Diabetes))。糖尿病是指一组以长期高血糖为特征的代谢性疾病(《糖尿病概况N°312"》(Diabetes Fact sheet N°312").世界卫生组织“WHO”,(2013))。根据美国糖尿病协会(American Diabetes Association,ADA)，糖尿病的诊断需要血红蛋白A1c的检测水平≥6.5％，空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG)的检测水平(定义为至少8小时无热量摄入)≥126mg/dL(7.0mmol/L)，摄入75g口服葡萄糖负荷后2小时的血糖检测≥200mg/dL(11.1mmol/L)，或在具有典型高血糖或高血糖危象的患者中检测到随机血浆葡萄糖≥200mg/dL(11.1mmol/L)(美国糖尿病协会，《糖尿病护理》“Diabetes Care”(2010)33(增刊1)：S62-S69)。糖尿病的症状包括尿频、口渴和饥饿感增加。糖尿病的根本原因通常是胰腺产生的胰岛素不足，或者身体细胞对产生的胰岛素反应不正常。
如《糖尿病概况N°312"》.世界卫生组织“WHO”,(2013)中所述，糖尿病主要分为三种类型。1型糖尿病(T1D)是由于胰岛中产生胰岛素的β细胞数量不足导致胰腺无法产生足够的胰岛素而引起的。例如Kahanovitz等人在《护理要点》“Point Care”.(2017)16(1):37-40中，对T1D及其诊断进行了综述，通过引用将其全文并入本文。2型糖尿病(T2D)是由于受试者的细胞不能对胰岛素做出适当的应答而导致的，并且可能进展为还包括胰岛素分泌不足。T2D最常见的原因是体重超标和运动不足。DeFronzo在《自然综述疾病导论》“NatureReviews Disease Primers”(2015)1:15019对T2D进行了综述，其全文通过引用并入本文。妊娠期糖尿病(也称为妊娠相关高血糖症)发生在孕妇出现高血糖水平时。在与妊娠相关的胰岛素抵抗的情况下，妊娠期糖尿病是由妊娠期间所需的额外胰岛素的产生不足引起的。例如Kampmann等人在《世界糖尿病杂志》“World J Diabetes”.(2015)6(8):1065-1072中，对妊娠期糖尿病进行了综述，其全文通过引用并入本文。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括胰岛素缺乏。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括胰岛素抵抗。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括高血糖。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括2型糖尿病(T2D)。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括1型糖尿病(T1D)。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括妊娠相关高血糖症。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括糖尿病前期。糖尿病前期指的是一种高血糖状态，其中血糖水平长期升高，但低于糖尿病诊断所需的水平。例如Bansal在《世界糖尿病杂志》“World J Diabetes”.(2015)6(2):296-303中，对糖尿病前期及其诊断进行了综述，通过引用将其全文并入本文。世界卫生组织将糖尿病前期定义为中度高血糖状态，通过测定空腹血糖水平为6.1-6.9mmol/L(110-125mg/dL)和摄入75g口服葡萄糖负荷后2小时的血糖水平为7.8-11.0mmol/L(140-200mg/dL)进行诊断。根据ADA，糖尿病前期的诊断需要摄入75g口服葡萄糖负荷后2小时的血糖水平为7.8-11.0mmol/L(140-200mg/dL)，空腹血糖水平为100-125mg/dL，血红蛋白A1c水平为5.7％-6.4％。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括代谢综合征。例如Rochlani等人在《心血管疾病》“Cardiovascular Disease”(2017)215-225中，对代谢综合征进行了综述，通过引用将其全文并入本文。世界卫生组织将代谢综合征定义为除了存在以下情况中的两种外：肥胖、高脂血症(高甘油三酯血症，或高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)胆固醇偏低)、高血压或微量白蛋白尿外，还存在胰岛素抵抗(空腹血糖受损、糖耐量受损或T2D)。存在代谢综合征的其他几种定义，并在Rochlani等人同上的表1中进行了总结。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括胆汁淤积。胆汁淤积是指从肝脏到十二指肠的胆汁流量减少。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括胆汁淤积性肝病。胆汁淤积性肝病是胆汁合成、分泌和/或流经胆道的流量不足所致，如Jansen等人在《肝脏病学》“Hepatology”(2017)65(2):722-738中，以及Pollock和Minuk在《肠胃病学与肝病期刊》“JGastroenterol Hepatol”(2017)32(7):1303-1309中，对其进行了综述，将其全文通过引用并入本文。胆汁淤积性肝病包括原发性胆汁性胆管炎(Primary biliary cholangitis,PBC)和原发性硬化性胆管炎(Primary sclerosing cholangitis,PSC)。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括高脂血症。高脂血症是指血液中脂质或脂或脂蛋白水平升高。高脂血症包括高甘油三酯血症、高胆固醇血症和混合型高脂血症(高甘油三酯血症和高胆固醇血症结合)。高脂血症与例如动脉粥样硬化和心血管疾病等相关。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括高甘油三酯血症。Berglund等人在《临床内分泌与代谢杂志》“J.Clin.Endocrinol.Metab”.(2012)97(9):2969-89中对高甘油三酯血症进行了描述，并且将其定义为血液甘油三酯水平≥150mg/dL(≥1.7mmol/L)。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括高胆固醇血症。例如Bhatnagar等人在《英国医学杂志》“BMJ”(2008)337:a993中对高胆固醇血症进行了描述。英国国家卫生局将高胆固醇血症定义为血液总胆固醇水平≥5mmol/L或血液低密度脂蛋白(Low-densitylipoprotein,LDL)水平≥3mmol/L。美国国家卫生研究院将高胆固醇血症定义为≥240mg/dL。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括胰腺功能不全。胰腺功能不全可为内分泌或外分泌。内分泌胰腺功能不全的特征在于选自：胰岛素、胰淀素、胰高血糖素、生长抑素、生长激素释放肽和胰多肽(Pancreatic polypeptide,PP)中的一种或多种产生不足。外分泌胰腺功能不全的特征在于选自：胰液、消化酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶、核酸酶和淀粉酶中的一种或多种产生不足，从而导致无法正确地消化食物。胰腺功能不全通常是由产生相关因素的胰腺细胞丧失引起的，例如在内分泌功能情况下的胰岛细胞，在外分泌功能情况下的腺泡细胞。例如Struyvenberg等人在《BMC医学杂志》“BMC Med”(2017)15:29中对外分泌胰腺功能不全进行了描述，其全文以引用方式并入本文。胰腺功能不全的最常见原因是胰腺炎，但也可能由囊性纤维化、外科手术、乳糜泻和糖尿病引起。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括胰腺损伤。在此，“损伤”是指对相关器官和/或器官组织或细胞的损伤。细胞/组织/器官的损伤可能是由于例如化学或物理治疗/经历对细胞/组织/器官造成的损伤。在一些实施例中，损伤可以是化学损伤的结果，例如在药物诱导损伤的情况下。在一些实施例中，损伤可由物理损伤引起，例如由于手术损伤而引起的损伤，其可发生在例如治疗疾病和/或进行移植的手术期间(例如损伤可具有医源性病因)。在一些实施例中，损伤可以是缺氧的结果，例如缺血的结果，或者可以是再灌注的结果。在一些实施例中，损伤可由感染、对感染的免疫反应、癌症和/或自身免疫引起。损害可为可逆的或不可逆的。细胞/组织/器官的损伤可通过改变细胞/组织/器官的结构和/或功能来表征。例如，对细胞/组织/器官的损伤可表现为细胞/组织/器官的正常功能相关性水平降低和/或细胞/组织/器官的受损功能相关性增加。细胞/组织/器官的损伤可表现为细胞死亡，例如受损器官/组织的细胞死亡。细胞死亡可由凋亡(即程序性细胞死亡)或坏死(由于损伤导致的细胞过早死亡)引起。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括胰腺炎。胰腺炎的特点是胰腺发炎。胰腺炎可为急性或慢性的。例如Shah等人在《炎症研究杂志》“J Inflamm Res”(2018)11:77-85中对急性胰腺炎进行了综述，将其全文通过引用并入本文。急性胰腺炎最常由胆结石引起，但也可由酒精和代谢性疾病等引起。例如Pham等人在第1版《千名医学家》“F1000Res”(2018)7:F1000专家评估(Faculty Rev)-607中对慢性胰腺炎进行了综述，其全文通过引用并入本文。慢性胰腺炎是一种包括慢性炎症、纤维化、腺泡和胰岛细胞丧失的综合征，可表现为外分泌和内分泌功能不全。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括脂肪变性。脂肪变性是指脂质在细胞/组织/器官内的异常滞留。脂肪变性可为巨泡型或微泡型。
在一些实施例中，代谢性疾病的特征在于含有脂质部分(或其衍生物)的分子在非脂肪组织中积聚。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括脂毒性，或以脂毒性为特征，或与脂毒性相关。
如本文所用，“脂毒性”是指由于含有脂质部分(或其衍生物)的分子在非脂肪组织中的积聚而导致的细胞/组织的损伤、功能障碍和/或死亡。在依照本发明的一些实施例中，脂毒性存在于肝、肾、心脏和/或骨骼肌的细胞中。在一些实施例中，脂毒性存在于肝脏的细胞(例如肝细胞)中。
以脂毒性为特征/与脂毒性相关的代谢性疾病包括例如非酒精性脂肪肝(NAFLD)和NASH。Friedman等人在《自然医学》“Nat.Med.”(2018)24(7):908-922中，和Farrell等人在《实验医学与生物学进展》“Adv.Exp.Med.Biol”.(2018)1061:19-44中，对肝细胞中脂质的积聚及其与NAFLD特别是NASH的相关性进行了描述(两者的全文均通过引用并入本文)。
NAFLD例如NASH被认为是由于对肝细胞的脂毒性所致。脂毒性因子被认为包括游离(未酯化)胆固醇、饱和游离脂肪酸(例如棕榈酸)、二酰基甘油、溶血磷脂酰胆碱、鞘脂和神经酰胺。肝细胞无法隔离此类化学反应性脂质分子，从而导致线粒体损伤、内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激和自噬。脂毒性导致肝细胞凋亡，以及导致会激活先天免疫系统并触发促炎因子表达的坏死、程序性坏死和细胞焦亡。促炎细胞因子和趋化因子继而招募炎性细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞。
在本实施例(特别是实施例5)中，发明人证明了自分泌IL-11介导的信号传导是脂毒性信号传导(例如在肝细胞中)的重要组成部分，并且可以通过拮抗IL-11介导的信号传导来抑制脂毒性(及其下游信号传导)。因此，本发明的各方面提供了通过拮抗IL-11介导的信号传导来治疗/预防脂毒性或以脂毒性为特征或与脂毒性相关的疾病。
重要的是，本发明人在本文的实施例5.3.5中证明IL-11介导的信号传导是与NAFL相关的肝细胞中脂毒性的重要组成部分，并导致NASH上游和单独的IL-11介导的HSC对肌成纤维细胞的激活。因此，本公开的各方面提供了对NAFLD(例如NASH)的治疗/预防，包括通过拮抗IL-11介导的信号传导抑制肝细胞中的脂毒性。
在一些实施例中，代谢性疾病为非酒精性脂肪肝(NAFLD)。Benedict和Zhang在《世界肝病学杂志》“World J Hepatol”.(2017)9(16):715-732中，和Albhaisi等人在第1版《千名医学家》“F1000Res”(2018)7:F1000专家评估(Faculty Rev)-720中，对NAFLD进行了综述，两者的全文均通过引用并入本文。NAFLD的特点是肝脏尤其是肝细胞的脂肪变性。NAFLD包括非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFL的特征是肝脏的脂肪变性，涉及超过5％的实质损伤，没有肝细胞损伤的证据。NAFL可能进展为NASH，即脂肪变性合并炎症和/或纤维化(脂肪性肝炎)。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括脂肪营养不良。例如Fiorenza等人在《自然综述内分泌学》“Nature Reviews Endocrinology”(2011)7:137-150中对脂肪营养不良进行了综述，其全文通过引用并入本文。脂肪营养不良是指不能产生和/或维持健康的脂肪组织，包括脂肪组织的完全或部分丧失(脂肪萎缩)，这可以与脂肪组织的病理性积聚(脂肪增生)同时发生。虽然遗传性脂肪营养不良综合征很少见，但脂肪营养不良可为遗传性或获得性的。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括脂肪萎缩。在一些实施例中，代谢性疾病为或包括脂肪增生。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括高血糖症。例如Wewer Albrechtsen等人在《医学生物标志物》“Biomark Med”.(2016)(11):1141-1151中，对高血糖症进行了描述，通过引用将其全文并入本文。
在一些实施例中，代谢性疾病为或包括消瘦。如本文所用，术语“消瘦”是指非自愿的体重减轻，其可能是渐进性和/或退化性的。消瘦可定义为肌肉损失，伴有或不伴有脂肪量损失，通常包括体重(包括骨骼肌)的显著损失，一般是非自愿的损失，可包括也可不包括脂肪组织的损失。在某些情况下，脂肪组织消瘦可以单独发生，如脂肪营养不良疾病。消瘦的特征可能是由食物摄入减少和异常代谢的可变组合而导致的蛋白质和能量的负平衡(Fearon等人，《柳叶刀肿瘤学》“Lancet Oncol”.(2011)12(5):489-95)。消瘦可导致进行性功能损害，降低生活质量，增加发病率和死亡率的风险。在某些情况下，消瘦会导致乏力(身体异常虚弱或缺乏能量)和/或贫血(血液中缺乏红细胞或血红蛋白)。在某些情况下，传统的营养支持或迄今为止已经试验过的治疗干预措施无法完全逆转消瘦。一旦体重减轻达到患者历史稳定体重的30％，通常就会死亡(Tisdale，《自然综述癌症》“Nature ReviewsCancer”,2,862-871(2002))。
以消瘦为特征的疾病/病症包括恶病质(与年龄无关的肌肉量减少)、肌肉减少症(肌肉量减少：例如与年龄相关、废用、太空旅行或去神经支配)、厌食症(蛋白质-能量营养不良)、肌营养不良(Muscular dystrophies)、脂肪营养不良(例如脂肪组织的异常或退化状况)、脂肪萎缩(面部和其他组织中与年龄相关的皮下脂肪减少)和肌肉减少(任何慢性疾病中的肌肉萎缩；由Fearon等人提出，《恶病质肌肉减少症和肌肉杂志》“J CachexiaSarcopenia Muscle”.2011；2:1-3)。在本文中，以消瘦为特征的疾病/病症也称为“消耗性疾病”。在一些实施例中，本发明的消耗性疾病为恶病质、恶病质前期、顽固性恶病质、肌肉减少症、厌食症、脂肪营养不良、脂肪萎缩和/或肌肉减少。在本文所述各方面的一些实施例中，消耗性疾病为恶病质、恶病质前期和/或顽固性恶病质。
慢性疾病引起的消耗性疾病可能包括“轻度肌肉消耗疾病”(伴有或不伴有虚弱)、“中度肌肉消耗疾病”(伴有或不伴有虚弱；有时称为“前恶病质”)或“严重肌肉消耗疾病”(有时称为“恶病质”，通常伴有虚弱)。
恶病质是一种复杂的炎症/代谢综合征，与基础疾病(可为急性或慢性疾病)相关，以消瘦为特征。恶病质的突出临床特征是成人体重减轻(校正液体潴留)或儿童生长衰竭(不包括内分泌紊乱)。厌食症、炎症、胰岛素抵抗、肌肉蛋白分解增加和基础代谢率增加常与恶病质有关。恶病质患者的低血脂水平和脂肪肝提示肝脏代谢在恶病质发病机制中发挥作用。因此，针对肝脏的治疗和预防脂肪肝、肝损伤或肝代谢的治疗可能与恶病质直接相关。恶病质不同于饥饿、与年龄相关的肌肉量损失、原发性抑郁症、吸收不良和甲状腺机能亢进，但与发病率增加有关(Evans等人，《临床营养》“Clin Nutr”.2008(6):793-9)。
恶病质可定义为历史稳定体重的非自愿体重减轻>5％，体重指数(BMI)<20kg/m2(65岁以下的人)或<22kg/m2(65岁或以上的人)伴有任何程度的体重减轻>2％，或骨骼肌指数与肌肉减少症一致且伴有任何程度的体重减轻>2％。受试者还可表现出<10％的体脂和/或<35g/L的血白蛋白低水平。这些标准也可能有助于识别罹患消耗性疾病的“高危”人群(Fearon等人，《柳叶刀肿瘤学》“Lancet Oncol”.2011；12(5):489-95)。
已提出了恶病质的三步分类法，即根据能量储存和身体蛋白质(BMI)的消耗程度以及持续的体重减轻程度，对其严重程度进行分类。
1.恶病质前期——当患者体重减轻<5％，但尚未出现严重并发症时。
2.恶病质——该综合征正在进展，体重减轻超过上述参数，但仍有可能得到治疗。
3.顽固性恶病质——在这个时间点疾病不再对治疗有反应，或此时的负担和风险超过了治疗收益(Fearon等人，同上)。顽固性阶段通常由下述基础疾病的总体阶段以及患者的状况决定。
代谢性疾病可存在于急性或慢性疾病环境中。本发明的各方面提供了与代谢性疾病相关的疾病/病症的治疗/预防。与代谢性疾病相关的疾病/病症包括与代谢性疾病的发作正相关的疾病/病症。在一些实施例中，与代谢性疾病相关的疾病/病症为可以引起/引起/已经引起(即可以导致、导致或已经导致)代谢性疾病的疾病/病症。
与代谢性疾病相关的疾病/病症还包括由代谢性疾病引起和/或加剧(恶化、发展发展和/或复杂化)的疾病/病症。在一些实施例中，与代谢性疾病相关的疾病/病症可能与代谢性疾病的发作正相关，并且也可能因代谢性疾病而恶化。“相关”疾病/病症可为包括代谢性疾病相关病理的疾病/病症。
在本发明的实施例中，代谢性疾病或与代谢性疾病相关的疾病/病症可存在于或影响任何器官/组织，例如心脏、肝脏、肾脏、脑、皮肤、肌肉系统、胃、小肠、大肠、胰腺、口腔、唾液腺、咽、食道、胆囊、气管、喉、膀胱、卵巢、子宫、睾丸、内分泌系统的腺体例如垂体或甲状腺、淋巴系统例如脾。
在本发明的实施例中，与代谢性疾病相关的疾病/病症可以为选自：癌症、心脏病、肾病、肺病、肝病、慢性感染、神经退行性疾病、急性损伤、创伤性损伤/创伤、术后状况或衰老/老年化中的一种或多种。
在一些实施例中，可以使用代谢疾病的一种或多种生物标志物或相关物来识别/鉴定/诊断代谢疾病。
能够抑制IL-11作用的试剂
本发明的各方面涉及对IL-11介导的信号传导的抑制。
在本文中，“抑制”是指相对于对照条件的减少、降低或减轻。例如，利用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂来抑制IL-11的作用是指在没有该试剂的存在下和/或在有适当的对照试剂的存在下，IL-11介导的信号传导的范围/程度的减少、降低或减轻。
抑制在本文中也可称为中和作用或拮抗作用。也就是说，能够抑制IL-11介导的信号传导(例如，由IL-11或含有IL-11的复合物介导的相互作用、信号传导或其他活性)的试剂可称为相关功能或过程的“中和剂”或“拮抗剂”。例如，能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂可以称为能够中和IL-11介导的信号传导的试剂，或可以称为IL-11介导的信号传导的拮抗剂。
IL-11信号通路提供了多种抑制IL-11信号通路的途径。能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂可以抑制IL-11信号通路，例如通过对IL-11受体信号传导涉及或必需的一种或多种因子的作用进行抑制。
例如可以通过破坏IL-11(或含有IL-11的复合物，例如IL-11和IL-11Rα的复合物)和IL-11受体(例如IL-11Rα、包含IL-11Rα的受体复合物、gp130或包含IL-11Rα和gp130的受体复合物)之间的相互作用来抑制IL-11信号传导。在一些实施例中，IL-11介导的信号传导的抑制是通过抑制例如IL-11、IL-11Rα和gp130中的一种或多种的基因或蛋白质表达来实现的。
在实施例中，通过干扰IL-11介导的顺式信号传导而不是干扰IL-11介导的反式信号传导来实现对IL-11介导的信号传导的抑制，例如通过抑制涉及膜结合IL-11Rα的gp130介导的顺式复合物来实现对IL-11介导的信号传导的抑制。在实施例中，通过干扰IL-11介导的反式信号传导而不是干扰IL-11介导的顺式信号传导来实现对IL-11介导的信号传导的抑制，即通过抑制gp130介导的反式信号传导复合物来实现对IL-11介导的信号传导的抑制，例如IL-11与可溶性IL-11Rα结合或IL-6与可溶性IL-6R结合。在实施例中，通过干扰IL-11介导的顺式信号传导和IL-11介导的反式信号传导来实现对IL-11介导的信号传导的抑制。本文所述的任何试剂均可用于抑制IL-11介导的顺式和/或反式信号传导。
在其他实施例中，IL-11信号传导的抑制可以通过干扰IL-11/IL-11Rα/gp130下游的信号通路来实现。即在一些实施例中，对IL-11介导的信号传导的抑制/拮抗包括通过IL-11/IL-11受体复合物对信号传导下游的信号传导途径/过程/因子进行抑制。
在一些实施例中，IL-11介导的信号传导的抑制/拮抗包括对经由细胞内信号传导途径的信号传导的抑制，所述细胞内信号传导途径被IL-11/IL-11受体复合物激活。在一些实施例中，IL-11介导的信号传导的抑制/拮抗包括抑制一种或多种因子，所述因子的表达/活性经由IL-11/IL-11受体复合物的信号传导而上调。
在一些实施例中，本发明的方法采用能够抑制JAK/STAT信号传导的试剂。在一些实施例中，能够抑制JAK/STAT信号传导的试剂能够抑制JAK1、JAK2、JAK3、TYK2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和/或STAT6的作用。例如试剂可以抑制JAK/STAT蛋白的激活，抑制JAK或STAT蛋白与细胞表面受体(例如IL-11Rα或gp130)的相互作用，抑制JAK蛋白的磷酸化，抑制JAK和STAT蛋白之间的相互作用，抑制STAT蛋白的磷酸化，抑制STAT蛋白的二聚化，抑制STAT蛋白向细胞核的易位，抑制STAT蛋白与DNA的结合，和/或促进JAK和/或STAT蛋白的降解。在一些实施例中，JAK/STAT抑制剂选自卢可替尼(Ruxolitinib)(捷恪卫“Jakafi/Jakavi”；因塞特医疗“Incyte”)、托法替尼(Tofacitinib)(赛尔金斯/雅克维努斯“Xeljanz/Jakvinus”；美国国立卫生研究院/辉瑞“NIH/Pfizer”)、奥拉替尼(Oclacitinib)(爱波可“Apoquel”)、巴瑞替尼(Baricitinib)(艾乐明“Olumiant”；因塞特医疗/礼来“Incyte/Eli Lilly”)、非洛替尼(Filgotinib)(G-146034/GLPG-0634；加拉帕戈斯公众有限公司“Galapagos NV”)、甘多替尼(Gandotinib)(LY-2784544；礼来“EliLilly”)、来他替尼(Lestaurtinib)(CEP-701；梯瓦制药“Teva”)、莫洛替尼(Momelotinib)(GS-0387/CYT-387；吉利德科学“Gilead Sciences”)、帕瑞替尼(Pacritinib)(SB1518；CTI生物制药“CTI”)、PF-04965842(辉瑞“Pfizer”)、乌帕替尼(Upadacitinib)(ABT-494；艾伯维“AbbVie”)、吡西替尼(Peficitinib)(ASP015K/JNJ-54781532；安斯泰来“Astellas”)、菲卓替尼(Fedratinib)(SAR302503；新基“Celgene”)、葫芦素I(Cucurbitacin I)(JSI-1264)和CHZ868。
在一些实施例中，本发明的方法采用能够抑制MAPK/ERK信号传导的试剂。在在一些实施例中，能够抑制MAPK/ERK信号传导的试剂能够抑制GRB2的作用、抑制RAF激酶的作用、抑制MEK蛋白的作用、抑制MAP3K/MAP2K/MAPK和/或Myc的活化，以及/或抑制STAT蛋白的磷酸化。在一些实施例中，能够抑制ERK信号传导的试剂能够抑制ERK p42/44。在一些实施例中，ERK抑制剂选自SCH772984、SC1、VX-11e、DEL-22379、索拉非尼(Sorafenib)(多吉美“Nexavar”；拜耳/Onyx制药公司“Bayer/Onyx”)、SB590885、PLX4720、XL281、RAF265(诺华“Novartis”)、康奈非尼(Encorafenib)(LGX818/布拉夫托维“Braftovi”；阿莱生物制药“Array BioPharma”)、达拉非尼(Dabrafenib)(泰菲乐“Tafinlar”；葛兰素史克“GSK”)、维莫非尼“Vemurafenib”(佐博伏“Zelboraf”；罗氏集团“Roche”)、考比替尼(Cobimetinib)(科泰利克“Cotellic”；罗氏集团“Roche”)、CI-1040、PD0325901、比美替尼(Binimetinib)(MEK162/梅克托维“MEKTOVI”；阿莱生物制药“Array BioPharma”)、司美替尼(Selumetinib)(AZD6244；阿莱/阿斯利康“Array/AstraZeneca”)和曲美替尼(Trametinib)(GSK1120212/梅可尼斯特“Mekinist”；诺华“Novartis”)。在一些实施例中，本发明的方法采用能够抑制c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)信号传导/活性的试剂。在一些实施例中，能够抑制JNK信号传导/活性的试剂能够抑制JNK(例如JNK1、JNK2)的作用和/或磷酸化。在一些实施例中，JNK抑制剂选自SP600125、CEP 1347、TCS JNK 6o、c-JUN肽、SU3327、AEG 3482、TCS JNK 5a、BI78D3、IQ3、SR3576、IQ1S、JIP-1(153-16)和CC401二盐酸盐。
在本实施例中，发明人证明了NOX4表达和活性通过IL-11/IL-11Rα/gp130的信号传导而上调。NOX4是一种NADPH氧化酶，也是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的来源。Nox4的表达在具有肝细胞特异性IL-11表达的转基因小鼠中上调，且IL-11刺激的原代人肝细胞上调NOX4的表达。
在一些实施例中，本发明采用能够抑制NOX4表达(基因或蛋白质表达)或功能的试剂。在一些实施例中，本发明采用能够抑制IL-11介导的NOX4表达/功能上调的试剂。能够抑制NOX4表达或功能的试剂在本文中可称为NOX4抑制剂。例如，NOX4抑制剂或许能够降低NOX4的表达(例如基因和/或蛋白质表达)、降低编码NOX4的RNA水平、降低NOX4蛋白水平和/或降低NOX4活性水平(例如降低NOX4介导的NADPH氧化酶活性和/或NOX4介导的ROS产生)。
NOX4抑制剂包括NOX4结合分子和能够降低NOX4表达的分子。NOX4结合抑制剂包括肽/核酸适体、抗体(和抗体片段)以及NOX4的相互作用片段，所述相互作用片段充当NOX4功能的拮抗剂，以及NOX4的小分子抑制剂。能够降低NOX4表达的分子包括NOX4的反义RNA(例如siRNA、shRNA)。在一些实施例中，NOX4抑制剂选自如Altenhofer等人在《抗氧剂与氧化还原信号》“Antioxid Redox Signal”.(2015)23(5):406-427中所述，或如Augsburder等人在《氧化还原生物学》“Redox Biol”.(2019)26:101272中所述的NOX4抑制剂，如GKT137831。
结合试剂
在一些实施例中，能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂可以结合IL-11。在一些实施例中，能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂可以结合IL-11的受体(例如IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)。此类试剂的结合可通过降低/阻止IL-11与IL-11受体结合的能力来抑制IL-11介导的信号传导，从而抑制下游信号传导。此类试剂的结合可通过降低/阻止IL-11与IL-11受体结合的能力来抑制IL-11介导的顺式和/或反式信号传导，例如IL-11Rα和/或gp130，从而抑制下游信号传导。试剂可与反式信号复合物(如IL-11和可溶性IL-11Rα)结合并抑制gp130介导的信号传导。
能够结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体的试剂可以是任何种类，但在一些实施例中，所述试剂可以是抗体或其抗原结合片段、多肽、肽、核酸、寡核苷酸、适体或小分子。所述试剂能以分离的或纯化的形式提供，或者可以配制成药物组合物或药品。
抗体及抗原结合片段
在一些实施例中，能够结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体的药物为抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，能够结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体的药物为多肽，例如诱捕受体分子。在一些实施例中，能够结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体的药物可为适体。
在一些实施例中，能够结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体的药物为抗体或其抗原结合片段。“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，包括单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出与相关靶分子的结合。
鉴于当今与单克隆抗体技术相关的技术，大多数抗原的抗体都能被制备。抗原结合部分可以是抗体的一部分(例如Fab片段)或人工合成抗体片段(例如单链Fv片段[ScFv])。可以通过已知技术制备针对所选抗原的单克隆抗体，例如H Zola在《单克隆抗体：技术手册》“Monoclonal Antibodies:A manual of technology”(CRC出版社，1988年)中，和J G R Hurrell在《单克隆杂交瘤抗体：技术和应用》“Monoclonal HybridomaAntibodies:Techniques and Applications”(CRC出版社，1982年)中所公开的方法。Neuberger等人(1988年，《第八届国际生物技术研讨会第二部分》“8th InternationalBiotechnology Symposium Part 2”,792-799)则对嵌合抗体进行了讨论。单克隆抗体(Monoclonal antibodies,mAbs)在本发明的方法中尤其有用，且为特异性靶向抗原上单个表位的同质抗体群。
多克隆抗体也可用于本发明的方法。优选地为单特异性多克隆抗体。可以使用本用本领域公知的方法制备合适的多克隆抗体。
也可以使用/提供抗体的抗原结合片段，例如Fab和Fab2片段，正如可被基因工程改造的抗体及抗体片段一样。抗体的重链可变(Variable heavy,VH)区和轻链可变(Variable light,VL)区参与抗原识别，这一事实首先由早期蛋白酶消化实验所证实。啮齿动物抗体的“人源化”进一步证实了这一点。啮齿动物来源的可变结构域可以与人源的恒定结构域融合，使得所得抗体保留啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison等人，(1984)《美国科学院院报》“Proc.Natl.Acad.Sd.USA”81,6851-6855)。
本发明的抗体及抗原结合片段包括能够结合相关靶分子(即IL-11/含有IL-11的复合物/IL-11的受体)的抗体互补决定区(Complementarity-determining regions,CDRs)。
能够结合IL-11的抗体包括例如单克隆小鼠抗人IL-11抗体#22626克隆、如Bockhorn等人在《自然通讯》“Nat.Commun”.(2013)4(0):1393中所用的目录号MAB218(安迪生物科技“R&D Systems”，美国明尼苏达州)、6D9A克隆(Ab生物科技“Abbiotec”)、KT8克隆(Ab生物科技“Abbiotec”)、M3103F11克隆(百进生物科技“BioLegend”)、1F1克隆(亚诺法生技“Abnova Corporation”)、3C6克隆(亚诺法生技“Abnova Corporation”)、GF1克隆(生命周期生物科学“LifeSpan Biosciences”)、13455克隆(起源生物科学“SourceBioScience”)、11h3/19.6.1(Hermann等人，《关节炎和风湿病》“Arthritis Rheum”.(1998)41(8):1388-97)、AB-218-NA(安迪生物科技“R&D Systems”)、X203(Ng等人，《科学转化医学》“Sci Transl Med”.(2019)11(511)pii:eaaw1237)以及US 2009/0202533 A1、WO 99/59608 A2、WO 2018/109174 A2和WO 2019/238882 A1中公开的抗IL-11抗体。
特别地，如Schaefer等人在《自然》“Nature”(2017)552(7683):110-115中所述，抗IL-11抗体22626克隆(也称为MAB218)已被证明是IL-11介导的信号传导的拮抗剂。如Hermann等人在《关节炎和风湿病》“Arthritis Rheum”.(1998)41(8):1388-97中所公开，单克隆抗体11h3/19.6.1是一种中和性抗IL-11的IgG1。如McCoy等人在《BMC癌症》“BMCCancer”(2013)13:16中所用，安迪生物科技“R&D Systems”的AB-218-NA是中和性抗IL-11抗体的另一个实例。WO 2018/109174 A2和WO 2019/238882 A1还公开了IL-11介导的信号传导的又一示例性抗IL-11抗体拮抗剂。如Ng等人在“IL-11是特发性肺纤维化的治疗靶点”(“IL-11is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis.”)《生物档案》“bioRxiv”336537；doi:https://doi.org/10.1101/336537中，和在WO 2019/238882 A1中所公开，X203(也称为Enx203)是IL-11介导的信号传导的抗IL-11抗体拮抗剂，其包括WO2019/238882 A1中SEQ ID NO:92的VH区(本发明的SEQ ID NO:22)和WO 2019/238882 A1中SEQ ID NO:94的VL区(本发明的SEQ ID NO:23)。如WO 2019/238882 A1中所述，X203的人源化版本包括hEnx203，其中hEnx203包括WO 2019/238882 A1中SEQ ID NO:117的VH区(本发明的SEQ ID NO:30)和WO 2019/238882 A1中SEQ ID NO:122的VL区(本发明的SEQ ID NO:31)。Enx108A是IL-11介导的信号传导的抗IL-11抗体拮抗剂的另一个实例，并且包括WO2019/238882 A1中SEQ ID NO:8的VH区(本发明的SEQ ID NO:26)以及WO 2019/238882 A1中SEQ ID NO:20的VL区(本发明的SEQ ID NO:27)。
能够结合IL-11Rα的抗体包括例如单克隆抗体025克隆(义翘神州“SinoBiological”)；EPR5446克隆(艾博抗“Abcam”)；克隆473143(安迪生物科技“R&DSystems”)；8E2、8D10和8E4克隆以及如US 2014/0219919 A1中所述的8E2的亲和力成熟变体；如Blanc等人(在《免疫学方法杂志》“J.Immunol Methods”.2000年7月31日；241(1-2)；43-59中)所述的单克隆抗体；如WO 2014121325A1和US 2013/0302277 A1中所公开的X209抗体(Widjaja等人，《胃肠病学》“Gastroenterology”(2019)157(3):777-792，其也发表为——Widjaja等人，“IL-11中和疗法靶向NASH中肝星状细胞诱导的肝脏炎症和纤维化”(“IL-11neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liverinflammation and fibrosis in NASH.”)《生物档案》“bioRxiv”470062；doi:https://doi.org/10.1101/470062)；和如US 2009/0202533 A1、WO 99/59608 A2、WO 2018/109170A2和WO 2019/238884 A1中所公开的抗IL-11Rα抗体。
特别地，如Schaefer等人在《自然》“Nature”(2017)552(7683):110-115中所述，抗IL-11Rα抗体473143克隆(也称为MAB1977)已被证明是IL-11介导的信号传导的拮抗剂。US2014/0219919 A1提供了抗人IL-11Rα抗体8E2、8D10和8E4克隆的序列，并公开了它们拮抗IL-11介导的信号传导的能力——参见例如US 2014/0219919 A1的[0489]至[0490]。此外，US 2014/0219919 A1提供了另外62种亲和力成熟的8E2克隆变体的序列信息，其中61种被公开用于拮抗IL-11介导的信号传导——参见US 2014/0219919 A1的表3。WO 2018/109170A2和WO 2019/238884 A1公开了IL-11介导的信号传导的又一示例性抗IL-11Rα抗体拮抗剂。如Widjaja等人在“IL-11中和疗法靶向NASH中肝星状细胞诱导的肝脏炎症和纤维化”(“IL-11neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liverinflammation and fibrosis in NASH.”)《生物档案》“bioRxiv”470062；doi:https://doi.org/10.1101/470062中，和在WO 2019/238884 A1中所公开，X209(也称为Enx209)是IL-11介导的信号传导的抗IL-11Rα抗体拮抗剂，其包括WO 2019/238884 A1中SEQ ID NO:7的VH区(本发明的SEQ ID NO:24)，以及WO 2019/238884 A1中SEQ ID NO:14的VL区(本发明的SEQ ID NO:25)。如WO 2019/238884 A1中所述，X209的人源化版本包括hEnx209，其中hEnx209包括WO 2019/238884 A1中SEQ ID NO:11的VH区(本发明的SEQ ID NO:32)和WO2019/238884 A1中SEQ ID NO:17的VL区(本发明的SEQ ID NO:33)。
技术人员熟知适于给定物种/受试者的治疗用途的抗体生产技术。例如，Park和Smolen在《蛋白质化学进展》“Advances in Protein Chemistry”(2001)56:369-421中描述了适于人类治疗用途的抗体的生产流程(通过引用将其全文并入本文)。
针对给定靶蛋白(例如IL-11或IL-11Rα)的抗体可以在模式物种(例如啮齿动物、兔形动物)中产生，然后进行工程改造以提高它们在给定物种/受试者中治疗用途的适用性。例如，通过免疫模式物种产生的单克隆抗体的一个或多个氨基酸可以被替换以获得与人种系免疫球蛋白序列更相似的抗体序列(从而降低施用抗体治疗的人类受试者体内抗异种抗体免疫反应的可能性)。抗体可变区中的修饰可能集中在骨架区以保留抗体互补位。抗体人源化是抗体技术领域的常规实践问题，例如Almagro和Fransson在《生物科学前沿》“Frontiers in Bioscience”(2008)13:1619-1633中，Safdari等人在《生物技术与基因工程综述》“Biotechnology and Genetic Engineering Reviews”(2013)29(2):175-186中，以及Lo等人在《微生物光谱》“Microbiology Spectrum”(2014)2(1)中对此进行了综述，上述全文均通过引用并入本文。在表达人免疫球蛋白基因的转基因模式物种中，可以通过产生针对给定靶蛋白(例如IL-11或IL-11Rα)的抗体来规避对人源化的要求，使得在这些动物中产生的抗体是完全人源化的(例如Brüggemann等人在《免疫学与实验治疗档案》“ArchImmunol Ther Exp(Warsz)”(2015)63(2):101-108中所述，通过引用将其全文并入本文)。
噬菌体展示技术也可用于鉴定针对给定靶蛋白(例如IL-11或IL-11Rα)的抗体，且为技术人员熟知。例如Hoogenboom在《自然生物技术》“Nat.Biotechnol.”(2005)23,1105-1116中，和Chan等人在《国际免疫学》“International Immunology”(2014)26(12):649-657中对噬菌体展示在鉴定针对人靶蛋白的完全人源化抗体方面的应用进行了综述，其全文均通过引用并入本文。
抗体/片段可为抑制或降低IL-11生物活性的拮抗剂抗体/片段。抗体/片段可为能够中和IL-11生物学效应的中和性抗体，例如其通过IL-11受体刺激生产性信号传导的能力。中和活性可以通过中和T11小鼠浆细胞瘤细胞系中IL-11诱导增殖的能力来测定(Nordan,R.P.等人，(1987)《免疫学杂志》“J.Immunol”.139:813)。
IL-11结合抗体或IL-11Rα结合抗体，其拮抗IL-11介导的信号传导的能力可被评估，例如使用在US 2014/0219919 A1中，或Blanc等人(在《免疫学方法杂志》“J.ImmunolMethods”.2000年7月31日；241(1-2)；43-59.中)所述的方法。简而言之，可在体外评估IL-11结合抗体和IL-11Rα结合抗体抑制Ba/F3细胞增殖的能力，其中所述Ba/F3细胞表达来自适当物种的IL-11Rα和gp130，以应答来自适当物种IL-11的刺激。或者，通过评估αSMA的表达(如在WO 2018/109174 A2(实施例6)和WO 2018/109170 A2(实施例6)中所述，如Ng等人在《科学转化医学》“Sci Transl Med”.(2019)11(511)pii:eaaw1237中所述，以及如Widjaja等人在《胃肠病学》“Gastroenterology”(2019)157(3):777-792中所述)，可在体外分析在用TGFβ1刺激成纤维细胞后，IL-11结合抗体和IL-11Rα结合抗体抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转变的能力。
抗体通常包括六个CDR，有三个在轻链可变区(VL)中：LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3，还有三个在重链可变区(VH)中：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3。六个CDR共同定义了抗体的互补位，其为抗体与靶分子结合的部分。VH区和VL区包括每个CDR两侧的为CDR提供支架的骨架区(Framework regions,FRs)。从N端到C端，VH区包括以下结构：N端-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C端；VL区包括以下结构：N端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C端。
有几种定义抗体CDR和FR的不同惯例，例如Kabat等人在第5版《具有免疫学意义的蛋白质序列》“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，公共卫生署，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(Maryland,MD)(1991)中所述，Chothia等人在《分子生物学杂志》“J.Mol.Biol”196:901-917(1987)中所述，以及如Retter等人在《核酸研究》“Nucl.Acids Res”.(2005)33(增刊1):D671-D674中所述的VBASE2。本文所述抗体VH区和VL区的CDR和FR是根据Kabat系统定义的。
在一些实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段源自与IL-11特异性结合的抗体(例如Enx108A、Enx203或hEnx203)。在一些实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段源自与IL-11Rα特异性结合的抗体(例如Enx209或hEnx209)。
本发明的抗体和抗原结合片段优选地抑制IL-11介导的信号传导。此类抗体/抗原结合片段可被描述为IL-11介导的信号传导的拮抗剂，和/或可被描述为具有中和IL-11介导的信号传导的能力。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括IL-11结合抗体的CDR。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括本文所述IL-11结合抗体(例如Enx108A、Enx203或hEnx203)的CDR，或源自所述抗体的CDR。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区，所述VH区包括以下CDR：
(1)
具有氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR1，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR2，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:36的HC-CDR3，
或其变体，其中一个或多个HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VL区，所述VL区包括以下CDR：
(2)
具有氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR1，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR2，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:39的LC-CDR3，
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区，所述VH区包括以下CDR：
(3)
具有氨基酸序列SEQ ID NO:40的HC-CDR1，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:41的HC-CDR2，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:42的HC-CDR3，
或其变体，其中一个或多个HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VL区，所述VL区包括以下CDR：
(4)
具有氨基酸序列SEQ ID NO:43的LC-CDR1，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:44的LC-CDR2，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:45的LC-CDR3，
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括含有(1)中CDR的VH区和含有(2)中CDR的VL区。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括含有(3)中CDR的VH区和含有(4)中CDR的VL区。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括IL-11结合抗体的VH区和VL区。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括本文所述IL-11结合抗体(例如Enx108A、Enx203或hEnx203)的VH区和VL区，或源自所述抗体的VH区和VL区。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区，所述VH区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VL区，所述VL区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区和VL区，其中所述VH区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:26的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性；并且其中所述VL区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区，所述VH区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VL区，所述VL区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区和VL区，其中所述VH区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:22的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性；并且其中所述VL区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区，所述VH区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VL区，所述VL区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区和VL区，其中所述VH区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:30的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性；并且其中所述VL区包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括IL-11Rα结合抗体的CDR。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括本文所述IL-11Rα结合抗体(例如Enx209或hEnx209)的CDR，或源自所述抗体的CDR。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VH区，所述VH区包括以下CDR：
(5)
具有氨基酸序列SEQ ID NO:46的HC-CDR1，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:47的HC-CDR2，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:48的HC-CDR3，
或其变体，其中一个或多个HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括VL区，所述VL区包括以下CDR：
(6)
具有氨基酸序列SEQ ID NO:49的LC-CDR1，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:50的LC-CDR2，
具有氨基酸序列SEQ ID NO:51的LC-CDR3，
或其变体，其中一个或多个LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的一个或两个或三个氨基酸被另一氨基酸取代。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括含有(5)中CDR的VH区和含有(6)中CDR的VL区。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括IL-11Rα结合抗体的VH区和VL区。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括本文所述IL-11Rα结合抗体(例如Enx209或hEnx209)的VH区和VL区，或源自所述抗体的VH区和VL区。
在本发明的实施例中，参考氨基酸序列(例如本文所述的CDR序列、VH区序列或VL区序列)的一个或多个氨基酸被另一氨基酸置换，置换可为保守置换，例如下表。在一些实施例中，中间列中相同区块的氨基酸被取代。在一些实施例中，最右列中同一行的氨基酸被取代：
Figure BDA0003455680330000261
Figure BDA0003455680330000271
在一些实施例中，取代可以是功能上保守的。即在一些实施例中，相对于等效的未取代分子，取代可能不影响(或可能基本上不影响)包含取代的抗体/片段的一种或多种功能特性(例如靶标结合)。
在一些实施例中，相对于参考VH区或VL区序列的取代可集中在VH区或VL区序列的一个或多个特定区域中。例如来自参考VH区或VL区序列的变异可以集中在一个或多个骨架区中(FR1、FR2、FR3和/或FR4)。
可以使用能够结合相关靶分子的单克隆抗体(Monoclonal antibodies,mAb)序列来设计和制备本发明的抗体及抗原结合片段。也可以使用/提供抗体的抗原结合区，例如单链可变片段(Single chain variable fragment,scFv)、Fab和Fab2片段。“抗原结合区”或“抗原结合片段”为抗体的任何片段，所述抗体能够结合给定抗体的特异性靶标。
在一些实施例中，抗体/片段包括能够结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体的抗体VL区和VH区。抗体抗原结合区的VL和VH区共同构成Fv区。在一些实施例中，抗体/片段包括能够结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体的抗体Fv区或由所述抗体Fv区组成。Fv区可表达为单链，其中VH和VL区共价连接，例如通过柔性寡肽。因此，抗体/片段可以包括含有抗体VL区和VH区的scFv或由所述scFv组成，其中抗体VL区和VH区中所述的抗体能够结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体。
抗体抗原结合区的VL和轻链恒定区(Constant region of light chain,CL)，以及VH区和重链恒定区1(Constant region of heavy chain 1,CH1)共同构成Fab区。在一些实施例中，所述抗体/片段包括能够结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体的抗体Fab区或由所述抗体Fab区组成。
在一些实施例中，抗体/片段包括能够结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体的全抗体或由所述全抗体组成。“全抗体”是指具有与免疫球蛋白(Ig)结构基本相似结构的抗体。例如Schroeder和Cavacini在《过敏与临床免疫学杂志》“J Allergy ClinImmunol”.(2010)125(202):S41-S52中对不同种类的免疫球蛋白及其结构进行了描述，其全文通过引用并入本文。G型免疫球蛋白(即IgG)为约150kDa的包括两条重链和两条轻链的糖蛋白。从N端到C端，重链包括一个VH，接着是一个包括三个恒定域(CH1、CH2和CH3)的重链恒定区，类似地，轻链包括一个VL，接着是一个CL。根据重链，免疫球蛋白可分为IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM。轻链可为卡帕(Kappa,κ)或拉姆达(Lambda,λ)。
在一些实施例中，本发明的抗体/抗原结合片段包括免疫球蛋白重链恒定序列。在一些实施例中，免疫球蛋白重链恒定序列可为人免疫球蛋白重链恒定序列。在一些实施例中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为IgG或源自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM，例如人IgG(例如hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4)、hIgA(例如hIgA1、hIgA2)、hIgD、hIgE或hIgM。在一些实施例中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为或源自人IgG1同种型(例如G1m1、G1m2、G1m3或G1m17)的重链恒定序列。
在一些实施例中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为或源自人免疫球蛋白G1恒定区的序列(IGHG1；通用蛋白质资源“UniProt”:P01857-1,v1)。在一些实施例中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为或源自人免疫球蛋白G1恒定区的序列(IGHG1；通用蛋白质资源“UniProt”:P01857-1,v1)，所述人免疫球蛋白G1恒定区的序列包括K214R、D356E和L358M(即G1m3同种型)的取代。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
在一些实施例中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为或源自人免疫球蛋白G4恒定区的序列(IGHG4；通用蛋白质资源“UniProt”:P01861,v1)。在一些实施例中，所述免疫球蛋白重链恒定序列为或源自人免疫球蛋白G4恒定区的序列(IGHG4；通用蛋白质资源“UniProt”:P01861,v1)，所述人免疫球蛋白G4恒定区的序列包括S241P和/或L248E的取代。所述S241P的突变具有铰链稳定性，而L248E的突变进一步降低了IgG4已经很低的ADCC效应子功能(Davies和Sutton，《免疫学综述》“Immunol Rev”.2015年11月；268(1):139-159；Angal等人，《分子免疫学》“Mol Immunol”.1993年1月；30(1):105-8)。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
在一些实施例中，本发明的抗体/抗原结合片段包括免疫球蛋白轻链恒定序列。在一些实施例中，免疫球蛋白轻链恒定序列可为人免疫球蛋白轻链恒定序列。在一些实施例中，免疫球蛋白轻链恒定序列为或源自卡帕(Kappa,κ)或拉姆达(Lambda,λ)轻链，例如人免疫球蛋白κ恒定区(IGKC；Cκ；通用蛋白质资源“UniProt”:P01834-1,v2)或人免疫球蛋白λ恒定区(IGLC；Cλ)，例如IGLC1(通用蛋白质资源“UniProt”:P0CG04-1,v1)、IGLC2(通用蛋白质资源“UniProt”:P0DOY2-1,v1)、IGLC3(通用蛋白质资源“UniProt”:P0DOY3-1,v1)、IGLC6(通用蛋白质资源“UniProt”:P0CF74-1,v1)或IGLC7(通用蛋白质资源“UniProt”:A0M8Q6-1,v3)。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括免疫球蛋白轻链恒定序列。在一些实施例中，所述免疫球蛋白轻链恒定序列为或源自人免疫球蛋白κ的恒定区(IGKC；Cκ；通用蛋白质资源“UniProt”:P01834-1,v2；SEQ ID NO:90)。在一些实施例中，免疫球蛋白轻链恒定序列为人免疫球蛋白λ的恒定区(IGLC；Cλ)，例如IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6或IGLC7。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:55的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括：(i)一多肽，所述多肽包括或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性，以及(ii)一多肽，所述多肽包括或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括：(i)一多肽，所述多肽包括或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性，以及(ii)一多肽，所述多肽包括或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
在一些实施例中，所述抗体/抗原结合片段包括：(i)一多肽，所述多肽包括或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性，以及(ii)一多肽，所述多肽包括或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少70％序列同源性，优选地具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同源性。
Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和分泌，因此可以轻松生产大量所述片段。
全抗体和F(ab')2片段是“二价”的。“二价”是指所述抗体和F(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相比之下，Fab、Fv、ScFv和dAb片段是单价的，只有一个抗原结合位点。也可以使用本领域公知的噬菌体展示技术制备能够结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体的合成抗体。
抗体可以通过亲和力成熟的过程产生，其中所述亲和力成熟的过程产生经修饰的抗体，与未经修饰的亲本抗体相比，所述经修饰的抗体具有抗体对抗原亲和力的改善。亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的流程产生，例如Marks等人，《可重构技术》“Rio/Technology”10:779-783(1992)；Barbas等人，《美国科学院院报》“Proc Natl Acad SciUSA”91:3809-3813(1994)；Schier等人，《基因》“Gene”169:147-155(1995)；Yelton等人，《免疫学杂志》“J.Immunol”.155:1994-2004(1995)；Jackson等人，《免疫学杂志》“J.Immunol”.154(7):331 0-15 9(1995)；和Hawkins等人，《分子生物学杂志》“J.Mol.Biol”.226:889-896(1992)。
抗体/片段包括双特异性抗体，例如由两种不同抗体的两种不同片段组成，使得双特异性抗体结合两种类型的抗原。所述双特异性抗体包括如本文所述的能够结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体的抗体/片段。所述抗体可包括对第二抗原具有亲和力的不同片段，第二抗原可以是任何所需的抗原。用于制备双特异性抗体的技术是本领域众所周知的，例如参见Mueller,D等人(2010《生物制药》“Biodrugs”24(2):89-98)，Wozniak-KnoppG等人(2010《蛋白质工程设计与选择》“Protein Eng Des”23(4):289-297)和Baeuerle,PA等人(2009年《癌症研究》“Cancer Res”69(12):4941-4944)。双特异性抗体和双特异性抗原结合片段能够以任何合适的形式提供，例如Kontermann在《单克隆抗体》“MAbs”2012,4(2):182-197中所述的那些形式，其全文通过引用并入本文。例如，双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是双特异性抗体偶联物(例如IgG2、F(ab')2或CovX抗体(CovX-Body))、双特异性IgG或IgG样分子(例如IgG、scFv4-Ig、IgG-scFv、scFv-IgG、DVD-Ig、IgG-sVD、sVD-IgG、二合一IgG、mAb2或串联单抗(Tandemab)通用轻链(Common light chain,commonLC))、不对称双特异性IgG或IgG样分子(例如kih IgG、kih IgG通用轻链、交叉单抗(CrossMab)、kih IgG-scFab、mAb-Fv、电荷异构体(Charge pair)抗体或SEED抗体(SEED-body))、双特异性抗体小分子(例如双抗体(Diabody,Db)、dsDb、DART、scDb、串联双特异抗体(Tandem diabodies,tandAbs)、串联scFv(Tandem scFv,taFv)、串联dAb/VHH、三抗体、三抗体头部、Fab-scFv或F(ab')2-scFv2)、双特异性Fc和CH3融合蛋白(例如taFv-Fc、双重双抗体(Di-diabody)、scDb-CH3、scFv-Fc-scFv、HCAb-VHH、scFv-kih-Fc或scFv-kih-CH3)，或双特异性融合蛋白(例如scFv2-白蛋白、scDb-白蛋白、taFv-毒素、DNL-Fab3、DNL-Fab4-IgG、DNL-Fab4-IgG-细胞因子2)。尤其参见Kontermann《单克隆抗体》“MAbs”2012,4(2):182-19的图2。
产生双特异性抗体的方法包括化学交联抗体或抗体片段，例如使用可还原的键或不可还原的硫醚键，如Segal和Bast在2001年“双特异性抗体的产生”(“Production ofBispecific Antibodies”)《当前免疫学协议》“Current Protocols in Immunology”.14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16中所述，其全文通过引用并入本文。例如，N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-propionate,SPDP)可用于化学交联，例如Fab片段通过铰链区SH-基团产生二硫键连接的双特异性F(ab)2异二聚体。
产生双特异性抗体的其他方法包括融合抗体产生的杂交瘤，例如使用聚乙二醇产生能够分泌双特异性抗体的四源杂交瘤细胞，例如D.M.和Bast,B.J.在2001年“双特异性抗体的产生”(“Production of Bispecific Antibodies”)《当前免疫学协议》“CurrentProtocols in Immunology”.14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16中所述。
双特异性抗体和双特异性抗原结合片段也可通过从例如编码抗原结合分子多肽的核酸构建体表达而重组产生，例如在第二版《抗体工程：方法与操作》“AntibodyEngineering:Methods and Protocols”(美国胡马纳出版社(Humana Press)，2012年)中所述，在第40章《双特异性抗体的生产：双抗体和串联scFv》“Production of BispecificAntibodies:Diabodies and Tandem scFv”(Hornig和
Figure BDA0003455680330000311
Figure BDA0003455680330000312
)中所述，或French在“如何制作双特异性抗体”(“How to make bispecific antibodies”)《分子医学方法》“Methods Mol.Med”.2000；40:333-339中所述。
例如，可以通过分子克隆技术制备编码两个抗原结合域的轻链和重链可变区(即能够结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体的抗原结合域的轻链和重链可变区，和能够结合另一靶蛋白的抗原结合域的轻链和重链可变区)，并包括编码抗原结合域之间合适连接子或二聚化结构域的序列的DNA构建体。此后可以通过在合适的宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达(例如体外)构建体来产生重组双特异性抗体，然后可以任选地纯化表达的重组双特异性抗体。
诱捕受体
能够结合IL-11或含有IL-11的复合物的基于肽或多肽的药物，可以基于IL-11受体，例如IL-11受体的IL-11结合片段。
在一些实施例中，结合剂可包含IL-11Rα链的IL-11结合片段，并且可以优选地为可溶的和/或排除一个或多个或全部跨膜结构域。在一些实施例中，结合剂可以包括gp130的IL-11结合片段，并且可以优选地为可溶的和/或排除一个或多个或全部跨膜结构域。此类分子可被描述为诱捕受体。此类药物的结合可通过降低/阻止IL-11与IL-11受体(例如IL-11Rα或gp130)结合的能力来抑制IL-11介导的顺式和/或反式信号传导，从而抑制下游信号传导。
Curtis等人(《血液》“Blood”，1997年12月1日；90(11):4403-12)报道，当在表达跨膜IL-11R和gp130的细胞上进行测试时，可溶性鼠IL-11受体α链(sIL-11R)能够拮抗IL-11的活性。他们提出，观察到的sIL-11R对IL-11的拮抗作用取决于已经表达跨膜IL-11R的细胞上gp130分子的数量限制。
使用可溶性诱捕受体作为抑制信号转导和治疗干预的基础也被报道用于其他信号分子：受体对，例如VEGF和VEGF受体(De-Chao Yu等人，《分子治疗》“Molecular Therapy”(2012)；20 5,938-947；Konner和Dupont，《临床结直肠癌》“Clin Colorectal Cancer”2004年10月；4增刊2:S81-5)。
因此，在一些实施例中，结合剂可以是诱捕受体，例如IL-11和/或含有IL-11的复合物的可溶性受体。据报道，由诱捕受体提供的IL-11和/或含有IL-11的复合物的竞争导致IL-11拮抗剂作用(Curtis等，同上)。诱捕IL-11受体也在WO 2017/103108 A1和WO 2018/109168 A1中进行了描述，其全文均通过引用并入本文。
诱捕IL-11受体优选地结合IL-11和/或含有IL-11的复合物，从而使这些物种不能与gp130、IL-11Rα和/或gp130:IL-11Rα受体结合。因此，它们充当IL-11和含有IL-11的复合物的“诱捕”受体，与依那西普(Etanercept)充当TNFα的诱捕受体的方式非常相似。与不存在诱捕受体时的信号传导水平相比，IL-11介导的信号传导水平降低。
诱捕IL-11受体优选地通过一种或多种细胞因子结合模块(Cytokine bindingmodules,CBMs)与IL-11结合。CBM为或源自或同源于天然存在的IL-11受体分子的CBM。例如，诱捕IL-11受体可包括或由一种或多种CBM组成，所述CBM来自、衍生自或同源于gp130和/或IL-11Rα的CBM。
在一些实施例中，诱捕IL-11受体可包括或由一氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于gp130的细胞因子结合模块。在一些实施例中，诱捕IL-11受体可包括对应于IL-11Rα的细胞因子结合模块的氨基酸序列。在本文中，与给定肽/多肽的参考区域或序列“对应”的氨基酸序列具有至少60％序列同源性，例如与参考区域/序列的氨基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性。
在一些实施例中，诱捕受体可以结合IL-11，例如以至少为100μM或更小的结合亲和力，任选地为10μM或更小、1μM或更小、100nM或更小，或约1至100nM。在一些实施例中，诱捕受体可以包括全部或部分IL-11结合域并且可以任选地缺少全部或部分跨膜域。诱捕受体可以任选地融合到免疫球蛋白恒定区，例如IgG Fc区。
抑制剂
本发明考虑了能够结合IL-11、含有IL-11的复合物、IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物中的一种或多种，并抑制IL-11介导的信号传导的抑制剂分子的用途。
在一些实施例中，所述药物为基于肽或多肽的结合剂，所述结合剂基于IL-如IL-11的突变体、变异体或结合片段)。基于肽或多肽的合适药物能以不导致信号转导起始的方式或产生次优信号的方式结合IL-11受体(例如IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)。这种IL-11突变体可以作为内源性IL-11的竞争性抑制剂。
例如，W147A是一种IL-11拮抗剂，其中147位氨基酸从色氨酸突变为丙氨酸，从而破坏了IL-11所谓的“III位点”。该突变体可与IL-11Rα结合，但无法与gp130同源二聚体结合，从而有效阻断IL-11信号传导(Underhill-Day等人，2003年；《内分泌学》“Endocrinology”2003年8月；144(8):3406-14)。Lee等人(《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志》“Am J respire Cell Mol Biol”.2008年12月；39(6):739-746)还报道了能够特异性抑制IL-11与IL-11Rα结合的IL-11拮抗剂突变体(“突变蛋白”)的产生。IL-11突变蛋白也于WO 2009/052588 A1中进行了描述。
Menkhorst等人(《生殖生物学》“Biology of Reproduction”2009年5月1日第80卷第5期920-927)对一种聚乙二醇化的IL-11拮抗剂进行了描述，即PEGIL11A(CSL有限公司(CSL Limited)，帕克维尔，维多利亚州，澳大利亚)，它可在雌性小鼠中有效抑制IL-11的作用。
Pasqualini等人在《癌症》“Cancer”(2015)121(14):2411-2421描述了一种能够与IL-11Rα结合的配体导向的拟肽药物，即骨转移靶向拟肽-11(Bone metastasis-targetingpeptidomimetic-11,BMTP-11)。
在一些实施例中，可提供一能够结合IL-11受体的结合剂，所述结合剂是IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物之一的小分子抑制剂的形式。在一些实施例中，结合剂能以IL-11或含有IL-11的复合物的小分子抑制剂的形式提供，例如Lay等人在《国际肿瘤学杂志》“Int.J.Oncol”.(2012)；41(2):759-764中所述的IL-11抑制剂，其全文通过引用并入本文。
适体
在一些实施例中，能够结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11的受体(例如IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)的药物为适体。适体，也称为核酸/肽配体，是核酸或肽分子，其特征在于能够以高特异性和高亲和力结合靶分子。迄今为止，几乎所有鉴定出的适体都是非天然存在的分子。
给定靶标(例如IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11的受体)的适体，其鉴定和/或产生可通过指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands byEXponential enrichment,SELEXTM)方法，或通过开发SOMAmers(Slow off-rate modifiedaptamers，慢解离率修饰适体)(Gold L等人，(2010)《公共科学图书馆：综合》“PLoS One”5(12):e15004)进行。Tuerk和Gold在《科学》“Science”(1990)249(4968):505-10和WO 91/19813中对适体和SELEX进行了描述。SELEX和SOMAmer技术的应用包括添加拟氨基酸侧链的官能团，以扩展适体的化学多样性。因此，针对靶标的高亲和力适体可得到富集和鉴定。
适体可为DNA或RNA分子并且可以是单链或双链的。适体可包括经化学修饰的核酸，例如核酸中的糖和/或磷酸盐和/或碱基被化学修饰。此类修饰可提高适体的稳定性或使适体更耐降解，并且可包括在核糖2′位点的修饰。
适体可通过技术人员公知的方法合成。例如，适体可以化学合成，例如在在固相载体上。固相合成可使用亚磷酰胺化学法。简而言之，将固相载体上的核苷酸去三苯甲基，然后与适当活化的核苷亚磷酰胺偶联以形成亚磷酸三酯键。之后可能发生带帽(Capping)反应，随后用氧化剂(通常是碘)氧化亚磷酸三酯。接下来可重复该循环以组装所述适体(例如，参见Sinha,N.D.；Biernat,J.；McManus,J.；
Figure BDA0003455680330000341
H.《核酸研究》“Nucleic AcidsRes”.1984,12,4539；和Beaucage,S.L.；Lyer,R.P.(1992).《四面体》“Tetrahedron”48(12):2223)。
合适的核酸适体可任选地具有以下之一的最小长度：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。合适的核酸适体可任选地具有以下之一的最大长度：20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸。合适的核酸适体可任选地具有以下之一的长度：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸。
适体可为经选择或工程化以结合特定靶分子的肽。Reverdatto等人在《医药化学当前论题》“Curr Top Med Chem”.(2015)15(12):1082-101中对肽适体及其生成和鉴定方法进行了综述，其全文通过引用并入本文。肽适体可任选地具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之一的最小长度。肽适体可任选地具有以下之一的最大长度：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。合适的肽适体可任选地具有2-30、2-25、2-20、5-30、5-25或5-20个氨基酸之一的长度。
适体可具有nM或pM范围内的KD，例如小于500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM之一。
IL-11结合药物的特性
本发明的能够结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体的药物可表现出以下一种或多种特性：
·与IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体的特异性结合；
·以10μM或更小的KD结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体，优选地为≤5μM、≤1μM、≤500nM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤100pm之一的KD；
·抑制IL-11和IL-11Rα之间的相互作用；
·抑制IL-11和gp130之间的相互作用；
·抑制IL-11和IL-11Rα:gp130受体复合物之间的相互作用；
·抑制IL-11:IL-11Rα复合物和gp130之间的相互作用。
这些特性可通过在合适的试验中分析相关药物来确定，这可能涉及将药物的性能与合适的对照药物进行比较。技术人员能够为给定的试验确定合适的对照条件。
例如，用于分析测试抗体/抗原结合片段结合IL-11/含有IL-11的复合物/IL-11受体能力的合适阴性对照可为针对非靶蛋白的抗体/抗原结合片段(即对IL-11/含有IL-11的复合物/IL-11受体没有特异性的抗体/抗原结合片段)。合适的阳性对照可为已知的、经验证的(例如市售的)IL-11-或IL-11受体结合抗体。对照可与所分析的推定的IL-11/含有IL-11的复合物/IL-11受体结合抗体/抗原结合片段具有相同的同种型，例如可以具有相同的恒定区。
在一些实施例中，所述药物可以特异性结合IL-11或含有IL-11的复合物，或IL-11受体(例如IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)。与结合其他非靶分子相比，与给定靶分子特异性结合的药物结合靶分子亲和力宜更强和/或持续时间宜更长。
在一些实施例中，所述药物可结合IL-11或含有IL-11的复合物，其亲和力大于与IL-6细胞因子家族的一个或多个其他成员结合的亲和力(例如IL-6、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)、抑瘤素M(Oncostatin M,OSM)、心肌营养素-1(Cardiotrophin-1,CT-1)、睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)和心肌营养素样细胞因子(Cardiotrophin-like cytokine,CLC))。
在一些实施例中，所述药物可结合IL-11受体(例如，IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)，其亲和力大于与IL-6受体家族的一个或多个其他成员结合的亲和力。在一些实施例中，所述药物与IL-11Rα结合的亲和力可大于与IL-6Rα、白血病抑制因子受体(Leukemia inhibitory factor receptor,LIFR)、抑瘤素M受体(Oncostatin Mreceptor,OSMR)、睫状神经营养因子受体α(Ciliary neurotrophic factor receptoralpha,CNTFRα)和细胞因子受体样因子1(Cytokine receptor-receptor-like factor 1,CRLF1)中的一个或多个结合的亲和力。
在一些实施例中，结合药物与非靶标的结合程度比所述药物与靶标结合的约10％还要小，所述结合程度通过例如ELISA、SPR、生物膜层干涉技术(Bio-LayerInterferometry,BLI)、微尺度热泳(MicroScale Thermophoresis,MST)或放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)进行测量。或者，结合特异性可以通过结合亲和力来反映，其中所述结合药物与IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体结合，其KD比另一个非靶标分子的KD大至少0.1个数量级(即0.1×10n，其中n为代表数量级的整数)。所述数量级可以任选地为至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.5或至少2.0之一。
给定结合药物对其靶标的结合亲和力通常用其解离常数(KD)来描述。结合亲和力可以通过本领域已知的方法测量，例如通过ELISA、表面等离子体共振(Surface PlasmonResonance,SPR；参见例如Hearty等人，《分子生物学方法》“Methods Mol Biol”(2012)907:411-442；或Rich等人，《分析生物化学》“Anal Biochem”.2008年2月1日；373(1):112-20)、生物膜层干涉技术(参见例如Lad等人，(2015)《生物分子筛选杂志》“J Biomol Screen”20(4):498-507；或Concepcion等人，《组合化学和高通量筛选》“Comb Chem High ThroughputScreen”.2009年9月；12(8):791-800)、微尺度热泳(MST)分析(参见例如Jerabek-Willemsen等人，《检测和药物开发技术》“Assay Drug Dev Technol”.2011年8月；9(4):342–353)进行测定，或通过放射性标记抗原结合试验(RIA)测定。
在一些实施例中，所述药物能够以50μM或更小的KD结合IL-11或含有IL-11的复合物或IL-11受体，优选地KD≤10μM、≤5μM、≤4μM、≤3μM、≤2μM、≤1μM、≤500nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤15nM、≤12.5nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤500pM、≤400pM、≤300pM、≤200pM或≤100pM。
在一些实施例中，所述药物以EC50＝10,000ng/mL或更低的结合亲和力(例如通过ELISA测定)结合IL-11、含有IL-11的复合物或IL-11受体，优选地EC50≤5,000ng/mL、≤1000ng/mL、≤900ng/mL、≤800ng/mL、≤700ng/mL、≤600ng/mL、≤500ng/mL、≤400ng/mL、≤300ng/mL、≤200ng/mL、≤100ng/mL、≤90ng/mL、≤80ng/mL、≤70ng/mL、≤60ng/mL、≤50ng/mL、≤40ng/mL、≤30ng/mL、≤20ng/mL、≤15ng/mL、≤10ng/mL、≤7.5ng/mL、≤5ng/mL、≤2.5ng/mL，或≤1ng/mL。此类ELISA能以例如刊于第1卷(第2版)《实验室指南》“Springer Protocols”，斯普林格出版社(Springer)(2010)，第五部分第657-665页的“抗体工程”(“Antibody Engineering”)中所述方法进行。
在一些实施例中，所述药物结合IL-11或含有IL-11的复合物，所述结合在对于结合IL-11受体或含有IL-11复合物(例如gp130或IL-11Rα)很重要的区域中发生，从而抑制IL-11或含有IL-11的复合物与IL-11受体之间的相互作用，和/或抑制通过受体的信号传导。在一些实施例中，所述药物结合IL-11受体，所述结合在对于结合IL-11或含有IL-11的复合物很重要的区域中发生，从而抑制IL-11或含有IL-11的复合物与IL-11受体之间的相互作用，和/或抑制通过受体的信号传导。
给定结合药物(例如能够结合IL-11/含有IL-11的复合物或IL-11受体的药物)抑制两种蛋白质之间相互作用的能力，可通过例如存在结合药物时或将相互作用配体之一或二者都与结合药物孵育后的相互作用分析来确定。确定给定结合药物是否能够抑制两个相互作用配体之间相互作用的一个合适的测定实例是竞争ELISA。
能够抑制给定相互作用(例如IL-11和IL-11Rα之间，或IL-11和gp130之间，或IL-11和IL-11Rα:gp130之间，或IL-11:IL-11Rα和gp130之间)的结合药物是通过存在结合药物时或将相互作用配体之一或二者都与结合药物孵育后，与不存在结合药物(或存在适当的对照结合药物)时的相互作用水平相比，观察到相互作用配体之间相互作用水平的减少/降低来定义的。可在体外进行合适的分析，例如使用重组相互作用配体或使用表达所述相互作用配体的细胞。表达相互作用配体的细胞可以是内源性的，或者可以通过引入细胞的核酸来表达。出于此类测定的目的，为了检测和/或测量相互作用的水平，相互作用配体之一或两者和/或结合药物可被标记或与可检测实体结合使用。例如，所述药物可被标记，所述标记使用放射性原子或有色分子或荧光分子或能以任何其他方式易检测到的分子进行。合适的可检测分子包括荧光蛋白、荧光素酶、酶底物和放射性标记。所述结合药物可被可检测标记直接标记或可被间接标记。例如，所述结合药物可为未标记的，并且可被另一种本身被标记的结合药物检测到。或者，第二结合药物可能已与其生物素结合，并且被标记的链霉亲和素与生物素的结合可用于间接标记第一结合药物。
结合药物抑制两个结合配体之间相互作用的能力也可以通过分析这种相互作用的下游功能后果来确定，例如IL-11介导的信号传导。例如，相互作用的下游功能后果可包括例如由IL-11介导的过程，或例如胶原蛋白或IL-11的基因/蛋白质表达，所述相互作用为IL-11和IL-11Rα:gp130之间的，或IL-11:IL-11Rα和gp130之间的。
IL-11或含有IL-11的复合物与IL-11受体之间相互作用的抑制可以使用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法(3H-thymidine incorporation)和/或Ba/F3细胞增殖试验(Ba/F3 cellproliferation assays)进行分析，例如Curtis等人在《血液》“Blood”,1997,90(11)中所述，和Karpovich等人在《分子人类生殖学》“Mol.Hum.Reprod.”2003 9(2):75-80中所述的方法。Ba/F3细胞共表达IL-11Rα和gp130。
在一些实施例中，所述结合药物可以将IL-11和IL-11Rα之间的相互作用抑制到制到小于100％，例如抑制到不存在所述结合药物(或存在适当的对照结合药物)时IL-11和IL-11Rα之间相互作用水平的99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少，或1％或更少。在一些实施例中，所述结合药物可以将IL-11和IL-11Rα之间的相互作用抑制到小于1倍，例如抑制到不存在所述结合药物(或存在适当的对照结合药物)时IL-11和IL-11Rα之间相互作用水平的≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍。
在一些实施例中，所述结合药物可以将IL-11和gp130之间的相互作用抑制到小于100％，例如抑制到不存在所述结合药物(或存在适当的对照结合药物)时IL-11和gp130之间相互作用水平的99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少，或1％或更少。在一些实施例中，所述结合药物可以将IL-11和gp130之间的相互作用抑制到小于1倍，例如抑制到不存在所述结合药物(或存在适当的对照结合药物)时IL-11和gp130之间相互作用水平的≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍。
在一些实施例中，所述结合药物可以将IL-11和IL-11Rα:gp130之间的相互作用抑制到小于100％，例如抑制到不存在所述结合药物(或存在适当的对照结合药物)时IL-11和IL-11Rα:gp130之间相互作用水平的99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少，或1％或更少。在一些实施例中，所述结合药物可以将IL-11和IL-11Rα:gp130之间的相互作用抑制到小于1倍，例如抑制到不存在所述结合药物(或存在适当的对照结合药物)时IL-11和IL-11Rα:gp130之间相互作用水平的≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍。
在一些实施例中，所述结合药物可以将IL-11:IL-11Rα复合物和gp130之间的相互作用抑制到小于100％，例如抑制到不存在所述结合药物(或存在适当的对照结合药物)时IL-11:IL-11Rα复合物和gp130之间相互作用水平的99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少，或1％或更少。在一些实施例中，所述结合药物可以将IL-11:IL-11Rα复合物和gp130之间的相互作用抑制到小于1倍，例如抑制到不存在所述结合药物(或存在适当的对照结合药物)时IL-11:IL-11Rα复合物和gp130之间相互作用水平的≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍。
能够降低IL-11或IL-11受体表达的药物
在本发明的各个方面，所述能够抑制IL-11介导的信号传导的药物可以阻止或降低IL-11、IL-11Rα或gp130中的一种或多种的表达。
表达可以是基因或蛋白质表达，并且能用如本文所述的方法或通过技术人员公知的本领域方法确定。表达可以通过受试者的细胞/组织/器官/器官系统进行。
合适的药物可以是任何种类，但在一些实施例中，能够阻止或降低IL-11、IL-11Rα或gp130中的一种或多种表达的药物可以是小分子或寡核苷酸。
能够阻止或降低IL-11、IL-11Rα或gp130中的一种或多种表达的药物可以通过例如抑制编码IL-11、IL-11Rα或gp130的基因的转录，抑制编码IL-11、IL-11Rα或gp130的RNA的转录后加工，降低编码IL-11、IL-11Rα或gp130的RNA的稳定性，促进编码IL-11、IL-11Rα或gp130的RNA的降解，抑制IL-11、IL-11Rα或gp130多肽的翻译后加工，降低IL-11、IL-11Rα或gp130多肽的稳定性，或促进IL-11、IL-11Rα或gp130多肽的降解，来实现阻止或降低。
Taki等人，《临床与实验免疫学》“Clin Exp Immunol”(1998)4月；112(1):133-138中报道了在用吲哚美辛(Indomethacin)、地塞米松(Dexamethasone)或干扰素γ(Interferon-gamma,IFNγ)治疗后，类风湿关节炎滑膜细胞中IL-11的表达降低。
本发明考虑使用反义核酸来阻止/减少IL-11、IL-11Rα或gp130的表达。在一些实施例中，能够阻止或降低IL-11、IL-11Rα或gp130表达的药物可通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)引起表达降低。
在一些实施例中，所述药物可为抑制性核酸，例如反义RNA或小干扰RNA，包括但不限于shRNA或siRNA。
在一些实施例中，抑制性核酸在载体中提供。例如，在一些实施例中，所述药物可为一慢病毒载体，所述慢病毒载体编码用于IL-11、IL-11Rα或gp130中的一种或多种的shRNA。
寡核苷酸分子，尤其是RNA，可用于调控基因表达。这些基因表达的调控包括反括反义寡核苷酸、小干扰RNA(Small interfering RNAs,siRNA)对mRNA的靶向降解、转录后基因沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGs)、微RNA(Micro-RNAs,miRNAs)对mRNA发育调控序列特异性的翻译抑制，和靶向转录基因沉默。
反义寡核苷酸是一种寡核苷酸，优选地为单链的，它通过互补序列的结合靶向并结合到靶寡核苷酸，例如mRNA。当靶寡核苷酸是mRNA时，反义寡核苷酸与mRNA的结合会阻止mRNA的翻译和基因产物的表达。反义寡核苷酸可被设计成结合正义基因组核酸并抑制靶核苷酸序列的转录。
鉴于IL-11、IL-11Rα和gp130的已知核酸序列(例如可从基因库(GenBank)中下组的登录号获得已知mRNA序列：BC012506.1GI:15341754(人IL-11)、BC134354.1GI:126632002(小鼠IL-11)、AF347935.1GI:13549072(大鼠IL-11)、NM_001142784.2GI:391353394(人IL-11Rα)、NM_001163401.1GI:254281268(小鼠IL-11Rα)、NM_139116.1GI:20806172(大鼠IL-11Rα)、NM_001190981.1GI:300244534(人gp130)、NM_010560.3GI:225007624(小鼠gp130)、NM_001008725.3GI:300244570(大鼠gp130))，寡核苷酸可被设计以抑制或沉默IL-11、IL-11Rα或gp130的表达。
这种寡核苷酸可具有任何长度，但优选地为短的，例如少于100个核苷酸，例如10-40个核苷酸，或20-50个核苷酸，并且可包括一核苷酸序列，所述核苷酸序列与靶寡核苷酸中相应长度的核苷酸序列(例如IL-11、IL-11Rα或gp130的mRNA)具有完全互补性或近似互补性(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的互补性)。所述核苷酸序列的互补区可具有任何长度，但优选地为至少5个，任选地不超过50个核苷酸，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸之一。
IL-11、IL-11Rα或gp130表达的抑制将优选地导致由细胞/组织/器官/器官系统/受试者表达的IL-11、IL-11Rα或gp130的量减少。例如，通过施用合适的核酸，在给定的细胞中抑制IL-11、IL-11Rα或gp130，将导致该细胞相对于未经处理的细胞表达的IL-11、IL-11Rα或gp130的量减少。抑制可为局部的。优选地抑制程度为至少50％，更优选地为至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少90％之一。90％到100％之间的抑制水平被认为是表达或功能的“沉默”。
RNA干扰机制(RNAi machinery)和小RNA(Small RNAs)在靶向异染色质复合物和在特定染色体位点的表观遗传基因沉默中的作用已得到证实。双链RNA(Double strandedRNA,dsRNA)依赖性转录后沉默，也称为RNA干扰(RNAi)，是一种其中的双链RNA复合物可在短时间内靶向特定的同源基因进行沉默的现象。它充当一促进降解的信号，所述降解为具有序列同源性的mRNA的降解。20个核苷酸(20-nt)的siRNA通常足够长以诱导基因特异性沉默，但足够短以规避宿主反应。随着由一些siRNA分子诱导的90％沉默，靶向基因产物表达的降低是广泛的。基于RNAi的疗法已进入针对多种适应症的I、II和III期临床试验(《自然》“Nature”2009年1月22日；457(7228):426-433)。
在本领域中，这些RNA序列根据它们的来源被称为“短或小干扰RNA”(“Short orsmall interfering RNAs”)(siRNAs)或“微RNA”(“MicroRNAs”)(miRNA)。两种类型的序列都可用于下调基因表达，所述下调通过与互补RNA结合，并且要么触发mRNA消除(RNAi)或要么阻止mRNA翻译成蛋白质进行。siRNA是通过加工长双链RNA获得的，当在自然界中发现时通常为外源性的。微干扰RNA(Micro-interfering RNA,miRNA)是内源性编码的非编码小RNA，通过加工短发夹结构获得。siRNA和miRNA都可以抑制带有部分互补靶序列的mRNA的翻译，而不会发生RNA切割，并且都可降解带有完全互补序列的mRNA。
siRNA配体通常是双链的，为了优化RNA介导的靶基因功能下调的有效性，优选地siRNA分子的长度被选择以确保RISC复合物正确识别siRNA，所述RISC复合物介导siRNA对mRNA靶标的识别，因此所述siRNA需足够短以减少宿主反应。
miRNA配体通常是单链并具有部分互补的区域，使配体能够形成发夹结构。miRNA是从DNA转录的RNA基因，但不翻译成蛋白质。编码miRNA基因的DNA序列比miRNA长。该DNA序列包括所述miRNA序列和一个近似的反向互补序列。当该DNA序列转录成单链RNA分子时，所述miRNA序列与其反向互补碱基对形成部分双链RNA片段。John等人在《公共科学图书馆：生物学》“PLoS Biology”,11(2),1862-1879,2004中对微RNA序列的设计进行了讨论。
通常，旨在模拟siRNA或miRNA作用的RNA配体具有10至40个核糖核苷酸(或其合成类似物)，更优选地具有17至30个核糖核苷酸，更优选地具有19至25个核糖核苷酸，最优选地具有21至23个核糖核苷酸。在使用双链siRNA的本发明的一些实施例中，所述分子可具有对称的3'突出端，例如一个或两个(核糖)核苷酸，通常是dTdT 3'突出端的UU。基于本文提供的公开内容，技术人员不难设计出合适的siRNA和miRNA序列，例如使用诸如Ambion公司的siRNA finder之类的资源。siRNA和miRNA序列可被人工合成产生并被外源性地添加以引起基因下调，或使用表达系统(例如载体)产生。在一个优选的实施例中，siRNA是人工合成的。
较长的双链RNA可在细胞中加工以产生siRNA(参见例如Myers(2003)《自然生物技术》“Nature Biotechnology”21:324-328)。较长的dsRNA分子可能具有对称的3'或5'突出端，例如一个或两个(核糖)核苷酸，或可能有平末端。所述较长的dsRNA分子可为25个核苷酸或更长。优选地，较长的dsRNA分子的长度在25和30个核苷酸之间。更优选地，较长的dsRNA分子的长度在25至27个核苷酸之间。最优选地，较长的dsRNA分子的长度为27个核苷酸。长度为30个或更多核苷酸的dsRNA可使用载体pDECAP(Shinagawa等人，《基因与发育》“Genes and Dev.”,17,1340-5,2003)表达。
另一种选择是在细胞中表达短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)分子。shRNA比合成的siRNA更稳定。shRNA由短的反向重复序列组成，所述短的反向重复序列由小的环序列分隔。一个反向重复序列与基因靶标是互补的。在细胞中，所述shRNA被DICER加工成siRNA，从而降解靶基因mRNA并抑制表达。在一个优选的实施例中，所述shRNA是通过从载体转录而内源性地(在细胞内)产生的。shRNA可通过使用一载体转染细胞而在细胞内产生，所述载体在RNA聚合酶III启动子(例如人H1或7SK启动子)或RNA聚合酶II启动子的控制下编码shRNA序列。或者，所述shRNA可通过从一载体的转录来外源性地(体外)合成。所述shRNA随后可被直接引入细胞。优选地，所述shRNA分子包括IL-11、IL-11Rα或gp130的部分序列。优选地，所述shRNA序列的长度在40和100个碱基之间，更优选地长度在40和70个碱基之间。发夹结构茎部的长度优选地在19到30个碱基对之间。所述茎部可包括G-U配对以稳定所述发夹结构。
siRNA分子、较长的dsRNA分子或miRNA分子可通过核酸序列的转录重组制备，优选地其包含在一载体内。优选地，所述siRNA分子、较长的dsRNA分子或miRNA分子包括IL-11、IL-11Rα或gp130的部分序列。
在一个实施例中，所述siRNA、较长的dsRNA或miRNA是通过从一载体的转录而内源性地(在细胞内)产生的。所述载体能以本领域已知的任何方式引入细胞。任选地，RNA序列的表达可使用组织特异性(例如心脏、肝脏或肾脏特异性)启动子来调控。在进一步的实施例中，所述siRNA、较长的dsRNA或miRNA是通过从一载体的转录而外源性地(体外)产生的。
合适的载体可为寡核苷酸载体，所述寡核苷酸载体被配置为表达寡核苷酸药物，所述寡核苷酸药物能够抑制IL-11、IL-11Rα或gp130。这种载体可为病毒载体或质粒载体。治疗性寡核苷酸可被掺入一病毒载体的基因组中，并与一调控序列(例如驱动其表达的启动子)可操作地连接。术语“可操作地连接”可包括下述情况：其中一选定核苷酸序列和调控核苷酸序列共价连接，所述共价连接的方式使得一核苷酸序列的表达受到所述调控序列的影响或控制。因此，如果所述调控序列能够影响一核苷酸序列的转录，所述核苷酸序列形成部分或全部的所述选定核苷酸序列，则调控序列可操作地连接于选定核苷酸序列。
编码由启动子表达的siRNA序列的病毒载体是本领域已知的并且有利于长期表达治疗性寡核苷酸。实例包括慢病毒(《自然》“Nature”2009年1月22日；457(7228):426-433)、腺病毒(Shen等人，《欧洲生化学会联合会快报》“FEBS Lett”2003年3月27日；539(1-3)111-4)和逆转录病毒(Barton和Medzhitov，《美国科学院院报》“PNAS”2002年11月12日，第99卷第23期14943-14945)。
在其他实施例中，载体可被配置为协助将治疗性寡核苷酸递送至指定位点，所述位点需要抑制IL-11、IL-11Rα或gp130的表达。此类载体通常涉及：将所述寡核苷酸与一带正电荷的载体(例如阳离子细胞穿透肽、阳离子聚合物和树枝状聚合物以及阳离子脂质)复合；将所述寡核苷酸与小分子(例如胆固醇、胆汁酸和脂质)、聚合物、抗体和RNA结合；或将所述寡核苷酸封装在纳米颗粒制剂中(Wang等人，《AAPS期刊》“AAPS J”.2010年12月；12(4):492-503)。
在一个实施例中，载体可同时包括正义方向和反义方向的核酸序列，使得当表达为RNA时，正义和反义片段将结合形成双链RNA。
或者，siRNA分子可使用本领域已知的标准固相或液相合成技术合成。核苷酸之间的连接可为磷酸二酯键或其替代物，例如下组各式的连接基团：P(O)S(硫代)；P(S)S(二硫代)；P(O)NR'2；P(O)R'；P(O)OR6；CO；或CONR'2，其中R为H(或盐)或烷基(1-12C)且R6为通过-O-或-S-连接至相邻核苷酸的烷基(1-9C)。
除了天然存在的碱基之外，还可使用经修饰的核苷酸碱基，并且可赋予含有经修饰的核苷酸碱基的siRNA分子以有利的性质。
例如，经修饰的碱基可增加siRNA分子的稳定性，从而减少沉默所需的总量。提供经修饰的碱基也可提供siRNA分子，所述siRNA分子比未经修饰的siRNA更稳定或更不稳定。
术语“经修饰的核苷酸碱基”包括具有共价修饰碱基和/或糖的核苷酸。例如，经修饰的核苷酸包括具有糖的核苷酸，所述具有糖的核苷酸共价连接于低分子量的有机基团(3'位羟基和5'位磷酸基团除外)。因此，经修饰的核苷酸也可包括2'取代糖：例如2'-O-甲基-；2'-O-烷基；2'-O-烯丙基；2'-S-烷基；2'-S-烯丙基；2'-氟代-；2'-卤代或叠氮-核糖、碳环糖类似物、a-异构化糖；差向异构糖，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖。
经修饰的核苷酸是本领域已知的，包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶以及其他杂环。这些类型的嘧啶和嘌呤在本领域是已知的，且包括：假异胞嘧啶、N4、N4-乙烯基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、-D-甘露糖基辫苷、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-丙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-乙基胞嘧啶、5-丁基尿嘧啶、5-戊基尿嘧啶、5-戊基胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤、甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基胞嘧啶。
使用RNAi沉默线虫(C.elegans)、果蝇(Drosophila)、植物和哺乳动物基因的相关方法在本领域是已知的(Fire A等人，1998《自然》“Nature”391:806-811；Fire,A.《遗传学趋势》“Trends Genet”.15,358-363(1999)；Sharp,P.A.“RNA干扰”(“RNA interference”)2001.《基因与发展》“Genes Dev”.15,485-490(2001)；Hammond,S.M.等人，《自然综述遗传学》“Nature Rev.Genet”.2,110-1119(2001)；Tuschl,T.《化学与生物化学》“Chem.Biochem”.2,239-245(2001)；Hamilton,A.等人，《科学》“Science”286,950-952(1999)；Hammond,S.M.等人，《自然》“Nature”404,293-296(2000)；Zamore,P.D.等人，《细胞》“Cell”101,25-33(2000)；Bernstein,E.等人，《自然》“Nature”409,363-366(2001)；Elbashir,S.M.等人，《基因与发展》“Genes Dev”.15,188-200(2001)；WO0129058；WO9932619和Elbashir S M等人，2001《自然》“Nature”411:494-498)。
因此，本发明提供一核酸，当其被适当地引入以其他方式表达IL-11、IL-11Rα或gp130的哺乳动物(例如人)细胞或在哺乳动物(例如人)细胞内表达时，所述核酸能通过RNAi抑制IL-11、IL-11Rα或gp130的表达。
IL-11、IL-11Rα和gp130的核酸序列(例如可从基因库(GenBank)中下组的登录号获得的已知mRNA序列：BC012506.1GI:15341754(人IL-11)、BC134354.1GI:126632002(小鼠IL-11)、AF347935.1GI:13549072(大鼠IL-11)、NM_001142784.2GI:391353394(人IL-11Rα)、NM_001163401.1GI:254281268(小鼠IL-11Rα)、NM_139116.1GI:20806172(大鼠IL-11Rα)、NM_001190981.1GI:300244534(人gp130)、NM_010560.3GI:225007624(小鼠gp130)、NM_001008725.3GI:300244570(大鼠gp130))，寡核苷酸可被设计为抑制或沉默IL-11、IL-11Rα或gp130的表达。
所述核酸可与IL-11、IL-11Rα或gp130 mRNA的一部分具有实质性序列同源性，例如在GenBank登录号NM_000641.3GI:391353405(IL-11)、NM_001142784.2GI:391353394(IL-11Rα)、NM_001190981.1GI:300244534(gp130)中所定义，或与所述mRNA的互补序列具有实质性序列同源性。
所述核酸可为双链siRNA(正如技术人员将理解，并且如下文进一步解释，siRNA分子也可包括短的3'DNA序列)。
或者，所述核酸可为DNA(通常为双链DNA)，当在哺乳动物细胞中转录时，会产生通过间隔子连接的具有两个互补部分的RNA，使得当互补部分互相杂交时所述RNA呈发夹结构形式。在哺乳动物细胞中，所述发夹结构可被酶DICER从分子上切割，产生两个不同但杂交的RNA分子。
在一些优选的实施例中，所述核酸一般靶向SEQ ID NO(序列号):4至7(IL-之一或靶向SEQ ID NO:8至11(IL-11Rα)之一的序列。
只有mRNA转录本的单链(即非自杂交)区域有望成为RNA干扰的合适靶点。因此提出在IL-11或IL-11RαmRNA转录本中，与SEQ ID NO:4至7或8至11之一所代表的序列非常接近的其他序列，也可能是RNA干扰的合适靶点。此类靶序列的长度优选地为17-23个核苷酸，且优选地与SEQ ID NO:4至7或8至11中的一个序列重叠至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或全部19个核苷酸(在SEQ ID NO:4至7或8至11之一的任一端)。
因此，本发明提供一核酸，当其被适当地引入以其他方式表达IL-11、IL-11Rα或gp130的哺乳动物细胞或在哺乳动物细胞内表达时，所述核酸能通过RNAi抑制IL-11、IL-11Rα或gp130的表达，其中所述核酸一般靶向SEQ ID NO:4至7或8至11之一的序列。
通过“一般靶向”，所述核酸可靶向与SEQ ID NO:4至7或8至11重叠的序列。具体而言，所述核酸可靶向人类IL-11或IL-11RαmRNA中的序列，所述序列略长于或略短于SEQ IDNO:4至7或8至11之一(优选地长度为17至23个核苷酸)，但与SEQ ID NO:4至7或8至11之一在其他方面相同。
预期本发明的核酸和靶序列之间不必具有完全同源性/互补性，尽管优选地为完全同源性/互补性。因此，与IL-11或IL-11Rα的mRNA相比，本发明的核酸可包括单个错配。然而，预期即使存在单个错配也可能导致效率降低，因此最好不存在错配。如果存在3'突出端，则可将其排除在错配数量的考虑之外。
术语“互补性”不限于核酸之间的常规碱基配对，其中所述核酸由天然核糖和/或脱氧核糖核苷酸组成，“互补性”还包括mRNA和本发明的核酸之间的碱基配对，其中所述核酸包括非天然核苷酸。
在一个实施例中，所述核酸(本文称为双链siRNA)包括SEQ ID NO:12至15中所示的双链RNA序列。在另一实施例中，所述核酸(本文称为双链siRNA)包括SEQ ID NO:16至19中所示的双链RNA序列。
然而，也可以预期，靶向IL-11或IL-11Rα的mRNA相同区域的略短或略长的序列也将有效。尤其是，预期长度在17到23bp之间的双链序列也将有效。
形成双链RNA的链可具有短的3'二核苷酸突出端，所述突出端可为DNA或RNA。与3'RNA突出端相比，使用3'DNA突出端对siRNA的活性没有影响，但降低了核酸链的化学合成成本(Elbashir等人，2001c)。因此，DNA二核苷酸可为优选的。
当存在二核苷酸突出端时，所述二核苷酸突出端可为互相对称的，尽管这不是必需的。事实上，正义(上部)链的所述3'突出端与RNAi的活性无关，因为它不参与mRNA识别和降解(Elbashir等人，2001a、2001b、2001c)。
尽管果蝇中的RNAi实验表明反义3'突出端可能参与mRNA识别和靶向(Elbashir等人，2001c)，但在哺乳动物细胞中，3'突出端对siRNA的RNAi活性似乎并不是必需的。因此认为3'突出端的不正确退火对哺乳动物细胞几乎没有影响(Elbashir等人，2001c；Czauderna等人，2003)。
因此，任何二核苷酸突出端都可用于siRNA的反义链。然而，所述二核苷酸优选地为-UU或-UG(或-TT或-TG，如果突出端为DNA)，更优选地为-UU(或-TT)。-UU(或-TT)二核苷酸突出端是最有效的，并且与RNA聚合酶III转录终末信号(终止信号为TTT)一致(即能够形成RNA聚合酶III转录终末信号的一部分)。因此，该二核苷酸是最优选的。也可使用二核苷酸AA、CC和GG，但效果稍逊一筹，因此为次优选。
此外，3'突出端可从siRNA中被完全省略。
本发明还提供了单链核酸(本文称为单链siRNA)，所述单链核酸分别由上述双链核酸之一的组分链组成，优选地具有3'突出端，但任选地可不具有。本发明还提供包含成对的这种单链核酸的试剂盒，所述单链核酸能在体外相互杂交以形成上述双链siRNA，随后所述双链siRNA可被引入细胞中。
本发明还提供一DNA，当在哺乳动物细胞中转录时，所述DNA产生具有两个互补部分的RNA(本文也称为shRNA)，所述互补部分能够自我杂交以产生双链基序，例如包括选自下组的序列：SEQ ID NO:12至15或16至19，或通过单个碱基对替换而不同于上述任何一个序列的序列。
所述互补部分通常由间隔子连接，所述间隔子具有适当的长度和序列，以允许所述的两个互补部分互相杂交。所述的两个互补部分(即正义和反义部分)可按任意顺序5'-3'连接。所述间隔子通常为一短序列，具有约4-12个核苷酸，优选地具有4-9个核苷酸，更优选地具有6-9个核苷酸。
优选地，所述间隔子的5'端(紧接上游互补部分的3'端)由核苷酸-UU-或-UG-组成，再次优选地由-UU-组成(再次，尽管这些特定二核苷酸的使用不是必需的)。UUCAAGAGA是一个合适的间隔子，建议在OligoEngine(西雅图，华盛顿州，美国)的pSuper系统中使用。在这种和其他情况下，所述间隔子的端部可以互相杂交，例如通过少量(例如1个或2个)碱基对将所述双链基序延伸，使其超出SEQ ID NO:12至15或16至19的确切序列。
类似地，转录的RNA优选地包括来自下游互补部分的3'突出端。再次，所述3'突出端优选地为-UU或-UG，更优选地为-UU。
随后，这种shRNA分子可在哺乳动物细胞中被酶DICER切割以产生如上所述的双链siRNA，所述双链siRNA中杂交dsRNA的一条或每条链包括一3'突出端。
当然，本发明核酸的合成技术在本领域中是众所周知的。
本领域技术人员能使用公知的技术和商用材料为本发明的DNA构建合适的转录载体。特别地，所述DNA将与调控序列相关联，所述调控序列包括启动子和转录终止序列。
特别适用的是OligoEngine(西雅图，华盛顿州，美国)的商用pSuper和pSuperior系统。它们使用聚合酶III启动子(H1)和T5转录终止子序列，所述T5转录终止子序列在转录本的3'端贡献两个U残基(所述U残基经DICER处理后，提供所述siRNA的一条链的3'UU突出端)。
Shin等人(在《RNA》，2009年5月；15(5):898-910中)描述了另一个合适的系统，所述系统使用另一个聚合酶III启动子(U6)。
本发明的双链siRNA可使用如下所述的已知技术在体外或体内引入哺乳动物细胞中，用以抑制IL-11或IL-11受体的表达。
类似地，含有本发明DNA的转录载体可使用如下所述的已知技术在体外或体内引入肿瘤细胞中，用于RNA的瞬时或稳定表达，再次用以抑制IL-11或IL-11受体的表达。
因此，本发明还提供了一种抑制哺乳动物(例如人)细胞中IL-11或IL-11受体表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用本发明的双链siRNA或本发明的转录载体。
类似地，本发明进一步提供一种治疗代谢性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的双链siRNA或本发明的转录载体。
本发明进一步提供本发明的双链siRNA和本发明的转录载体，用于一种治疗方法，优选地为一种治疗代谢性疾病的方法。
本发明进一步提供本发明的双链siRNA和本发明的转录载体在制备用于治疗代谢性疾病的药物中的用途。
本发明进一步提供一种组合物，所述组合物包括本发明的双链siRNA或本发明的转录载体并与一种或多种药学上可接受的载体相混合。合适的载体包括亲脂性载体或囊泡，其可帮助穿透细胞膜。
适用于施用本发明的siRNA双链体和DNA载体的材料和方法在本领域是公知的，并且鉴于RNAi技术的潜力，正在开发改进的方法。
通常，许多技术可用于将核酸导入哺乳动物细胞。技术的选择将取决于核酸是转移到体外培养的细胞中，还是转移到患者体内的细胞中。适合在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用：脂质体、电穿孔、微量注射、细胞融合、DEAE、葡聚糖和磷酸钙沉淀。体内基因转移技术包括病毒(通常是逆转录病毒)载体转染和病毒外壳蛋白脂质体介导的转染(Dzau等人，(2003)《生物技术趋势》“Trends in Biotechnology”11,205-210)。
具体而言，用于在体外和体内对本发明核酸进行细胞给药的合适技术在以下文章文章中公开：
一般综述：Borkhardt,A.2002.“通过RNA干扰阻断恶性细胞中的癌基因——高度特异性癌症治疗的新希望？”(“Blocking oncogenes in malignant cells by RNAinterference--new hope for a highly specific cancer treatment？”)《癌细胞》“Cancer Cell”2:167-8；Hannon,G.J.2002.“RNA干扰”(“RNA interference”)《自然》“Nature”.418:244-51；McManus,M.T.和P.A.Sharp.2002.“通过小干扰RNA在哺乳动物中进行基因沉默”(“Gene silencing in mammals by small interfering RNAs”)《自然综述遗传学》“Nat Rev Genet”.3:737-47；Scherr,M.,M.A.Morgan和M.Eder.2003b.“哺乳动物细胞中由小干扰RNA介导的基因沉默”(“Gene silencing mediated by small interferingRNAs in mammalian cells”)《当前医药化学》“Curr Med Chem”.10:245-56；Shuey,D.J.,D.E.McCallus和T.Giordano.2002.“RNAi：治疗干预中的基因沉默”(“RNAi:gene-silencing in therapeutic intervention”)《今日药物发现》“Drug Discov Today”.7:1040-6。
使用脂质体进行全身给药：Lewis,D.L.,J.E.Hagstrom,A.G.Loomis,J.A.Wolff和H.Herweijer.2002.“siRNA的高效传递抑制出生后小鼠的基因表达”(“Efficientdelivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice”)《自然遗传学》“Nat Genet”.32:107-8；Paul,C.P.,P.D.Good,I.Winer和D.R.Engelke.2002.“小干扰RNA在人细胞中的有效表达”(“Effective expression of small interfering RNAin human cells”)《自然生物技术》“Nat Biotechnol”.20:505-8；Song,E.,S.K.Lee,J.Wang,N.Ince,N.Ouyang,J.Min,J.Chen,P.Shankar和J.Lieberman.2003.“靶向Fas的RNA干扰对小鼠重型肝炎的保护作用”(“RNA interference targeting Fas protects micefrom fulminant hepatitis”)《自然医学》“Nat Med”.9:347-51；Sorensen,D.R.,M.Leirdal和M.Sioud.2003.“在成年小鼠中通过全身给药合成siRNA实现基因沉默”(“Genesilencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice”)《分子生物学杂志》“J Mol Biol”.327:761-6。
病毒介导的转移：Abbas-Terki,T.,W.Blanco-Bose,N.Deglon,W.Pralong和P.Aebischer.2002.“慢病毒介导的RNA干扰”(“Lentiviral-mediated RNAinterference”)《人类基因治疗》“Hum Gene Ther”.13:2197-201；Barton,G.M.和R.Medzhitov.2002.“逆转录病毒递送小干扰RNA进入原代细胞”(“Retroviral deliveryof small interfering RNA into primary cells”)《美国科学院院报》“Proc Natl AcadSci U S A”.99:14943-5；Devroe,E.和P.A.Silver.2002.“逆转录病毒介导的siRNA”(“Retrovirus-delivered siRNA”)《BMC生物技术》“BMC Biotechnol”.2:15；Lori,F.,P.Guallini,L.Galluzzi和J.Lisziewicz.2002.“HIV感染的基因治疗方法”(“Genetherapy approaches to HIV infection”)《美国药物基因组学杂志》“Am JPharmacogenomics”.2:245-52；Matta,H.,B.Hozayev,R.Tomar,P.Chugh和P.M.Chaudhary.2003.“使用慢病毒载体递送小干扰RNA”(“Use of lentiviral vectorsfor delivery of small interfering RNA”)《癌症生物学与治疗》“Cancer Biol Ther”.2:206-10；Qin,X.F.,D.S.An,I.S.Chen和D.Baltimore.2003.“通过慢病毒介导的对CCR5的小干扰RNA递送抑制人T细胞中的HIV-1感染”(“Inhibiting HIV-1infection in humanT cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA againstCCR5”)《美国科学院院报》“Proc Natl Acad Sci U S A”.100:183-8；Scherr,M.,K.Battmer,A.Ganser和M.Eder.2003a.“通过慢病毒介导的小干扰RNA递送调控基因表达”(“Modulation of gene expression by lentiviral-mediated delivery of smallinterfering RNA”)《细胞周期》“Cell Cycle”.2:251-7；Shen,C.,A.K.Buck,X.Liu,M.Winkler和S.N.Reske.2003.“通过腺病毒传递的siRNA进行基因沉默”(“Gene silencingby adenovirus-delivered siRNA”)《欧洲生化学会联合会快报》“FEBS Lett”.539:111-4。
肽的传递：Morris,M.C.,L.Chaloin,F.Heitz和G.Divita.2000.“易位肽和蛋白质及其在基因传递中的应用”(“Translocating peptides and proteins and their usefor gene delivery”)《生物技术最新观点》“Curr Opin Biotechnol”.11:461-6；Simeoni,F.,M.C.Morris,F.Heitz和G.Divita.2003.“深入了解基于肽的基因传递系统MPG的机制：siRNA传递到哺乳动物细胞中的意义”(“Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG:implications for delivery of siRNA intomammalian cells”)《核酸研究》“Nucleic Acids Res”.31:2717-24。其他可能适合将siRNA递送至靶细胞的技术基于纳米颗粒或纳米胶囊，如美国专利号6,649,192B和5,843,509B中所述。
IL-11介导的信号传导的抑制
在本发明的实施例中，能够抑制IL-11作用的试剂可具有以下一种或多种功能特性：
·抑制IL-11介导的信号传导；
·抑制由IL-11与IL-11Rα:gp130受体复合物的结合介导的信号传导；
·抑制由IL-11:IL-11Rα复合物与gp130的结合介导的信号传导(即IL-11反式信号传导)；
·抑制IL-11介导的过程；
·抑制IL-11和/或IL-11Rα的基因/蛋白表达。
这些特性可通过在合适的试验中分析相关试剂来确定，所述试验可能涉及将所述试剂的性能与合适的对照试剂进行比较。技术人员能够确定给定试验的适当对照条件。
IL-11介导的信号传导和/或由IL-11介导的过程包括由IL-11片段和包含IL-11或其片段的多肽复合物介导的信号传导。IL-11介导的信号传导可为由人IL-11和/或小鼠IL-11介导的信号传导。IL-11介导的信号传导可在IL-11或含有IL-11的复合物与受体结合之后发生，所述受体为IL-11或所述复合物结合的受体。
在一些实施例中，试剂可以抑制IL-11或含有IL-11的复合物的生物活性。
在一些实施例中，所述试剂为一个或多个信号通路的拮抗剂，所述信号通路通过包含IL-11Rα和/或gp130的受体(例如IL-11Rα:gp130)的信号转导激活。在一些实施例中，所述试剂能够通过一个或多个包含IL-11Rα和/或gp130(例如IL-11Rα:gp130)的免疫受体复合物抑制信号传导。在本发明的各个方面，本发明提供的试剂能够抑制IL-11介导的顺式和/或反式信号传导。在一些实施例中，在本发明各个方面，本发明提供的试剂能够抑制IL-11介导的顺式信号传导。
在一些实施例中，所述试剂可以将IL-11介导的信号传导抑制到小于100％，例如抑制到不存在所述试剂(或存在适当的对照试剂)时IL-11介导的信号传导水平的99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少，或1％或更少。在一些实施例中，所述试剂可以将IL-11介导的信号传导抑制到小于1倍，例如抑制到不存在所述试剂(或存在适当的对照试剂)时IL-11介导的信号传导水平的≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍。
在一些实施例中，所述IL-11介导的信号传导可为通过IL-11与IL-11Rα：gp130受体的结合介导的信号传导。例如，可通过用IL-11处理表达IL-11Rα和gp130的细胞，或通过刺激表达IL-11Rα和gp130的细胞中IL-11的产生来分析此类信号传导。
试剂抑制IL-11介导信号传导的IC50可被测定，例如通过在人IL-11和所述试剂存在的情况下，培养表达IL-11Rα和gp130的Ba/F3细胞，并测量掺入DNA的3H-胸腺嘧啶核苷。在一些实施例中，所述试剂在这种试验中可表现出10μg/mL或更小的IC50，优选地为以下之一：≤5μg/mL、≤4μg/mL、≤3.5μg/mL、≤3μg/mL、≤2μg/mL、≤1μg/mL、≤0.9μg/mL、≤0.8μg/mL、≤0.7μg/mL、≤0.6μg/mL，或≤0.5μg/mL。
在一些实施例中，所述IL-11介导的信号传导可为通过IL-11:IL-11Rα复合物与gp130的结合介导的信号传导。在一些实施例中，所述IL-11:IL-11Rα复合物可为可溶性的，例如IL-11Rα和IL-11的胞外结构域的复合物，或可溶性IL-11Rα同种型/片段和IL-11的复合物。在一些实施例中，所述可溶性IL-11Rα为IL-11Rα的可溶性(分泌)同种型，或为所述胞外结构域的蛋白裂解的释放产物，其中所述胞外结构域为结合IL-11Rα的细胞膜的胞外结构域。
在一些实施例中，所述IL-11:IL-11Rα复合物可为与细胞结合的，例如结合IL-11Rα和IL-11的细胞膜的复合物。由IL-11:IL-11Rα复合物与gp130的结合介导的信号传导可通过用IL-11:IL-11Rα复合物处理表达gp130的细胞来进行分析，所述IL-11:IL-11Rα复合物例如包括IL-11的重组融合蛋白，其中所述IL-11通过肽连接子连接到IL-11Rα的胞外结构域，例如超级IL-11(Hyper IL-11)。超级IL-11是使用IL-11Rα(由结构域1至3组成的氨基酸残基1至317；UniProt知识库(UniProt Knowledgebase,UniProtKB):Q14626)和IL-11(UniProtKB:P20809的氨基酸残基22至199)的片段以及20个氨基酸长的连接子(SEQ IDNO:20)构建的。超级IL-11的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在一些实施例中，所述试剂可以抑制通过IL-11:IL-11Rα复合物与gp130的结合介导的信号传导，并且还能够抑制通过IL-11与IL-11Rα:gp130受体的结合介导的信号传导。
在一些实施例中，所述试剂可以抑制由IL-11介导的过程。
在一些实施例中，所述试剂可以抑制IL-11和/或IL-11Rα的基因/蛋白质表达。基因和/或蛋白质表达可如本文所述地进行测定或通过本领域技术人员公知的方法来测定。
在一些实施例中，所述试剂可以将IL-11和/或IL-11Rα的基因/蛋白表达抑制到小于100％，例如抑制到不存在所述试剂(或存在适当的对照试剂)时IL-11和/或IL-11Rα的基因/蛋白表达水平的99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少，或1％或更少。在一些实施例中，所述试剂可以将IL-11和/或IL-11Rα的基因/蛋白表达抑制到小于1倍，例如抑制到不存在所述试剂(或存在适当的对照试剂)时IL-11和/或IL-11Rα的基因/蛋白表达水平的≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍。
代谢性疾病的治疗/预防
本发明提供用于治疗和/或预防代谢性疾病(例如本文所述的代谢性疾病)的方法和物品(试剂和组合物)。
治疗通过抑制IL-11介导的信号传导(即拮抗IL-11介导的信号传导)来实现。也就是说，本发明提供的对代谢性疾病的治疗/预防是通过抑制在例如细胞、组织/器官/器官系统/受试者中IL-11介导的信号传导进行的。在一些实施例中，本发明对IL-11介导的信号传导的抑制包括对肝脏的细胞(例如肝细胞)中IL-11介导的信号传导进行抑制。
因此，本发明提供一种能够抑制白细胞介素11(IL-11)介导的信号传导的试剂，所述试剂用于治疗或预防代谢性疾病的方法。
还提供了一种能够抑制白细胞介素11(IL-11)介导的信号传导的试剂的用途，所述用途为用于制造一药物，所述药物用于治疗或预防代谢性疾病的方法。
进一步提供了一种治疗或预防代谢性疾病的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的一试剂，所述试剂能够抑制白细胞介素11(IL-11)介导的信号传导。
本发明的用途扩展到任何代谢性疾病的治疗/预防。本发明还提供由代谢疾病引起或加剧的疾病/状况的治疗/预防。在一些实施例中，本发明提供对代谢性疾病预后不良的受试者的疾病/状况的治疗/预防。
在一些实施例中，待治疗/预防的代谢性疾病的特征可为IL-11和/或IL-11Rα表达(即基因和/或蛋白质表达)的增加，所述增加是指例如与正常器官/组织/受试者相比(即在没有代谢性疾病的情况下)，受代谢性疾病影响的器官/组织/受试者中IL-11和/或IL-11Rα表达的增加。
本发明的代谢性疾病的治疗/预防可为与IL-11的上调相关联的代谢性疾病，例如，在疾病症状显现或可能发生的细胞或组织中IL-11的上调，或细胞外IL-11或IL-11Rα的上调。
所述代谢性疾病可能影响任何组织、器官或器官系统。在一些实施例中，代谢性疾病可影响若干组织/器官/器官系统。
在一些实施例中，所述代谢性疾病影响下组的一个或多个：肝脏、胰腺、心血管系统、消化系统、排泄系统、呼吸系统、肾脏系统、生殖系统、循环系统、肌肉系统、内分泌系统、外分泌系统、淋巴系统、免疫系统、神经系统和/或骨骼系统。
在本发明公开的各个方面，在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病时的功能，代谢性疾病的特征在于肝脏功能的降低或肝脏的细胞(例如肝细胞)功能的降低。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病时的水平，代谢性疾病的特征在于ALT和/或AST水平的升高和/或GSH(例如血清中)水平的降低。
在一些实施例中，代谢性疾病的特征在于肝脏的炎症和/或纤维化。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的水平，代谢性疾病的特征在于肝脏的细胞(例如肝细胞)中促炎症因子和/或促纤维化因子(例如IL-11、IL-6、CCL2和/或CCL5)的基因/蛋白质表达的增加。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的水平，代谢性疾病的特征在于肝脏的细胞中胶原蛋白的基因/蛋白质表达的增加和/或肝脏的胶原蛋白含量的增加。
在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的肝脏中肌成纤维细胞的数量/比例，代谢性疾病的特征在于肝脏中肌成纤维细胞的数量/比例的增加。
在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的水平，代谢性疾病的特征在于肝脏的细胞(例如肝细胞)中凋亡和/或坏死的增加。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的数量/比例，代谢性疾病的特征在于凋亡和/或坏死肝细胞的数量/比例增加。
在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的水平，代谢性疾病的特征在于肝脏的细胞(例如肝细胞)中脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)的基因/蛋白质表达的增加。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的水平，代谢性疾病的特征在于肝脏的细胞(例如肝细胞)中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的增加。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的水平，代谢性疾病的特征在于肝脏的细胞(例如肝细胞)中NOX4基因/蛋白质表达的增加。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的水平，代谢性疾病的特征在于肝脏的细胞(例如肝细胞)中ERK和/或JNK激活水平的增加。
在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的水平，代谢性疾病的特征在于肝脏中或肝脏的细胞(例如肝细胞)中甘油三酯水平的升高。在一些实施例中，代谢性疾病以高血糖为特征。在一些实施例中，代谢性疾病的特征为高甘油三酯血症。在一些实施例中，代谢疾病以高胆固醇血症为特征。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的体重，代谢性疾病的特征在于体重出现增加。在一些实施例中，相对于没有代谢性疾病的肝脏重量，代谢性疾病的特征在于肝脏重量出现增加。
治疗可有效减少/延迟/预防代谢性疾病的发展或进展。治疗可有效减少/延迟/防止代谢性疾病的一个或多个症状恶化。治疗可有效改善代谢性疾病的一个或多个症状。治疗可有效降低代谢性疾病的严重程度和/或逆转一种或多种症状。治疗可以有效逆转代谢性疾病的影响。
预防可指预防代谢性疾病的发展和/或预防代谢性疾病的恶化，例如预防代谢性疾病的进展，所述进展例如进入晚期/慢性阶段。
在本发明的各个方面，本发明的治疗和/或预防代谢性疾病的方法可包括下组的一个或多个：
降低血脂水平；
降低血糖水平；
提高葡萄糖耐受性(例如葡萄糖不耐受的受试者)；
提高胰岛素耐受性(例如胰岛素抵抗受试者)；
增强胰腺功能；
减轻体重(如超重/肥胖受试者)；
减少体脂量；
增加瘦体重；
降低空腹血糖水平；
降低血清甘油三酯水平；
降低血清胆固醇水平；
提高葡萄糖耐量；
增强胰腺功能(例如外分泌和/或内分泌功能)；
促进胰腺组织生长；
胰腺组织再生；
增加胰腺重量；
抑制PSC向肌成纤维细胞的转化；
减少胰腺中肌成纤维细胞的数量/比例；
降低胰腺羟脯氨酸水平；
降低胰腺胶原蛋白水平；
减少胰腺损伤；
减少胰岛细胞增生；
降低胰高血糖素表达；
提高胰岛素表达；
增加体重(例如患有消耗性疾病的受试者，例如恶病质)；
降低肝脏中IL-11蛋白的表达；
减少肝脏中Erk的激活；
减少肝脏中JNK的激活；
减少肝脏中胱冬酶-3(Caspase-3)的裂解；
降低肝脏中ROS的水平；
降低肝脏中NOX4的表达；
减少脂肪变性，例如肝脏的脂肪变性；
降低肝脏甘油三酯水平；
降低脂肪酸合成酶的表达；
降低血清ALT和/或AST水平；
减少促炎因子(例如TNFa、CCL2、CCL5、IL-6、CXCL5和/或CXCL1)的表达；
减少促纤维化因子(例如IL-11、TIMP1、ACTA2、TGFβ1、MMP2、TIMP2、MMP9、COL1A2、COL1A1和/或COL3A1)的表达；
降低血清TGFβ1水平；
减少IL-11、ACTA2、MMP2、TGFβ1、PDGF、ANG II、bFGF、CCL2和/或H2O2的HSC表达/产生；
抑制HSC向肌成纤维细胞的转化；
减少肝脏中肌成纤维细胞的数量/比例；
降低肝脏羟脯氨酸水平；
降低肝脏胶原蛋白水平；
增强肝功能；
提高血清GSH水平；
增强受代谢性疾病影响的器官/组织的功能；
减少肝损伤；
减少肝细胞死亡；
减少脂肪毒性导致的细胞死亡；
减少肝细胞中IL-11介导的信号传导；和
减少肝脏中CD45+细胞的数量/比例。
在本发明所述的各个方面和各个实施例中，代谢性疾病的治疗/预防具体包括抑制、减少或预防例如在给定器官系统/器官/组织/细胞类型中的脂毒性。在一些实施例中，代谢性疾病的治疗/预防包括抑制/减少/预防肝脏(例如肝细胞)中的脂毒性。
施用
能够抑制IL-11介导的信号传递的试剂的施用优选地为“治疗有效”量或“预防有效”量，这足以显示对受试者的益处。
实际施用量、施用的速率和时间过程取决于疾病的性质和严重程度以及试剂的性质。治疗处方，如剂量等的决定，由全科医生和其他医生负责，通常将待治疗的疾病/状况、受试者个体的状况、递送位置、施用方法和从业人员已知的其他因素纳入考虑。上述技术和方案的实例可在利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins)2000年出版的第20版《雷明登氏制药科学》“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中找到。
可提供多剂量的所述试剂。一个或多个或每个剂量可伴随另一治疗试剂同时施用或顺序施用。
多剂量可通过预定的时间间隔分开，所述时间间隔可选择为下组之一：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天，或选择为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。举例来说，剂量可以每7天、每14天、每21天或每28天(正负3天、2天或1天)给予一次。
在治疗性应用中，能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂优选地与本领域技术人员公知的一种或多种其他药学上可接受的成分一起配制为药物或药品，所述其他药学上可接受的成分包括但不限于药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填料、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(如润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
本文使用的术语“药学上可接受”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，其其在合理医学判断范围内，适合与所述受试者(例如人)的组织接触使用，且无过度毒性、刺激性、过敏反应，或其他问题或复杂情况，与合理的收益/风险比相称。每种载体、佐剂、赋形剂等在与所述制剂的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
合适的载体、佐剂、赋形剂等可在标准药物文本中找到，例如麦克出版公司(MackPublishing Company)于1990年在伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚州(Pennsylvania,Pa.)出版的第18版《雷明登氏制药科学》“Remington’s Pharmaceutical Sciences”；和1994年第2版的《药用赋形剂手册》“Handbook of Pharmaceutical Excipients”。
所述制剂可通过药学领域中公知的任何方法制备。此类方法包括使活性化合物与由一种或多种辅助成分组成的载体结合的步骤。一般而言，所述制剂的制备方法是将活性化合物均匀紧密地与载体(例如液体载体、精细固体载体等)结合，然后在必要时成型产品。
所述制剂可被制备用于局部、非消化道、全身、静脉、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、皮下、口服或经皮给药途径，所述给药途径可包括注射。可注射性制剂可包括处于无菌或等渗介质中的所选制剂。所述制剂和施用方式可根据所述试剂和待治疗的疾病进行选择。
IL-11及其受体的检测
本发明的一些方面和实施例涉及从一受试者获得的样本中检测IL-11或IL-11受体(例如IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)的表达。
在一些方面和实施例中，本发明涉及IL-11或IL-11受体(作为分别编码IL-11或IL-11受体的蛋白质或寡核苷酸)的表达上调(过度表达)，以及检测这种上调作为治疗的适宜性指标，所述治疗使用能够抑制IL-11作用的试剂进行，或使用能够阻止或减少IL-11或IL-11受体表达的试剂进行。
表达上调包括高于给定类型的细胞或组织正常预期水平的表达。上调可通过测量细胞或组织中相关因子的表达水平来确定。可在来自受试者的细胞或组织样本中的表达水平与相关因子的参考表达水平(例如代表相同或对应细胞或组织类型的相关因子的正常表达水平的值或范围值)之间进行比较。在一些实施例中，参考水平可通过检测对照样品中(例如来自一健康受试者相应的细胞或组织中，或来自同一受试者的健康组织中)IL-11或IL-11受体的表达来确定。在一些实施例中，可从标准曲线或数据集获得参考水平。
表达水平可被量化以进行绝对比较，也可进行相对比较。
在一些实施例中，当测试样品中的表达水平为参考水平的至少1.1倍时，可认为存在IL-11或IL-11受体(例如IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)的上调。更优选地，所述表达水平为选自下组之一的参考水平倍数：至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍或至少10.0倍。
表达水平可通过许多已知的体外分析技术之一来确定，例如基于PCR的检测、原位杂交检测、流式细胞术检测、免疫学检测或免疫组织化学检测。
举例来说，合适的技术涉及检测样品中IL-11或IL-11受体水平的方法，所述方法通过将所述样品与能够结合IL-11或IL-11受体的试剂接触，并检测所述试剂与IL-11或IL-11受体的复合物的形成来进行。所述试剂可为任何合适的结合分子，例如抗体、多肽、肽、寡核苷酸、适体或小分子，并且可以任选地被标记以允许对所形成的复合物的检测(例如可视化)。用于检测它们的合适标记和方法是本领域技术人员公知的，包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、曙红和NDB、绿色荧光蛋白(GFP)、稀土螯合物例如铕(Eu)、铽(Tb)和钐(Sm)、四甲基罗丹明、德克萨斯红、4-甲基伞形酮、7-氨基-4-甲基香豆素、Cy3、Cy5)、同位素标记、放射性同位素(例如32P、33P、35S)、化学发光标记(例如吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺)、酶(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶，荧光素酶)、抗体、配体和受体。检测技术是本领域技术人员公知的，并且可选择与标记试剂相对应的检测技术。合适的技术包括寡核苷酸标签的PCR扩增、质谱分析法、荧光或颜色的检测(例如通过报告蛋白对底物进行酶转化时)，或放射性检测。
所述检测方法可被配置以量化样本中IL-11或IL-11受体的量。来自测试样品的IL-11或IL-11受体的量化值可与参考值进行比较，所述比较用于确定测试样品含有IL-11或IL-11受体的量是否高于或低于所述参考值，并且达到选定的统计显著性程度。
检测到的IL-11或IL-11受体的定量可用于确定编码IL-11或IL-11受体的基因的上调或下调或扩增。如果测试样品含有纤维化细胞，则可将此类上调、下调或扩增与参考值进行比较，以确定是否存在任何统计显著性的差异。
从受试者身上获得的样本可为任何种类的。可从任何组织或体液中提取生物样本，例如血液样本、血源样本、血清样本、淋巴样本、精液样本、唾液样本、滑液样本。血源样本可为患者血液的选定部分，例如含有血浆部分或含有血清部分的选定细胞。样本可包括组织样本或活检样本；或从受试者身上分离出来的细胞。样本可通过已知技术采集，如活检或针吸。样本可被存储和/或处理以用于随后测定IL-11表达水平。
样本可用于确定受试者中IL-11或IL-11受体的上调，其中所述样本提取自所述受试者。
在一些优选的实施例中，样本可以是从受代谢性疾病影响的组织/器官中获取的取的组织样本，例如活检样本。样本可包含细胞。
根据确定受试者具有IL-11或IL-11受体(例如IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)表达水平的上调，受试者可被选择进行本发明的治疗/预防。IL-11或IL-11受体的上调表达可作为代谢性疾病的标记物，所述代谢性疾病的标记物表示适用于使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂进行的治疗。
上调可存在于给定组织或来自给定组织的选定细胞中。优选的组织可以是肝组织或胰腺组织。IL-11或IL-11受体表达的上调也可在循环液体(例如血液)或血液衍生样品中测定。上调可为细胞外IL-11或IL-11Rα的上调。在一些实施例中，表达可为局部地或系统地上调。
进行上述受试者的选择后，可向受试者施用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂。
诊断和预后
检测IL-11或IL-11受体(例如，IL-11Rα、gp130或含有IL-11Rα和/或gp130的复合物)的表达上调也可用于诊断代谢性疾病的方法中，也可用于识别有发生代谢性疾病风险的受试者，以及可用于预后或预测受试者对治疗的反应的方法中，其中所述治疗使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂。
“发展”、“进展”和其他形式的“发展”可以指一种障碍/疾病的开始，或一种障碍/疾病的持续或进展。
在一些实施例中，例如基于受试者身体中或受试者身体的选定细胞/组织中指示代谢性疾病存在的其他症状，受试者可能被怀疑具有或患有代谢性疾病，或者被认为存在发生代谢性疾病的风险，例如由于遗传易感性或暴露于已知是代谢性疾病的风险因素的环境条件中。确定IL-11或IL-11受体表达的上调可以确诊或疑似确诊，或可确认受试者有发生代谢性疾病的风险。所述确定还可将代谢性疾病或易感代谢性疾病诊断为一适合使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂进行治疗的代谢性疾病或易感代谢性疾病。
因此，可提供一种为患有或怀疑患有代谢性疾病的受试者提供预后的方法，所述方法包括确定从受试者获得的样本中IL-11或IL-11受体的表达是否上调，并基于所述确定，使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂为所述受试者的治疗提供预后。
在一些方面，诊断方法或预后或预测受试者对治疗的反应的方法可能不需要测定IL-11或IL-11受体的表达，其中所述治疗使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂，但可能是基于确定受试者中遗传因子预测为表达上调或活性上调。此类遗传因子可包括确定IL-11、IL-11Rα和/或gp130中的基因突变、单核苷酸多态性(SNPs)或基因扩增，所述遗传因子与表达或活性和/或IL-11介导的信号传导的上调相关和/或能预测其上调。使用遗传因子预测疾病状态的易感性或对治疗的反应在本领域是已知的，例如参见Peter
Figure BDA0003455680330000591
《Gut期刊》“Gut”2008；57:440-442；Wright等人，《分子和细胞生物学》“Mol.Cell.Biol”.2010年3月，第30卷第6期1411-1420。
遗传因子可通过本领域普通技术人员已知的方法进行分析，包括基于PCR的检测，例如定量PCR、竞争性PCR。通过确定遗传因子的存在，例如在从受试者获得的样本中，可确诊和/或可将受试者分类为有发生代谢性疾病的风险，和/或可将受试者确定为适合使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂进行治疗。
一些方法可包括确定与IL-11分泌或代谢性疾病发生的易感性相关的一个或多个SNP的存在。SNP通常是双等位基因，因此可以使用本领域技术人员已知的许多常规检测中的一种来容易地确定(例如参见Anthony J.Brookes.“单核苷酸多态性的本质”(“Theessence of SNPs.”)《基因》“Gene”卷234，第2期，1999年7月8日，177-186页；Fan等人，“高度平行单核苷酸多态性基因分型”(“Highly Parallel SNP Genotyping”)《冷泉港定量生物学专题讨论会》“Cold Spring Harb Symp Quant Biol”2003.68:69-78；Matsuzaki等人，“在高密度寡核苷酸阵列上使用单引物检测对超10000个单核苷酸多态性进行平行基因分型”“Parallel Genotyping of Over 10,000SNPs using a one-primer assay on ahigh-density oligonucleotide array”《基因组研究》“Genome Res”.2004.14:414-425)。
所述方法可包括确定从受试者获得的样本中存在哪个SNP等位基因。在一些实施例中，确定最小等位基因的存在可能与IL-11分泌的增加相关或与对代谢性疾病发展的易感性相关。
因此，在本发明的一个方面中，提供了一种筛选受试者的方法，所述方法包括：
从所述受试者获得核酸样本；
确定样本中哪个等位基因出现在WO 2017/103108 A1(通过引用并入本文)的图33、图34或图35中所列的一个或多个SNP的多态性核苷酸位点，或确定样本中哪个等位基因出现在与所列SNP之一具有r2≥0.8的连锁不平衡的SNP的多态性核苷酸位点。
所述确定步骤可包括确定在所选多态性核苷酸位点处，样本中是否存在最小等位基因。它可包括确定是否存在0个、1个或2个最小等位基因。
所述筛选方法可为确定受试者对代谢性疾病发生的易感性的方法，或构成上述方法的一部分，或所述筛选方法可为本文所述的诊断或预后方法，或构成上述方法的一部分。
所述方法还可包括将受试者识别为易患代谢性疾病或患代谢性疾病的风险增加的步骤，例如如果确定受试者在所述多态核苷酸位点具有最小等位基因。所述方法还可包括选择受试者进行治疗的步骤，其中所述治疗使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂，和/或向受试者施用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂的步骤，以提供对受试者代谢性疾病的治疗或预防受试者中代谢性疾病疾病的发展或进展。
在一些实施例中，一种诊断代谢性疾病的方法、识别有发生代谢性疾病风险的受试者的方法、预后或预测受试者对治疗的反应的方法，其中所述治疗使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂，上述方法使用的指示剂不检测IL-11或IL-11受体或遗传因子表达的上调
在一些实施例中，诊断代谢性疾病的方法、识别有发生代谢性疾病风险的受试者的方法、预后或预测受试者对治疗的反应的方法，其中所述治疗使用能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂，上述方法基于测量和/或识别一个或多个代谢性功能指标的检测。
诊断或预后方法可在体外对从受试者获得的样本中进行，或在对从受试者获得的样本进行处理后进行。一旦采集了样本，就不需要患者在场进行体外诊断或预后方法，因此所述方法可以不在人体或动物身上实施。如上文所述，从受试者获得的样品可以是任何种类的。
其他诊断或预后测试可与本文所述的测试结合使用，用以提高诊断或预后的准确性，或用以确认通过使用本文所述的测试获得的结果。
受试者
受试者可为动物或人类。受试者优选地为哺乳动物，更优选地为人。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选地为人。所述受试者可以是男性也可以是女性。受试者可能是患者。
所述患者可能患有本文所述的代谢性疾病。受试者可能被诊断患有需要治疗的代谢性疾病，可能被怀疑患有此类代谢性疾病，或者可能有患代谢性疾病的风险。
在本发明的实施例中，受试者优选地为人类受试者。在本发明的实施例中，可根据基于代谢性疾病的特定标记物的表征方法选择受试者进行治疗。
提供的进一步方法和用途
本发明还提供了一种用于下组方法的能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂，或能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂在下组方法中的用途：降低血脂水平、降低血糖水平、提高葡萄糖耐受性(例如葡萄糖不耐受的受试者)、提高胰岛素耐受性(例如胰岛素抵抗受试者)、增强胰腺功能、减轻体重(如超重/肥胖受试者)、减少体脂量、增加瘦体重、降低空腹血糖水平、降低血清甘油三酯水平、降低血清胆固醇水平、提高葡萄糖耐量、增强胰腺功能(例如外分泌和/或内分泌功能)、促进胰腺组织生长、胰腺组织再生、增加胰腺重量、抑制PSC向肌成纤维细胞的转化、减少胰腺中肌成纤维细胞的数量/比例、降低胰腺羟脯氨酸水平、降低胰腺胶原蛋白水平、减少胰腺损伤、减少胰岛细胞增生、降低胰高血糖素表达、提高胰岛素表达、增加体重(例如患有消耗性疾病的受试者，例如恶病质)、降低肝脏中IL-11蛋白的表达、减少肝脏中Erk的激活、减少肝脏中JNK的激活、减少肝脏中半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的裂解、降低肝脏中ROS的水平、降低肝脏中NOX4的表达、减少脂肪变性，例如肝脏的脂肪变性、降低肝脏甘油三酯水平、降低脂肪酸合成酶的表达、降低血清ALT和/或AST水平、减少促炎因子(例如TNFa、CCL2、CCL5、IL-6、CXCL5和/或CXCL1)的表达、减少促纤维化因子(例如IL-11、TIMP1、ACTA2、TGFβ1、MMP2、TIMP2、MMP9、COL1A2、COL1A1和/或COL3A1)的表达、降低血清TGFβ1水平、减少IL-11、ACTA2、MMP2、TGFβ1、PDGF、ANG II、bFGF、CCL2和/或H2O2的HSC表达/产生、抑制HSC向肌成纤维细胞的转化、减少肝脏中肌成纤维细胞的数量/比例、降低肝脏羟脯氨酸水平、降低肝脏胶原蛋白水平、增强肝功能、提高血清GSH水平、增强受代谢性疾病影响的器官/组织的功能、减少肝损伤、减少肝细胞死亡、减少脂肪毒性导致的细胞死亡、减少肝细胞中IL-11介导的信号传导，或减少肝脏中CD45+细胞的数量/比例。
本发明还提供一种能够抑制IL-11介导的信号传导的试剂的用途，用于制造一组合物，所述组合物用于下组的方法：降低血脂水平、降低血糖水平、提高葡萄糖耐受性(例如葡萄糖不耐受的受试者)、提高胰岛素耐受性(例如胰岛素抵抗受试者)、增强胰腺功能、减轻体重(如超重/肥胖受试者)、减少体脂量、增加瘦体重、降低空腹血糖水平、降低血清甘油三酯水平、降低血清胆固醇水平、提高葡萄糖耐量、增强胰腺功能(例如外分泌和/或内分泌功能)、促进胰腺组织生长、胰腺组织再生、增加胰腺重量、抑制PSC向肌成纤维细胞的转化、减少胰腺中肌成纤维细胞的数量/比例、降低胰腺羟脯氨酸水平、降低胰腺胶原蛋白水平、减少胰腺损伤、减少胰岛细胞增生、降低胰高血糖素表达、提高胰岛素表达、增加体重(例如患有消耗性疾病的受试者，例如恶病质)、降低肝脏中IL-11蛋白的表达、减少肝脏中Erk的激活、减少肝脏中JNK的激活、减少肝脏中半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的裂解、降低肝脏中ROS的水平、降低肝脏中NOX4的表达、减少脂肪变性，例如肝脏的脂肪变性、降低肝脏甘油三酯水平、降低脂肪酸合成酶的表达、降低血清ALT和/或AST水平、减少促炎因子(例如TNFa、CCL2、CCL5、IL-6、CXCL5和/或CXCL1)的表达、减少促纤维化因子(例如IL-11、TIMP1、ACTA2、TGFβ1、MMP2、TIMP2、MMP9、COL1A2、COL1A1和/或COL3A1)的表达、降低血清TGFβ1水平、减少IL-11、ACTA2、MMP2、TGFβ1、PDGF、ANG II、bFGF、CCL2和/或H2O2的HSC表达/产生、抑制HSC向肌成纤维细胞的转化、减少肝脏中肌成纤维细胞的数量/比例、降低肝脏羟脯氨酸水平、降低肝脏胶原蛋白水平、增强肝功能、提高血清GSH水平、增强受代谢性疾病影响的器官/组织的功能、减少肝损伤、减少肝细胞死亡、减少脂肪毒性导致的细胞死亡、减少肝细胞中IL-11介导的信号传导，或减少肝脏中CD45+细胞的数量/比例。
本发明还提供了下组的方法：降低血脂水平、降低血糖水平、提高葡萄糖耐受性(例如葡萄糖不耐受的受试者)、提高胰岛素耐受性(例如胰岛素抵抗受试者)、增强胰腺功能、减轻体重(如超重/肥胖受试者)、减少体脂量、增加瘦体重、降低空腹血糖水平、降低血清甘油三酯水平、降低血清胆固醇水平、提高葡萄糖耐量、增强胰腺功能(例如外分泌和/或内分泌功能)、促进胰腺组织生长、胰腺组织再生、增加胰腺重量、抑制PSC向肌成纤维细胞的转化、减少胰腺中肌成纤维细胞的数量/比例、降低胰腺羟脯氨酸水平、降低胰腺胶原蛋白水平、减少胰腺损伤、减少胰岛细胞增生、降低胰高血糖素表达、提高胰岛素表达、增加体重(例如患有消耗性疾病的受试者，例如恶病质)、降低肝脏中IL-11蛋白的表达、减少肝脏中Erk的激活、减少肝脏中JNK的激活、减少肝脏中半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的裂解、降低肝脏中ROS的水平、降低肝脏中NOX4的表达、减少脂肪变性，例如肝脏的脂肪变性、降低肝脏甘油三酯水平、降低脂肪酸合成酶的表达、降低血清ALT和/或AST水平、减少促炎因子(例如TNFa、CCL2、CCL5、IL-6、CXCL5和/或CXCL1)的表达、减少促纤维化因子(例如IL-11、TIMP1、ACTA2、TGFβ1、MMP2、TIMP2、MMP9、COL1A2、COL1A1和/或COL3A1)的表达、降低血清TGFβ1水平、减少IL-11、ACTA2、MMP2、TGFβ1、PDGF、ANG II、bFGF、CCL2和/或H2O2的HSC表达/产生、抑制HSC向肌成纤维细胞的转化、减少肝脏中肌成纤维细胞的数量/比例、降低肝脏羟脯氨酸水平、降低肝脏胶原蛋白水平、增强肝功能、提高血清GSH水平、增强受代谢性疾病影响的器官/组织的功能、减少肝损伤、减少肝细胞死亡、减少脂肪毒性导致的细胞死亡、减少肝细胞中IL-11介导的信号传导，或减少肝脏中CD45+细胞的数量/比例。
序列同源性
为了确定两个或多个氨基酸或核酸序列之间的百分比同源性，可通过本领域技术人员已知的各种方式实现成对序列比对和多序列比对，例如使用公开可用的计算机软件，例如ClustalOmega软件(
Figure BDA0003455680330000621
J.2005，《生物信息学》“Bioinformatics”21,951-960)、T-coffee软件(Notredame等人，2000，《分子生物学杂志》“J.Mol.Biol”.(2000)302,205-217)、Kalign软件(Lassmann和Sonnhammer，2005，《BMC生物信息学》“BMCBioinformatics”,6(298))和MAFFT软件(Katoh和Standley，2013，《分子生物学与进化》“Molecular Biology and Evolution”30(4)772-780)。使用此类软件时，最好使用默认参数，例如空位罚分和空位扩展罚分的默认参数。
序列
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Figure BDA0003455680330000641
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Figure BDA0003455680330000701
本发明包括所描述的各个方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许或明确避免的。
在前述的描述中所公开的特征，或在以下的权利要求中所公开的特征，或以其特定形式表示在附图中所公开的特征，或在用于执行所公开功能的方式方面所公开的特征，或在用于获得所公开结果的方法或过程中所公开的特征，视情况而定，可以单独地或以此类特征的任何组合来表示，可用于以多种形式实现本发明。
为了避免任何疑问，本文提供的任何理论解释都是为了提高读者的理解。发明人不希望受到这些理论解释的约束。
本文使用的任何章节标题仅用于组织文章的目的，不应被解释为对所述主题的限制。
在本说明书中，包括随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和“包含”以及诸如“含有”、“其包括”和“其包含”等变体将被理解为暗示包括规定的整数或步骤或整数组或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数组或步骤组。
必须注意，如说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。在本发明中范围可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解所述特定值形成另一实施例。与数值相关的术语“约”是可选的，其表示例如+/-10％的数值变化。
本发明公开的方法可在体外、离体或体内实施，或产品可存在于体外、离体或体内。术语“体外”旨在包括在实验室条件下或培养物中使用材料、生物物质、细胞和/或组织进行的实验，而术语“体内”旨在包括使用完整多细胞生物体进行的实验和步骤。在一些实施例中，在体内进行的方法可在非人动物上进行。“离体”是指存在于或发生于生物体外部的东西，例如人体或动物体外部的东西，可能位于取自生物体的组织(例如整个器官)或细胞上。
在本文已公开核酸序列的情况下，还明确考虑其反向互补序列。
有关标准分子生物学技术，请参见由Sambrook,J.与Russel,D.W.所著，由冷泉港实验室出版社于2001年在纽约冷泉港出版的第3版《分子克隆：实验室手册》“MolecularCloning,A Laboratory”。
现将参考附图讨论本发明的各个方面和实施例。对于本领域技术人员来说，进一步的方面和实施例将是显而易见的。本文中提及的所有文件全部通过引用并入本文。虽然已经结合下述的示例性实施例描述了本发明，但当提供本公开时，许多等价的修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，上述的本发明的示例性实施例被认为是说明性的，而不是限制性的。在不脱离本发明的实质和范围的情况下，可以对所描述的实施例进行各种改变。
附图简述
现在将参考附图对说明本发明原理的实施例和实验进行讨论。
图1A和1B.图表显示了IL-11RA敲除(Il11ra1-/-)或野生型，IL-11RA表达(Il11ra1+/+)的小鼠喂食(1A)正常饮食(NCD)或(1B)西式饮食及果糖(WDF)后体重随时间推移的百分比变化。
图2A和2B.条形图显示了IL-11RA敲除(Il11ra1KO)或野生型，IL-11RA表达(Il11raWT)的小鼠喂食(2A)正常饮食(NCD)或(2B)西式饮食及果糖(WDF)后全身脂肪量百分比变化。
图3.图表显示了IL-11RA敲除(KO)或野生型，IL-11RA表达(WT)的小鼠喂食正常饮食(NC)或西式饮食及果糖(WDF)后空腹血糖水平(mM)。
图4.图表显示了IL-11RA敲除(KO)或野生型，IL-11RA表达(WT)的小鼠喂食正常饮食(NC)或西式饮食及果糖(WDF)后血清甘油三酯水平(mg/g)。
图5A和5B.图表显示了IL-11RA敲除(KO)或野生型，IL-11RA表达(WT)的小鼠喂食(5A)正常饮食(NC)或(5B)西式饮食及果糖(WDF)后血清甘油三酯水平(mg/dl)。
图6A和6B.图表和箱形图显示了喂食正常饮食(NC)或西式饮食及果糖(WDF)，并用抗IL-11RA抗体或IgG对照治疗的小鼠体重变化。(6A)显示了体重随时间(周)推移的变化百分比。(6B)显示了全身脂肪量和瘦肉量之间的差异百分比。*P＜0.05。
图7A和7B.图表、示意图和条形图显示了通过腹膜内葡萄糖耐量试验(ipGTT)确定的，喂食西式饮食及果糖(WDF)并用抗IL-11RA抗体或IgG对照治疗的小鼠的葡萄糖耐量。(7A)显示了从1分钟时间点开始的葡萄糖水平(mM)的变化。(7B)显示了曲线下面积。*：P＜0.05；**：p＜0.01。
图8.箱形图显示了喂食正常饮食(NCD)或西式饮食及果糖(WDF)，并从不同的时间点起用抗IL-11RA抗体或IgG对照治疗的小鼠胰腺重量。*P＜0.0001。
图9A到9C.箱形图显示了在指定的时间点喂食正常饮食(NCD)或西式饮食及果糖(WDF)，并用抗IL-11RA抗体或IgG对照治疗的小鼠的(9A)血清胆固醇水平(mg/dl)，(9B)血清甘油三酯水平(mg/g)和(9C)空腹血糖水平(mM)。
图10A和10B.图像显示从喂食正常饮食(NCD)的小鼠或喂食西式饮食及果糖(WDF)，并从16周开始使用抗IL-11RA抗体或IgG对照治疗的小鼠中，在第24周获得的胰腺组织切片的(10A)胰高血糖素含量和(10B)胰岛素含量的免疫组织化学分析结果。
图11A和11B.图表和图像显示抗IL-11/抗IL-11Rα抗体治疗对恶病质相关体重减轻的影响。(11A)喂食诱导恶病质的高脂肪蛋氨酸胆碱缺乏症(HFMCD)饮食的小鼠，在用抗IL-11或抗IL-11Rα抗体治疗2x/周时恢复到正常或接近正常体重。对照组小鼠喂食正常饮食(NC)，或喂食HFMCD饮食并用IgG同种型对照治疗。(11B)以HFMCD饮食喂养并用IgG或抗IL-11抗体或抗IL-11Rα抗体治疗的小鼠的体型实施例比较。
图12A到12C.图表显示了抗IL-11/抗IL-11Rα抗体治疗对恶病质相关体重减轻模型的体重影响。喂食HFMCD饮食的小鼠每周用0.5、1、5或10mg/kg的抗IL-11Rα抗体(12A)或两种抗IL-11抗体之一(12B和12C)进行治疗。对照组小鼠喂食正常饮食(NC)，或喂食HFMCD饮食并用IgG同种型对照治疗。
图13A到13C。图表显示了抗IL-11/抗IL-11Rα抗体治疗对恶病质相关体重减轻模型的食物消耗量影响。喂食HFMCD饮食的小鼠每周用0.5、1、5或10mg/kg的抗IL-11Rα抗体(13A)或两种抗IL-11抗体之一(13B和13C)进行治疗。对照组小鼠喂食正常饮食(NC)，或喂食HFMCD饮食并用IgG同种型对照治疗。
图14A和14B.图表显示了抗IL-11/抗IL-11Rα抗体治疗对叶酸诱导的急性肾损伤后恶病质相关体重减轻的体重影响。(14A)叶酸诱导肾损伤的小鼠从损伤前1小时至损伤后28天用抗IL-11Rα抗体、抗IL-11抗体、或IgG对照治疗。对“对照”小鼠单独施用载体。(14B)叶酸诱导肾损伤的小鼠从损伤后21天起用抗IL-11抗体或IgG对照治疗。FA＝叶酸(folicacid)。
图15.图表显示了抗IL-11抗体治疗对单侧输尿管梗阻(UUO)诱导的急性肾损伤后恶病质相关体重减轻的体重影响。UUO诱导肾损伤的小鼠在损伤后用抗IL-11抗体或IgG对照治疗10天。
图16A和16B.图表显示了IL-11过表达对体重增加的影响。(16A)应用重组小鼠IL-11(rmIL11)减缓了正常小鼠的体重增加进展。(16B)诱导小鼠IL-11转基因(IL-11Tg)导致体重随时间推移而减轻。
图17A到17N.IL-11诱导HSC激活和肝纤维化。(A)IL-11RNA在用TGFβ1刺激HSC中上调。(B)用TGFβ1刺激的HSC分泌IL-11蛋白。(C)用TGFβ1刺激精密切割的人肝脏切片，并在上清液中测定IL-11蛋白。(D)HSC和活化的THP-1细胞中IL6R和IL11RA表达的免疫荧光图像(比例尺，100μm)。在未使用TGFβ1，PDGF或IL-11刺激的情况下(-)孵育后的HSC中ACTA2的(E)免疫荧光图像(比例尺，100μm)和(F)蛋白质印迹。经使用TGFβ1，PDGF或IL-11刺激的HSC上清液中的(G)HSC胶原蛋白I染色免疫荧光图像(比例尺，100μm)和(H)胶原蛋白分泌量。(I)由IL-11诱导的HSC的剂量依赖性基质胶浸润。(J)高IL-11诱导HSCs分泌IL-11蛋白(ELISA)。(A-C、E-H、J)TGFβ1(5ng/ml)，高IL-11(0.2ng/ml)，PDGF(20ng/ml)，IL-11(5ng/ml)；24小时；(I)48小时。(K)接受每日注射生理盐水(对照)或rmIl-11(100μg/kg)的小鼠的示意图。(L-N)rmIl-11注射实验的数据如1K所示，(n≥7/组)。(L)相对肝羟脯氨酸含量，(M)促纤维化和促炎标志物的肝脏mRNA表达，以及(N)血清ALT水平。(A-B,H-J,L,N)数据表示为平均值±s.d；(C,M)箱须图显示了中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)。(A-C,J,L-N)双侧学生t检验；(H-I)双侧邓尼特检验。FC：倍数变化；I/A：强度/面积。
图18A到18N.删除Il11ra1的小鼠受到保护免受NASH肝脏病变，高脂血症和高血糖症的侵害。(A)HFMCD饮食1、4、6和10周的小鼠中肝Il-11、Gapdh、p-Erk和Erk的蛋白质印迹。Il11ra+/+(WT)和Il11ra-/-(KO)小鼠在HFMCD饮食10周后(n≥5/组)后的(B)肝脏的代表性马森三色图像(比例尺，100μm)、(C)肝甘油三酯水平、(D)血清ALT水平和(E)促炎mRNA表达水平。(F-N)WT和KO小鼠喂食WDF 16周的数据。(F)肝Il-11和Gapdh的蛋白质印迹。(G)肝脏促炎标志物的相对mRNA表达水平，(H)血清ALT水平，(I)相对肝脏羟脯氨酸含量(n≥4/组)。(J)肝脏的代表性马森三色图像(比例尺，100μm)。(K)肝脏Erk活化状态的蛋白质印迹，(L)空腹血糖，(M)血清甘油三酯和(N)血清胆固醇水平(n≥3/组)。(C-E,G-I)数据显示为带有中位数(中线)，25-75百分位数(盒子)和最小-最大百分位数(须)的箱须图；(L-N)数据表示为平均值±s.d.，虚线表示喂食NC的WT的平均值；Sidak校正学生t检验。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症；WDF：西式饮食+15％(w/v)果糖。
图19A到19J.抗IL-11疗法以ERK依赖性方式抑制HSC向肌成纤维细胞的转化，并具有良好的代谢安全性。(A)X203和X209和(61pg/ml至4μg/ml；4倍稀释)抑制TGFβ1刺激的HSCM的MP2分泌的剂量-反应曲线和IC50值。(B)由各种NASH因子(n≥5/组)刺激的HSC分泌的IL-11的ELISA。(C)在存在IgG、X203或X209的情况下，来自用TGFβ1和其他NASH因子处理的HSC的ACTA2+ve细胞的代表性的荧光图像和其定量(比例尺，100μm和虚线代表基线的中位值)。(D)X203和X209对PDGF或CCL2诱导的HSC侵袭的影响。(E)IL-11刺激的(上图)或在IgG或X209存在下使用各种NASH因子刺激的(下图)HSC裂解物中p-ERK和ERK的蛋白质印迹。(F)在存在ERK/MEK抑制剂U0126或PD98059的情况下，用IL-11和重要NASH因子处理的HSC中ACTA2+ve细胞的代表性的荧光图像和其定量(比例尺，100μm和虚线代表基线的中位值)。5个月内每两周注射10mg/kg X203和X209的小鼠(n≥5/组)的(A-F)TGFβ1(5ng/ml)、IL-11(5ng/ml)、PDGF(20ng/ml)、AngII(100nM)、bFGF(10ng/ml)、CCL2(5ng/ml)、H202(0.2mM)、IgG、X203和X209(2μg/ml)、U0126 or PD98059(10μM)；(A,C,E-F)24h；(B,D)48h。(G)外周血小板计数，(H)血清ALT水平，(I)血清甘油三酯水平，以及(J)血清胆固醇水平。(B,D)数据显示为平均值±s.d；(C,F,G-J)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图。(B,D,G-J)双侧邓尼特检验；(C,F)双侧Tukey矫正学生t检验。FC：倍数变化。
图20A到20N.在临床前模型中，Il-11治疗靶向抑制和逆转NASH病变。(A)显示X203和X209(10mg/kg，每两周一次)在用于(B-E)所示实验的HFMCD喂养的小鼠中的治疗用途的示意图。X203、X209或IgG同种型对照从HFMCD饮食的第6周至第10周施用。(B)代表性肝脏组织学图像(马森三色染色；比例尺，100μm)，(C)相对肝脏羟脯氨酸含量，(D)相对肝脏促炎mRNA表达水平(n≥6/组)和(E)血清ALT水平。(F)肝脏Erk激活状态的蛋白质印迹。(G)给用于H-N所示实验的MCD喂养的db/db小鼠施用X203或IgG的示意图。肝脏(H)Il-11和Gapdh、(I)p-Erk和Erk的蛋白质印迹。(J)来自X203或IgG治疗的MCD喂养的db/db小鼠的代表性肝脏马森三色图像(比例尺，100μm)。(K)肝甘油三酯水平，(L)相对肝羟脯氨酸水平，(M)血清ALT水平和(N)mRNA表达的肝脏促炎标志物水平(n≥5/组)。(C-E,K-N)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图。双侧Tukey矫正学生t检验。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症；MCD：蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图21A到21L.抑制Il-11信号传导能逆转临床前模型中的NASH病变和HSC向肌成纤维细胞的转化。(A)显示了NASH逆转实验中(B-G)所示数据的治疗剂量方案的示意图。用WDF喂养小鼠16周以诱导NASH，然后在持续WDF喂养期间用(10mg/kg)X209或IgG处理8周。NC和IgG-和X209-处理的WDF(n≥5/组)小鼠的(B)总肝羟脯氨酸含量、(C)肝甘油三酯水平、(D)血清ALT水平、(E)空腹血糖水平、(F)血清甘油三酯水平和(G)血清胆固醇水平。(H)示意图显示了逆转实验中通过喂养小鼠HFMCD 10周，然后代之以NC并开始抗体(X203和X209)治疗来构建纤维化。在指定的时间点对小鼠实施安乐死。在同时进行代谢干预(饮食切换)和X203、X209或IgG治疗(n≥3/组)后1周、3周、6周的(I)肝羟脯氨酸总含量(虚线表示NC的平均值＝0.93)和(J)相对mRNA表达。在加入X203、X209、或IgG(n＝5/组)之前或之后，(K)用TGFβ1或(L)用PDGF孵育后ACTA2+ve免疫染色定量(比例尺，200μm)。(K-L)TGFβ1(5ng/ml)、PDGF(20ng/ml)、IgG、X203和X209(2μg/ml)。(B-G,K-L)数据显示为带有中位数线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图；(I)数据显示为平均值±s.d；(J)数据表示为折线图(平均值)，透明区表示s.d。(B)双侧学生t检验(C-G,K-L)双侧Tukey矫正学生t检验；(I-J)双因素方差分析。FC：倍数变化；NC：正常饮食；WDF：西式饮食+15％(w/v)果糖；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图22A到22K.Il-11信号传导的中和可逆转早期NASH的肝损伤。(A)在指定时间点内喂养NC或HFMCD饮食的小鼠的纤维化和炎症标志物的相对肝脏mRNA表达。(B)早期HFMCD饮食NASH模型中抗IL-11治疗实验的示意图。抗体治疗在NASH饮食开始后1周开始，腹膜内注射X209、X203或IgG(10mg/kg，每两周一次)5周。(C-G)实验数据如图21B所示。在IgG或X209治疗5周后的(C)代表性肝脏图像和(D)肝脏马森三色染色图像(比例尺，100μm)。(E)肝脏甘油三酯水平(n≥5/组)，(F)X209-和IgG处理的小鼠肝羟脯氨酸含量(n≥5/组)，(G)血清ALT水平(n≥5/组)。(H)肝细胞中IL6R和IL11RA表达的免疫荧光图像(比例尺，100μm)。(I)IL-11对肝细胞上清液中ALT的剂量依赖性作用和(J)肝细胞中应激纤维形成(罗丹明染色)的剂量依赖性作用(比例尺，200μm)。(K)用TGFβ1(5ng/ml)刺激的原代人肝细胞中分泌IL-11蛋白；24小时。(E)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图；(F-G,I,K)数据显示为平均值±s.d。(E)双侧Tukey矫正学生t检验；(F,G)双因素方差分析；(I,K)双侧邓尼特检验。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图23A到23G.抗IL11RA疗法将NASH的分子特征逆转为正常肝脏的特征，同时抑制免疫细胞活化。(A-G)实验数据如图22B所示。(A)在存在IgG、X203或X209抗体的情况下，6B显示的时间中的喂食NC或HFMCD的小鼠肝脏基因表达的主成分分析(PCA)图。箭头描绘了从正常基因表达(NC)到NASH中最受干扰的基因表达(HFMCD+IgG)，到中间恢复的基因表达(HFMCD+Abs(3w))到正常化基因表达(HFMCD+Abs(6w))的转变。(B)促纤维化和促炎基因表达热图(按比例缩放的每百万转录本，TPM)。(C)通过qPCR检测Tnfα、Ccl2和Ccl5mRNA表达(n≥5/组)。说明用于检测Ly6C+ve TGFβ1+ve细胞的门控策略(n≥4/组)的(D)肝脏CD45+ve免疫细胞数，(E)总CD45+ve群体中的Ly6C+ve TGFβ1+ve细胞，(F)代表性假色图。(G)血清TGFβ水平(n≥5/组)。(C-E,G)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图。(C,G)双侧Tukey矫正学生t检验；(D-E)双侧学生t检验。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图24A到24K.HSC会分泌并响应IL-11以及给小鼠注射Il-11会引起肝纤维化。(A)TGFβ1刺激后HSC中RNA表达的全基因组变化(n＝3，RNAseq)。(B)刚度诱导的人类HSC中的RNA上调(RNA-seq14),基因根据每千碱基百万(FPKM)的片段进行排名,IL-11上调是基因组范围内上调基因程度最高的。(C)人心脏成纤维细胞(HCF)、人肺成纤维细胞(HLF)和人(HSC)中的IL11RA转录本。健康个体和患有酒精性肝病(ALD)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的患者的人肝样本中IL-11和GAPDH的(D)蛋白质印迹和(E)密度测定。在没有使用TGFβ1、PDGF或IL-11刺激(-)的情况下孵育后，对(F)ACTA2+ve细胞和(G)胶原蛋白I免疫染色进行自动荧光定量。(H)通过ELISA检验无TGFβ1或IL-11刺激(-)的HSC上清液中的MMP-2浓度。(A，F-H)TGFβ1和IL-11(5ng/ml)，PDGF(20ng/ml)；24h刺激。(I)代表性马森三色染色图像(比例尺，100μm)和(J)马森三色染色图像定量，这些图像来自注射盐水或rmIl-11的小鼠的肝脏切片。(K)每天注射rmIl-11或盐水的Col1a1-GFP小鼠的GFP+ve细胞的示意图和代表性荧光图像。对切片进行Acta2免疫染色，并用DAPI复染(比例尺，200μm)。(C,F-G)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图；(E,H,J)数据表示为平均值±s.d。(F-H)双侧邓尼特检验；(J)双侧学生t检验。FC：倍数变化；TPM：每百万转录本。
图25A到25I.对Il-11信号传导的遗传抑制保护小鼠免受HFMCD诱导的NASH病变的侵害。与NC饮食相比，16周的HFMCD饮食对肝脏的(A)Il-11mRNA和(B)Il-11蛋白水平的影响。(A-B)从相同的小鼠中提取RNA和蛋白质(n＝5/组)。来自NC或HFMCD饮食1、4、6或10周的小鼠(n≥5/组)的(C)相对肝羟脯氨酸含量和(D)血清ALT水平。(E-I)Il11ra+/+(WT)和Il11ra-/-(KO)小鼠在HFMCD饮食10周后的数据。(E)相对肝脏羟脯氨酸含量，(F)代表性肝脏马森三色染色图像(比例尺，100μm)和(G)肝脏马森三色染色图像定量。(H)Acta2、Col1a1、Col1a2和Col3a1的相对肝脏mRNA表达水平(n≥5/组)。(I)NC和HFMCD饮食10周后磷酸化和总Erk的蛋白质印迹。(A,E,H)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图；(C-D,G)数据表示为平均值±s.d。(A,G)双侧学生t检验；(C-D)双因素方差分析；(E,H),Sidak矫正学生t检验。(C)NC和HFMCD6周的值与图20C中使用的值相同；NC和HFMCD1周的值与图22F中使用的值相同。(D)HFMCD6周的值与图20D中使用的值相同；NC和HFMCD1周的值与图22G中使用的值相同。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图26A到26E.对Il-11信号传导的遗传抑制保护小鼠免受WDF诱导的NASH病变的侵害。16周的WDF对Il11ra+/+(WT)和Il11ra-/-(KO)小鼠(A)体重(n≥6/组)的影响。WT和KO小鼠在NC和WDF喂食16周后的(B)肝脏甘油三酯水平、(C)代表性肝脏马森三色染色图像(比例尺，100μm)和(D)肝脏马森三色染色图像定量，(E)促纤维化基因的相对肝脏mRNA表达水平(n≥5/组)。(A,D)数据显示为平均值±s.d，双侧学生t检验；(B,E)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Sidak矫正t检验。FC：倍数变化；NC：正常饮食；WDF：西式饮食+15％(w/v)果糖。
图27A到27F.中和抗IL-11RA单克隆抗体的开发。(A)用纯化的小鼠单克隆抗IL11RA候选物(6μgml-1)抑制TGFβ1-(上图)、HyperIL-11-(中图)刺激的人心房成纤维细胞和TGFβ1-(下图)刺激的小鼠心房成纤维细胞的ACTA2+ve细胞转化。(B)通过SPR确定的X209与IL11RA的相互作用(1：1Langmuir)。(C)125I-X209在小鼠中的血液药代动力学(n＝5)。将结果拟合(R2＝0.92)到双相指数衰减模型中。(D)后眶后注射后，在指定时间点的肝脏摄取125I-X209的百分比(n＝5)。(E-F)在存在(E)IgG对照、X203或X209或存在(F)MEK/ERK抑制剂(U0126或PD98059)的情况下，用各种NASH因子处理的HSC的胶原蛋白I免疫染色的代表性荧光图像(比例尺，100μm)和定量。(A,E-F)TGFβ1(5ng/ml)、IL-11(5ng/ml)、PDGF(20ng/ml)、AngII(100nM)、bFGF(10ng/ml)、CCL2(5ng/ml)、H202(0.2mM)、IgG、X203和X209(2μg/ml)、U0126或PD98059(10μM)；刺激24h。(C-D)数据表示为平均值+s.d；(E-F)数据显示为带有中位数(中线)，25-75百分位数(盒子)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，虚线表示基线值的平均值，Tukey矫正学生t检验。FC：倍数变化；I/A：强度/面积。
图28A到28F.中和性抗IL-11和抗IL11RA抗体可抑制HFMCD和WDF诱导的NASH病变。(A-D)X203和X209在HFMCD喂养的小鼠中的治疗应用数据如图20A所示。(A)肝脏切片马森三色染色定量(虚线表示平均NC值)。(B)纤维化基因的相对肝脏mRNA表达水平和(C)肝脏甘油三酯含量(n≥5/组)。(D)来自NC、IgG-和X203处理的HFMCD饮食小鼠(10mg/kg，每两周)的肝ERK激活的蛋白质印迹。(E)肝脏切片的马森三色染色定量，虚线表示12周龄db/db的脂肪肝的平均值(见图20G)和(F)注射IgG或X203的脂肪性和MCD喂养的db/db小鼠肝脏中的相对促纤维化mRNA表达水平如示意图所示(图20G，n≥5/组)。(A,E)数据表示为平均值±s.d；(B-C,F)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图。(A-C,E-F)双侧Tukey矫正学生t检验。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症；MCD：蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图29A到29E.中和性抗IL11RA治疗可逆转WDF诱导的NASH病变。(A-E)WDF饮食小鼠抗IL-11RA治疗干预研究的数据如图所示(图21A)。WDF饮食的小鼠接受每两周的IgG或X209(10mg/kg)治疗8周，从第16周开始直到处死时间(第24周)。(A)24周的NC或WDF的小鼠肝脏中p-Erk和Erk的蛋白质印迹。(B)两月一次体重测量(n≥4/组)。WDF饮食小鼠肝脏的16周(左)，在第16-24周注射IgG的24周(中间)，在第16-24周用X209治疗的24周(右)的(C)代表性肝脏马森三色染色图像(比例尺，100μm)和(D)肝脏马森三色染色图像定量，虚线代表NC的平均值。(E)促炎症基因的相对肝脏mRNA表达水平(n≥5/组)。(B,D)数据显示为平均值±s.d；(E)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图。(D,E)双侧Tukey矫正学生t检验。
图30A到30G.中和性抗IL-11或抗IL11RA抗体可逆转HFMCD诱导的肝纤维化和HSC向肌成纤维细胞的转化。(A-D)来自用IgG、X203或X209处理1、3或6周的小鼠的数据，如5G(HFMCD逆转实验)(A)肝ERK激活状态的蛋白质印迹所示。用IgG，X203或X209处理6周的小鼠肝脏的(B)代表性肝脏马森三色染色图像(比例尺，100μm)和(C)肝脏马森三色染色图像定量。(D-G)来自HSC转化实验的逆转的数据如图21K-21L所示；TGFβ1(5ng/ml)、PDGF(20ng/ml)、IgG、X203、和X209(2μg/ml)。(D)在加入X203、X209或IgG之前或之后，与TGFβ1或PDGF一起孵育后ACTA2+ve免疫染色的代表性荧光图像(比例尺，200μm)。在添加IgG、X203或X209(n＝5/组)之前或之后，由(E)TGFβ1或(F)PDGF刺激的HSC分泌的胶原蛋白量。(G)TGFβ1处理的HSC中X203和X209处理后ERK激活状态的蛋白质印迹。(C)数据显示为平均值±s.d；(E-F)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图。(C,E-F)双侧Tukey矫正学生t检验。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图31A到31H.中和性抗IL-11和抗IL11RA抗体可保护HFMCD喂养的小鼠免受肝纤维化和炎症的侵害。(A)通过ELISA检验在存在IgG、X203或X209的情况下，在无IL-11或TGFβ1刺激(-)的HSC(n＝4/组)上清液中的CCL2；IL-11(5ng ml-1),TGFβ1(5ng ml-1),IgG、X203、和X209(2μg ml-1)。(B-I)治疗剂量实验的数据如图22B所示。在早期X203和X209治疗5周后的(B)代表性的粗略肝脏图像，(C)肝脏ERK激活状态的蛋白质印迹，(D)代表性肝脏马森三色染色图像(比例尺，100μm)和(E)肝脏马森三色染色图像定量。X203和X209治疗5周后的(F)肝羟脯氨酸含量(NC和HFMCD 1周饮食的值与图25C中使用的值相同，IgG 3和6周的值与图22F中使用的值相同，n≥5/组)，(G)通过qPCR检测肝脏中纤维化标志物的相对RNA表达水平，这证实了来自RNA-seq的数据(Col1a1、Col1a2、Col3a1和Acta2的NC 6周值与图28D，n≥5/组所示的值相同)和(H)血清ALT水平(NC和HFMCD 1周的值与图25D中使用的值相同，IgG3和6周的值(分别治疗2周和5周)与图22G中使用的相同，n≥5/组)。(A,E-F,H)数据表示为平均值±s.d；(G)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图。(A,E,G)双侧Tukey校正学生t检验；(F，H)双因素方差分析。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图32A到32D.中和性抗IL-11或抗IL11RA抗体将NASH的分子特征逆转为正常肝脏的特征。(A-D)用于早期治疗剂量实验的RNA-seq和基因集富集分析的数据如图22A所示(n＝3/组)。(A-B)热图显示了IgG和(A)X209或(B)X203处理之间表达具有统计学差异的所有基因样本的基因表达水平(每百万映射读取的缩放转录本，TPM)。抗IL-11治疗的表达谱与NC中的谱一起，表明HFMCD饮食的转录作用几乎完全逆转了。(C)脂肪生成和β氧化基因表达热图显示了，与IgG相比，X209比X203更能改善肝脂质代谢。(D)气泡图显示了NC或HFMCD饮食和抗体治疗6周后差异表达基因的基因集富集分析(GSEA)结果。每个点代表基因集的归一化富集评分(NES)及其FDR校正后的显著性水平，分别按颜色和大小汇总。用于富集测试的基因集是从MSigDB的“H-Hallmark”集合中选择的。FC：倍数变化；NC：普通饮食；HFMCD：高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏症。
图33A到33K.与IL-11和IL-6受体的表达以及IL-11和IL-6信号传导在原代人肝细胞中的作用相关的散点图，箱形图，直方图和图像。(A)肝细胞上IL11RA，IL6R和gp130染色的代表性流式细胞术前向散射(FSC)和荧光强度图。(B)在基础的肝细胞中基于RNA-seq(左)和Ribo-seq(右)(每百万转录本，TPM)的IL11RA1和IL6R读取(read)的丰度。(C和D)基于人肝细胞的RNA-seq和Ribo-seq(n＝3)的(C)IL11RA1和(D)IL6R转录本的读取覆盖率。(E和F)(E)显示ERK，JNK和STAT3激活状态的蛋白质印迹，以及(F)在剂量范围内刺激hyperIL11或hyperIL6后肝细胞分泌的ALT。(G)单独用hyperIL11刺激，或在可溶性gp130(sgp130)量增加的情况下的肝细胞上清液中的ALT水平。(H和I)肝细胞裂解物的蛋白质印迹显示(H)磷酸化的ERK和JNK及其各自的总表达，分别响应于单独的或与sgp130共存的hyperIL6刺激，和(I)磷酸化的STAT3和总STAT3，响应于有或没有sgp130的hyperIL6刺激。(J)在存在sgp130或可溶性IL11RA(sIL11RA)的情况下对IL11刺激的肝细胞进行碘化丙啶(PI)染色的代表性FSC图。(K)蛋白质印迹显示p-ERK，p-JNK及其在肝细胞中各自的总表达，响应于IL11单独刺激或在存在sgp130或sIL11RA的情况下的IL11刺激。(A-K)原代人肝细胞；(E-K)24小时刺激；(E-K)hyperIL11，hyperIL6、IL11(20ng/ml)、sgp130、sIL11RA(1μg/ml)。(B,F-G)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图。
图34A到34K.图表、散点图和图像显示，富含脂质的肝细胞分泌IL11，IL11通过自分泌IL11顺式信号传导驱动多种脂毒性表型。(A-K)在存在IgG(2μg/ml)、抗IL11RA(X209，2μg/ml)或sgp130(1μg/ml)的情况下，原代人肝细胞上的棕榈酸酯负荷实验数据。通过上清液的ELISA测量的(A)IL11、(B)IL6、(C)CCL2和(D)CCL5蛋白分泌水平。(E和F)用棕榈酸酯刺激的PI+ve肝细胞的(E)代表性FSC图和(F)定量。(G)上清液中的ALT水平。(H)肝细胞谷胱甘肽(GSH)水平。(I)DCFDA染色的代表性荧光图像(ROS检测；比例尺，100μm)。(J)pERK，ERk，pJNK，JNK，裂解的Caspase3，Caspase3，NOX4，FASN和GAPDH的蛋白质印迹(K)油红O染色的代表性图像(比例尺，100μm)。(A-D，F-H)平均值±SD；Tukey矫正学生t检验。
图35A到35P.示意图，图像和箱形图显示了，抑制IL6家族细胞因子反式信号传导对西式饮食外加果糖的小鼠的NASH或代谢表型没有影响。(A)在肝细胞特异性表达sgp130的小鼠中WDF喂养的示意图，数据如(B-P)所示。在AAV8-Alb-Null或AAV8-Alb-sgp130病毒注射后三周，小鼠喂食WDF16周。(B)蛋白质印迹显示肝脏水平的sgp130、IL11、IL6，GAPDH作为内部参照。(C)血清IL11水平。(D)血清IL6水平。(E)代表性的肝脏大体解剖学和H&E染色图像。(F)肝脏重量。(G)肝脏甘油三酯含量。(H)血清ALT水平。(I)血清AST水平。(J)肝胶原蛋白水平。(K)空腹血糖水平。(L)血清甘油三酯水平。(M)血清胆固醇水平。(N)肝谷胱甘肽含量。(O)肝脏促炎和纤维化基因表达热图(值如图41D和41E所示)。(P)肝p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-STAT3和STAT3的蛋白质印迹。(C-N)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Tukey矫正学生t检验；从左到右依次显示的条件为：NC Null(无)、WDF Null、WDF sgp130。
图36A到36K.示意图，图像，图表和箱形图显示了，肝细胞特异性的IL11顺式信号传导抑制可防止HFMCD饮食小鼠的恶病质和NASH。(A)HFMCD喂养方案的注射AAV8-Alb-Cre的Il11ra1loxP/loxP(条件敲除；CKO)小鼠的示意图，用于实验显示(B-K)。在HFMCD饮食开始前三周，给l11ra1loxP/loxP 小鼠静脉注射AAV8-Alb-Null或AAV8-Alb-Cre以特异性删除肝细胞中的Il11ra1。(B)肝Il-11RA和GAPDH的蛋白质印迹。(C)体重(显示为初始体重的百分比(％))。(D)代表性的肝脏大体解剖和H&E染色图像。(E)肝脏甘油三酯含量。(F)血清ALT水平。(G)血清AST水平。(H)肝谷胱甘肽含量。(I)肝胶原蛋白水平。(J)显示促炎标志物(Tnfα、Ccl2、Ccl5)和纤维化标志物(Col1a1、Col1a2、Col3a1、Acta2)的肝mRNA表达的热图。数值如图43A和43B所示。(K)显示肝ERK和JNK激活状态的蛋白质印迹。(C)数据显示为平均值±SEM，双因素方差分析与Tukey多重比较检验，统计显著性显示为HFMICD WT和CKO之间的P值；(E-I)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Sidak矫正学生t检验；从左到右依次为：NC WT、NC CKO、HFMCD WT、HFMCD CKO。
图37A到37M.。示意图，图像，图表和箱形图显示了，肝细胞特异性抑制IL11顺式信号传导的小鼠受到保护免受WDF诱导的肥胖和NASH的侵害。(A)WDF喂养的对照和CKO小鼠的示意图，数据如(B-M)所示。在AAV8-Alb-Null或AAV8-Alb-Cre病毒注射后三周，给CKO小鼠喂食WDF16周。(B)显示肝脏IL11RA和GAPDH水平的蛋白质印迹。(C)体重(显示为初始体重的百分比(％))。(D)脂肪量。(E)代表性的肝脏大体解剖学和H&E染色图像。(F)肝脏甘油三酯含量。(G)肝脏重量。(H)血清ALT水平。(I)血清AST水平。(J)肝谷胱甘肽含量。(K)肝胶原蛋白水平。(L)肝脏促炎和纤维化基因表达热图(值如图44A和44B所示)。(M)显示肝ERK和JNK活化状态的蛋白质印迹。(C和D)数据显示为平均值±SEM，双因素方差分析与Tukey多重比较检验，统计显著性显示为WDF WT和CKO之间的P值；(F-K)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Sidak矫正学生t检验；从左到右依次为：NC WT、NC CKO、WDF WT、WDF CKO。
图38A到38N.示意图、图像和箱形图显示了，肝细胞特异性IL11顺式信号传导驱动喂食WDF的小鼠的脂肪性肝炎，而非IL11反式信号传导。(A)示意图显示了Il11ra1+/+(WT)和Il11ra1-/-(KO)小鼠的WDF喂养方案，用于(B-N)所示的实验。注射了AAV8-Alb-Null、AAV8-Alb-mbIl111ra1(全长膜结合Il11ra1)和AAV8-Alb-sIl11ra1(Il11ra1的可溶性形式)的KO小鼠在病毒给药后3周给予16周的WDF喂养。(B)显示肝脏IL11RA和GAPDH水平的蛋白质印迹。(C)代表性的肝脏大体解剖和H&E染色图像。(D)肝脏重量。(E)肝脏甘油三酯含量。(F)血清ALT水平。(G)血清AST水平。(H)肝谷胱甘肽含量。(I)肝胶原蛋白含量。(J)肝脏促炎和纤维化基因表达热图(值如图45C和45D所示)。(K)显示肝ERK和JNK活化状态的蛋白质印迹。(L)空腹血糖水平。(M)血清甘油三酯水平。(N)血清胆固醇水平。(D-I,L-N)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Tukey矫正学生t检验；从左到右依次显示的条件为：NC Null WT、WDF Null WT、WDF Null KO、WDFmbIl11ra1 KO、WDF sIl11ra1 KO。
图39.所提出的NASH中IL11信号传导的机制示意图。肝细胞中脂质积累过多导致脂质毒性，导致活性氧类的产生，从而触发IL11蛋白的翻译和分泌。IL11与肝细胞上的IL11RA和gp130结合，启动自分泌的ERK，JNK和Caspase3激活，导致脂质凋亡。IL11还以旁分泌方式起作用，驱动静止的肝星状细胞(HSC)转化为活化的肌成纤维细胞。脂毒性肝细胞和HSC释放的细胞因子和趋化因子激活并招募引起炎症的免疫细胞。因此，肝细胞中的自分泌IL11顺式信号传导是所有NASH病变的重要起因事件。
图40A到40I.与IL-11和IL-6受体的表达以及IL-11和IL-6信号传导在原代人肝细胞中的作用相关的散点图、箱形图、直方图、图像和图表。(A)在活化的THP-1细胞上IL11RA，IL6R和gp130染色的代表性FSC图。(B)基于RNA-seq和Ribo-seq(每百万转录本，TPM)的原代人肝细胞中的gp130转录本。(C)基于人肝细胞的RNA-seq和Ribo-seq(n＝3)的gp130转录本的读取覆盖率。(D)原代人肝细胞和活化的THP-1细胞中IL11RA、IL6R、gp130和白蛋白表达的免疫荧光图像(比例尺，100μm)。(E)肝细胞培养基中可溶性IL6R的基础水平。(F)在存在sgp130或sIL11RA的情况下，对IL11刺激的原代人肝细胞(PI+ve细胞)的PI染色进行定量。(G)在存在1μg/ml sgp130或sIL11RA的情况下，IL11浓度增加对原代人肝细胞分泌的ALT水平的剂量依赖性效应。(H)sgp130或sIL11RA浓度增加对IL11诱导的ALT分泌的剂量依赖性作用。(I)在存在IgG(2μg/ml)、抗IL11RA(X209，2μg/ml)或sgp130(1μg/ml)的情况下，棕榈酸酯刺激后的肝细胞甘油三酯水平。(B,G-H)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图；(E-F，I)数据显示为平均值±SEM；(F-I)Tukey矫正学生t检验。(G)对于IL11的每个浓度，从左到右依次显示条件为：BL、sgp130、sIL11RA。(H)对于每个浓度的IL11+sgp130/IL11RA，从左到右，显示的条件为：sgp130，sIL11RA。
图41A到41E.显示sgp130表达不能保护小鼠免受WDF诱导的肝脏和肥胖表型的侵害的示意图，箱形图和图表。(A)gp130蛋白结构域结构及其氨基酸位置(左)以及本研究中用于构建sgp130的结构域(右)的示意图。(B-E)WDF-sgp130体内实验的数据如图35A所示。(B)NC喂养的对照小鼠和WDF喂养的注射AAV8-Alb-Null-和AAV8-Alb-sgp130的小鼠的血清gp130水平。(C)16周WDF对注射AAV8-Alb-Null-和AAV8-Alb-sgp130的小鼠体重的影响。数据显示为平均值±SEM。(D和E)(D)促炎标志物(Tnfα、Ccl2、Ccl5)和(E)纤维化标志物(Col1a1、Col1a2、Col3a1、Acta2)的肝mRNA表达如图35O所示。(B,D-E)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Tukey矫正学生t检验；从左到右依次显示的条件为：NC Null、WDF Null、WDF sgp130。
图42A到42N.示意图，图像和箱形图显示了，抑制IL6家族成员的推定反式信号传导对HFMCD饮食小鼠的NASH表型没有影响。(A)HFMCD饮食的具有sgp130肝细胞特异性表达的小鼠的示意图，数据如(B-N)中所示。小鼠静脉注射AAV8-Alb-Null或AAV8-Alb-sgp130并喂食HFMCD4周。(B)蛋白质印迹显示肝脏水平的sgp130、IL11和IL6，GAPDH作为内部参照。(C)血清gp130水平。(D)血清IL11水平。(E)血清IL6水平。(F)代表性的肝脏大体解剖和H&E染色图像。(G)肝脏甘油三酯含量。(H)血清ALT水平。(I)血清AST水平。(J)肝谷胱甘肽含量。(K)肝胶原蛋白水平。(L和M)(L)促炎标志物(Tnfα、Ccl2、Ccl5)和(M)纤维化标志物(Col1a1、Col1a2、Col3a1、Acta2)的肝mRNA表达。(N)肝p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-STAT3、STAT3的蛋白质印迹。(C-E,G-M)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Tukey矫正学生t检验；从左到右依次显示的条件为：NCNull、HFMCD Null、HFMCD sgp130。
图43A和43B.箱形图显示了，肝细胞特异性缺失Il11ra1的小鼠受到保护免受HFMCD诱导的基因失调。(A和B)NC和HFMCD饮食的对照和CKO小鼠(如图36J所示)的(A)促炎标志物(Tnfα、Ccl2、Ccl5)和(B)纤维化标志物(Col1a1，Col1a2，Col3a1，Acta2)的肝mRNA表达。(A-B)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Sidak矫正学生t检验；对每个基因，从左到右依次显示的条件为：NC WT、NC CKO、HFMCD WT、HFMCD CKO。
图44A到44E.箱形图显示了肝细胞特异性Il11ra1删除的小鼠受到保护免于WDF诱导的NASH表型。(A-E)NC和WDF饮食的对照组和CKO小鼠的数据如图37A所示。(A和B)(A)促炎标志物(Tnfα，Ccl2，Ccl5)和(B)纤维化标志物(Col1a1，Col1a2，Col3a1，Acta2)的肝mRNA表达如图37L所示。(C)空腹血糖水平。(D)血清甘油三酯水平。(E)血清胆固醇水平。(A-E)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Sidak矫正学生t检验。(A和B)对于每个基因，从左到右，显示的条件是：NC WT、NC CKO、WDF WT、WDF CKO。(C-E)从左到右，显示的条件是：NC WT、NC CKO、WDF WT、WDF CKO。
图45A到45D.示意图和箱形图显示了，肝细胞特异性IL11顺式信号传导驱动WDF诱导的小鼠脂肪性肝炎，而非IL11反式信号传导。(A)全长膜结合IL11RA蛋白结构域结构及其氨基酸位置(左)和用于构建可溶性IL11RA的结构域(右)示意图。(B-D)Il11ra1+/+(WT)小鼠以及已注射AAV8-Alb-Null，AAV8-Alb-mbIl11ra1(全长膜结合Il11ra1)或AAV8-Alb-sIl111ra1(Il11ra1的可溶性形式)的整体删除了Il11ra的小鼠(Il11ra1-/-；KO小鼠)的WDF喂养方案数据如图38A所示。(B)注射了AAV8-Alb-Null和AAV8-Alb-sIl11ra1的喂养WDF的KO小鼠的血清IL11RA水平。(C和D)(C)促炎标志物(Tnfα、Ccl2、Ccl5)和(D)纤维化标志物(Col1a1、Col1a2、Col3a1、Acta2)的肝mRNA表达。(B-D)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Tukey矫正学生t检验。(C和D)对于每个基因，从左到右，显示的条件是：NC Null WT、WDF Null WT、WDF Null KO、WDF mbIl11ra1KO、WDF sIl11ra1KO。
图46A到46L.示意图、图像和箱形图显示了，肝细胞特异性IL11顺式信号传导驱动喂食HFMCD的小鼠的脂肪性肝炎，而非IL11反式信号传导。(A)HFMCD喂养的WT和KO小鼠的示意图，用于如(B-L)所示的实验。KO小鼠静脉注射AAV8-Alb-Null、AAV8-Alb-mbIl11ra1或AAV8-ALB-sIl11ra1；WT小鼠接受AAV8-Alb-Null作为对照。在病毒给药后三周，小鼠开始进行HFMCD喂养4周。(B)显示肝脏IL11RA和GAPDH水平的蛋白质印迹。(C)血清IL11RA水平。(D)代表性的肝脏大体解剖和H&E染色图像。(E)肝脏甘油三酯含量。(F)血清ALT水平。(G)血清AST水平。(H)肝谷胱甘肽水平。(I)肝胶原蛋白含量。(J和K)(J)促炎标志物(Tnfα、Ccl2、Ccl5)和(K)纤维化标志物(Col1a1、Col1a2、Col3a1、Acta2)的肝mRNA表达。(L)显示肝ERK和JNK活化状态的蛋白质印迹。(C,E-K)数据显示为带有中位数(中线)、25-75百分位数(箱)和最小-最大百分位数(须)的箱须图，Tukey矫正学生t检验。(E-I)从左到右，显示的条件是：NC Null WT、HFMCD Null WT、HFMCD Null KO、HFMCD mbIl11ra1 KO、HFMCD sIl11ra1 KO。(J和K)对于每个基因，从左到右，显示的条件是：NC Null WT、HFMCD Null WT、HFMCD NullKO、HFMCD mbIl11ra1 KO、HFMCD sIl11ra1 KO。
图47A和47B.图形和图像显示胰腺星状细胞(PSC)表达IL-11Rα和gp130，但不表达IL-6Rα。(A)单细胞RNA测序分析Il6st(编码gp130)，Il11ra1和Il6ra在小鼠PSC和导管细胞中的表达。(B)人PSC表达gp130，IL11RA和IL6RA蛋白的免疫荧光分析。
图48A和48B.箱形图和图像显示胰腺星状细胞(PSC)激活为αSMA阳性、表达胶原蛋白的纤维化表型。(A)在存在或不存在中和性抗IL-11RA抗体或IgG同种型对照抗体的情况下，用指示的因子体外刺激PSCs2后，对ACTA2阳性细胞和胶原蛋白I强度/面积百分比的高含量成像测定的定量。(B)在存在中和性抗IL-11RA抗体或IgG同种型对照抗体的情况下，用指示的因子体外刺激PSC 24小时后，高含量成像分析的代表性图像。
图49A到49C。关于在具有可诱导的成纤维细胞特异性IL-11表达的转基因小鼠体内诱导胰腺纤维化的示意图、方框图和图像。(A)用三苯氧胺处理转基因Col1a2-CreERRosa26Il11/+(IL11 Tg)小鼠，诱导其在成纤维细胞中表达IL-11的实验示意图。(B)24天后对照组小鼠和IL11 Tg小鼠胰腺组织的羟脯氨酸含量。(C)24天后对照组和IL11 Tg小鼠胰腺组织马森三色染色的代表性图像。
图50A到50C.在胰腺损伤的胰管结扎(PDL)模型中，与IL-11介导的信号拮抗作用相关的示意图、方框图和图像。(A)PDL诱发胰腺损伤的实验示意图，其中小鼠随后用中和性抗IL-11RA抗体或IgG同型对照抗体进行治疗。(B)14天时用中和性抗IL-11RA抗体或IgG同型对照抗体治疗的小鼠的结扎肺叶重量。(C)14天时用中和性抗IL-11RA抗体或IgG同型对照抗体治疗的小鼠胰腺组织马森三色染色的代表性图像。
实施例
在以下实施例中，发明人证明抑制IL-11介导的信号传导降低了一系列代谢疾病的严重性并逆转了其症状。
实施例1：实施例1到4的通用方法
IL-11-RA敲除小鼠
C57Bl/6J遗传背景下的缺乏Il11rα(Il11rα-/-)功能性等位基因的小鼠(B6.129S1-Il11rαtm1Wehi/J，杰克逊实验室)。
使用抗IL-11抗体或抗IL-11Rα处理
给小鼠腹膜内注射10mg/kg的拮抗性抗IL-11抗体、拮抗性抗IL-11Rα抗体或等量的同种型匹配的IgG对照抗体。抗IL-11和抗IL-11Rα抗体分别与小鼠IL-11和小鼠IL-11Rα结合，并抑制IL-11介导的信号传导。
具体地，本实施例中使用的抗IL-11抗体是小鼠抗小鼠IL-11IgG X203，其描述于例如在Ng等人，Sci Transl Med.(2019)11(511)pii：eaaw1237(也发表于Ng等人，“IL-11是特发性肺纤维化的治疗靶点”bioRxiv 336537；doi：https://doi.org/10.1101/336537)。X203也称为“Enx203”，并且包含根据WO 2019/238882 A1的SEQ ID NO:92的VH区(本公开的SEQ ID NO:22)和根据WO 2019/238882 A1的SEQ ID NO:94的VL区(本公开的SEQ ID NO:23)。
本实施例中使用的抗-IL-11Rα抗体是小鼠抗小鼠IL-11RαIgG X209，其描述于例如在Widjaja等人，Gastroenterology(2019)157(3):777-792(也发表于Widjaja等人，“IL-11中和疗法靶向NASH中肝星状细胞诱导的肝脏炎症和纤维化”bioRxiv470062；doi:https://doi.org/10.1101/470062)。
X209也称为“Enx209”，包含根据WO 2019/238884 A1的SEQ ID NO:7的VH区(本公开的SEQ ID NO:24)和根据WO 2019/238884 A1的SEQ ID NO:14的VL区(本公开的SEQ IDNO:25)。
饮食
西方饮食和果糖(WDF)被用于建立与肥胖、T2D和NAFLD期间人类代谢紊乱非常相似的代谢紊乱(Baena等人，Sci Rep(2016)6:26149，Machado等人，PLoS One(2015)10:e0127991)。
为了建立如肥胖和T2D等代谢疾病，小鼠从12周龄开始喂食西方饮食(D12079B，研究饮食)，并在饮用水中补充15％体重/体积的果糖(WDF)，持续16周。
高脂肪蛋氨酸胆碱缺乏饮食(HFMCD)用于建立恶病质样代谢紊乱。为了建立恶病质体重减轻和瘦体重减轻，给C57BL/6N小鼠喂食补充有60千卡％脂肪的蛋氨酸和胆碱缺乏(HFMCD)饮食(A06071301B，研究饮食)。
对照组被喂食正常食物(NC，专业饲料)和饮用水。
身体成分的回波MRI分析
使用活体小动物的4合1身体成分分析仪通过EchoMRI分析每两周进行一次全身脂肪和瘦体重测量。
空腹血糖测量
对于空腹血糖测量，小鼠在采血(通过剪尾)前禁食6小时，并使用Accu-Chek血Chek血糖仪进行空腹血糖测量。
腹腔葡萄糖耐量试验(ipGTT)
对于腹腔葡萄糖耐量试验，小鼠在进行ipGTT之前禁食6小时。使用Accu-Chek血糖仪通过剪尾测量基础空腹血糖。腹膜内注射2g/kg瘦体重葡萄糖，每15分钟测量一次葡萄糖，持续2小时。计算曲线下面积(AUC)，并将其绘制为条形图。
胰腺胰岛、胰高血糖素和胰岛素的组织学
对于组织学分析，将胰腺样本切除并在室温下在4％中性缓冲福尔马林(NBF)中固定24小时，然后储存在30％蔗糖中。5μm冷冻切片用胰高血糖素或胰岛素抗体染色过夜，并根据标准方案用ImmPRESS HRP IgG聚合物检测试剂盒(载体实验室)和ImmPACT DAB过氧化物酶底物(载体实验室)可视化，并通过光学显微镜检查。
实施例2：IL-11介导的信号传导在肥胖相关疾病中的拮抗作用
为了研究IL-11介导的信号传导对肥胖和T2D等相关疾病的拮抗作用，进行了体内实验，通过使用这些代谢疾病的饮食诱导小鼠模型，并使用IL-11受体α敲除(IL11-RA-/-)小鼠，或通过用拮抗性抗小鼠IL-11抗体或拮抗性抗小鼠IL11-RA抗体处理小鼠。
与表达野生型IL11RA的同窝小鼠相比，以正常食物(NCD)或WDF喂养的IL11RA敲除小鼠表现出改善的代谢表型。
图1A和1B显示，与IL11RA敲除小鼠相比，野生型小鼠的体重增加更多。图2A和2B显示，与野生型小鼠相比，IL11RA敲除小鼠的总体脂肪量显著降低。图3显示，与野生型小鼠相比，IL11RA敲除小鼠的空腹血糖水平显著降低。图4显示，与野生型小鼠相比，IL11RA敲除小鼠的血清甘油三酯水平显著降低。图5A和5B显示，与野生型小鼠相比，IL11RA敲除小鼠的血清胆固醇水平显著降低。
结果表明，减少IL-11介导的信号传导对代谢具有有益影响。
发明人接下来研究了拮抗性抗IL-11RA抗体或对照IgG抗体对喂食WDF的小鼠的影响。
出乎意料地，与喂食WDF的对照IgG抗体处理的小鼠相比，喂食WDF的抗IL-11RA抗体处理小鼠的体重显著降低(图6A)。
与IL11RA KO小鼠类似(图3)，这些抗IL-11RA抗体处理的小鼠也显示出显著减少的脂肪量(图6B)。
有趣的是，与IgG对照处理的小鼠相比，在用抗IL-11RA抗体处理的小鼠中也观察到瘦体重增加，这表明在WDF诱导的代谢发病机制期间抑制IL-11信号传导恢复了肌肉质量。此外，腹腔葡萄糖耐量试验(ipGTT)结果显示，连同空腹血糖，用抗IL-11RA抗体处理的小鼠的葡萄糖耐量显著改善(图7A和7B)。
该分析扩展到对胰腺的影响。出乎意料地发现，与IgG对照处理的小鼠相比，以WDF喂养的抗IL-11RA抗体处理小鼠对WDF诱导的胰腺损失显示出显著的保护(图8)，无论是在8至16周处理(用于防止与代谢疾病相关的影响)还是在16至24周(用于逆转与代谢疾病相关的影响)处理。
图9A显示与喂食WDF的对照IgG抗体处理小鼠相比，喂食WDF的抗IL-11RA抗体处理小鼠的血清胆固醇水平显著较低，图9B显示与喂食WDF的对照IgG抗体处理小鼠相比，喂食WDF的抗IL-11RA抗体处理小鼠的血清甘油三酯水平显著较低。图9C显示，与喂食WDF的对照IgG抗体处理小鼠相比，喂食WDF的抗IL-11RA抗体处理小鼠具有显著较低的空腹血糖水平。
此外，胰腺的免疫组织学还揭示了IgG处理的WDF喂养小鼠的胰岛中胰高血糖素和胰岛素染色的增加以及胰岛增生(图10A和10B)，这是T2D(Bonner-Weir和O'Brien糖尿病(2008)57:2899-2904)的典型特征。从16周到24周对WDF喂养小鼠的抗IL-11RA抗体处理显著降低了胰岛增生和胰高血糖素染色，并改善了WDF喂养小鼠胰岛中的胰岛素表达(图10A和10B)，这表明IL-11的拮抗作用介导的信号传导有助于改善和逆转由西式饮食引起的代谢疾病。
实施例3：IL-11介导的信号传导的拮抗作用和恶病质
评估了抗IL-11疗法对恶病质小鼠模型的影响。
用蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食喂养小鼠会导致严重的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝脏炎症和纤维化，并导致严重和持续的体重减轻(MCD饮食3周后体重下降高达30％)。虽然MCD饮食的小鼠的代谢率比正常饮食(NCD)的小鼠高36％，并且具有强烈的食欲刺激环境(低瘦素、低葡萄糖、低TG/胆固醇、低胰岛素)，但它们并没有增加食物消耗(Rizki等人J.Lipid Res.(2006)47:2280-2290)。因此，MCD饮食是一种公认的恶病质模型，并且具有许多与癌症相关恶病质的共同特征。脂肪性肝炎经常被记录在实验性和人类癌症恶病质中，并且在消耗综合征中起着重要但知之甚少的作用。
给五周大的雄性小鼠喂食含60千卡％脂肪的蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饮食(A06071301B，研究饮食)，指定为高脂肪MCD(HFMCD)饮食，与仅MCD饮食相比，这种饮食会导致更严重的NASH。对照小鼠喂养正常食物(NC；专业饲料)。小鼠在接受HFMCD一周后，每周两次腹膜内注射10mg/kg抗IL-11抗体或抗IL-11RA抗体，或相同浓度的IgG同种型对照，持续相同的处理时间。每周测量体重。
结果如图11A和11B所示。发现抗IL-11疗法对体重具有深远的积极影响，表明抑明抑制IL-11介导的信号传导能够改善恶病质相关的体重减轻。虽然所有HFMCD治疗组(n≥5只小鼠/组)在脂肪性肝炎诱导HFMCD饮食的第一周后体重减轻了约15％，但那些接受抗IL-11或抗IL-11RA治疗的小鼠体重迅速恢复，并且5周后体重恢复正常或接近正常(图11A)。用NC饮食喂养的小鼠体重稳定增加，而用HFMCD饮食喂养并用IgG对照处理的小鼠在治疗过程中体重减轻了>30％。小鼠大小的示例比较如图11B所示。因此，发现抑制IL-11介导的信号传导可在厌食症/恶病质模型小鼠体内逆转恶病质。
为了进一步研究抑制IL-11介导的信号传导对恶病质的影响，在MCD模型中研究了一系列剂量的抗IL-11治疗。五周大的雄性小鼠像以前一样用HFMCD或NC饮食喂养一周以诱导恶病质，导致MCD小鼠体重下降约15％。最初一周后，小鼠每周两次腹膜内注射0.5、1、5或10mg/kg的抗IL-11或抗IL-11RA抗体。
研究了三种抗体：两种抗IL-11((1)和(2))抗体和一种抗IL-11RA抗体。10mg/kg的IgG同种型抗体用作对照。
每周测量体重和食物消耗。对于食物消耗，在来自笼子(每笼n＝3只小鼠)的食物漏斗中测量平均食物摄入量(克/小鼠/周)。
体重结果如图12A至12C所示。发现所有三种抗IL-11疗法都提供了剂量依赖性的体重增加，表明恶病质的逆转。最高剂量显示出最大的恶病质逆转作用。用NC饮食喂养的小鼠体重稳步增加，而用HFMCD饮食喂养并用IgG对照处理的小鼠在治疗过程中体重减轻了约30％。食物消耗结果如图13A至13C所示。发现所有三种抗IL-11疗法都提供了剂量依赖性的食物消耗增加。最高剂量对食物消耗的影响最大，而用IgG对照处理的小鼠的食物消耗略有减少。发现抗IL-11RA抗体治疗在逆转体重减轻方面最有效，并且与食物摄入量的最大增加有关。
急性疾病，例如外伤或败血症也可能与厌食症和恶病质有关，因此本发明人接下来研究了IL-11介导的信号传导的拮抗作用对急性肾损伤小鼠模型中的厌食症和恶病质的影响。
通过向10周龄雄性小鼠腹腔注射在溶媒(0.3M NaHCO3)中的叶酸(180mg/kg)诱导肾损伤；对照小鼠仅给药溶媒。注射后28天处死动物。从施用叶酸前1小时开始，每3天给小鼠腹膜内注射20mg/kg的抗IL-11抗体、抗IL-11RA抗体或相同浓度的IgG同种型对照，直到小鼠被处死。
结果如图14A所示。叶酸诱导的肾损伤导致与严重和双侧肾损伤的急性期相关的快速厌食/恶病质相关的体重减轻。在损伤时接受抗IL-11Rα或抗IL-11治疗的小鼠(n＝7/组)，在损伤期间，与IgG对照相比，体重恢复得更快，并且在3周后体重恢复正常，或接近正常。
在第二个实验中，如前一样通过腹腔注射叶酸诱导肾损伤。小鼠仅在肾损伤后接受抗IL-11抗体或IgG对照治疗。在抗体治疗前后评估动物体重。未接受叶酸的健康小鼠用作对照。
结果如图14B所示。用抗IL-11抗体治疗的动物在治疗开始后体重开始恢复，表明与消瘦相关的体重减轻在晚期疾病中可以得到改善。
在进一步的实验中，小鼠受到单侧输尿管梗阻(UUO)诱导的急性肾损伤。UUO手术在12周龄的小鼠上进行。简而言之，通过腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)/甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉小鼠，并通过踏板反射进入完全深度麻醉。然后给小鼠腹部左侧剃毛。用手术刀在皮肤上做一个垂直切口，通过腹膜做第二个切口以显露肾脏。使用镊子，将肾脏抬至表面，并在肾脏下方用手术丝线将输尿管结扎两次。将结扎的肾脏轻轻放回其正确的解剖位置，并加入无菌生理盐水以补充流失的液体。然后缝合切口。动物术后连续三天用抗生素恩诺沙星(15mg/kg,SC)和镇痛剂丁丙诺啡(0.1mg/kg,SC)进行治疗。结扎后10天处死小鼠。从手术后第4天开始，小鼠腹膜内注射20mg/kg(2次/周)的抗IL-11抗体或相同浓度的IgG同种型对照，直到小鼠被处死。
结果如图15所示。由于手术创伤相关的厌食症，两组动物最初都减轻了相似的体重(～6％)。接受抗IL-11治疗(从UUO后第4天到处死小鼠，20mg/kg，每周2次)的动物比接受IgG对照的动物体重恢复更快，并在4天内恢复到正常体重。
因此，IL-11介导的信号传导的拮抗作用与急性疾病模型中体重的治疗性恢复有关。
本发明人接下来通过注射重组小鼠IL-11或诱导IL-11转基因表达来研究IL-11过表达对小鼠体重的影响。
重组小鼠IL-11(rmIL11)在盐水中重新溶解至50μg ml-1的浓度。10周龄的雄性野生型C57BL/6J小鼠每天接受皮下注射含100μg kg-1rmIL11的生理盐水(n＝19)或相同体积的生理盐水(n＝15)，持续21天。
结果如图16A所示。发现给药rmIL11可以减缓正常的体重增加进程。与仅接受生理盐水的小鼠相比，接受每日rmIL11注射21天的小鼠在治疗过程中体重增加较少。
构建了IL-11转基因(IL-11-Tg)小鼠。杂合Rosa26-IL11小鼠与Col1a2-CreER小鼠杂交以产生双重杂合Col1a2-CreER:Rosa26-IL11后代(IL-11-Tg小鼠)，其在成纤维细胞中表达IL-11转基因。对于Cre介导的IL-11转基因诱导，IL-11-Tg小鼠在6周龄时连续10天腹膜内注射50mg kg-1他莫昔芬(西格玛奥德里奇)，并在第21天处死动物(n＝14)。Rosa26:Il11小鼠(无Col1a2-CreER等位基因)连续10天注射等量剂量的他莫昔芬作为对照(n＝10)。
结果如图16B所示。IL-11-Tg小鼠表现出恶病质的早期症状，体重停止增加，并且并且随着时间的推移体重减轻。因此，发现IL-11介导的信号传导有助于消瘦相关的体重减轻。
实施例4：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型中IL-11介导的信号传导的拮抗作 用
本发明人研究了IL-11信号传导在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发病机制中的作用。
4.1方法
用IL-11刺激肝星状细胞(HSC)或肝细胞，并使用细胞和高内涵成像、免疫印迹、ELISA和侵袭测定评估效果。在体外和体内进行了遗传和药理学IL-11获得或丧失功能实验。使用ERK抑制剂研究了IL-11信号传导。在三个使用蛋氨酸/胆碱缺乏饮食或含有液体果糖的西方饮食的临床前NASH模型中评估了抗IL-11或抗IL11RA治疗的效果。使用羟脯氨酸测定、qPCR、RNA-seq、蛋白质印迹、组织学、CyTOF、脂质和代谢生物标志物进行表型分析。
动物实验
所有动物程序是根据SingHealth机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准和进行的。所有小鼠随意提供食物和水。
NASH小鼠模型
高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏(HFMCD)饮食喂养野生型小鼠
五周龄的雄性C57BL/6N小鼠喂食添加了60千卡％的脂肪的蛋氨酸和胆碱缺乏的饮食(A06071301B16，研究饮食)；对照小鼠喂食正常食物(NC，专业饲料)。描述了饮食和抗体治疗的持续时间。
蛋氨酸和胆碱缺乏(HFMCD)饮食喂养db/db小鼠
12周龄且处于肝脂肪变性阶段的C57BL/6J遗传背景下的雄性BKS.Cg-Dock7m+/+LeprdbJ(db/db)小鼠被喂食蛋氨酸和胆碱缺乏的饮食(MCD，A02082002BRi，研究饮食)8周；对照小鼠具有相同的基因型。描述了饮食和抗体治疗的持续时间。
含有果糖(WDF)的西方饮食喂养野生型小鼠
十周龄的雄性C57Bl/6J小鼠喂食西方饮食(D12079B，研究饮食)，在饮用水中补充15％重量/体积的果糖，以模拟人类的NAFLD/NASH17,18，而对照小鼠则接受正常的食物和自来水。描述了饮食和抗体治疗的持续时间。
Il11ra缺失小鼠
C57Bl/6J遗传背景下缺失Il11rα(Il11ra-/-)功能性等位基因的小鼠(B6.129S1-Il11ratm1Wehi/J，杰克逊实验室)。Il11ra-/-小鼠和它们的野生型同窝小鼠(Il11ra+/+)：(1)从5周龄开始喂食HFMCD 10周，和(2)从12周龄开始喂食WDF16周以发展NASH；对照组小鼠喂食相同时间的NC。
Il-11体内给药
10周龄的雄性Col1a1-GFP报告小鼠19和野生型C57BL/6J小鼠每天接受皮下注射100μg/kg的重组小鼠Il-11(rmIl-11)或相同体积的生理盐水，持续21天。
体内给药抗IL-11或抗IL11RA单克隆抗体
在图中列出的治疗持续时间内，对小鼠腹膜内注射拮抗性抗IL-11抗体、拮抗性抗IL11RA抗体或等量的IgG同种型对照。
空腹血糖测定
小鼠在采血(通过剪尾)前禁食6小时，并使用Accu-Chek血糖仪进行空腹血糖测量。
细胞培养
细胞(心房成纤维细胞、HSC和肝细胞)在37℃和5％CO2下生长和维持。每2-3天更新一次生长培养基，并使用标准胰蛋白酶消化技术在80-90％汇合度下传代细胞。所有实验均在低细胞传代(P1-P2)下进行。细胞在刺激前血清饥饿16小时。将受刺激的细胞与未受刺激的细胞进行比较，未受刺激的细胞在相同条件下生长相同时间(无血清培养基)，但未受刺激。
原代人心房成纤维细胞
如前所述制备和培养人心房成纤维细胞11。
原代人肝星状细胞(HSC)
HSC(5300，ScienCell)在星状细胞完全培养基(5301，ScienCell)中在聚-L-赖氨酸包被的平板(2μg/cm2，0403，ScienCell)上培养。
原代人肝细胞
人肝细胞(5200，ScienCell)在添加2％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的肝细胞培养基(5201，ScienCell)中生长和维持。
THP-1
THP-1(ATCC)在添加10％的FBS和0.05mMβ-巯基乙醇的RPMI 1640(A1049101，赛默飞世尔)中培养。THP-1细胞在RPMI 1640中用10ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA，P1585，西格玛)分化48小时。
Operetta高通量表型分析
Operetta分析主要按照先前的描述进行11，并在此处进行了细微的修改：HSC或肝细胞以每孔5x103细胞的密度接种在96孔黑色CellCarrier板(PerkinElmer)中。在实验条件下，将细胞固定在4％多聚甲醛(PFA，28908，Thermo Fisher)中，用0.1％Triton X-100(西格玛)透化，用含0.5％BSA和0.1％Tween-20的PBS封闭非特异性位点。将细胞与一抗(1:500)一起孵育过夜(4℃)，然后与适当的AlexaFluor 488二抗(1:1000)孵育。过夜孵育(4℃)进行罗丹明鬼笔环肽染色(1:1000，R415，赛默飞世尔)。细胞用含1μg/ml DAPI(D1306，赛默飞世尔)的封闭溶液复染。使用Operetta高内涵成像系统1483(PerkinElmer)从重复孔和最少7个视野/孔对每种条件进行成像。使用Harmony v3.5.2(PerkinElmer)量化表达ACTA2的细胞，并确定每个区域的活化成纤维细胞/总细胞数(ACTA2+ve)的百分比。使用Columbus 2.7.1(PerkinElmer)测量I型胶原蛋白的单位面积荧光强度(归一化为细胞数)。
免疫荧光
人HSC和肝细胞在染色前24小时接种于8孔室玻片(1.5×104细胞/孔)。细胞在4％PFA中固定20分钟，用PBS洗涤，非特异性位点用含5％BSA的PBS封闭2小时。细胞与抗IL11RA或抗IL6R抗体一起孵育过夜(4℃)，然后与适当的Alexa Fluor 488二抗孵育1小时。在通过荧光显微镜(莱卡)成像之前，将室玻片在黑暗中干燥，并在15分钟内将5滴含有DAPI的封固剂添加至载玻片。
飞行时间质谱流式细胞术(CyTOF)
如前所述从肝脏中分离免疫细胞20。将肝组织切碎并用100μg/ml胶原酶IV和20U/ml DNA酶I在37℃下消化1小时。消化后，细胞通过过滤器从而获得单细胞悬浮液并进行percoll梯度离心以分离免疫细胞。如前所述进行CyTOF染色21。将细胞解冻并用顺铂(富鲁达)染色以鉴定活细胞，然后用金属偶联的CD45抗体染色，用于编码目的。编码后，细胞用金属偶联的细胞表面抗体(Ly6C)染色。然后用1.6％PFA固定细胞，用100％甲醇透化，并进行细胞内抗体染色(TGFβ1)。在Helios质谱仪(富鲁达)上采集之前，细胞用DNA嵌入剂标记。对于分析，首先鉴定活的单细胞，然后进行解码以鉴定单个样品。使用Flowjo软件(Flowjo)进行手动门控。
统计分析
用GraphPad Prism软件(6.07版)进行统计学分析。按Dunnett(几个实验组在一个条件下比较)、Tukey(几个条件在一个实验中彼此比较)、Sidak(将两种不同基因型的几种条件进行彼此比较)对多次检验的P值进行校正。通过双向方差分析对用于比较两个不同组的两个参数(随时间变化的抗体功效)进行分析。统计学意义判断标准为P<0.05。
数据可用性
本研究产生的高通量测序数据可从GSE128940下载。所有其他数据都在手稿或补充方法中。
4.2 结果
概述
当受到NASH因子刺激时，HSC会分泌IL-11以驱动HSC到肌成纤维细胞转化所需的自分泌、ERK依赖性信号回路。IL-11在人和鼠NASH中上调，Il-11注射导致小鼠肝损伤、炎症和纤维化，并且Il11ra1缺失的小鼠在两个临床前模型中免受NASH的影响。在三种小鼠NASH模型中，针对IL11RA或IL-11的治疗性抗体始终如一地抑制和逆转纤维化和脂肪变性。出乎意料的是，IL-11会导致肝细胞损伤并促进基质介导的炎症，而抗IL-11疗法可逆转NASH相关的肝毒性和肝炎。NASH中IL-11信号传导的遗传或药理学抑制与较低的血清甘油三酯、胆固醇和葡萄糖有关。
IL-11 激活HSC并驱动肝纤维化
全基因组RNA-seq分析显示TGFβ1强烈上调HSC中的IL-11(14.9倍，P＝3.40x10-145)，这通过qPCR验证，在蛋白水平上得到证实，并在使用精确切割的人肝脏切片的实验中得到重复(图17A-17C，图24A)。独立生成的RNA-seq数据22表明，当在坚硬的基质上生长以模拟肝硬化时，IL-11是HSC中上调最多的基因(图24B)。HSC表达的IL-11受体亚基α(IL11RA)水平高于对IL-11有反应的心脏或肺成纤维细胞(图24B)。免疫组织化学分析证实了HSC中的高IL11RA表达和不可检测的IL6R表达(图17D)。人肝脏样品的蛋白质印迹显示在患有包括NASH在内的纤维化肝病的患者中IL-11增加(图24D-24E)。这些数据表明，HSC既是人类肝脏中IL-11的来源，也是其靶标，并且IL-11在人类肝脏疾病中升高。
为了研究IL-11对HSC的影响，用IL-11、TGFβ1或PDGF刺激细胞。IL-11激活活HSC的程度与TGFβ1或PDGF相似，将静止的HSC转化为ACTA2+ve肌成纤维细胞，其分泌胶原蛋白和基质修饰酶(图17E-17H，图24F-24H)。IL-11还促进HSC的剂量依赖性基质侵袭，这是NASH中HSC病理生物学的一个重要方面23(图17I)。用超级IL-11(hyperIL-11)刺激的HSC11也分泌IL-11，证实了IL-11信号传导的自分泌前反馈回路(图17J)。
用重组小鼠Il-11(rmIl-11)处理的Col1a1-GFP报告小鼠19在肝脏中积累了表达GFP的Col1a1+ve肌成纤维细胞，进一步证实了Il-11对体内HSC向肌成纤维细胞转化的影响。向小鼠皮下施用rmIl-11持续21天也增加了肝胶原含量、关键性促纤维化和促炎基因的表达以及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)(图17K-17N，图24I-24K)。这意味着rmIl-11除了引起纤维化外，还会引起肝细胞损伤和炎症。
Il11ra1缺失可保护小鼠免受NASH相关炎症、肝毒性和纤维化的影响，并降低血清脂质和葡萄糖
在使用高脂肪蛋氨酸和胆碱缺乏(HFMCD)饮食的严重NASH临床前模型16中进行了研究。在该模型中，Il-11mRNA轻度升高而蛋白质水平高度上调，表明了肝脏中Il-11表达的转录后调节(图25A-25B)。通过Erk激活(这在NASH发病机制中可能很重要24)、胶原蛋白增加和血清ALT水平升高反映了NASH期间Il-11蛋白的逐步诱导(图18A，图25C-25D)。
为了评估NASH中Il-11水平升高的病理生理学相关性，发明人使用了遗传功能丧失模型：Il-11受体α亚基缺失小鼠(Il11ra1-/-)25。与对照相比，采用HFMCD饮食的Il11ra1-/-小鼠免受纤维化，并且脂肪变性和肝损伤较少(图18B-18D，图25E-25H)。此外，在Il11ra1-/-小鼠中观察到明显较少的肝脏炎症(图18E)，表明Il-11在多种NASH病理中起着重要作用。
HFMCD模型具有早发性脂肪变性肝炎，随后出现纤维化。然而，该模型不发生肥胖或胰岛素抵抗。
建立了另一个NASH模型，使用西方饮食并补充液体果糖(WDF)26，它具有肥胖、胰岛素抵抗和高血糖症，反映了人类NASH18。WDF喂养16周后，NASH建立并且IL-11蛋白在肝脏中上调(图18F)。WDF的Il11ra1-/-小鼠与对照小鼠相比体重增加相似，但不受肝脏脂肪变性、炎症、肝细胞损伤和纤维化的影响(图18G-18J，图26)。Il11ra1-/-小鼠的Erk激活在HFMCD和WDF模型中均减弱，这意味着Il-11驱动的Erk激活对NASH非常重要(图18K，图25I)。
NASH死亡的主要原因是心血管疾病：心肌梗塞、肾功能衰竭和中风27,28。在WDF饮食16周后，在Il11ra1-/-小鼠中测量心血管风险的生物标志物。与同窝对照相比，WDF的Il11ra1-/-小鼠的空腹血糖、血清胆固醇和甘油三酯水平较低(图18L-18N)。
中和抗IL-11或抗IL11RA抗体可阻断HSC活化
用IL11RA对小鼠进行基因免疫以产生中和抗IL11RA抗体。鉴定了阻断成纤维细胞转化的克隆，并优先考虑克隆X209(IgG1κ，KD＝6nM)。X209以5.8pM的IC50阻断来自HSC的MMP2分泌，并且具有约18天的体内半衰期和良好的肝脏摄取(图19A，图27A-27D)。为确保IL-11信号传导的治疗特异性，开发了中和抗IL-11抗体X20312(IgG1κ，IC50＝40.1pM，用于HSC激活)并用于实验。
发明人发现，除了TGFβ1(图17A-17C)之外，其他关键NASH刺激物，例如PDGF、CCL2、血管紧张素II、bFGF或氧化应激也会诱导HSC分泌IL-11(图19B)。这表明IL-11在多种因素下游的HSC激活中发挥作用。为了测试这一点，HSC用各种NASH因子刺激，发现所有刺激都依赖于完整的IL-11信号传导以诱导ACTA2或胶原蛋白表达(图19C，图27E)。在单独的测定中，PDGF或CCL2对HSC的促侵袭作用也显示为IL-11依赖性(图19D)。
在Il11ra1-/-小鼠中，HFMCD或WDF饮食的肝脏保护与减少的Erk激活有关。发明人发现IL-11直接激活HSC中的ERK，并且诱导HSC分泌IL-11的所有刺激物也诱导ERK激活。X209消除了所有因子下游的ERK磷酸化和HSC转化，包括IL-11本身。ERK抑制剂阻断了所有NASH触发器下游的IL-11效应和HSC活化，表明IL-11驱动的ERK磷酸化对于HSC转化至关重要(图19E-19F，图27F)。
已发表的关于肝脏中IL-11的文献有限，但将大剂量重组人IL-11注射到啮齿类动物中与保护作用有关13,14，并且对于IL-11在血小板生物学中的作用存在混淆25。
为了排除安全问题，发明人进行了X209和X203的长期(5个月)高剂量(10mg/kg x2/周)临床前毒理学研究，并观察到对血清ALT水平或血小板没有影响(图19G-19H)。与Il11ra-/-小鼠中的数据一致，抗IL-11疗法在该治疗期间降低或趋向于降低血清脂质水平(图19I-19J)。
IL-11或IL11RA的治疗靶向在三种临床前NASH模型中有效
然后，本发明人在体内测试了X209和X203疗法，并在HFMCD饮食六周后开始施用抗体，此时IL-11被强烈上调，胶原蛋白已经积累并且脂肪性肝炎已经建立(图18A、20A和图25C-25D)。四个星期的治疗后，两种抗体都抑制或逆转了肝纤维化、炎症和损伤，而脂肪变性没有改变(图20B-20E，图28A-28C)。此外，两种抗体都消除了Erk激活，表明靶标参与和覆盖(图20F，图28D)。
发明人还对20周龄的db/db小鼠进行了抗IL-11治疗试验，这些小鼠患有肥胖、糖尿病，并且在八周的NASH诱导蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食中出现脂肪变性(图20G)29-31。与我们的其他模型一致，在MCD喂养的db/db小鼠的肝脏中IL-11表达和Erk活化增加，并且Erk活化被治疗所抑制(图20H-20I)。在该模型中，抗IL-11治疗减少了肝脂肪变性、纤维化和炎症，同时降低了ALT水平(图20J-20N，图28E-28F)。
WDF诱导的NASH的第三个模型用于测试抗IL-11治疗在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病背景下的效果18。给小鼠喂食WDF持续16周，此时它们患有肥胖且胰岛素抵抗，伴有肝脂肪变性、炎症和纤维化。然后开始用抗-IL11RA(X209)疗法进行治疗(图21A)。当靶向IL-11信号时，NASH肝脏中的肝Erk激活受到抑制(图29A)。尽管体重增加相似，但在抗IL11RA治疗的小鼠中观察到肝纤维化、脂肪变性、炎症的逆转和血清ALT水平的降低。这伴随着血清葡萄糖、甘油三酯和胆固醇水平的降低(图21B-21G和图29B-29E)。
代谢和抗IL-11联合干预对肝纤维化的影响
我们的数据显示抗IL-11治疗逆转了纤维化，但没有评估这种效果是持续的还是进行性的。此外，联合疗法可能有利于逆转NASH中的纤维化1。为了解决这些问题，使用HFMCD持续10周建立了的严重肝纤维化，然后将小鼠转换为正常食物，模拟强劲的代谢干预，并同时启动抗IL-11治疗(图21H)。
在去除代谢刺激后，Erk激活缓慢回复，其通过X203或X209处理加速(图30A)。在实验期间，用IgG处理的动物的纤维化没有改变，这表明单独的完全代谢校正不会逆转纤维化，或者非常缓慢地逆转纤维化。相比之下，抗体治疗三周后肝胶原含量显著逆转(逆转：18％，X203；24％，X209)，六周时进一步逆转(逆转：37％，X203；46％，X209)，显示出渐进和持续的效果(图21I，图30B-30C)。
纤维化的消退与较低的TIMP和较高的MMP水平相关，这促进了有利的基质重塑3,32。与此一致，X203或X209治疗患有严重纤维化的小鼠迅速上调Mmp2并下调Timp1(图21J)。当转化的HSC经历细胞凋亡33、衰老34、35和/或恢复到失活的ACTA2-ve状态36时，有利于肝纤维化的逆转。为了检查是否需要IL-11来维持HSC处于转化状态，用TGFβ1或PDGF刺激HSC，然后抑制IL-11信号传导。在IL-11抑制的24小时内，ACTA2+ve细胞的百分比和分泌的胶原蛋白的量被逆转到接近基线水平，并且ERK活性大大降低，尽管存在持续的TGFβ1/PDGF刺激(图21K-21L，图30D-30G)。
早期NASH急性坏死性炎症期间抗IL-11治疗对肝脏健康的影响
从NAFLD到NASH的转变以脂肪性肝炎、炎症和细胞死亡(坏死性炎症)的发展为特征。HSC通过分泌促炎因子在该过程中发挥核心作用3,8,37,38。本发明人研究了IL-11是否影响HSC驱动的炎症通路，并发现IL-11刺激HSC产生CCL2，而IL-11抑制阻断CCL2分泌(图31A)。这表明IL-11在基质免疫中具有未被重视的促炎作用，这与在NASH饮食的Il11ra1-/-、X203-或X209治疗小鼠的肝脏中观察到的持续低水平炎症保持一致。
在NASH的HFMCD模型中，早期炎症之后是纤维化阶段(图22A)。
在早期脂肪性肝炎期间靶向IL-11的治疗显著减少了肝脂肪变性，同时伴有更少的Erk激活(图22B-22E，图31B-31C)。在接受X203-和X209的小鼠的肝脏中没有看到脂滴，这些小鼠也没有发生纤维化(图22D、22F和图31D-31G)。HFMCD饮食还诱导急性和严重的坏死性炎症(1周前ALT增加20倍以上)，在三周内意外地观察到抗IL-11治疗显著逆转肝损伤(图22G，图31H)。这些快速的治疗益处先于疾病的纤维化阶段，并且表明，在先前的临床前模型中，IL-11直接对肝细胞产生损害作用，同时IL-11ra1-/-、X203或X209治疗的小鼠体内ALT水平持续降低。
发现原代人肝细胞表达IL11RA但不表达IL6R(图22H)。当用生理水平的IL-11刺激肝细胞时，ALT的释放呈剂量依赖性。这与肝细胞中应力纤维表达的逐渐增加一致(图22I-22J)。
有趣的是，当用TGFβ1刺激时，肝细胞也强烈分泌IL-11，表明肝细胞中IL-11的自分泌活性失调(图22K)。因此IL-11信号传导直接破坏肝细胞功能。
进行RNA-seq分析以描述IL-11治疗在HFMCD诱导的NASH急性炎症期的影响。无监督分析显示抗体治疗几乎完全逆转了由HFMCD饮食诱导的病理性RNA表达特征(图23A，图32A-32B)。促纤维化和促炎基因的上调被消除，脂质代谢基因表达重新建立(图23B-23C，图32C)。无偏基因集富集研究证实了接近正常的脂肪酸、胆汁酸、氧化应激、纤维化和炎症转录特征的恢复(图32D)。
驻留巨噬细胞和浸润性单核细胞在NASH发病机制中起重要作用，也是TGFβ1的主要来源39。脂肪性肝炎期间，对肝脏中的炎性细胞群进行了检查，发现X209治疗的肝脏中免疫细胞普遍减少，Ly6C+veTGFβ1+ve细胞特异性减少(图23D-23F)。循环TGFβ1水平因HFMCD饮食而升高，但因X209治疗而降低，这表明抗IL11RA疗法可改善疾病(图23G)。
4.3 讨论
HSC是肝脏中促炎性肌成纤维细胞的主要来源，抑制和逆转它们的转化是NASH治疗的目标。HSC转化需要非冗余的(Non-redundant)、ERK依赖性IL-11信号传导，与它在心脏、肾脏和肺中成纤维细胞激活的作用相似11,12。因此，与针对其他免疫、代谢或纤维化因素的疗法相比，靶向IL-11以逆转肝纤维化可能有益处，这些因素通常表现出一定程度的冗余(redundancy)。有趣的是，在我们的实验中，单独的有效代谢干预对纤维化没有影响，代谢疗法对逆转NASH纤维化的影响可能有限。
本发明人发现IL-11在肝脏中具有出人意料的促炎作用，并表明HSC表达高水平的IL11RA，而免疫细胞则表达IL6R。数据表明IL-11对通过基质介导的免疫细胞有间接影响。无论使用遗传或药理学功能丧失方法，IL-11介导的信号传导抑制均一致且有力地证明可以预防/逆转多个NASH模型中的炎症。虽然早期的出版物表明Il-11可能在肝脏中具有保护作用，但这些研究在啮齿动物中使用了极高剂量的外源重组人IL-1113,14，其不会刺激小鼠Il11ra111。IL-11在生理水平上的真正生物学效应被证明是促炎和基质驱动的。
在肝细胞中用TGFβ1和IL-11信号传导刺激诱导应力纤维形成和细胞毒性后，肝细胞也表达IL11RA并强烈分泌IL-11。在NASH急性坏死性炎症期间，IL-11对肝细胞的影响是深远的，IL-11信号传导的治疗靶向在三周内将ALT水平从大约700U/L逆转至正常。在NASH的后期，IL-11的遗传或治疗抑制也可以预防或逆转肝细胞损伤，这需要进一步研究。
人类40和小鼠25的IL11RA敲除可能有轻微的颅骨畸形和关节松弛，但在其他方面是健康的，IL-11在成年哺乳动物中显得冗余。这为IL-11作为药物靶点提供了令人信服的遗传安全数据。除了这一靶标安全性数据之外，目前的研究表明，当使用高剂量的治疗性抗体长时间中和IL-11信号传导时，不会产生不利影响。此外，遗传或药理学抑制与较低的血清甘油三酯、胆固醇和空腹血糖有关。IL-11抑制的这一方面是潜在NASH治疗的理想特征，因为NASH患者经常患有心血管疾病。
本发明人已经确定了IL-11在肝脏病理学中的未被重视的核心作用。用中和抗体靶向IL-11信号可以逆转NASH范围内的纤维化、脂肪变性、肝细胞死亡和炎症。这种新的治疗方法与有利的心脏代谢特征相关。
4.4实施例4参考文献
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4.5 补充材料
抗体
ACTA2(ab7817,艾博抗；IF),ACTA2(19245,CST；WB),CD45(103102,生物传奇),胶原I(ab34710,艾博抗),p-ERK1/2(4370,CST),ERK1/2(4695,CST),GAPDH(2118,CST),IgG(Aldevron),中和抗-IL-11(X203,Aldevron),中和抗-IL11RA(X209,Aldevron；体内研究),IL11RA(ab1250515,艾博抗；IF),Ly6C(128039，生物传奇),TGFβ1(141402,生物传奇),抗兔HRP(7074,CST),抗鼠HRP(7076,CST),抗兔Alexa Fluor 488(ab150077,艾博抗),抗鼠Alexa Fluor 488(ab150113,艾博抗)。
重组蛋白
商业重组蛋白：人血管紧张素II(A9525，西格玛奥德里奇)，人CCL2(279-050/CF，R&D系统)，人bFGF(233-FB-025，R&D系统)，人IL-11(PHC0115，生命技术公司)、人类PDGF(220-BB-010，R&D系统)、人TGFβ1(PHP143B，伯乐)和小鼠TGFβ1(7666-MB-005，R&D系统)。
定制重组蛋白：合成小鼠Il-11(UniProtKB:P47873)，不含信号肽。超级IL-11(IL11RA：IL-11融合蛋白)，其模拟反式信号转导复合物，使用IL11RA(氨基酸残基1-317；UniProtKB：Q14626)和IL-11(氨基酸残基22-199,UniProtKB:P20809)以及20个氨基酸的接头(GPAGQSGGGGGSGGGSGGGSV)1构建而成。所有定制重组蛋白均由GenScript使用哺乳动物表达系统合成。
化学品
过氧化氢(H2O2，31642，西格玛)，PD98059(9900，CST)，U0126(9930，CST)。
产生针对IL11RA的小鼠单克隆抗体
基因免疫和特异性结合筛选
将编码人IL11RA的氨基酸23-422的cDNA克隆到表达质粒(Aldevron)中。使用用于粒子轰击的手持装置通过皮内应用DNA包被的金粒子对小鼠进行免疫。用识别添加到IL11RA蛋白N端的标签的抗标签抗体证实了瞬时转染的HEK细胞上的细胞表面表达。在24天和一系列免疫后收集血清，并在流式细胞术中对用上述表达质粒瞬时转染的HEK293细胞进行测试。二抗是山羊抗小鼠IgG R-藻红蛋白偶联抗体(南方生物技术，#1030-09)，终浓度为10μg ml-1。血清在含有3％FBS的PBS中稀释。将血清的相互作用与用无关cDNA转染的HEK293细胞进行比较。在2只动物中确认了特异性反应性，从这些动物中分离出产生抗体的细胞，并根据标准程序与小鼠骨髓瘤细胞(Ag8)融合。将杂交瘤培养物的上清液与表达IL11RA标志构建体的HEK细胞一起孵育，并通过流式细胞术鉴定产生对IL11RA具有特异性的抗体的杂交瘤。
中和抗IL11RA抗体的鉴定
与IL11RA标志细胞结合但不与阴性对照结合的抗体被认为是特异性结合剂，随后按照Schafer等人2的描述测试了对人和小鼠心房成纤维细胞的抗纤维化活性。简而言之，在候选抗体(6μg ml-1)存在下，分别用人或小鼠TGFβ1(5ng ml-1；24小时)刺激原代人或小鼠成纤维细胞。TGFβ1刺激导致内源性IL-11上调，如果被中和，则会阻断TGFβ1的促纤维化作用。如上所述，在Operetta平台上测量活化的肌成纤维细胞(ACTA2+ve细胞)的分数，以估计候选抗体的中和潜力。为了阻断潜在的反式信号传导效应，还在人成纤维细胞(200pgml-1)的超级IL-11刺激背景下筛选了抗体。检测到三种特异性和中和抗IL11RA抗体，其中X209被用于体内研究。进行相同的程序以获得与配体IL-11结合的中和抗体3。
X209与IL11RA的结合动力学
X209与人IL11RA的结合在Biacore T200(GE保健公司)上进行测量。X209被固化在抗鼠捕获芯片上。用pH 7.4的含有0.005％P20和0.5％BSA的HEPES缓冲盐水进行相互作用测定。将浓度范围(1.56nM至100nM)的分析物(人IL11RA)以40μl min-1的流速注射到X209和参考表面上。使用类似的策略在Octet系统(ForteBio)上确认了与小鼠Il11ra1的结合。所有传感图都被对齐并双重引用4。通过将校正的传感图与1:1Langmuir模型拟合来确定亲和力和动力学常数。平衡结合常数KD由kd/ka的比率确定。
X209 IC50测量
在IgG(4μg ml-1)和不同浓度的X209(4μg ml-1至61pg ml-1；4倍稀释)存在下，用TGFβ1(5ng ml-1，24小时)刺激HSC。收集上清液并测定分泌的MMP2的量。通过使用最小二乘法(普通)拟合绘制X209测试浓度(pM)对相应抑制百分比值的对数来生成剂量反应曲线。IC50值是使用log(抑制剂)与归一化响应变量斜率方程计算的。
血液药代动力学和生物分布
C57BL/6J小鼠(10-12周龄)眼眶后注射(左眼)100μl在PBS中的新鲜放射性标记的125I-X209(5μCi，2.5μg)。小鼠用2％异氟醚麻醉，并在注射后几个时间点(2、5、10、15、30分钟、1、2、4、6、8小时、1、2、3、7、14和21天)通过下颌下出血收集血液。对于生物分布研究，通过心脏穿刺收集血液，并在以下时间点收集组织：注射后1、4小时、1、3、7、14、21天。使用具有衰减校正(100μl剂量100倍稀释)的伽马计数器(2480Wizard2，Perkin Elmer)测量放射性含量。测量的放射性被标准化为％注射剂量/g组织。
RNA-seq
RNA-seq文库的生成
使用Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒(赛默飞世尔科技)定量总RNA，使用LabChipGX RNA检测试剂盒(Perkin Elmer)评估RNA完整性数目(RIN)。根据制造商的方案，使用TruSeq Stranded mRNA文库制备试剂盒(Illumina)制备转录文库。使用KAPA文库定量试剂盒(KAPA生物系统)对所有最终文库进行定量。使用LabChip GX DNA高灵敏度试剂盒(Perkin Elmer)确定最终文库的质量和平均片段大小。使用NextSeq 500高输出v2试剂盒和配对末端75-bp测序化学在NextSeq 500台式测序仪(Illumina)上汇集并测序文库。
RNA-seq分析
肝星状细胞中刚度诱导的RNA调节：从Dou等人5下载标准化的基因表达值。从分析中去除低表达的基因(基线时的FPKM≥2)，并计算倍数变化，即硬表面上HSC中的平均FPKM除以软表面上HSC中的平均FPKM。绘制了上调基因(f.c.>1)的RNA表达的倍数变化，并根据它们的平均FPKM值对基因进行排序。
HFMCD中人肝星状细胞的TGFB1刺激和抗体处理：使用bcl2fastq v2.19.0.316和--no-lane-splitting选项对测序文库进行多路分解。然后在配对末端模式下使用trimmomatic6 v0.36和选项MAXINFO:35:0.5MINLEN:35修剪适体序列。修剪后的读数使用STAR7 v.2.2.1与智人GRCh38对齐，选项为--outFilterType BySJout--outFilterMultimapNmax 20--alignSJoverhangMin 8--alignSJDBoverhangMin 1--outFilterMismatchNmax 999--alignIntronMin 20--align00s0Max0Max 1000000双端，单通模式。仅保留独特的比对进行计数。使用来自subread8 v.1.5.1的FeatureCounts模块在基因水平计算计数，并使用选项-O-s 2-J-T 8-p-R-G。Ensembl 86版hg38 GTF被用作注释，用于编制星号索引和特征计数(FeatureCounts)。
对于小鼠抗体治疗实验，文库的处理与人类样本一样，仅使用mm10 Ensemblrelease 86基因组和注释。
差异表达分析在R 3.4.1中使用Bioconductor包DESeq29 1.18.1进行，使用Wald检验进行比较并包括方差收缩步骤，显著性阈值设置为0.05。
基因集富集分析(GSEA)在R 3.4.1中使用fgsea包和MSigDB Hallmark基因集进行10,11，执行100000次迭代。DESeq2结果输出的“stat”列用作每个富集的排序输入，仅采用具有一对一人类直系同源物的小鼠基因。
酶联免疫吸附测定(ELISA)和比色测定
分别使用人IL-11Quantikine ELISA试剂盒(D1100，R&D系统)和总MMP-2Quantikine ELISA试剂盒(MMP200，R&D系统)定量等体积细胞培养基中IL-11和MMP-2的水平。使用Sirius红胶原蛋白检测试剂盒(9062,Chondrex)对细胞培养上清液中的总分泌胶原蛋白进行定量。使用Quickzyme总胶原测定试剂盒(Quickzyme生物科学)测量肝脏中的总羟脯氨酸含量。分别使用丙氨酸转氨酶活性检测试剂盒(ab105134,艾博抗)、胆固醇检测试剂盒(ab65390,艾博抗)和甘油三酯检测试剂盒(ab65336,艾博抗)测量小鼠血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)、胆固醇和甘油三酯水平。使用甘油三酯比色测定试剂盒(10010303,Cayman)进行肝甘油三酯(TG)测量。所有ELISA和比色测定均根据制造商的方案进行。
基质胶侵袭试验
使用24孔Boyden室侵袭测定(细胞生物实验室有限公司)测定人类HSC的侵袭行为。将无血清HSC培养基中等量的HSC一式三份接种到ECM包被的基质胶上，并使其侵入含有0.2％FBS的HSC培养基。与刺激物孵育48小时后，吸出培养基并使用棉签去除非侵入性细胞。向底部腔室侵入的细胞用细胞染色溶液(细胞生物实验室有限公司)染色，并对来自5个非重叠区域/膜的侵入细胞进行成像并在40倍放大率下计数。对于抗体抑制实验，在添加刺激之前，用X203、X209或IgG对照抗体预处理HSC 15分钟。
精确切割的肝脏切片(PCLS)和NASH患者肝脏的蛋白质印迹
简而言之，将人PCLS切割并与TGFβ1一起孵育24小时。使用人IL-11DuoSet(DY218,R&D系统)对上清液进行ELISA。该CRO还收集了因癌症进行肝切除术的患者的肝活检，其中收集了邻近的非癌组织用于分子研究。患者没有记录的内源性肝病(对照)或先前记录的酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎或NASH。出于保密原因，没有提供这些样品的进一步信息。
定量聚合酶链反应(qPCR)
使用Trizol(英杰公司)从速冻肝组织或HSC裂解物中提取总RNA，然后使用RNeasy柱子(凯杰公司)纯化。根据制造商的说明，使用iScriptTM cDNA合成试剂盒(伯乐)合成cDNA。使用StepOnePlusTM(应用生物系统)使用TaqMan(应用生物系统)或快速SYBR green(凯杰公司)技术对重复样品进行基因表达分析超过40个循环。将表达数据标准化为GAPDHmRNA表达，并使用2-ΔΔCt方法计算倍数变化。可根据要求提供特定TaqMan探针和SYBR green引物的序列。
免疫印迹
对来自HSC和肝组织的总蛋白提取物进行蛋白质印迹。细胞和冷冻组织均在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(赛默飞科技)的放射免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液中匀浆，然后离心以清除裂解物。蛋白质浓度通过Bradford测定法(伯乐)确定。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质裂解物，转移到PVDF膜上，并对指定的一抗进行免疫印迹分析。使用ECL检测系统(Pierce)和适当的二抗对蛋白质进行可视化。
组织学
肝组织在室温下在10％中性缓冲福尔马林(NBF)中固定48小时，脱水，包埋在石蜡块中，并以7μm切片。通过光学显微镜检查用Masson三色染色的切片。每个组织学实验独立重复，n＝3/组的结果相似。捕获切片的图像，并使用Image-J软件(颜色去卷积-马森三色)从4个切片/肝脏半定量测定蓝色染色的纤维化区域。治疗和基因型未向执行组织学和生成半定量读数的研究人员披露。
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实施例5：肝细胞中的自分泌IL11顺式信号传导是脂毒性和非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)之间的起始联系
5.1 概述
IL11信号传导在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中很重要。在本实施例中，发明人表明负载有脂质的肝细胞分泌IL11，IL11通过自分泌顺式信号环路起作用以引起脂肪细胞凋亡。虽然IL6保护肝细胞，但IL11通过激活非经典信号通路和上调NOX4和活性氧而导致肝细胞死亡。在两个临床前模型中，Il11ra1的肝细胞特异性缺失保护小鼠免受NASH的各个方面的影响。此外，仅在全身Il11ra1基因敲除小鼠中，肝细胞中IL11顺式信号传导的恢复重建了脂肪变性和炎症。没有发现证据支持IL6或IL11信号转导的存在。发明人得出结论，肝细胞脂毒性刺激IL11分泌，导致肝细胞死亡，继之以纤维化和炎症。这些数据概述了从非酒精性脂肪性肝病向NASH转变的新的肝细胞特异性机制。
5.2 介绍
白细胞介素11(IL11)是一种关键的纤维化因子(Ng等人，2019年；Schafer等人，2017年)，它在跨物种的纤维化精密肝切片中升高(Bigaeva等人，2019年)。IL11已被证明对中毒性肝损伤后的肝细胞功能有负面影响(Widjaja等人)，并直接或间接导致非酒精性脂肪性肝炎(NASH)病理学(Widjaja等人，2019年)。在另一极端方面，许多早期出版物表明IL11在缺血性、感染性或毒素诱导的肝损伤小鼠模型中具有保护作用(Bozza等人，1999年；Maeshima等人，2004年；Nishina等人al.，2012；Trepicchio等，2001；Yu等，2016；Zhu等，2015)。然而现在很明显，早期研究中使用的重组人IL11(rhIL11)试剂对小鼠无效(Widjaja等人)。
IL11是白介素6(IL6)细胞因子家族的成员，与IL6一样，与其膜结合α受体(IL11RA)和糖蛋白130(gp130)结合以发出顺式信号。IL6本身与肝功能有关，并且公开文献表明它具有总体有益作用(Klein等人，2005年；Kroy等人，2010年；Matthews等人，2010年；Schmidt-Arras和Rose-John，2016年；Wuestefeld等人,2003年)。然而，也有人认为IL6可以与可溶性IL6受体(sIL6R)结合并发出反式信号，这被认为是适应不良的(Schmidt-Arras和Rose-John，2016)。IL11可能与IL6一样，在致病模式中发出反式信号，但迄今为止的实验在肿瘤或生殖组织中没有发现这方面的证据(Agthe等人，2017年；Balic等人，2017年)。
从非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)向NASH转变的潜在因素是多因素的，但肝细胞的脂质负荷是至关重要的(Friedman等，2018)。某些脂质对肝细胞有毒，这种脂毒性会刺激细胞因子释放，导致肝细胞死亡和肝星状细胞(HSC)和免疫细胞的旁分泌激活(Farrell等，2018；Friedman等，2018)。脂毒性，例如棕榈酸酯引起的脂毒性(Kakisaka等，2012)，是NASH的早期事件，代表饮食、NAFLD和NASH之间的联系。虽然IL6顺式信号传导的遗传或药理学抑制会恶化脂肪变性表型(Kroy等人，2010年；Matthews等人，2010年；Yamaguchi等人，2010年)，但尚未描述IL11在肝脂毒性中的作用。
在本实施例中，使用一系列体外和体内方法用于解决肝细胞生物学、NAFLD和NASH中有关IL11的关键问题：(1)定义IL11顺式和反式信号传导在人类肝细胞中的真正作用，(2)检查脂毒性是否与肝细胞中的IL11活性有关，(3)确定IL11或IL6反式信号转导是否有助于NASH，(4)剖析肝细胞中IL11顺式信号转导与脂肪变性、肝细胞死亡、炎症和纤维化发展之间的相互关系。这些研究揭示了IL6和IL11生物学的意想不到的方面，并证明了肝细胞中脂毒性激活的自分泌IL11顺式信号传导的明确致病作用，启动了从NAFLD到NASH的转变。
5.3 结果
5.3.1 合成的IL11反式信号转导构建体导致肝细胞死亡
发明人首先通过流式细胞术评估了原代人肝细胞中IL6R、IL11RA和gp130的表达水平。在大多数细胞(分别为92.6％和91.9％)中观察到IL11RA和gp130的强表达，但只有少数肝细胞(3.0％)表达IL6R，并且水平较低(图33A和40A)。根据这一结果，RNA-seq和Ribo-seq研究发现IL11RA和gp130转录物在肝细胞中高度表达并积极翻译。相比之下，观察到很少的IL6R转录物，并且几乎没有可检测的IL6R翻译物(图33B-33D、40B和40C)。肝细胞的免疫荧光染色证实了Ribo-seq数据的结果：高IL11RA表达但没有可检测的IL6R表达(图40D)。本发明人也没有检测到培养基中显着水平的IL6R(水平略高于检测下限)，因此他们排除了IL6R脱落的可能性(图40E)。综上所述，这些数据表明IL6R在原代人肝细胞中的表达水平非常低，这意味着IL6顺式信号传导在这些细胞中的作用有限。然而，这些细胞显示出IL11RA和gp130的强烈共表达。
鉴于人肝细胞缺乏IL6R表达，发明人采用合成的IL6反式信号传导构建体(hyperIL6)来激活这些细胞中的IL6信号传导，并将其与合成的IL11反式信号传导复导复合物(hyperIL11)进行比较。HyperIL11，与IL11本身(Widjaja等人)类似，以似，以剂量依赖性方式(2.5ng/ml至20ng/ml)激活ERK和JNK。相比之下，IL6IL6反式信号传导不激活非经典信号传导途径，而是剂量依赖性地诱导STAT3激活(图33E)。因此，当与肝细胞上的gp130结合时，IL11或IL6与其同源受体在预先形成的合成复合物中激活不同的细胞内途径，这是一个新颖而有趣的发现。
HyperIL11导致原代人肝细胞培养基中丙氨酸转氨酶(ALT)的剂量依赖性增加，其中发现hyperIL6(20ng/ml)具有显着但有限的细胞保护作用(倍数变化(FC)＝0.9；P＝0.0468)(图33F)。可溶性gp130(sgp130)是一种通过gp130起作用的反式信号复合物的抑制剂(Schmidt-Arras和Rose-John，2016年)。与其报道的诱饵效应一致，sgp130阻断了hyperIL11(p-ERK/p-JNK)和hyperIL6(p-STAT3)下游信号通路的激活，并且还抑制了hyperIL11的肝毒性作用(图33G-33I)。
然后，发明人进行了实验以在不存在人工蛋白质复合物hyperIL6或hyperIL11的情况下检测IL11反式信号转导。在可溶性gp130(sgp130，以抑制推定的反式信号转导)或可溶性IL11RA(sIL11RA，以增强推定的转式信号转导)存在的情况下，用IL11刺激细胞。IL11诱导的肝细胞死亡和信号传导不受sgp130或sIL11RA的影响(图33J-33K和40F)。此外，IL11剂量依赖性地(0.625ng/ml至20ng/ml)引起肝细胞死亡，这不受添加sgp130(1μg/ml)或sIL11RA(1μg/ml)的影响(图40G)。相反，增加sgp130或sIL11RA的剂量对IL11刺激的肝细胞的ALT释放没有影响(图40H)。这些数据表明，在没有合成构建体的情况下，IL11反式信号转导可能不存在。
5.3.2 顺式传导信号是肝细胞脂毒性的基础
为了解决IL11在脂肪肝疾病中的作用，发明人模拟了肝细胞脂毒性，其被视为NASH的起始病理并且与受损肝细胞的细胞因子释放有关(Friedman等，2018)。使用NAFLD患者血清中所见的饱和脂肪酸(sFS)浓度，以6:1的比例向肝细胞加载棕榈酸酯:BSA混合物(Kleinfeld等，1996)。与对照相比，负载sFA的细胞分泌更大量的IL11(FC＝28，P<0.0001)以及IL6、CCL2和CCL5(图34A-34D)。负载脂质的肝细胞经历了FACS导致的细胞凋亡以及ALT的坏死释放(图34E-34G)。
为了测试来自加载脂质的肝细胞的IL11分泌是否与顺式或反式信号传递方式的脂毒性功能相关，将细胞与抗IL11RA抗体(X209)或sgp130一起孵育。X209减少了所有细胞因子的分泌，包括IL11本身，而sgp130没有影响(图34A-34G)。这表明肝细胞脂毒性中IL11顺式信号传导的自分泌环路。受损线粒体中活性氧(ROS)的产生对于脂毒性很重要(Farrell等人，2018年)，并且来自NOX4的ROS也与NASH相关(Bettaieb等人，2015年)。发现X209可阻止负载sFA的肝细胞中ROS的产生，并且这伴随着谷胱甘肽(GSH)水平的部分恢复(图34H和34I)。
发明人接下来检查了信号传导事件。脂毒性与JNK的激活密切相关，后者驱动caspase-3激活和脂肪细胞凋亡。因此，加载棕榈酸酯的肝细胞显示出JNK激活和caspase-3裂解，以及ERK磷酸化(图34J)。这种模式与IL11刺激所见的效果明显相似(图33E)。尽管肝细胞对sFA的吸收相似，但X209在很大程度上抑制了棕榈酸酯诱导的信号事件以及脂肪酸合酶(FASN)上调、caspase3激活和甘油三酯积累(图34J、34K和40I)。NOX4被棕榈酸酯上调并且也被X209抑制(图34J)。虽然STAT3被sFA加载激活，但发现这种效应独立于IL11RA介导的信号传导并且与脂肪细胞凋亡无关(图34J)。在整个实验中，sgp130没有影响。总之，这些数据表明棕榈酸酯诱导的IL11分泌和自分泌、前馈IL11顺式信号传导对肝细胞脂毒性很重要。
5.3.3 在两个NASH模型中没有证据表明IL11或IL6信号转导
然后，发明人使用两种临床前小鼠NASH模型研究了反式信号转导是否是体内NASH的基础：补充果糖的西方饮食(WDF)模型和缺乏蛋氨酸和胆碱的高脂肪饮食(HFMCD)模型。WDF模型与肥胖、高脂血症和胰岛素抵抗有关，并被视为可转化为人类NASH的常见形式，如糖尿病患者。HFMCD模型刺激快速发作的NASH，特别是由肝细胞脂毒性驱动，在没有胰岛素抵抗的情况下与体重减轻有关。两种模型都有脂毒性，而肥胖和胰岛素抵抗则不然。
在开始WDF和HFMCD饮食前三周，小鼠被注射了一种AAV8病毒，该病毒编码任一白蛋白启动子驱动的sgp130(AAV8-Alb-sgp130)，其中包含小鼠gp130蛋白的整个细胞外结构域(氨基酸1到617)，或单独的白蛋白启动子(AAV8-Alb-Null)(图35A、41A和42A)。AAV8-Alb-sgp130给药诱导肝脏中高水平的sgp130，这在外周循环中也可检测到，适用于局部和全身抑制的推定的IL6或IL11反式信号传导(图35B、41B、42B-42C)。
WDF 16周后，IL11水平在肝脏和外周中强烈上调，但IL6表达不受影响(图35B和35C)。WDF的小鼠变得肥胖(图41C)，肝脏质量增加了大约2倍，并发展为严重的脂肪变性，通过肝脏甘油三酯的大体形态学、组织学和定量分析(图35E-35G)。这些表型不受高水平sgp130表达的影响(图35B-35G)。类似地，WDF小鼠的ALT、AST、胶原蛋白和外周心血管危险因素(空腹血糖、血清甘油三酯和血清胆固醇)水平升高，GSH水平降低，但这些参数均不受sgp130的影响(图35H-35N)。来自WDF饮食16周小鼠的肝脏显示促炎和纤维化基因的表达增加，并且该特征不受sgp130介导的推定顺式信号转导抑制的影响(图35O和41D-41E)。
在第二组实验中，使用HFMCD饮食诱导NASH(图42A)。HFMCD饮食增加了肝脏和血清中的IL11水平，而肝脏中的IL6水平略低，外周轻度增加(图42B和42D-42E)。通过大体形态学、组织学和分子分析，食用HFMCD饮食的小鼠发生了快速而严重的脂肪变性，sgp130表达未改变这一点(图42F和42G)。HFMCD饮食升高肝细胞损伤标志物(ALT和AST)，并消耗GSH，与sgp130表达无关(图42H-42J)。类似地，sgp130表达未改变HFMCD诱导的肝纤维化(图42K)。在RNA水平上，HFMCD饮食与炎症和纤维化基因的失调表达相关，并且这些分子表型不受sgp130表达的影响(图42L和42M)。
在信号水平上，WDF和HFMCD饮食都刺激了ERK和JNK激活，这与升高的IL11顺式信号传导一致(图35P和42N)。相比之下，肝脏中的pSTAT3水平没有被WDF升高(图35P)并且在HFMCD饮食的小鼠中出现轻度升高(图42N)。在所有情况下，sgp130对饮食诱导的信号事件没有影响。总体而言，这些数据表明IL6和IL11反式传导信号均未在NASH中起作用，这与其他未检测到IL6家族转信号的研究一致(Agthe等人，2017年；Balic等人，2017年；Kammoun等人，2017年；Kraakman等人，2015年)。
5.3.4 启动NASH需要肝细胞特异性IL11顺式信号传导
虽然在NASH模型中没有发现支持IL11反式信号转导的证据，但总体而言，数据表明肝细胞中IL11效应增加，推测为顺式。为了测试这个假设，发明人向Il11ra1loxP/loxP小鼠施用AAV8-Alb-Cre，从而仅删除肝细胞(CKO小鼠)中的Il11ra1。然后用正常食物(NC)、HFMCD饮食或WDF喂养CKO小鼠(图36A和37A)。施用AAV8-Alb-Cre后CKO中肝脏IL11RA蛋白大大减少，表明该模型是有效的，并表明肝细胞是Il11ra1的最大肝脏储库(图36B和37B)。
除了快速刺激脂毒性驱动的NASH(Stephenson等人，2018年)之外，HFMCD饮食还会导致体重减轻(Stephenson等人，2018年)。令人惊讶的是，HFMCD饮食小鼠的体重减轻最初是有限的，后来在CKO小鼠中逆转(图36C)。正如预期的那样，WDF上的小鼠在整个实验期间体重和脂肪量增加。然而，同样令人惊讶的是，这些肥胖表型在CKO小鼠中得到缓解(图37C和37D)。这些数据表明，抑制IL11信号传导有助于体重稳态，具有特定环境的抗恶病质或抗肥胖作用。
通过大体形态学、组织学和定量甘油三酯分析，食用HFMCD或WDF饮食的CKO小鼠均明显不发生脂肪变性(图36D和36E、37E和37F)，而食用WDF的小鼠肝增重较小(图37G)。在喂食HFMCD饮食(降低：ALT，99％；AST，97％；两者P<0.0001)或WDF(降低：ALT，98％；AST，98％；P<0.0001)的CKO小鼠中，肝损伤标志物显着降低，并发现与NC对照水平相当(图36F和36G、37H和37I)。在两种模型中，食用NASH饮食的对照小鼠的GSH水平降低，但在CKO中恢复正常(图36H和37J)。
与对照相比，食用任一NASH饮食的CKO小鼠的肝纤维化大大减少(减少：HFMCD，87％；WDF，64％；两者的P<0.001)(图36I和36K)。食用HFMCD或WDF饮食的小鼠中促炎和纤维化基因的上调在CKO中也减少(图36J、37L、43A和43B、44A和44B)。这表明HSC向肌成纤维细胞的转化和免疫细胞的激活在一定程度上继发于肝细胞中IL11驱动的上游事件。
食用WDF的小鼠也会出现高血糖、高甘油三酯血症和高胆固醇血症，所有这些都在CKO中得到改善，表明肝细胞特异性IL11信号传导对于更普遍的NASH表型具有重要作用(图44C-44E)。在信号水平上，HFMCD饮食和WDF均导致ERK和JNK磷酸化升高。这在CKO小鼠中很大程度上被阻止，与肝细胞中IL11信号传导的抑制一致(图36K和37M)。
5.3.5 在IL11ra1缺失小鼠中，肝细胞特异性IL11顺式信号转导的重建可恢复脂肪性肝炎，但不能恢复肝纤维化
采用体内功能获得实验补充CKO小鼠的功能丧失实验。本发明人研究了在具有整体Il11ra1缺失(Il11ra1-/-敲除(KOs))的小鼠的肝细胞中特异性恢复IL11顺式或反式信号传导是否会导致疾病。KO小鼠注射编码全长膜结合Il11ra1(mbIl11ra1；重建顺式传导信号)或Il11ra1的分泌/可溶性形式(sIl11ra1，构成Il11ra1的胞外部分；以启用反式信号传导)的AAV8或对照构建体，然后给动物喂食NC、HFMCD饮食或WDF(图38A、45A和46A)。
注射AAV8-Alb-mbIl11ra1的KO小鼠在肝细胞上重新表达IL11RA1，注射AAV8-Alb-sIl11ra1的KO小鼠在肝脏和循环中显示sIL11RA1表达增加(图38B、45B、46B和46C)。正如预期的那样，在NC中接受对照AAV8构建体(AAV8-Alb-Null)的野生型小鼠具有正常的肝脏，并且在食用HFMCD饮食或WDF WDF时，发生脂肪变性、炎症和肝损伤(图38C-38J、45C和45D，46D-46K)。46K)。注射对照病毒并喂食HFMCD或WDF饮食的KO小鼠免受NASH表型的影响，尽管Il11ra1种系缺失的保护作用不如在CKO中看到的那么强。
使用mbIl11ra1在KO小鼠中恢复IL11顺式信号转导的恢复，从大体形态到基因表达和信号传导的分子模式都明显再现了肝脏脂肪变性和炎症(图38C-38J、45C-45D和46D-46L)。值得注意的是，肝胶原含量和纤维化基因表达没有恢复(图38I和38J、45D、46I和46K)，因为HSC中的IL11信号传导对HSC到肌成纤维细胞的转化很重要(Widjaja等人，2019)，但不受白蛋白驱动的Il11ra1表达(即这些模型中Il11ra1的HSC仍然被删除)的影响。形成鲜明对比的是，理论上会激活反式信号转导的sIL11RA在KO肝细胞中的表达没有影响，尽管IL11水平很高(图35B)，并且小鼠仍然免受所有NASH肝病的影响(图38C-38J、45C-45D，和46D-46K)。信号变化是一致的，因为mIL11RA表达在两种饮食中都恢复了KOs中的ERK和JNK激活，而sIL11RA1则没有(图38K和46L)。在WDF模型中，KO小鼠中肝细胞特异性IL11顺式信号传导的恢复导致高血糖、高甘油三酯血症和高胆固醇血症，但sIl11ra1的表达没有(图38L-38N)。
5.4讨论
代谢性肝病通常发生在肥胖和2型糖尿病的背景下，最初表现为可进展为NASH的NAFLD(Friedman等，2018年；Sanyal，2019年)。进展为NASH的一个关键潜在病理是“底物超载”，大量代谢物超过了肝细胞处理脂肪的能力，导致脂毒性。细胞因子是脂毒性肝细胞分泌的关键NASH因子(Friedman等人，2018年)，在此发明人将IL11确立为脂毒性环境的重要组成部分和NAFLD到NASH转变的驱动因素。
大量证据支持肝脏中IL6信号传导有益的观点(Kroy等，2010；Schmidt-Arras和Rose-John，2016；Yamaguchi等，2010)。然而，IL6反式信号转导在肝脂肪变性中的致病作用(Kammoun等人，2017年；Wieckowska等人，2008年)已经被提出。发明人使用合成构建体发现，启动IL11反式信号传导的hyperIL11具有细胞毒性，而hyperIL6在肝细胞中具有保护作用。然而，没有证据表明在体外或体内的生物学相关背景中使用功能获得和功能丧失进行信号转导。这表明IL6家族成员反式信号传导在NASH中没有作用，这与之前肝脏以外的研究一致(Agthe等人，2017年；Balic等人，2017年)。这些发现与其他疾病的相关性尚不清楚，针对溃疡性结肠炎中反式信号传导的临床试验正在进行中(Kang等，2019)。之前的研究表明IL6R在肝细胞中表达(Schmidt-Arras和Rose-John，2016)，因此令人惊讶的是，原代人类肝细胞几乎不表达或不表达IL6R。这可能反映了早期研究对转化的肝细胞样细胞(例如HepG2)的强烈依赖。
在此，发明人展示了肝细胞中IL11顺式信号转导对于NASH的重要性。这种效果是使用野生型遗传背景上的肝细胞特异性功能丧失和Il11ra1空背景上的肝细胞特异性功能获得建立的。这推翻了文献中的观点，即IL11在使用rhIL11的基础上对肝细胞具有保护作用，但在小鼠肝脏疾病的小鼠模型中无效(Maeshima等，2004；Nishina等，2012；Trepicchio等。,2001；Zhu et al.,2015)。重要的是，虽然肝细胞特异性IL11顺式信号传导的恢复导致KO小鼠的脂肪性肝炎，但在CKO小鼠中纤维化并未恢复，而被阻止。这表明HSC中的IL11顺式信号传导是肝纤维化所必需的，并将肝细胞功能障碍置于HSC激活的上游。
本发明人提出了NASH的机制模型，其中负载脂质的肝细胞分泌IL11，导致自分泌细胞死亡、HSC的旁分泌激活和继发性炎症细胞激活和浸润(图39)。抑制IL11信号传导的目标是饮食诱导的脂肪性肝炎的起始联系，其影响随后的肝纤维化和炎症，这表明NASH的新治疗方法。
5.5 实施例5的材料和方法
5.5.1 AAV8载体
所有腺相关病毒血清型8(AAV8)载体均由载体生物实验室(Vector Biolabs)合成。携带小鼠膜结合Il11ra1 cDNA(NCBI登录号：BC069984)、小鼠可溶性Il11ra1 cDNA和由白蛋白(Alb)启动子驱动的小鼠可溶性gp130 cDNA的AAV8载体分别称为AAV8-Alb-mbIl11ra1、AAV8-Alb-sIl111ra1和AAV8-Alb-sgp130。通过分别去除小鼠gp130序列(NCBI登录号：BC058679)和小鼠Il11ra1序列的跨膜和细胞质区域，构建了AAV8-Alb-sgp130和AAV8-Alb-sIl111ra1。AAV8-Null载体被用作载体对照。为了特异性删除表达白蛋白的细胞中的Il11ra1，将AAV8-Alb-iCre载体注射到LoxP侧接Il11ra1等位基因(Il11ra1loxP/loxP小鼠)的纯合子小鼠中。
5.5.2 抗体
白蛋白(ab207327，艾博抗)、Alexa Fluor 488二抗(ab150077，艾博抗)、裂解半胱天冬酶-3(9664，CST)、半胱天冬酶3(9662，CST)、p-ERK1/2(4370，CST)、ERK1/2(4695，CST)、GAPDH(2118，CST)、gp130(PA5-28932，赛默飞世尔)、IL6(AF506，研发系统)、IL6R(流式细胞术，ab222101，艾博抗)、IL6R(用于免疫荧光染色，MA1-80456，赛默飞世尔)、IL11(Aldevron)、IL11RA(流式细胞术和免疫荧光染色，ab125015，艾博抗)、IL11RA(蛋白质印迹，130920，圣克鲁斯)，p-JNK(4668，CST)，JNK(9258，CST)，p-STAT3(4113，CST)，STAT3(4904，CST)，小鼠HRP(7076，CST)，兔HRP(7074，CST)，大鼠HRP(31470，圣克鲁斯)。
5.5.3 重组蛋白
市售重组蛋白：人hyperIL6(IL6R：IL6融合蛋白，8954-SR，R&D系统)，人类可溶性gp130 Fc(671-GP-100，R&D系统)，人IL11RA(8895-MR-050，R&D系统)。定制重组蛋白：人IL11(UniProtKB：P20809，Genscript)。模仿反式信号传导复合物的人hyperIL11(IL11RA：IL11融合蛋白)是使用IL11RA片段(氨基酸残基1-317；UniProtKB：Q14626)和IL11(氨基酸残基22-199，UniProtKB：P20809)与一个20个氨基酸的接头(SEQ ID NO：20)构建的(Schafer等人，2017)。
5.5.4 化学品
棕榈酸酯(P5585，西格玛)，多聚甲醛(PFA，28908；赛默飞世尔)，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA，P1585，西格玛)，Triton X-100(T8787，西格玛)和4',6-二氨基-2-苯基吲哚(D1306；赛默飞世尔)。
5.5.5 原代人肝细胞培养
将原代人肝细胞(5200，研究实验室)维持在37℃和5％CO2下的补充有2％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的肝细胞培养基(520，ScienCell)中。肝细胞(P2-P3)如所述的那样在用不同剂量的各种重组蛋白刺激24小时之前血清饥饿过夜，除非另有规定。
5.5.6 THP-1培养
THP-1(ATCC)在补充有10％FBS和0.05mMβ巯基乙醇的RPMI 1640(A1049101，赛默飞世尔)中培养。将THP-1细胞用10ng/ml PMA在RPMI 1640中分化48小时。
5.5.7 棕榈酸酯(饱和脂肪酸)体外处理
如前所述以6:1的比例制备棕榈酸酯:BSA偶联溶液(Alsabeeh等人，2018)。如图例中描述的，使用在脂肪酸游离BSA中偶联的棕榈酸酯(0.5mM)处理细胞；使用0.5％BSA溶液作为对照。
5.5.8 流式细胞术
对于表面的IL11RA，IL6R和gp130分析，用IL11RA，IL6R或gp130抗体和相应的Alexa Fluor 488二抗对原代人肝细胞和THP-1细胞进行染色。通过用膜联蛋白VFITC和PI(V13242，赛默飞世尔)的死细胞凋亡试剂盒对原代人肝细胞染色，进行细胞死亡分析。然后用流式细胞仪(Fortessa，BD生物科技)定量PI+ve细胞，并使用FlowJo版本X软件(TreeStar)进行分析。
5.5.9 免疫荧光
在染色前24小时将原代人肝细胞接种在8孔室载玻片(1.5X104细胞/孔)上。将细胞在4％PFA中固定20分钟，用PBS洗涤，在PBS中用5％BSA阻断非特异性位点2小时。将细胞与IL11RA、IL6R、gp130或白蛋白抗体一起孵育过夜(4℃)，然后用合适的Alexa Fluor 488二抗孵育1小时。在黑暗中干燥腔室载玻片，并在用荧光显微镜(徕卡)成像之前将5滴带有DAPI的固定(mounting)介质加入载玻片15分钟。
5.5.10 油红O染色
将原代人肝细胞接种在8孔室载玻片(1X104细胞/孔)上。经过24小时的棕榈酸酯处理后，将细胞固定在10％PFA中30分钟，用蒸馏水洗涤，并与60％(v/v)异丙醇孵育5分钟。然后用油红O溶液染色细胞30分钟，并在用明场显微镜(BX53，奥林巴斯)成像之前用蒸馏水洗涤。脂滴通过其红色染色来识别。
5.5.11 活性氧类(ROS)检测
将原代人肝细胞接种在8孔室载玻片(1X104细胞/孔)上。对于本实验，细胞在棕榈酸酯处理之前未经过血清饥饿。根据制造商的协议，棕榈酸酯刺激后24小时，洗涤细胞，用25μM DCFDA溶液(ab113851，艾博抗)在黑暗中在37℃下孵育45分钟，并用稀释缓冲液冲洗。使用荧光显微镜(徕卡)用适合荧光素(FITC)的滤光片对具有阳性DCF染色的活细胞进行成像。
5.5.12 动物模型
动物实验是在新加坡保健机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指导下进行的。将小鼠饲养在SPF环境中，并不限量提供食物和水。
代谢性肝病小鼠模型
HFMCD
对6-8周龄的C57BL/6N，Il11ra1-/-小鼠和Il11ra1loxP/loxP及其各自的对照组喂食蛋氨酸和胆碱缺乏饮食，补充60千卡％脂肪(HFMCD，A06071301B16，研究饮食)4周。对照小鼠接受正常饮食(NC，特殊饲料)。
WDF
对6-8周龄的C57BL/6N，Il11ra1-/-小鼠和Il11ra1loxP/loxP及其各自的对照组喂养西式饮食(D12079B，研究饮食)，并在饮用水中补充15％体重/体积的果糖(WDF)16周。对照小鼠接受NC和自来水。
删除Il11ra1的小鼠(KO)
将6-8周龄雄性Il11ra1-/-小鼠(B6.129S1-Il11ratm1Wehi/J,Jackson实验室)分别静脉注射4x 1011个AAV8-Alb-mbIl11ra1或AAV8-Alb-sIl11ra1病毒的基因组拷贝(gc)，诱导小鼠Il11ra1或可溶性Il11ra1的肝细胞特异性表达。作为对照，Il11ra1-/-小鼠及其野生型幼崽(Il11ra1+/+)静脉注射4x 1011gc AAV8-Alb-Null病毒。病毒注射后3周，用HFMCD，WDF或NC喂养小鼠。描述了饮食的持续时间。
体内施用可溶性gp130
将6-8周龄雄性C57BL/6N小鼠(InVivos)注射4×1011gc AAV8-Alb-sgp130病毒以诱导可溶性gp130的肝细胞特异性表达；对照小鼠注射4×1011gc AAV8-Alb-Null病毒。在病毒施用后3周，小鼠用HFMCD，WDF或NC喂养所描述的持续时间。
Il11ra絮凝(Il11ra-floxed)小鼠(CKO)
Il11ra絮凝小鼠是使用先前描述的CRISPR/Cas9系统创建的(Ng等人)，其Il11ra1基因的外显子4至7侧接有loxP位点。为了诱导肝细胞中Il11ra1的特异性缺失，将6-8周龄雄性纯合Il11ra1-floxed小鼠静脉注射AAV8-Alb-Cre病毒(4x1011gc)；将类似量的AAV8-Alb-Null病毒注射到纯合Il11ra1-floxed小鼠中作为对照。AAV8注射的小鼠在HFMCD，WDF或NC喂养之前恢复三周。使用肝脏IL11RA的蛋白质印迹测定敲低效率。
5.5.13 核糖核酸测序和核糖体分析
RNA-seq和Ribo-Seq文库制备如前所述(Chothani等人，2019)。
RNA-seq文库生成
使用RNeasy柱(凯杰)从人肝细胞中提取总RNA。使用Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒(生命科技公司)对RNA进行定量，并使用LabChip GX RNA测定试剂盒(珀金埃尔默公司)根据其RNA完整性数字评估其质量。按照制造商的标准说明使用TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒(依诺米那)测量转录本丰度。
Ribo-seq文库生成
在10cm培养皿中将肝细胞生长至90％汇合，并在1mL冷裂解缓冲液(配方如
Figure BDA0003455680330001191
Profile哺乳动物试剂盒，RPHMR12126，依诺米那)中裂解，并补充0.1mg/mL环己酰亚胺。然后根据制造商的说明使用Truseq核酸酶(依诺米那)对均质化和清除的裂解物进行足印。使用Illustra Sephacryl S400柱(GE保健公司)纯化核糖体，并用标准苯酚:氯仿:异戊醇技术提取受保护的RNA片段。在去除核糖体RNA(哺乳动物RiboZero磁金，依诺米那)之后，按照制造商的协议使用
Figure BDA0003455680330001192
Profile哺乳动物试剂盒根据足印的RNA制备测序文库。根据制造商的协议，
使用StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统)上的KAPA文库定量试剂盒(KAPA生物系统)对最终的RNA-seq和核糖体分析文库进行定量。使用LabChip GX DNA高灵敏度试剂盒(珀金埃尔默)测定最终文库的质量和平均片段大小。使用NextSeq 500高输出v2试剂盒和配对端75-bp测序化学，在NextSeq 500台式测序仪(依诺米那)上汇集和测序具有独特索引的文库。
用于RNA测序和核糖体分析的数据处理和分析
使用bcl2fastq V2.19.0.316解复用原始测序数据，并使用Trimomatic(Bolger等人，2014)V0.36修剪适配器，保留超过20nt的读取时间。使用bowtie(Langmead等人，2009)将Ribo-seq读数与已知的mtRNA，rRNA和tRNA序列(RNACentral(RNA中心财团，2017)，5.0版)对齐，仅未对齐的读数被保留为核糖体保护片段(RPF)。使用STAR(Dobin等人，2012)进行与人类基因组(hg38)的对齐。使用具有特征计数的唯一映射读取(Ensembl数据库发布GRCh38 v86)在Ribo-seq的CDS(编码序列)区域和RNA-seq的外显子区域对基因表达进行定量(Liao等人，2014)。计算TPM并使用箱线图将其可视化，以比较IL11RA(ENSG00000137070)，IL6R(ENSG00000160712)和gp130(ENSG00000134352)的基线表达。使用Gviz R包(Hahne和Ivanik，2016)和链特异性比对文件，将应用Ribo-seq和RNA-seq读取IL11RA、IL6R和gp130的读取覆盖率可视化。
5.5.14 比色法
使用ALT活性测定试剂盒(ab105134，艾博抗)测量细胞培养物和小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。使用谷胱甘肽比色检测试剂盒(EIAGSHC，赛默飞世尔)测量肝谷胱甘肽(GSH)水平。使用Quickzyme总胶原蛋白测定试剂盒(QZBtotco15，Quickzyme生物科学)测量小鼠肝脏中的总羟脯氨酸含量。使用甘油三酯测定试剂盒(ab65336，艾博抗)测量血清和肝脏甘油三酯的水平。使用AST测定试剂盒(ab105135，艾博抗)和胆固醇测定试剂盒(ab65390；艾博抗)，分别测定小鼠血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)和胆固醇水平。所有比色测定均根据制造商的协议进行。
5.5.15 酶联免疫吸附测定(ELISA)
根据制造商的协议，使用小鼠gp130 DuoSet ELISA(DY468，R&D系统)定量小鼠血清中gp130的水平。
5.5.16 RT-qPCR
使用Trizol(英杰公司)和RNeasy迷你试剂盒(凯杰)从快速冷冻的肝脏组织中提取总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(伯乐)进行PCR扩增。使用StepOnePlus(应用生物系统)在40个循环内通过TaqMan(应用生物系统)或SYBR绿色(Qiagen)技术对基因表达进行同样的分析。将表达数据标准化为GAPDH mRNA表达，并使用2-ΔΔCt方法计算倍数变化。可根据要求提供特详细的TaqMan探针和SYBR绿色引物的序列。
5.5.17 免疫印迹
对肝细胞和肝组织的总蛋白提取物进行免疫印迹。在RIPA裂解液和含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏)的提取缓冲液(89901，赛默科技)中匀浆肝细胞和肝组织裂解物。蛋白质裂解物通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。使用ECL检测系统(Pierce)和适当的二抗(抗兔HRP或抗小鼠HRP)可视化蛋白质条带。
5.5.18 肝脏组织处理和组织学分析
将肝脏样品固定在10％中性福尔马林中，石蜡处理，切成5μm切片，根据标准方案用苏木精和曙红(H&E)染色，并通过光学显微镜检查。
5.5.19 统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism软件(6.07版)进行。
根据Dunnett(当几个实验组与一个条件进行比较时)，Tukey(当在一个实验中将多个条件相互比较时)，Sidak(当来自2个不同基因型的多个条件相互比较时)，对P值进行多次测试进行校正。
通过双因素方差分析对两个不同组的比较进行两个参数的分析。
统计显著性标准设定为P<0.05。
5.6实施例5参考文献
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实施例6：分析胰腺炎中的纤维炎症机制
慢性胰腺炎是一种病因多样的纤维炎症综合征，可导致胰腺外分泌和内分泌功能不全。
胰腺星状细胞(PSC)以两种状态存在，是胰腺损伤中主要的纤维化细胞类型。PSC是体内广泛的维甲酸储存细胞网络的一部分，包括肝实质(HSC)细胞。IL-11最近被证明在HSC转化中起着关键作用，HSC转化是NASH的一种决定性病理(Widjaja等人，胃肠病学(Gastroenterology)(2019)157(3):777–792)。
对小家鼠胰腺组织的单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析(来自Tabula muris联合会(Tabula muris Consortium)数据–Schaum等人，自然(Nature)(2018)562:367–372)显示，PSC(和导管细胞)显示出Il11ra1的高表达，但不显示Il6ra-见图47A。通过对人PSC的免疫荧光分析，在蛋白质水平上证实了这一结果(图47B)。
在体外，无论PSC激活的刺激因素(即TGFβ1、IL-11、bFGF、CTGF、PDGF或ET-1)如何，PSC的激活可由IL-11的处理触发，并可被拮抗IL-11介导信号传导的抗IL-11RA抗体拮抗剂处理抑制-见图48A和48B。
具有可诱导的成纤维细胞特异性IL-11表达的转基因小鼠发生胰腺纤维化-见图49A至49C。
在胰腺损伤的胰管结扎(PDL)模型中，使用拮抗IL-11介导信号传导的抗IL-11RA抗体拮抗剂治疗可减少胰腺纤维化，并抑制与PDL相关的胰腺组织减少-见图50A至50C。
序列表
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新加坡国立大学 (所有国家)
R·克莱格 I (仅针对莱索托)
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Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro
1 5 10 15
Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser
20 25 30
Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser
35 40 45
Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe
50 55 60
Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met
65 70 75 80
Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg
85 90 95
Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg
100 105 110
Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr
115 120 125
Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met
130 135 140
Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro
145 150 155 160
Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala
165 170 175
Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu
180 185 190
Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu
195
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Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu
1 5 10 15
Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser
20 25 30
Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys
35 40 45
Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr
50 55 60
Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr
65 70 75 80
Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser
85 90 95
Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu
100 105 110
Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys
115 120 125
Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys
130 135 140
Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu
145 150 155 160
Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg
165 170 175
Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val
180 185 190
Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr
195 200 205
Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro
210 215 220
Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu
225 230 235 240
Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys
245 250 255
Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile
260 265 270
Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp
275 280 285
Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu
290 295 300
Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile
325 330 335
Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val
355 360 365
Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala
370 375 380
Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu
385 390 395 400
Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile
405 410 415
Pro Ala Cys Asp Phe Gln Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala
420 425 430
Phe Pro Lys Asp Asn Met Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu
435 440 445
Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala
450 455 460
Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr
465 470 475 480
Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val
485 490 495
Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala
500 505 510
Tyr Leu Lys Gln Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys
515 520 525
Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val
530 535 540
Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr
545 550 555 560
Ile Ile Gly Asn Glu Thr Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu
565 570 575
Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met
580 585 590
Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe
595 600 605
Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Val Pro
610 615 620
Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu Phe Cys
625 630 635 640
Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro
645 650 655
Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro
660 665 670
Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe
675 680 685
Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe
690 695 700
Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn
705 710 715 720
Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser
725 730 735
Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn
740 745 750
Thr Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg
755 760 765
His Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser Thr Gln
770 775 780
Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu Val Asp
785 790 795 800
His Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr Phe Lys
805 810 815
Gln Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His Phe Glu
820 825 830
Arg Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val Arg Leu
835 840 845
Lys Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser Gly Gln
850 855 860
Met Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly Pro Gly
865 870 875 880
Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu Ala Ala
885 890 895
Thr Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val Arg Gln
900 905 910
Gly Gly Tyr Met Pro Gln
915
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<400> 3
Met Ser Ser Ser Cys Ser Gly Leu Ser Arg Val Leu Val Ala Val Ala
1 5 10 15
Thr Ala Leu Val Ser Ala Ser Ser Pro Cys Pro Gln Ala Trp Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Val Gln Tyr Gly Gln Pro Gly Arg Ser Val Lys Leu Cys Cys
35 40 45
Pro Gly Val Thr Ala Gly Asp Pro Val Ser Trp Phe Arg Asp Gly Glu
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Gln Gly Pro Asp Ser Gly Leu Gly His Glu Leu Val
65 70 75 80
Leu Ala Gln Ala Asp Ser Thr Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Cys Gln Thr
85 90 95
Leu Asp Gly Ala Leu Gly Gly Thr Val Thr Leu Gln Leu Gly Tyr Pro
100 105 110
Pro Ala Arg Pro Val Val Ser Cys Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Asn Phe
115 120 125
Ser Cys Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ile Ser Gly Leu Pro Thr Arg Tyr
130 135 140
Leu Thr Ser Tyr Arg Lys Lys Thr Val Leu Gly Ala Asp Ser Gln Arg
145 150 155 160
Arg Ser Pro Ser Thr Gly Pro Trp Pro Cys Pro Gln Asp Pro Leu Gly
165 170 175
Ala Ala Arg Cys Val Val His Gly Ala Glu Phe Trp Ser Gln Tyr Arg
180 185 190
Ile Asn Val Thr Glu Val Asn Pro Leu Gly Ala Ser Thr Arg Leu Leu
195 200 205
Asp Val Ser Leu Gln Ser Ile Leu Arg Pro Asp Pro Pro Gln Gly Leu
210 215 220
Arg Val Glu Ser Val Pro Gly Tyr Pro Arg Arg Leu Arg Ala Ser Trp
225 230 235 240
Thr Tyr Pro Ala Ser Trp Pro Cys Gln Pro His Phe Leu Leu Lys Phe
245 250 255
Arg Leu Gln Tyr Arg Pro Ala Gln His Pro Ala Trp Ser Thr Val Glu
260 265 270
Pro Ala Gly Leu Glu Glu Val Ile Thr Asp Ala Val Ala Gly Leu Pro
275 280 285
His Ala Val Arg Val Ser Ala Arg Asp Phe Leu Asp Ala Gly Thr Trp
290 295 300
Ser Thr Trp Ser Pro Glu Ala Trp Gly Thr Pro Ser Thr Gly Thr Ile
305 310 315 320
Pro Lys Glu Ile Pro Ala Trp Gly Gln Leu His Thr Gln Pro Glu Val
325 330 335
Glu Pro Gln Val Asp Ser Pro Ala Pro Pro Arg Pro Ser Leu Gln Pro
340 345 350
His Pro Arg Leu Leu Asp His Arg Asp Ser Val Glu Gln Val Ala Val
355 360 365
Leu Ala Ser Leu Gly Ile Leu Ser Phe Leu Gly Leu Val Ala Gly Ala
370 375 380
Leu Ala Leu Gly Leu Trp Leu Arg Leu Arg Arg Gly Gly Lys Asp Gly
385 390 395 400
Ser Pro Lys Pro Gly Phe Leu Ala Ser Val Ile Pro Val Asp Arg Arg
405 410 415
Pro Gly Ala Pro Asn Leu
420
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA靶标IL-11
<400> 4
ccttccaaag ccagatctt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA靶标IL-11
<400> 5
gcctgggcag gaacatata 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA靶标IL-11
<400> 6
cctgggcagg aacatatat 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA靶标IL-11
<400> 7
ggttcattat ggctgtgtt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA靶标IL-11Ralpha
<400> 8
ggaccatacc aaaggagat 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA靶标IL-11Ralpha
<400> 9
gcgtctttgg gaatccttt 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA靶标IL-11Ralpha
<400> 10
gcaggacagt agatccct 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> siRNA靶标IL-11Ralpha
<400> 11
gctcaaggaa cgtgtgtaa 19
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-11的siRNA (NM_000641.3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n = 脱氧胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n = 脱氧胸苷
<400> 12
ccuuccaaag ccagaucuun naagaucugg cuuuggaagg nn 42
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-11的siRNA (NM_000641.3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n = 脱氧胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n = 脱氧胸苷
<400> 13
gccugggcag gaacauauan nuauauguuc cugcccaggc nn 42
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-11的siRNA (NM_000641.3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n = 脱氧胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n = 脱氧胸苷
<400> 14
ccugggcagg aacauauaun nauauauguu ccugcccagg nn 42
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-11的siRNA (NM_000641.3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n = 脱氧胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n = 脱氧胸苷
<400> 15
gguucauuau ggcuguguun naacacagcc auaaugaacc nn 42
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-11Ralpha的siRNA (U32324.1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n = 脱氧胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n = 脱氧胸苷
<400> 16
ggaccauacc aaaggagaun naucuccuuu gguauggucc nn 42
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-11Ralpha的siRNA (U32324.1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n = 脱氧胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n = 脱氧胸苷
<400> 17
gcgucuuugg gaauccuuun naaaggauuc ccaaagacgc nn 42
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-11Ralpha的siRNA (U32324.1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n = 脱氧胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n = 脱氧胸苷
<400> 18
gcaggacagu agaucccuan nuagggaucu acuguccugc nn 42
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-11Ralpha的siRNA (U32324.1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n = 脱氧胸苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n = 脱氧胸苷
<400> 19
gcucaaggaa cguguguaan nuuacacacg uuccuugagc nn 42
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 20氨基酸的接头
<400> 20
Gly Pro Ala Gly Gln Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Val
20
<210> 21
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 超IL-11 (IL-11RA:IL-11融合蛋白)
<400> 21
Met Ser Ser Ser Cys Ser Gly Leu Ser Arg Val Leu Val Ala Val Ala
1 5 10 15
Thr Ala Leu Val Ser Ala Ser Ser Pro Cys Pro Gln Ala Trp Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Val Gln Tyr Gly Gln Pro Gly Arg Ser Val Lys Leu Cys Cys
35 40 45
Pro Gly Val Thr Ala Gly Asp Pro Val Ser Trp Phe Arg Asp Gly Glu
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Gln Gly Pro Asp Ser Gly Leu Gly His Glu Leu Val
65 70 75 80
Leu Ala Gln Ala Asp Ser Thr Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Cys Gln Thr
85 90 95
Leu Asp Gly Ala Leu Gly Gly Thr Val Thr Leu Gln Leu Gly Tyr Pro
100 105 110
Pro Ala Arg Pro Val Val Ser Cys Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Asn Phe
115 120 125
Ser Cys Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ile Ser Gly Leu Pro Thr Arg Tyr
130 135 140
Leu Thr Ser Tyr Arg Lys Lys Thr Val Leu Gly Ala Asp Ser Gln Arg
145 150 155 160
Arg Ser Pro Ser Thr Gly Pro Trp Pro Cys Pro Gln Asp Pro Leu Gly
165 170 175
Ala Ala Arg Cys Val Val His Gly Ala Glu Phe Trp Ser Gln Tyr Arg
180 185 190
Ile Asn Val Thr Glu Val Asn Pro Leu Gly Ala Ser Thr Arg Leu Leu
195 200 205
Asp Val Ser Leu Gln Ser Ile Leu Arg Pro Asp Pro Pro Gln Gly Leu
210 215 220
Arg Val Glu Ser Val Pro Gly Tyr Pro Arg Arg Leu Arg Ala Ser Trp
225 230 235 240
Thr Tyr Pro Ala Ser Trp Pro Cys Gln Pro His Phe Leu Leu Lys Phe
245 250 255
Arg Leu Gln Tyr Arg Pro Ala Gln His Pro Ala Trp Ser Thr Val Glu
260 265 270
Pro Ala Gly Leu Glu Glu Val Ile Thr Asp Ala Val Ala Gly Leu Pro
275 280 285
His Ala Val Arg Val Ser Ala Arg Asp Phe Leu Asp Ala Gly Thr Trp
290 295 300
Ser Thr Trp Ser Pro Glu Ala Trp Gly Thr Pro Ser Thr Gly Pro Ala
305 310 315 320
Gly Gln Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
325 330 335
Ser Val Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro
340 345 350
Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala
355 360 365
Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp
370 375 380
Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly
385 390 395 400
Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala
405 410 415
Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly
420 425 430
Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala
435 440 445
Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu
450 455 460
Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro
465 470 475 480
Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly
485 490 495
Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu
500 505 510
Lys Thr Arg Leu
515
<210> 22
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx203 VH
<400> 22
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Pro Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Leu Gly His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx203 VL
<400> 23
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx209 VH
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Val Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx209 VL
<400> 25
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Phe Ser Ser Leu Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A VH
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ile Gly Ala Thr Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A VL
<400> 27
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Phe Asp Val Asn Glu Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Arg
85 90 95
Tyr Thr Trp Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 28
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A hIgG4 (L248E, S241P) HC
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ile Gly Ala Thr Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 29
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A lambda LC
<400> 29
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Phe Asp Val Asn Glu Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Arg
85 90 95
Tyr Thr Trp Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hEnx203 VH
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Pro Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Leu Gly His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hEnx203 VL
<400> 31
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Glu Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hEnx209 VH
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hEnx209 VL
<400> 33
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A VH CDR1
<400> 34
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A VH CDR2
<400> 35
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A VH CDR3
<400> 36
Ile Gly Ala Thr Asp Pro Leu Asp Tyr
1 5
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A VL CDR1
<400> 37
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A VL CDR2
<400> 38
Asp Val Asn Glu Arg Ser Ser
1 5
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx108A VL CDR3
<400> 39
Ala Ser Tyr Ala Gly Arg Tyr Thr Trp Met
1 5 10
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx203, hEnx203 VH CDR1
<400> 40
Asp Tyr Asn Met Asp
1 5
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx203, hEnx203 VH CDR2
<400> 41
Asp Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Pro Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx203, hEnx203 VH CDR3
<400> 42
Gly Glu Leu Gly His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx203, hEnx203 VL CDR1
<400> 43
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Ile His
1 5 10 15
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx203, hEnx203 VL CDR2
<400> 44
Leu Ala Ser Asn Leu Asp Ser
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx203, hEnx203 VL CDR3
<400> 45
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx209, hEnx209 VH CDR1
<400> 46
Asn Tyr Trp Met His
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx209, hEnx209 VH CDR2
<400> 47
Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx209, hEnx209 VH CDR3
<400> 48
Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx209, hEnx209 VL CDR1
<400> 49
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx209, hEnx209 VL CDR2
<400> 50
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Enx209, hEnx209 VL CDR3
<400> 51
Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 52
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) IGHG1恒定 (K214R, D356E, L358M)
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 53
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) IGHG4恒定 (L248E, S241P)
<400> 53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) IGKC恒定
<400> 54
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 55
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens) IGLC2恒定区
<400> 55
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 56
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hEnx203 hIgG1 HC
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro His Asn Gly Gly Pro Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Leu Gly His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 57
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hEnx203 kappa LC
<400> 57
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Glu Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 58
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hEnx209 hIgG4 (L248E, S241P) HC
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 59
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hEnx209 kappa LC
<400> 59
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (25)

1.一种能够抑制白介素11(IL-11)介导的信号传导的试剂，用于治疗或预防代谢性疾病的方法。
2.能够抑制白介素11(IL-11)介导的信号传导的试剂在制备用于治疗或预防代谢性疾病的方法的药物中的用途。
3.一种治疗或预防代谢性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的能够抑制白介素11(IL-11)介导的信号传导的试剂。
4.如权利要求1所述使用的试剂，权利要求2所述的用途，或权利要求3所述的方法，其特征在于，所述代谢性疾病为，或包括：肥胖、2型糖尿病(T2D)、1型糖尿病(T1D)、糖尿病前期、超重、代谢综合征、妊娠相关高血糖症、胆汁淤积性肝病、高血糖症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、消瘦、恶病质、化疗相关的体重减轻、胰腺功能不全、胰腺炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、脂肪变性、脂毒性、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪营养不良、脂肪增生、脂肪萎缩、胰岛素抵抗或高血糖素血症。
5.如权利要求1或权利要求4所述使用的试剂，权利要求2或权利要求4所述的用途，或权利要求3或权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试剂为能够防止或减少白介素11(IL-11)与白介素11受体(IL-11R)结合的试剂。
6.如权利要求1、4或5中任一项所述使用的试剂，权利要求2、4或5中任一项所述的用途，或权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述试剂能够结合白介素11(IL-11)或白介素11受体(IL-11R)。
7.如权利要求1或4-6中任一项所述使用的试剂，权利要求2或4-6中任一项所述的用途，或权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述试剂选自下组：抗体或其抗原结合片段、多肽、肽、核酸、寡核苷酸、适体或小分子。
8.如权利要求6或7所述使用的试剂，所述的用途或所述的方法，其特征在于，所述试剂为抗体或其抗原结合片段。
9.如权利要求8所述使用的试剂，所述的用途或所述的方法，其特征在于，所述试剂为IL-11介导的信号传导的抗IL-11抗体拮抗剂或其抗原结合片段。
10.如权利要求8所述使用的试剂，所述的用途或所述的方法，其特征在于，所述试剂为IL-11介导的信号传导的抗IL-11Rα抗体拮抗剂或其抗原结合片段。
11.如权利要求6或权利要求7所述使用的试剂，所述的用途或所述的方法，其特征在于，所述试剂为诱捕受体。
12.如权利要求11所述使用的试剂，所述的用途或所述的方法，其特征在于，所述试剂为IL-11的诱捕受体。
13.如权利要求12所述使用的试剂，所述的用途或所述的方法，其特征在于，IL-11的诱捕受体包括：(i)对应于gp130的细胞因子结合模块的氨基酸序列，和(ii)对应于IL-11Rα的细胞因子结合模块的氨基酸序列。
14.如权利要求6或权利要求7所述使用的试剂，所述的用途或所述的方法，其特征在于，所述试剂为IL-11突变蛋白。
15.如权利要求14所述使用的试剂，所述的用途或所述的方法，其特征在于，所述IL-11突变蛋白为W147A。
16.如权利要求1或权利要求4所述使用的试剂，权利要求2或权利要求4所述的用途，或权利要求3或权利要求4所述的方法，其特征在于，所述试剂能够阻止或降低白介素11(IL-11)或白介素11受体(IL-11R)的表达。
17.如权利要求16所述使用的试剂，所述的用途，或所述的方法，其特征在于，所述试剂为寡核苷酸或小分子。
18.如权利要求17所述使用的试剂，所述的用途，或所述的方法，其特征在于，所述试剂为能够阻止或降低IL-11表达的反义寡核苷酸。
19.如权利要求18所述使用的试剂，所述的用途，或所述的方法，其特征在于，能够阻止或降低IL-11表达的反义寡核苷酸为靶向IL11的siRNA，所述siRNA包含SEQ ID NO:12、13、14或15的序列。
20.如权利要求17所述使用的试剂，所述的用途，或所述的方法，其特征在于，所述试剂为能够阻止或降低IL-11Rα表达的反义寡核苷酸。
21.如权利要求20所述使用的试剂，所述的用途，或所述的方法，其特征在于，能够阻止或降低IL-11Rα表达的反义寡核苷酸为靶向IL11RA的siRNA，所述siRNA包含SEQ ID NO:16、17、18或19的序列。
22.如权利要求5-21中任一项所述使用的试剂，所述的用途，或所述的方法，其特征在于，白介素11受体为IL-11Rα或包含IL-11Rα。
23.如权利要求1或4-22中任一项所述使用的试剂，权利要求2或4-22中任一项所述的用途，或权利要求3-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用所述试剂，所述受试者其体内白介素11(IL-11)或IL-11受体(IL-11R)的表达上调。
24.如权利要求1或4-23中任一项所述使用的试剂，权利要求2或4-23中任一项所述的用途，或权利要求3-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用所述试剂，所述受试者其体内白介素11(IL-11)或IL-11受体(IL-11R)的表达已被确定上调。
25.如权利要求1或4-24中任一项所述使用的试剂，权利要求2或4-24中任一项所述的用途，或权利要求3-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括确定受试者体内白介素11(IL-11)或IL-11受体(IL-11R)的表达是否上调，并向体内白介素11(IL-11)或IL-11受体(IL-11R)表达上调的受试者施用所述试剂。
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