CN114349841B - 一种调控卵泡膜表面ovr基因表达活性的转录因子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控卵泡膜表面OVR基因表达活性的转录因子及其应用，所述转录因子为C/EBPα，用于促进禽类卵巢卵泡OVR基因表达。本发明以卵泡膜表面卵黄前体物受体(OVR)基因启动子区转录因子结合位点为研究对象，通过预测启动子区转录因子结合位点、过表达和敲低以及脂质转运验证启动子区转录因子，最后筛选出调控OVR表达的转录因子，并能促进OVR基因表达。本发明通过探究OVR表达调控的转录因子，以及转录因子应用于OVR高效表达，促进卵泡快速发育，对研究OVR基因启动子区转录调控因子参与卵泡发育促进产蛋等的分子机制具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及一种调控卵泡膜表面OVR基因表达活性的转录因子及其应用。
背景技术
产蛋量作为繁殖性状之一受卵泡发育成熟和排卵影响。卵泡发育成熟卵黄前体物合成与转运调节至关重要。卵黄前体物主要包括极低密度脂蛋白(VLDLy)和卵黄生成素(VTG)。卵黄前体物可通过母禽分泌雌激素刺激肝脏合成释放进入血液循环，转运至卵泡。卵泡快速发育阶段，VLDLy和VTG等营养物质通过卵泡膜表面血管进入卵泡膜颗粒细胞层，与颗粒细胞表面卵黄生成受体(Oocyte vitellogenesis receptor,OVR)结合后，细胞膜内陷封闭形成有被小泡，将其运输到生长中的卵母细胞。随后配体-受体复合物分离，受体重新回到卵母细胞表面继续下一轮转运。分离后的VLDLy在溶菌酶的作用下降解，供卵母细胞吸收形成卵黄内物质。可见，卵黄发育主要取决于VLDLy进入卵母细胞的数量，即颗粒细胞层表面受体OVR/VLDLR表达量决定了卵黄内物质含量和卵泡发育速度。
产蛋初期受激素水平影响，母禽卵巢胆固醇和脂质合成相关基因CETP、SREBP和Apo-VLDL2等表达产生变化，但卵泡膜颗粒细胞表面卵黄受体OVR基因表达不受激素调控。卵母细胞卵黄生成受体(OVR/VLDLR)是卵黄前体物进入卵母细胞的特异性受体，是蛋禽繁殖活动中调节卵母细胞正常发育的关键基因，可特异性转运卵黄等主要脂类物质和非脂类蛋白物质等，其基因多态可能影响卵黄内物质含量。利用OVR/VLDLR基因点突变培育了来航鸡限制性产蛋品系，并证实OVR/VLDLR基因突变导致受体与VLDLy及VTG结合效率下降，卵黄发育受阻。
产蛋量作为重要的经济性状，在我国地方品种禽类表现的差异较大，同一品种内不同个体间产蛋整齐性差，严重影响了地方品种家禽的产业化发展。如何有效调控地方品种家禽的产蛋量成为当前的研究热点。从以上分析可以看出，OVR在卵泡膜中的表达量影响到卵泡发育速度。因此，可通过调控OVR表达量的方法促进卵泡发育和产蛋。
基于上述内容，提出一种调控卵泡膜表面OVR基因表达活性的转录因子及其应用。
发明内容
本发明的提供了一种调控卵泡膜表面OVR基因表达活性的转录因子及其应用，解决背景技术中出现的问题。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种调控卵泡膜表面OVR基因表达活性的转录因子，所述转录因子为C/EBPα，用于促进禽类卵巢卵泡OVR基因表达。
本发明还提供了一种上述转录因子在研究OVR基因启动子区转录调控因子参与卵泡发育促进产蛋的分子机制中的应用。
本发明还提供了一种上述转录因子在协同OVR基因转运脂质进入细胞中的应用。
本发明还提供了一种调控卵泡膜表面OVR基因表达活性的方法，构建C/EBPα过表达或敲低载体，导入禽类卵泡膜颗粒细胞中，用以促进或降低禽类卵泡膜表面OVR基因表达活性。
进一步改进在于，所述禽类卵泡膜颗粒细胞为野生型鹅卵泡膜颗粒细胞或导入有OVR表达载体的鹅卵泡膜颗粒细胞。
进一步改进在于，所述鹅卵泡膜颗粒细胞为鹅小黄卵泡细胞。
本发明还提供了一种脂质转运系统，所述系统为包含上述转录因子的过表达载体和OVR基因的禽类卵泡膜颗粒细胞。
本发明的有益效果在于：本发明通过探究OVR表达调控的转录因子，以及转录因子应用于OVR高效表达，促进卵泡快速发育，对研究OVR基因启动子区转录调控因子参与卵泡发育促进产蛋等的分子机制具有很好的应用价值。
附图说明
图1为免疫组化分析OVR在鹅各级卵泡中的表达定位；1：卵巢组织HE染色；2：卵巢组织OVR抗体标记；3：小白卵泡OVR抗体标记；4：大白卵泡OVR抗体标记；5：小黄卵泡OVR抗体标记；6：F5卵泡OVR抗体标记；7：F4卵泡OVR抗体标记；8：F3卵泡OVR抗体标记；9：F2卵泡OVR抗体标记；10：F1卵泡OVR抗体标记；黑色箭头为标记的OVR，白色箭头为OVR胞吞卵黄物质；B为OVR在各级卵泡中的表达量。
图2为OVR表达调控区转录因子预测示意图；
图3为OVR及预测转录因子在鹅各级卵泡中的表达量分析示意图；
图4为过表达载体转染效果及对OVR表达量的影响示意图；
图5为C/EBPα、MF3和OVR在DF-1细胞过表达对血清脂质转运的影响，A为空白对照；B为转染空质粒的阴性对照；C为转染过表达OE-MF3质粒；D为转染过表达C/EBPα质粒；E为转染过表达OE-OVR质粒；F为共转染OE-MF3和OE-OVR质粒；G为共转染过表达C/EBPα和OE-OVR质粒；H为共转染OE-MF3和sh-3质粒；I为共转染OE-C/EBPα和sh-3质粒；J为各转染组DF-1细胞脂质转运比较。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1种鹅产蛋前后卵泡发育情况
选择产蛋前(163d)、产蛋早期(210d)、产蛋高峰期(291d)和产蛋末期(334d)的皖西白鹅母鹅(每个时间点6只鹅)，禁食12小时后，于上午10点从翅静脉采集非抗凝和抗凝血样。非抗凝血用于血清分离激素测定和血脂分离，抗凝血用于总DNA提取和OVR基因调控区序列扩增。
取12只产蛋高峰期种鹅，麻醉后屠宰用于组织取样，取出整个卵巢，并根据其直径将卵泡分为三级：初级卵泡(小于4mm)、发育中卵泡(5-30mm)和成熟卵泡(大于35mm)，其中6只鹅用于卵泡膜(仅包含卵泡膜和颗粒层)采集。收集的卵泡膜在液氮中快速冷冻后储存于-80℃用于RNA提取(每等级6个样品)。将卵巢和各等级卵泡置于4％多聚甲醛固定液固定后用于免疫组化分析。另6只鹅用于各等级卵泡颗粒层分离。分离出的卵泡层储存-80℃用于RNA提取。从小黄卵泡(SYF)中提取颗粒细胞(GCs)用于细胞培养。
种鹅产蛋前(5.70±0.53mIU/mL)和休产后(5.17±0.43mIU/mL)血清LH含量显著高于产蛋高峰期(2.39±0.57mIU/mL)。雌二醇在产蛋早期为588.27±106.61g/mL，显著高于其他时期，其中产蛋前(20.37±5.51pg/mL)和停止产蛋(7.18±1.54pg/mL)含量最低。FSH、PRL和P4的浓度在不同时期没有显著差异。
停产时OVR基因mRNA表达量为4.51，显著高于其他三个时期(P<0.05)。OVR在发育卵泡中的表达量为4.74，显著高于初级卵泡和成熟卵泡(P<0.01)。在产蛋前和休产期未收集到成熟卵泡。
2.2激素水平对卵泡发育的影响
为了确定激素水平对卵泡发育的影响，分析了不同卵泡水平下血液激素和OVR表达之间的相关性。成熟卵泡OVR表达与血清FSH水平显著相关(P<0.05)。然而，在初级卵泡和发育卵泡的OVR表达与血清FSH无显著相关性(P>0.05)。OVR的表达与血清LH、PRL、P4和E2在所有卵泡水平均无显著相关性(P>0.05)。说明OVR表达不受激素水平调控。
OVR特异性染色为浅棕色，在图1中由黑色箭头指示。如图1-2所示，在卵巢中观察到的生发卵泡充满OVR。如图1-3、1-4、1-5所示，OVR呈散在分布，并随着卵泡的发育而逐渐降低。卵黄被OVR包裹，在图1中用白色箭头表示，图1-6、1-7、1-8、1-9，内吞进入卵泡后在卵泡中释放。OVR在等级卵泡中的分布少于等级前卵泡。OVR的表达位于颗粒层外表面，并随卵泡发育而逐渐减少。
2.3构建过表达载体筛选调控OVR表达的转录因子
扩增获得鹅OVR调控区序列，并提交GenBank库(No.MK446725)，Promo软件在线预测转录因子，共预测到五种转录因子，分别为C/EBP alpha[T00107],MafG[T01437],MF3[T00507],Cdx-1[T01484]。
为了检测OVR在各等级前和等级卵泡中是否存在表达差异，试验检测了大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)和F3、F2和F1等级卵泡中OVR和相关转录因子的表达量。如图3A所示，在SYF和F3卵泡的OVR表达明显高于其他水平。如图3中B-D、F所示，CEBPα、MafG、MF3和NF-1的转录因子在SYF中的表达均高于其他卵泡水平，如图3E所示，CDX-1在SYF和LWF水平均高表达。因此，选择黄色小卵泡进行颗粒细胞培养。
2.3.1构建过表达载体或敲低载体验证启动子区结合的转录因子
如图4A、B所示，每个构建的过表达载体或敲低载体分别与OVR表达载体共转染鹅卵泡膜颗粒细胞。根据绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平，每个转染细胞显示出相似的高效转染效率。
通过qRT-PCR检测各转染组的OVR表达水平。如图4C所示，与WT组相比，OVR在OE-MAFG和OE-CDX1细胞中的表达较低，在OE-OVR、OE-CEBPα和OE-OVR-MF3细胞中的表达较高，在转染细胞中，OE-OVR-MF3细胞的表达最高。因此，认为CEBPα和MF3是OVR表达的潜在调节因子。如图4D所示，用CEBPα和MF3敲除载体转染颗粒细胞均显示OVR的显著低表达。
在敲除OVR载体(sh-1、sh-2、sh-3和h-4)转染的卵泡膜颗粒细胞中测定OVR表达水平。如图4D所示，与阴性对照(NC)相比，敲除载体中的OVR表达水平显著降低。
2.3.2脂质转运验证启动子区结合的转录因子
为了进一步研究哪种转录因子直接参与调控OVR表达，促进脂质转运，试验将OE-CEBPα和OE-MF3单独或与OE-OVR共转染DF-1细胞(图5A-I)。在体外细胞培养过程中，在培养基中加入鹅血清脂质，以监测脂质转运。结果表明，过表达的C/EBPα或OVR都可以增加脂质转运(图5D)。而当与OVR共转染时，C/EBPα的过表达可增强脂质转运的效果(图5G)。MF3过表达的细胞不能增加脂质转运(图5C)。结果表明，C/EBPα可有效增加OVR表达，进而帮助DF-1细胞的脂质转运(图5J)，是调控OVR基因表达的最佳转录因子。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种转录因子在调控禽类卵泡膜表面OVR基因表达活性中的应用，其特征在于，所述转录因子为C/EBPα，所述C/EBPα通过与0VR基因启动子区转录因子结合位点结合，用于促进禽类卵巢卵泡OVR基因表达，所述禽类为鹅。
2.一种转录因子在协同OVR基因转运脂质进入细胞中的应用，其特征在于，所述转录因子为C/EBPα，所述C/EBPα通过与0VR基因启动子区转录因子结合位点结合，用于促进禽类卵巢卵泡OVR基因表达，所述禽类为鹅。
3.一种调控禽类卵泡膜表面OVR基因表达活性的方法，其特征在于，构建C/EBPα过表达或敲低载体，导入禽类卵泡膜颗粒细胞中，用以促进或降低禽类卵泡膜表面OVR基因表达活性，所述禽类为鹅。
4.根据权利要求3所述的一种调控禽类卵泡膜表面OVR基因表达活性的方法，其特征在于，所述禽类卵泡膜颗粒细胞为野生型鹅卵泡膜颗粒细胞或导入有OVR表达载体的鹅卵泡膜颗粒细胞。
5.根据权利要求4所述的一种调控禽类卵泡膜表面OVR基因表达活性的方法，其特征在于，所述鹅卵泡膜颗粒细胞为鹅小黄卵泡细胞。
6.一种脂质转运系统，其特征在于，所述系统为包含转录因子的过表达载体和OVR基因的禽类卵泡膜颗粒细胞，所述转录因子为C/EBPα，所述C/EBPα通过与0VR基因启动子区转录因子结合位点结合，用于促进禽类卵巢卵泡OVR基因表达，所述禽类为鹅。
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