CN114317351A - 一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件下发酵产氢的方法 - Google Patents
一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件下发酵产氢的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317351A CN114317351A CN202111647642.7A CN202111647642A CN114317351A CN 114317351 A CN114317351 A CN 114317351A CN 202111647642 A CN202111647642 A CN 202111647642A CN 114317351 A CN114317351 A CN 114317351A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydrogen
- producing
- clostridium
- anaerobic bacteria
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 title claims abstract description 113
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 113
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 112
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 title claims description 24
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 63
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 60
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims abstract description 48
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 6
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-n-naphthalen-2-ylnaphthalene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(NC(=O)C3=CC4=CC=CC=C4C=C3O)=CC=C21 PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 5
- GFHNAMRJFCEERV-UHFFFAOYSA-L cobalt chloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Co+2] GFHNAMRJFCEERV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- MPTQRFCYZCXJFQ-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Cu+2] MPTQRFCYZCXJFQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- MQLVWQSVRZVNIP-UHFFFAOYSA-L ferrous ammonium sulfate hexahydrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O MQLVWQSVRZVNIP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- LAIZPRYFQUWUBN-UHFFFAOYSA-L nickel chloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Ni+2] LAIZPRYFQUWUBN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000010926 purge Methods 0.000 claims description 5
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 claims description 5
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 claims description 5
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011655 sodium selenate Substances 0.000 claims description 5
- 235000018716 sodium selenate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960001881 sodium selenate Drugs 0.000 claims description 5
- XMVONEAAOPAGAO-UHFFFAOYSA-N sodium tungstate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][W]([O-])(=O)=O XMVONEAAOPAGAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 5
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 9
- 239000000446 fuel Substances 0.000 abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 241000193375 Bacillus alcalophilus Species 0.000 abstract 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 abstract 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 38
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- -1 exist Chemical compound 0.000 description 3
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QTXZASLUYMRUAN-QLQASOTGSA-N Acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QTXZASLUYMRUAN-QLQASOTGSA-N 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000178972 Caloramator Species 0.000 description 1
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-VRPWFDPXSA-N D-fructopyranose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001137870 Thermoanaerobacterium Species 0.000 description 1
- 241001656794 [Clostridium] saccharolyticum Species 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003034 coal gas Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 239000010815 organic waste Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000003209 petroleum derivative Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001699 photocatalysis Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件下发酵产氢的方法，该产氢厌氧菌是从海底污泥中分离筛选出来的杆状嗜碱性梭菌Clostridium P21；该方法包括配备用于包括底物和辅料的液体培养基；对液体培养基高温灭菌，去除液体培养基中残存氧气的处理；将液体培养基放入具有搅拌器的发酵罐中，设置发酵温度为30℃‑80℃之间的一个温度，并且通过酸溶液和碱性溶液控制发酵罐在发酵周期内的pH值恒定为8‑12中的一个值；在发酵罐中加入嗜碱性梭菌母液进行产氢输出，其中，嗜碱性梭菌母液的浓度为1‑8％。因此，本发明可以提高生产氢气的产率，能量转换效率高，且氢气提纯非常容易，很好地解决了氢燃料电池在工业应用中的安全性问题。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌种筛选及生物发酵制氢技术领域，尤其涉及一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件下发酵产氢的方法。
背景技术
当今世界所用的主要能源如石油、天然气、煤，石油气均属不可再生资源，地球上存量有限，随着化石燃料耗量的日益增加，其储量日益减少，终有一天这些资源、能源将要枯竭，而人类生存又时刻离不开能源，所以必须寻找新的能源，开发可再生能源迫在眉睫。
可再生能源主要包括太阳能、风能、水电、生物能源、氢能等。这其中，氢能源是公认的清洁能源，作为低碳或零碳能源使用正在脱颖而出。与其它燃料相比，氢利用时最清洁，仅仅只生成水，基本上不生成任何对环境有害的污染物质，氢取代化石燃料能最大限度地减弱温室效应。氢能目前可以作为燃料电池的原料用于氢燃料电池驱动的汽车上，也可以添加在现有的天然气管道进入千家万户作为燃料使用。
本领域技术人员清楚，氢的制备主要包括化石燃料制氢、电解水制氢和生物制氢等。生物制氢是利用产氢微生物发酵分解各种有机物而产生氢，有机物的来源十分广泛，包括糖类，秸秆，城市和工厂排放的有机废物和废水、农作物秸秆、变质的粮食等。这些有机物都来自于植物的光合作用，全球每年通过光合作用固定的太阳能是全球能源总消费量的十倍以上，因而利用微生物分解有机物制氢具有无可比拟的优越性。
迄今为止，国内外对利用微生物产氢也有了很多相关的研究，但主要停留在实验室研发阶段。目前主要存在三种制氢的方法，有机物发酵法，光催化发酵法，以及混和发酵法。
其中，发酵有机物产氢的底物大多数为糖类(包括葡萄糖，木糖，果糖，纤维素等)，以及醇类(比如甘油，乙醇等)，或者有机酸(比如乳酸，乙酸等)。(Chao-Wei Wu,Liang-MingWhang,Hai-Hsuan Cheng,Kan-Chi Chan,Fermentative biohydrogen production fromlactate and acetate,Bioresource Technology,Volume 113，2012,Pages 30-36.)。
文献报道的有产氢能力的主要微生物包括梭菌、克莱伯厌氧菌、大肠杆菌、酵母、光合细菌、红假单细菌、微藻、蓝细菌等(如Clostridium saccharobutylicum，ClostridiumScatologenes，Thermoanaerobacterium sp，Thermosaccharolyticum，Clostridiumbutyricum，Caloramator Proteoclasticus，etc)。
然而，目前发现的微生物均有产率较低，能量转换效率低下，且生产的氢气中含有硫化物、氮氧化物、一氧化碳和甲烷等杂气，上述问题直接阻碍了氢燃料电池的工业应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件发酵产氢的工艺方法，该筛选出的梭菌Clostridium P21在高碱性条件下生长及发酵产氢具有优异特性，可以利用其推进氢燃料电池的工业应用进程。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种产氢厌氧菌，其从海底污泥中分离出来的嗜碱性梭菌，且所述嗜碱性梭菌菌种形状为杆状。
进一步地，所述嗜碱性梭菌为梭菌Clostridium P21。
进一步地，所述梭菌Clostridium P21采用16S rRNA基因测序方法，使用引物分别为：
27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT
测序所得基因序列如下：520bp
ACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTGGGTGAGGAATCATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCACAGAATCGAGTAGAAATACTTGAGTGCCTCGTAAGAGGAGCTGTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTTGGTAGTTACCAGCGTAAAGACGGGGACTCTACCGAGACTGCCGTGGATAACACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCTTTATGCCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCTGAACAGAGGGCAGCGAAGGAGCG。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢的方法，其包括如下步骤：
步骤S1：配备用于包括底物和辅料的液体培养基；其中，所述底物为用于发酵产氢的有机物糖类、醇类和/或有机酸类，所述辅料为磷酸盐复合液；
步骤S2：对所述液体培养基高温灭菌，用纯惰性气体吹扫所述液体培养基以去除所述液体培养基中残存的氧气；
步骤S3：将所述液体培养基放入具有搅拌器的发酵罐中，设置发酵温度为30℃-80℃之间的一个温度，并且通过酸溶液和碱性溶液控制所述发酵罐在发酵周期内的pH值恒定为8-12中的一个值；
步骤S4：在所述发酵罐中加入嗜碱性梭菌母液进行产氢输出，所述嗜碱性梭菌母液包括1-8％的上述的产氢厌氧菌。
进一步地，在步骤S1中：
配置每升所述液体培养基包括10g的所述底料；
配置每升所述液体培养基的所述磷酸盐复合液包含：
1.4g磷酸二氢钾，1.1g磷酸氢二钾，2g硫酸铵，0.5g硫酸镁，10g酵母抽提物，10g吗啉乙磺酸，40mg氨三乙酸，20mg一水硫酸锰，16mg六水硫酸亚铁铵，4mg六水氯化钴，0.04mg七水硫酸锌，0.4mg二水氯化铜，0.4mg六水氯化镍，0.4mg钼酸钠，0.4mg硒酸钠，0.4mg钨酸钠，以及0.3g半胱氨酸。
进一步地，在步骤S2中，对所述液体培养基高温灭菌的温度大于100℃，所述惰性气体为高纯氮气。
进一步地，在步骤S3中，所述发酵温度为55℃-60℃之间的一个值。
进一步地，在步骤S3中，所述pH值恒定为10-12之间的一个值。
进一步地，在步骤S3中，所述酸溶液为浓度2M的盐酸溶液，以及所述碱性溶液为5M的氢氧化钠溶液。
进一步地，所述发酵温度为60℃，所述pH值恒定为10。
从上述技术方案可以看出，本发明的嗜碱性梭菌及其在高碱性条件发酵产氢的工艺方法，具有如下有益效果：
①.采用上述嗜碱性梭菌种(梭菌Clostridium P21)，可以提高生产氢气的产率，且能量转换效率高；
②.在产出的氢气中仅含有二氧化碳，基本不含有硫化物、氮氧化物、一氧化碳和甲烷等杂气，使氢气提纯非常容易，很好地解决了氢燃料电池在工业应用中的安全性问题。
附图说明
图1所示为本发明实施例的梭菌Clostridium P21的显微镜照片示意图
图2所示为本发明的产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢方法的流程示意图
具体实施方式
下面结合附图1-2，对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。
请参阅图1，图1所示为本发明实施例中产氢厌氧菌的显微镜照片示意图。如图1所示，该产氢厌氧菌是通过从海底污泥中分离纯化得到的嗜碱性梭菌，该碱性梭菌菌种形状为杆状，是一株可耐高碱性及高温的梭菌菌株Clostridium P21。通过在优化后的高碱性发酵pH及中高温度条件下，发酵包含葡萄糖，乙醇，及乙酸的混合物制得了相当量的氢气，该梭菌Clostridium P21菌种及其发酵技术在可再生氢能源的应用方面具有重大的意义。
请参阅图2，图2所示为本发明的产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢方法的流程示意图。如图2所示，该发酵产氢的方法包括如下步骤：
步骤S1：配备用于包括底物和辅料的液体培养基；其中，所述底物为用于发酵产氢的有机物糖类、醇类和/或有机酸类，所述辅料为磷酸盐复合液。
本领域技术人员清楚，有机物糖类、醇类和/或有机酸类的混合物，在微生物的作用下，先转变成关键代谢中间体乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)，然后再转变成乙酸，或者氢气加二氧化碳。
以最常见的碳水化合物葡萄糖为代表，反应方程式如下：
C6H12O6+2H2O＝2CH3COOH+2CO2+4H2
在上述反应方程式中，如果一分子的葡萄糖(C6H12O6)在微生物的作用下，那么可以产生2分子的乙酸(CH3COOH)，2分子的二氧化碳，和4分子的氢气。
在本发明的实施例中，通过合成生物学的方法编辑获得嗜碱性梭菌为梭菌Clostridium P21基因，以及调整发酵环境(温度和pH值等)，使得本发明上述的发酵产氢的方法主要以产氢气为主，副产品有乙酸和二氧化碳。
步骤S2：对所述液体培养基高温灭菌，用纯惰性气体吹扫所述液体培养基以去除所述液体培养基中残存的氧气。
在上述步骤S2中，对所述液体培养基高温灭菌的温度大于100℃，较佳地，可以设置恒定温度为121℃；所述惰性气体可以为高纯氮气，例如高纯氮气为99.99％的高纯氮气。
步骤S3：将所述液体培养基放入具有搅拌器的发酵罐中，设置发酵温度为30℃-80℃之间的一个温度，并且通过酸溶液和碱性溶液控制所述发酵罐在发酵周期内的pH值恒定为8-12中的一个值，进一步地，所述pH值恒定为10-12之间的一个值；较佳地，所述pH值恒定为10。
此外，在步骤S3中，所述酸溶液可以为浓度2M的盐酸溶液，以及所述碱性溶液可以为5M的氢氧化钠溶液。
步骤S4：在所述发酵罐中加入嗜碱性梭菌母液进行产氢输出，所述嗜碱性梭菌母液包括8-12％的产氢厌氧菌。具体地，产氢厌氧菌从海底污泥中分离出来的嗜碱性梭菌，且所述嗜碱性梭菌菌种形状为杆状，所述嗜碱性梭菌为梭菌Clostridium P21。
下面通过三个具体的实施例进一步描述本发明筛选出嗜碱性梭菌菌种在高碱性条件下生长和发酵产氢的相关工艺路线。
实施例1
本实施例以在1.5L发酵罐中不同pH条件下厌氧发酵葡萄糖以生产氢气为例进行说明。
首先，配置1L液体培养基，每升液体培养基含有：10g葡萄糖，配置每升所述液体培养基的所述磷酸盐复合液可以包含：
1.4g磷酸二氢钾，1.1g磷酸氢二钾，2g硫酸铵，0.5g硫酸镁，10g酵母抽提物，10g吗啉乙磺酸，40mg氨三乙酸，20mg一水硫酸锰，16mg六水硫酸亚铁铵，4mg六水氯化钴，0.04mg七水硫酸锌，0.4mg二水氯化铜，0.4mg六水氯化镍，0.4mg钼酸钠，0.4mg硒酸钠，0.4mg钨酸钠，以及0.3g半胱氨酸。
具体地，本实施例在三个不同的pH值条件(pH8、pH10和12)下做了平行对照实验，即通过比较在不同pH情况下该菌株的发酵效率，得到了该菌株的优化发酵pH范围。在每组实验中，发酵罐的进出口全部关闭，只有在发酵罐气体出口处连上气体收集气袋以全程收集发酵过程中的产气量。
气体中的氢气组分通过配备有TCD检测器的安捷伦气相色谱检测得到，其检测方法使用氮气为载气、喷头、检测器以及炉温分别控制在190℃，110℃，以及190摄氏度。
通过测量收集气袋中气体的体积及组分，可以很容易的计算得出该48小时发酵过程总的氢气产量。请参阅表1，表1所示为本发明实施例中在不同pH条件下发酵葡萄糖所能产氢气的总量。
表1：
从上述表格可以看出，当pH大于8时，采用该嗜碱性梭菌种(梭菌ClostridiumP21)产氢，均可以获得理想的产量，尤其是当pH在10左右，能可以获得优异的产氢量，当然，若pH大于10时，该产氢量一直维持在较高的水准。
实施例2
本实施例以在1.5L发酵罐中不同温度条件下厌氧发酵葡萄糖以生产氢气为例进行说明。
首先，配置1L液体培养基，每升液体培养基含有：10g葡萄糖、1.4g磷酸二氢钾、1.1g磷酸氢二钾、2g硫酸铵、0.5g硫酸镁、10g酵母抽提物、10g吗啉乙磺酸、40mg氨三乙酸、20mg一水硫酸锰、16mg六水硫酸亚铁铵、4mg六水氯化钴、0.04mg七水硫酸锌、0.4mg二水氯化铜、0.4g六水氯化镍、0.4mg钼酸钠、0.4mg硒酸钠、0.4mg钨酸钠以及0.3g半胱氨酸。
在121℃下高温灭菌30分钟后，通入99.99％的高纯氮气吹扫10分钟以尽可能的减少液体培养基中可能残存的氧气。吹扫完毕之后，发酵罐中的搅拌设备的搅拌转速为100rpm，并且通过浓度2M的盐酸溶液及5M的氢氧化钠溶液以控制在整个48小时的发酵周期内的pH值恒定为10。
接着，使用预先制备的10mL梭菌Clostridium P21母液。
本实施例在五个不同的温度条件(40℃、50℃、60℃、70℃和80℃)下做了平行对照实验。通过比较在不同温度情况下该菌株的发酵效率，得到了该菌株的优化发酵温度范围。在每组实验中，发酵罐的进出口全部关闭，只在发酵罐气体出口处连上气体收集气袋以全程收集发酵过程中的产气量。
气体中的氢气组分通过配备有TCD检测器的安捷伦气相色谱检测得到，其检测方法使用氮气为载气、喷头、检测器以及炉温分别控制在190℃、110℃以及190摄氏度。通过测量收集气袋中气体的体积及组分，可以很容易的计算得出该48小时发酵过程总的氢气产量。请参阅表2，表2所示为本发明实施例中在不同温度条件下发酵葡萄糖所能产氢气的总量。
表2：
从上述表格可以看出，当pH恒定在10时，如果温度大于50℃时，采用该嗜碱性梭菌种(梭菌Clostridium P21)产氢，均可以获得理想的产量，尤其是当温度60℃在左右，能可以获得优异的产氢量，当然，当温度大于60℃时，产氢量也可以一直维持在较高的水准。
实施例3
本实施例以在1.5L发酵罐中厌氧发酵葡萄糖、乙醇和乙酸的混合物以生产氢气为例进行说明。
首先，配置1L液体培养基，每升液体培养基含有：1.4g磷酸二氢钾，1.1g磷酸氢二钾，2g硫酸铵，0.5g硫酸镁，10g酵母抽提物，10g吗啉乙磺酸，40mg氨三乙酸，20mg一水硫酸锰，16mg六水硫酸亚铁铵，4mg六水氯化钴，0.04mg七水硫酸锌，0.4mg二水氯化铜，0.4mg六水氯化镍，0.4mg钼酸钠，0.4mg硒酸钠，0.4mg钨酸钠，以及0.3g半胱氨酸。
在121℃下高温灭菌30分钟后，通入99.99％的高纯氮气吹扫10分钟以尽可能的减少液体培养基中可能残存的氧气。吹扫完毕之后，发酵罐中的搅拌设备的搅拌转速为100rpm，设置发酵温度60℃，并且通过浓度2M的盐酸溶液及5M的氢氧化钠溶液以控制在整个48小时的发酵周期内的pH值恒定为10。
接着，使用预先制备的10mL梭菌Clostridium P21母液，并且根据不同的情况，加入不同的葡萄糖、乙醇、乙酸或它们的混合物，通过在前述优化后的发酵pH及温度条件下，得到发酵包含葡萄糖、乙醇、乙酸或它们的混合物物制得的相应氢气量。
具体地，本实施例在测试了不同浓度底物发酵产氢的情况，分别为：
I.葡萄糖10g/L；
II.乙醇10g/L；
III.和乙酸10g/L；
IV.葡萄糖4g/L，加上乙醇3g/L，再加上乙酸3g/L的混合物。
在上述每组实验中，发酵罐的进出口全部关闭，只有在发酵罐气体出口处连上气体收集气袋以全程收集发酵过程中的产气量。气体中的氢气组分通过配备有TCD检测器的安捷伦气相色谱检测得到，其检测方法使用氮气为载气，喷头，检测器，以及炉温分别控制在190℃，110℃，以及190摄氏度。通过测量收集气袋中气体的体积及组分，可以很容易的计算得出该48小时发酵过程总的氢气产量。
请参阅表3，表3所示为本发明实施例中在发酵葡萄糖、乙醇、乙酸及其混合物所能产氢气的总量比较。
表3：
从以上表格可以看出，当pH恒定在10以及温度恒定在50℃时，且当底物为葡萄糖时，采用该嗜碱性梭菌种(梭菌Clostridium P21)产氢，可以获得优异的产氢量，当底物为乙酸及葡萄糖/乙醇/乙酸的混合物时，产氢量也可以一直维持在较高的水准。
需要说明的是，所述梭菌Clostridium P21采用16S rRNA基因测序方法，使用引物分别为：
27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT
测序所得基因序列如下：520bp
ACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTGGGTGAGGAATCATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCACAGAATCGAGTAGAAATACTTGAGTGCCTCGTAAGAGGAGCTGTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTTGGTAGTTACCAGCGTAAAGACGGGGACTCTACCGAGACTGCCGTGGATAACACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCTTTATGCCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCTGAACAGAGGGCAGCGAAGGAGCG。
以上所述的仅为本发明的优选实施例，所述实施例并非用以限制本发明的专利保护范围，因此凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种产氢厌氧菌，其特征在于，所述产氢厌氧菌从海底污泥中分离筛选出来的嗜碱性梭菌，且所述嗜碱性梭菌菌种形状为杆状。
2.根据权利要求1所述的产氢厌氧菌，其特征在于，所述嗜碱性梭菌为梭菌Clostridium P21。
3.根据权利要求2所述的产氢厌氧菌，其特征在于，所述梭菌Clostridium P21采用16SrRNA基因测序方法，使用引物分别为：
27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT
测序所得基因序列如下：520bp
ACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTGGGTGAGGAATCATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCACAGAATCGAGTAGAAATACTTGAGTGCCTCGTAAGAGGAGCTGTGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTTGGTAGTTACCAGCGTAAAGACGGGGACTCTACCGAGACTGCCGTGGATAACACGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCTTTATGCCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCTGAACAGAGGGCAGCGAAGGAGCG。
4.一种产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：配备用于包括底物和辅料的液体培养基；其中，所述底物为用于发酵产氢的有机物糖类、醇类和/或有机酸类，所述辅料为磷酸盐复合液；
步骤S2：对所述液体培养基高温灭菌，用纯惰性或者二氧化碳气体吹扫所述液体培养基以去除所述液体培养基中残存的氧气；
步骤S3：将所述液体培养基放入具有搅拌器的发酵罐中，设置发酵温度为30℃-80℃之间的一个温度，并且通过酸溶液和碱性溶液控制所述发酵罐在发酵周期内的pH值恒定为8-12中的一个值；
步骤S4：在所述发酵罐中加入嗜碱性梭菌母液产氢输出，其特征在于，所述嗜碱性梭菌母液包括1-8％的权利要求1-3任意一种所述的产氢厌氧菌。
5.根据权利要求4所述的产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢的方法，其特征在于，在步骤S1中：
配置每升所述液体培养基包括10g的所述底料；
配置每升所述液体培养基的所述磷酸盐复合液包含：
1.4g磷酸二氢钾，1.1g磷酸氢二钾，2g硫酸铵，0.5g硫酸镁，10g酵母抽提物，10g吗啉乙磺酸，40mg氨三乙酸，20mg一水硫酸锰，16mg六水硫酸亚铁铵，4mg六水氯化钴，0.04mg七水硫酸锌，0.4mg二水氯化铜，0.4mg六水氯化镍，0.4mg钼酸钠，0.4mg硒酸钠，0.4mg钨酸钠，以及0.3g半胱氨酸。
6.根据权利要求4所述的产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢的方法，其特征在于，在步骤S2中，对所述液体培养基高温灭菌的温度大于100℃，所述惰性气体为高纯氮气。
7.根据权利要求4所述的产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述发酵温度为55℃-60℃之间的一个值。
8.根据权利要求4所述的产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述pH值恒定为10-12之间的一个值。
9.根据权利要求4所述的产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述酸溶液为浓度2M的盐酸溶液，以及所述碱性溶液为5M的氢氧化钠溶液。
10.根据权利要求4-9任意一个所述的产氢厌氧菌在高碱性条件下发酵产氢的方法，其特征在于，所述发酵温度为60℃，所述pH值恒定为10。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111647642.7A CN114317351A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件下发酵产氢的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111647642.7A CN114317351A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件下发酵产氢的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317351A true CN114317351A (zh) | 2022-04-12 |
Family
ID=81016861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111647642.7A Pending CN114317351A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件下发酵产氢的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317351A (zh) |
-
2021
- 2021-12-30 CN CN202111647642.7A patent/CN114317351A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ferraren-De Cagalitan et al. | A review of biohydrogen production technology for application towards hydrogen fuel cells | |
| US20210115477A1 (en) | System for the production of methane from co2 | |
| Kothari et al. | Fermentative hydrogen production–An alternative clean energy source | |
| Wu et al. | Recent advances in reuse of waste material as substrate to produce biohydrogen by purple non-sulfur (PNS) bacteria | |
| CN102741417B (zh) | 醇的制备方法 | |
| Kim et al. | Hydrogen production conditions from food waste by dark fermentation with Clostridium beijerinckii KCTC 1785 | |
| Wang et al. | Optimization and modeling of biohydrogen production by mixed bacterial cultures from raw cassava starch | |
| CN108603201A (zh) | 整合发酵和电解工艺 | |
| Christopher et al. | A review on critical assessment of advanced bioreactor options for sustainable hydrogen production | |
| EP3907291A1 (en) | System for the production of methane from co2 | |
| Nath et al. | Biohydrogen production as a potential energy resource–Present state-of-art | |
| Show et al. | Bioreactor and bioprocess design for biohydrogen production | |
| Morya et al. | Recent updates in biohydrogen production strategies and life–cycle assessment for sustainable future | |
| US20190301029A1 (en) | Bioelectrosynthesis of organic compounds | |
| KR20210042082A (ko) | 이산화탄소 생물 전환 방법 | |
| Sivaranjani et al. | A comprehensive review on biohydrogen production pilot scale reactor technologies: Sustainable development and future prospects | |
| US8343749B2 (en) | Method and apparatus for membrane-based, two-stage gas production from solid biomaterials | |
| Gürtekin | Biological hydrogen production methods | |
| Fang et al. | Bio-hydrogen production from wastewater | |
| Watanabe et al. | Biohydrogen using leachate from an industrial waste landfill as inoculum | |
| CN114317351A (zh) | 一种产氢厌氧菌及其在高碱性条件下发酵产氢的方法 | |
| Thiruchelvi et al. | Potential of bio hydrogen production from dark fermentation of sewage waste water–A review | |
| Manikkandan et al. | Microbial production of Hydrogen from sugarcane Bagasse using Bacillus Sp | |
| WO2021244872A1 (en) | Process for the biological production of hydrogen and/or methane by absorption and biological conversion of carbon dioxide | |
| Ferretti et al. | Hydrogenophilic and bioelectrochemical production of acetate with a pure culture of Acetobacterium Woodii |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |