CN114306310A - Idhp用于制备防治脓毒症诱导的急性肺损伤药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了IDHP用于预防或/和治疗脓毒症诱导的急性肺损伤药物的应用。本发明研究发现IDHP可提高脓毒症诱导的急性肺损伤小鼠生存率，降低组织间隙蛋白水肿、MPO活性、改善组织病理学水平；同时降低肺泡灌洗液和肺组织蛋白炎性因子TNFα、IL‑1β、IL‑6及IL‑18的表达和释放。

Description

IDHP用于制备防治脓毒症诱导的急性肺损伤药物的应用

技术领域

本发明涉及IDHP的新适应症，具体涉及IDHP用于预防脂多糖诱导急性肺损伤药物的应用。

背景技术

丹参素异丙酯(IDHP)是从申请人团队从复方丹参方的众多代谢产物及其系列改性物中筛选出来的效应成分，进一步结合现代药物化学和药理学技术合成的一个化合物。

发明内容

发明人通过构建脂脓毒症诱导的急性肺损伤动物模型，观察其生存率、肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量、髓过氧化物酶(MPO)活性、肺组织切片及炎症蛋白的表达等各项指标发现：IDHP预处理可提高脂多糖小鼠生存率、降低BALF总蛋白含量、降低MPO活性、改善组织切片炎症、降低炎症因子TNFα、IL-1β、IL-6及IL-18表达和释放；

基于上述发现，本发明提供了IDHP用于预防或/和治疗脓毒症诱导的急性肺损伤药物的应用。

进一步，所述脓毒症诱导的急性肺损伤是脂多糖所致脓毒症诱导的急性肺损伤。

进一步，所述药物为口服药物。

进一步，所述药物为脓毒症发生前或发生后用药。

本发明还提供了预防或/和治疗脂多糖诱导的急性肺损伤药物，所述药物为由IDHP和辅料制成，且药物为液态口服药物。

附图说明

图1为IDHP预防处理对脂多糖小鼠死亡率的影响IDHP预处理对脂多糖小鼠的保护作用，分别给予预防组小鼠IDHP 30mg/kg、60mg/kg、90mg/kg剂量灌胃预处理，1小时后LPS模型组和药物预防组腹腔注射LPS50mg/kg诱导小鼠急性肺损伤，连续72小时观察记录小鼠生存状况，每隔6小时观察并记录一次小鼠的死亡情况；生存率用卡方检验统计表示，^#P<0.05,^###P<0.001vs.LPS。

图2为IDHP治疗处理对脂多糖小鼠死亡率的影响IDHP对脂多糖小鼠的治疗作用，LPS模型组和药物治疗组腹腔注射LPS50mg/kg诱导小鼠急性肺损伤，1小时后分别给予治疗组小鼠IDHP 30mg/kg、60mg/kg、90mg/kg剂量灌胃治疗，连续72小时观察记录小鼠生存状况，每隔6小时观察并记录一次小鼠的死亡情况；生存率用卡方检验统计表示，^#P<0.05vs.LPS。

图3为IDHP对脂多糖小鼠肺泡灌注液蛋白含量的影响(n＝6)，结果以均数±标准差表示,**P<0.01vs.Con,^#P<0.05vs.LPS。

图4为IDHP对脂多糖小鼠肺组织匀浆MPO活性的影响(n＝6)，结果以均数±标准差表示,**P<0.01vs.Con,^#P<0.05vs.LPS。

图5为动物肺组织病理切片HE染色，A图中(a)Control；(b)LPS(50mg/kg)；(c)IDHP(30mg/kg)+LPS；(d)IDHP(60mg/kg)+LPS；(e)IDHP(90mg/kg)+LPS倍数：100×标尺：200μm；B图为HE染色肺损伤评分水平(n＝10)，结果以均数±标准差表示,***P<0.001vs.Con,^##P<0.01vs.LPS。

图6为IDHP对脂多糖小鼠动物组织蛋白炎性因子表达的影响，A图为各炎性因子蛋白免疫印迹图；B图为免疫印迹灰度分析图(n＝3)，结果以均数±标准差表示,*P<0.05,***P<0.001vs.Con.^#P<0.05,^##P<0.01vs.LPS。

图7为IDHP对BALF炎性因子释放的影响(n＝6)，结果以均数±标准差表示,*P<0.05,**P<0.01vs.Con.^#P<0.05,^##P<0.01vs.LPS。

具体实施方式

除非有特殊说明，本文中的术语或方法根据相关领域普通技术人员的认识理解或采用已知相关方法实现。

脓毒症是由细菌等病原微生物及其毒性成分(如LPS)侵入机体引起的全身炎症反应综合征。脓毒症诱导的急性肺损伤是脓毒症导致的以双侧肺炎性细胞浸润、血管壁渗透性破坏、肺部水肿为特征的急性肺损伤(ALI)。ALI早期患者具有以下临床表现：①在直接损伤或间接损伤12-48小时内发病，呼吸困难，表现出急进性；②常规治疗吸氧后患者的低氧血症仍然存在；③急性期肺部拍片可见弥散性肺部浸润造影；④肺动脉压力增高，心脏功能受阻。ALI在细菌脂多糖(LPS)等因子的作用下，刺激巨噬细胞分泌细胞因子并激活炎症反应，以TNFα、IL-1β及IL-8等白介素分子为主，产生的炎症因子能强烈趋化聚集中性粒细胞，对血管内皮和上皮细胞产生损伤，导致肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞屏障功能破坏，大量血细胞和蛋白渗漏，肺泡与肺间质内积聚大量的水肿液。目前，ALI的鉴别诊断主要有肺水肿的鉴别诊断，即对灌洗液的临床测定，某些物质如血管紧张素酶，纤维连接蛋白，炎性因子等测定的观察，均为确定早期诊断的标志物。现有的主要治疗手段有机械性通气和无创机械通气，但两种临床治疗对患者身体均有刺激作用，目前国际上治疗ALI还没有特异性预防及治疗药物。

脂多糖所致脓毒症诱导的急性肺损伤是一种复制脓毒症诱导的急性肺损伤的模型，能破坏血管内皮屏障，引起肺组织间隙和肺泡水肿，被研究人员广泛使用。LPS是内毒素的主要成分，为革兰氏阴性菌致脓毒症诱导的急性肺损伤的主要物质，LPS通过激活巨噬细胞表面受体TLR4，ATP和钾离子辅助通道作用，协助LPS病毒进入细胞内，触发炎症介质。LPS是脓毒血症的重要介质，介导机体对革兰氏阴性菌的反应，导致细菌性败血症，是脓毒症诱导急性肺损伤的模型之一。

本发明所述药物辅料或溶剂是药物制剂在制备或调配过程中所必需的、除活性物IDHP以外的物质。一般要求这些物质无生理活性，不影响药物制剂中药物疗效、含量测定和稳定性。加入的主要目的是方便IDHP的溶解和制备。

以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些的任何限定。

需要说明的是，以下实验所用的丹参素异丙酯(IDHP)是申请人团队从复方丹参方的众多代谢产物中筛选出的活性成分，其结构式如式(Ⅰ)所示。纯度为HPLC≥98％。所用动物购自第四军医大学实验动物中心，所用试剂为市场采购，脂多糖购自Sigma公司。如无特殊说明，以下实施例中所采用的实验方法或相关检测方法采用本领域已知方法。

实施例1:发明人研究发现IDHP能够降低脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的死亡率。

步骤：

(1)药品配制：采用1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶解IDHP，然后依次按照NMP:PEG400:三蒸水为1:7:2(体积比)的比例加入一定体积的PEG400和一定体积的三蒸水对药品进行稀释，配置成浓度为3mg/ml、6mg/ml和9mg/ml的IDHP溶液；称取一定量的LPS粉剂，用生理盐水配置成浓度为2.5mg/ml的LPS注射液。

(2)分组及造模：

使用C57小鼠(15-20g)，提前三天饲养动物使其适应动物房环境，提供饲料和水，实验前12小时禁食禁水；

C57小鼠随机分为空白对照组Control(n＝20，n为该组小鼠数量)；肺损伤模型组LPS50mg/kg(n＝55)；预防组：药物预防组IDHP90mg/kg+LPS(n＝26)、药物预防组IDHP60mg/kg+LPS(n＝26)、药物预防组IDHP30mg/kg+LPS(n＝26)；治疗组：药物治疗组LPS+IDHP90mg/kg(n＝20)、药物治疗组LPS+IDHP60mg/kg(n＝20)和药物治疗组LPS+IDHP30mg/kg(n＝20)，每只小鼠分组编号并称重；

空白组为溶剂对照组即以NMP:PEG400:三蒸水＝1:7:2(体积比)配制而成的混合溶剂灌胃0.2ml；

肺损伤模型组(本文也称模型组或LPS组)造模方法是以0.02ml/g(ml/g为注射液体积和体重比)腹腔注射LPS50mg/kg LPS注射液；

药物预防组(IDHP+LPS)造模方法是：各组小鼠分别以0.01ml/g口腔灌胃IDHP90mg/kg、60mg/kg和30mg/kg，1小时后再腹腔注射LPS(50mg/kg)注射液(注射量为0.02ml/g)；

药物治疗组(LPS+IDHP)造模方法是：各组小鼠分别腹腔注射LPS(50mg/kg)注射液(注射量为0.02ml/g)，1小时后分别以0.01ml/g口腔灌胃IDHP 90mg/kg、60mg/kg和30mg/kg；

上述每组小鼠注射LPS后持续72小时每隔6小时记录一次死亡率并观察记录小鼠活动情况。

(3)统计：观察并记录每隔6小时小鼠死亡情况，并及时保存肺组织标本，用统计软件GraphPad Prism 6.02绘制小鼠生存率曲线进行统计分析。

预防实验观察结果：

6小时后观察到各组小鼠开始出现呼吸急促现象；

12小时后部分小鼠行动迟缓，眼睛微闭，LPS(50mg/kg)开始出现死亡情况；

持续观察24小时，发现肺损伤模型组小鼠眼睛脓毒、炎症明显；

36-60小时，肺损伤模型组小鼠死亡数目持续增加，预防组IDHP 90mg/kg+LPS小鼠开始恢复，已无持续死亡情况；

持续观察72小时后，各预防组生存率为：模型组LPS 50mg/kg生存率为11％，预防组IDHP 90mg/kg+LPS生存率为62.5％，IDHP 60mg/kg+LPS生存率为42.3％，IDHP 30mg/kg+LPS生存率为38.7％；

由上得出IDHP预处理能降低小鼠死亡率，IDHP中剂量60mg/kg、低剂量30mg/kg相对于LPS 50mg/kg比有预防效果，但与IDHP90mg/kg相比预防效果不显著，具体可参见图1所示。

治疗实验观察结果：

6小时后观察到各组小鼠开始出现呼吸急促现象；

12小时后各组小鼠行动迟缓，眼睛微闭，LPS(50mg/kg)及各治疗组(LPS+IDHP)同时开始出现死亡情况。

24小时观察肺损伤模型组小鼠眼睛脓毒、炎症明显，且IDHP治疗组低剂量和LPS组死亡及眼睛炎症情况相同；

36-72小时肺损伤模型组、IDHP治疗组LPS+IDHP 30mg/kg和LPS+IDHP 90mg/kg死亡数量继续增加，LPS+IDHP 60mg/kg保持不变；

72小时统计分析得：肺损伤模型组LPS 50mg/kg生存率为11％，治疗组LPS+IDHP90mg/kg生存率为25％，LPS+IDHP 60mg/kg生存率为30％，LPS+IDHP 30mg/kg生存率为15％；

由此可知，IDHP对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠有治疗效果，且LPS+IDHP 60mg/kg治疗组有显著性差异。

统计学分析：由生存率曲线可知，IDHP预处理可以降低小鼠死亡率，且在该实施例构建的浓度范围内，IDHP90 mg/kg保护效果显著，且能有效延长小鼠生存时间；IDHP治疗模型能降低小鼠死亡率，IDHP 60mg/kg治疗效果显著，具体可参见图2所示。

基于该实施例的研究结果，确定了IDHP预防组与治疗组均有显著效果，均可提高小鼠生存率并延长其生存时间。以下实施例以实施例1中所述空白组、肺损伤模型组及预防实验组模型为研究模型。

实施例2:发明人研究发现IDHP能降低肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白含量。

该实施例获取各组小鼠全肺组织BALF，用BCA蛋白定量法测定蛋白含量。

步骤：

(1)用戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉小鼠，每组6只，固定在小鼠固定架上，剥离小鼠气管，用手术剪剪开一个倒V字开口，取灌胃针插入气管，手术线扎紧灌胃针与气管，每次吸取1ml磷酸缓冲液(PBS)，反复冲洗肺两次，共计五次，每次回收0.9ml左右PBS，回收率达到90％，即为收取的相应模型的全肺肺泡灌洗液(BALF)；

(2)将BALF 450g离心10分钟，取上清，收集的BALF可置于-80℃冷藏，用于后续实验检测；取上清用BCA蛋白定量法测定BALF蛋白含量，根据碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作分别加入96孔板中，37℃孵育20-30分钟，震荡混匀，562nm处测量吸光度值，建立标准曲线，计算蛋白浓度；同时，用少量待测样品BALF于微型血球计数仪点样测蛋白浓度，记录数值做统计分析。

(3)根据所测吸光度值，制作标准曲线，计算并统计每组蛋白浓度。

结果：通过BCA蛋白浓度测定试剂盒与血球计数仪机器测定统计结果趋势相同，结果用BCA蛋白浓度测定曲线表示，如图3所示，IDHP能降低BALF中总蛋白含量，且呈梯度降低，且在该实施例构建的浓度范围内，IDHP 90mg/kg具有显著性差异，初步判断IDHP保护血管壁渗透性，减轻肺组织间隙蛋白漏出。

实施例3:发明人研究发现IDHP能减轻肺损伤小鼠肺组织髓过氧化物酶活性。

髓过氧化物酶(MPO)主要存在于中性粒白细胞中，在炎症状况下，被释放到细胞外液，中性粒细胞的大量聚集会导致组织、细胞渗透性改变、引起组织损伤，因此间接的通过测定MPO活性，可以表示炎性细胞浸润程度。该实施例通过取出实验组的全肺组织，采用南京建成髓过氧化物酶试剂盒检测各组的髓过氧化物酶活性。

步骤：

(1)戊巴比妥钠麻醉各组小鼠，每组6只，摘取全肺组织，用PBS清洗血渍，滤纸吸干水分后准确称取肺组织20mg左右，剪碎加入缓冲液试剂200ul置于1.5ml离心管，加入郜株，于组织研磨器研磨成组织匀浆；

(2)按照试剂盒表格说明内容分别加入待测样品和试剂，震荡混匀，60℃水浴10分钟，取出后立即用分光光度计460nm、1cm光径，用对照组调零，测量其吸光度值；

(3)计算公式：

MPO活力(U/g)＝(测定OD值-对照OD值)/11.3×取样量(g)。

结果：如图4所示，肺组织损伤模型组MPO活力最高，IDHP药物预防组呈梯度下降，且在该实施例构建的浓度范围内，IDHP90mg/kg效果显著，初步证明丹参素异丙酯可以降低MPO活性，抑制中性粒细胞聚集。

实施例4:发明人研究发现IDHP能改善脂多糖小鼠组织病理学改变。

该实施例通过取各组脂多糖小鼠全肺组织，4％多聚甲醛固定24小时以上，石蜡包埋、固定、切片，苏木精伊红(HE)染色。

步骤：

(1)C57小鼠称重，麻醉，每组3只，可用PBS灌洗2-3次全肺组织，摘取后培养皿中用PBS冲洗表面血渍，注意观察并记录肺组织表面有无出血现象并记录，取右肺组织用滤纸吸干水分，固定于4％多聚甲醛中24小时，石蜡包埋，切片4μm，苏木精伊红(HE)染色；

(2)制备好的切片于显微镜下观察并拍摄，从肺组织充血、肺泡中性粒细胞浸润、透明膜形成、肺泡隔厚度和肺泡腔断裂等五方面评价肺损伤程度，共计五个视野，按照等级划分为0-5分，最后统计分析脓毒症小鼠肺组织HE病理切片损伤评分；

结果：

脂多糖小鼠肺组织病理切片HE染色及肺损伤评分如图5A、B所示，LPS(50mg/kg)模型组小鼠肺组织损伤最大，肺间质出血严重、肺泡壁间隔增厚、中性粒细胞浸润明显，药物防护组损伤现象相对减轻，统计得知，与HE染色切片现象相符，LPS模型组损伤最重，且在该实施例构建的浓度范围内，药物预防组IDHP90mg/kg最轻，进一步证明了IDHP对脓毒症小鼠有保护作用。

实施例5:发明人研究发现IDHP能够抑制肺损伤小鼠肺组织中炎性因子的表达。

炎症因子TNFα、IL-1β为全身多效促炎细胞因子，在炎症的发生等多种疾病中扮演着重要的角色，IL-6趋化募集中性粒细胞，破坏内皮上皮细胞间黏附因子，引起局部炎症反应；IL-18与IL-1β为细胞焦亡的主要分泌因子，通道蛋白Gsdmd打开后释放IL-18及IL-1β，同时TNFα、IL-6等炎症因子也相应的释放到细胞间质，从而引起后续炎症反应和细胞组织损伤，因此，进一步为药物作用的可能靶点及机制探讨提供证据。

该实施例通过采用蛋白免疫印迹法测量各组小鼠肺组织中炎性因子TNFα、IL-1β、IL-6和IL-18的表达。

步骤：

(1)蛋白提取：每组3只，戊巴比托纳麻醉后固定，解剖小鼠取全肺组织用PBS清洗血渍，滤纸吸干后称取动物组织20mg左右，冰上置于1.5ml离心管中，按照比例100mg/ml，加入裂解液200ul，然后在离心管中加入锆株于组织研磨器研磨2-4分钟，研成组织匀浆没有大型组织块即可，冰上反复吹打裂解30分钟后于4℃，12000rpm离心25分钟取上清；

(2)蛋白定量：采用碧云天BCA蛋白定量试剂盒，将待测样品按照说明书操作分别加入96孔板中，37℃孵育20-30分钟，震荡混匀，562nm处测量吸光度值，建立标准曲线，计算蛋白浓度；

(3)样品制备：将定量好的样品蛋白，加入1/4溴酚蓝缓冲液(SDS-PAGE sampleloading buffer)，震荡混匀，100℃，5分钟金属浴加热使蛋白质变性，放凉至室温，4℃，12000rpm离心5分钟，制好的样品可保存在-20℃冰箱待测。

(4)SDS-PAGE凝胶电泳：取样品蛋白，在制好的8％琼脂糖凝胶上样，恒压80V至蛋白跑出浓缩胶，进入分离胶后换成恒压100V，待蛋白跑至所需范围内之后，停止电泳开始转膜，将分子片段转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，恒压100V冰上转膜60分钟，然后用5％脱脂牛奶封闭60分钟，裁膜，用TBST缓冲液洗涤三次5分钟，一抗孵育过夜，次日同样用TBST缓冲液将膜洗涤三次5分钟，二抗孵育1小时，再用TBST缓冲液将膜洗涤三次5分钟，最后滴加化学发光液用化学发光成像系统(Chemiscope 6100)成像拍摄。

(5)用image J图像分析软件，对分子片段条带进行灰度分析统计。

结果：

对脂多糖小鼠肺组织进行组织蛋白Western blot分析结果如图6A、B所示，四种炎症因子TNFα、IL-1β、IL-6和IL-18都有在LPS刺激下增加现象，预防组都有相应的减缓作用，其中IL-6的抑制效果显著。

实施例6:发明人研究发现IDHP能够降低BALF中释放的炎性因子水平

该实施例采用酶联免疫吸附实验测量实施例2收集的各组BALF中炎性因子TNFα、IL-1β、IL-6和IL-18的释放。

步骤：

(1)试剂盒选用R&D Systems小鼠肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA检测试剂盒、小鼠白细胞介素1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒、小鼠白细胞介素18(IL-18)ELISA检测试剂盒和小鼠白细胞介素6(IL-6)ELISA检测试剂盒；

(2)将实施例2收集的BALF通过离心和化验去除颗粒物质，保存在-20℃冰箱，避免反复冻融循环，检测采用定量夹心酶联免疫分析技术；实验操作前，将所有试剂平衡至室温，然后按照说明书操作每孔添加100μL的标准样品、对照样品和待测样品；胶条封盖后在室温下孵化2小时，洗涤孔板，重复洗涤三次；通过倒扣，滤纸边缘吸附等操作必须清洗干净残留物，然后每孔加入200μL TNFα、IL-1β、IL-6及IL-18结合物，用新的胶带覆盖，室温孵化2小时；重复洗涤三遍，每孔加入200μL底物溶液，在室温下孵化20分钟，最后加入50μL的显色液。通过波长校正于450nm处测量吸光度值。

(3)用测量得到的吸光度值建立双标准曲线，计算蛋白浓度。

结果：肺泡灌洗液中浸润的特征性TNFα、IL-1β、IL-6及IL-18炎症因子，LPS模型组较正常对照组相比都有显著升高，药物组IDHP 90mg/kg+LPS较LPS模型组比有显著降低；如图7所示，同Western blot结果一致，四种炎症因子在LPS模型组都有增加，丹参素异丙酯防治组也都有减轻，因此可初步判断IDHP能够减轻肺泡炎症因子的释放，进而减轻动物炎症反应。

Claims (5)

1.IDHP用于制备预防或/和治疗脓毒症诱导的急性肺损伤药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脓毒症诱导的急性肺损伤为脂多糖所致脓毒症诱导的急性肺损伤。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为口服药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为脓毒症发生前或发生后用药。

5.预防或/和治疗脓毒症诱导的急性肺损伤药物，其特征在于，所述药物为由IDHP和辅料制成，且药物为液态口服药物。

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