CN114292936A - 一种利用mcyE基因检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，涉及生物技术，旨在微囊藻毒素的毒性较强，致死的最低剂量是每千克体重0.05mg，使不少水生动物中毒死亡，而且微囊藻毒素有致癌作用，对人类的健康造成了潜在的危险，通过能产毒的沙漠蓝藻都含有mcyE基因，没有mcyE基因或mcyE基因缺活都不能产生微囊藻毒素，而不产毒素的沙漠蓝藻大多数都没有mcyE基因，因此使用PCR方法检测微囊藻毒素合成酶基因片段以确定微囊藻的产毒特性是可行的，准确率很高的方法；沙漠蓝藻中微囊藻毒素的普通PCR检测方法，由于其快速，灵敏，检出限低，较HPLC前处理简洁。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种利用mcyE基因检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法。
背景技术
藻类在地球上的分布极广，几乎在有光和潮湿的任何地方，从炎热的赤道地区到千年冰封的极地，从零下数十度的南北极到高达85℃的温泉，无论在江河湖海、沟渠塘堰等各种水体中，还是在潮湿的土表、墙壁、树干、树叶、岩石上甚至沙漠中，都有其生长，都能见到藻类的踪影。
荒漠藻类是指生长在荒漠地区的土壤藻类，是陆生藻类中特定的生态学类群，而非藻类分类学上的概念。荒漠藻类能在干旱、营养贫瘩、强辐射等环境恶劣条件下生存和繁衍，并通过自身的生理生态作用，影响和改变荒漠环境。荒漠藻类作为荒漠、半荒漠生态系统的先行者，在荒漠土壤的保水、改良、防风固沙及全球气候变化方而都有明显的生态功能。
藻类生长、加工、储藏、运输等环节以及消费方式，都会对产品质量安全产生影响。目前影响藻类食品食用安全性因素主要是天然毒素、环境污染物、药物残留、加工污染及掺杂使假等。20世纪50年代以后，海洋赤潮发生频繁，赤潮毒素对人类造成的危害事件也日益增多。在环境适宜时，海洋蓝藻能快速生长、繁殖，当蓝藻生长到一定量时会释放蓝藻毒素，尤其是微囊藻毒素。释放的藻毒素与人类在皮肤接触、饮用、食用水生动物等过程中可能会导致中毒。
近几年的研究表明，蓝藻毒素中属于环肽类的微囊藻毒素(Microcystin，MC)的毒性最强，危害最大，范围最广。微囊藻毒素是由各种各样的浮游蓝藻产生的，其中最常见的属种为铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)与浮丝藻(Planktothrix)，念珠藻(Nostoc)，颤藻(Oscillatoria)等。微囊藻毒素是细胞内毒素，它在细胞内合成，细胞破裂后释放出来并表现出毒性，由于它的体积很小，环状结构及其氨基酸的特殊结构，一般认为它不是由核糖体合成，而是由肤合成酶复合体合成的生物活性小肽(kleikaufetai，1996，谢平，2007)。微囊藻毒素(Microcystins)由于其毒性较大，分布广泛，以肝脏为靶器官，具有强烈致癌性，目前研究较多的一组有毒化合物。
淡水水华中蓝细菌产生的毒素中危害最大的是微囊藻毒素(MC)，微囊藻毒素不仅直接污染水源，而且可以在水生生物中富集和存留达到相当高的浓度(谷康定等，2004)，通过食物链进入人体，直接威胁人类的健康。这种毒素是肝癌的强烈致癌剂。大量研究表明，肝脏是主要的靶器官，对肝脏的损伤在组织病理学上主要表现为肝脏大面积出血、坏死、肿胀、淤血、肝体比重增加、肝细胞结构破坏(许秋瑾等，2002)。最近，研究人员还发现微囊藻毒素能在无脊椎动物性腺中大量积累，微囊藻毒素还可以在卵中大量存在并传递到后代，因此，微囊藻毒素对包括人类在内的哺乳动物生殖的影响应该受到关注和重视(陈文璟和温旺荣，2011)。随着有关MC毒性研究的深入开展，发现MC还能对其它器官和系统造成损伤。在研究微囊藻毒素在机体组织中的分布规律时还发现，MC可大量在动物的性腺中大量累积，揭示性腺可能是仅次于肝脏的第二个靶器官，预示着微囊藻毒素可从母体传递到后代(Chen and Xie,2005)。有研究显示，MC对脾脏亦有一定的毒性，可导致脾脏肿大。
微囊藻毒素的毒性较强，致死的最低剂量是每千克体重0.05mg，使不少水生动物中毒死亡，而且微囊藻毒素有致癌作用，如通过饮用，透析食物链等方式长期摄入含有微囊藻毒素的水可导致肝损伤以及严重到肝癌，对人类的健康造成了潜在的危险，因此了解微囊藻毒素的化学结构，研究其产毒特征与检测方法一直备受关注。
发明内容
鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种利用mcyE基因检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，采用的技术方案是，包括以下引物：
mcyE-F2：5'-GAAATTTGTGTAGAAGGTGC-3'；mcyE-R4：5'-AATTCTAAAGCCCAAAGACG-3'。
作为本发明的一种优选技术方案，包括以下步骤：
步骤1，对沙漠蓝藻进行纯种培养：称取50g的沙样于含有150mL经灭菌的BG11培养基的三角瓶中，静置于26℃培养架上培养约2周，2周后取适量培养的混培藻液，藻种分离采用平板涂布法，获取的混合藻液经充分稀释后涂布到含2％琼脂的固体培养基上，静置于18h光照6h黑暗光照培养架中，光照强度10000Lux，15天后挑取单藻落在固体平板上反复划线分离直至得到单一藻种，经镜检确认后转移到100mL液体培养基(250mL锥形瓶)，培养条件25℃，光照10000Lux，光照培养室中静置培养，定期镜检培养藻液，并用光学显微镜拍照记录藻种状态，直到100倍油镜下观察的藻细胞形态一致即纯化成功；
步骤2，取50mL对数生长期的沙漠蓝藻培养液，分装至50mL的离心管中，4000rpm/min离心10min，弃上清液，收集的藻体经液氮研磨后按照试剂盒说明书的方法提取基因组DNA；
步骤3，以提取的沙漠蓝藻基因组DNA为模板，以mcyE基因序列作为扩增的目标区域片段，引物序列为mcyE-F2：5'-GAAATTTGTGTAGAAGGTGC-3'；mcyE-R4：5'-AATTCTAAAGCCCAAAGACG-3'；
步骤4，PCR反应体系，ddH2O，上下引物，DNA模板，2×TAP PCR Master Mix(TIANGEN)；
步骤5，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，51.5℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；
步骤6，Alphalmager200型凝胶成像系统拍照记录；所用的分子量标准为B500350(100bp～2000bp)。
作为本发明的一种优选技术方案，所述PCR反应体系为25μL，ddH2O 8.5μL，上下引物各0.5μL，DNA模板3μL，2×TAP PCR Master Mix(TIANGEN)12.5μL。
作为本发明的一种优选技术方案，基因组DNA用含有五毒核酸染料的4SGreenPlus 1.0％琼脂糖凝胶(1×TAE配制)电泳检测。
本发明的有益效果：本发明通过mcyE基因表达的mcyE蛋白质是由PKS(聚酮合成酶)和NRPS(非核糖体肽合成酶)两个模块组成的混合蛋白质，与毒素中有毒组分Adda(3-氨基-9-甲基-10-苯基-2,6,8-三甲基-4,6-二烯酸)的合成有关用生物信息学分析，这个基因在众多微囊藻毒素合成基因中保守性最高；能产毒的沙漠蓝藻都含有mcyE基因，没有mcyE基因或mcyE基因缺活都不能产生微囊藻毒素，而不产毒素的沙漠蓝藻大多数都没有mcyE基因，因此使用PCR方法检测微囊藻毒素合成酶基因片段以确定微囊藻的产毒特性是可行的，准确率很高的方法；沙漠蓝藻中微囊藻毒素的普通PCR检测方法，由于其快速，灵敏，检出限低，较HPLC前处理简洁。
附图说明
图1为本发明的实验图之图一；
图2为本发明的实验图之图二。
具体实施方式
实施例1
如图1至图2所示，本发明公开了一种利用mcyE基因检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，采用的技术方案是，包括以下引物：mcyE-F2：5'-GAAATTTGTGTAGAAGGTGC-3'；mcyE-R4：5'-AATTCTAAAGCCCAAAGACG-3'。
作为本发明的一种优选技术方案，包括以下步骤：
步骤1，对沙漠蓝藻进行纯种培养：(1)：沙漠蓝藻培养的培养基的配制：沙漠蓝藻藻种用BG11培养基培养：NaNO3 125g/L、K2HPO4.3H2O 0.04g/L、MgSO4.7H2O 0.075g/L、CaCl2.2H2O 0.036g/L、citricacid 0.006g/L、ferric ammonium citrate 0.006g/L、EDTANa2 0.001g/L、Na2CO3 0.02g/L，pH值为7.4，依次加入好每个成分，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，置于4℃冰箱中，储存；
(2)：沙漠蓝藻细胞的液体培养：向150mL的三角瓶中倒入100mL新鲜培养基，盖上封口膜，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，过夜处理，第二天接藻，蓝藻细胞接种前，用20％氢氧化钾(KOH)将培养基调到藻种最适pH值，调好pH值，直接将10％接种比例将藻种接种至新鲜培养在基中；
(3)：沙漠蓝藻细胞的固体培养：沙漠蓝藻的固体培养是沙漠蓝藻细胞不断纯化和保藏纯种的关键，使用培养各种蓝藻所对应的BG11液体培养基，按照2％的比例加入琼脂粉，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，冷却到65℃，在无菌条件下倒入培养皿，直到完全冷却，用接种环，挑取单藻落划线培养，直到长出单藻落后将单藻落挑到装有30mL液体培养基的小型培养皿内静置培养，待培养液颜色变绿，接种在三角瓶中扩大培养，得到纯藻种；
步骤2，用生工生物Ezup柱式植物基因组DNA抽取试剂盒，提取蓝藻细胞基因组DNA；采用Ezup柱式植物基因组DNA抽提(B518261-0100)试剂盒法提取基因组DNA，在1.0％的琼脂糖凝胶电泳图谱中(如图1)所示:图中1至4号样品从武汉水生所购买的淡水蓝藻基因组中提取的DNA，作为阳性对照，5至14号是以沙漠蓝藻作为实验材料提取的DNA，15至16号样品是以沙漠绿藻作为实验材料提取的DNA，作为阴性对照，为了避免外源DNA的污染，每次提取DNA时设计空白实验；
步骤3，以提取的沙漠蓝藻基因组DNA为模板，以mcyE基因序列作为扩增的目标区域片段，引物序列为mcyE-F2：5'-GAAATTTGTGTAGAAGGTGC-3'；mcyE-R4：5'-AATTCTAAAGCCCAAAGACG-3'；由(图2)可知，扩增沙漠蓝藻mcyE基因所得的PCR产物，条带亮而清晰，1至4号阳性对照样品和5至14号沙漠蓝藻实验组样品的mcyE基因PCR扩增结果均出现单一的条带，而从15至16号沙漠绿藻样品的mcyE基因PCR扩增结果均未出现单一的条带，PCR产物没有杂带，且在标准分子量标记B500351(100bp～2000bp)(上海生工产品)的750bp左右，与引物设计的扩增条带相符，因此，初步确定为目的条带；
步骤4，PCR反应体系，ddH2O，上下引物，DNA模板，2×TAP PCR Master Mix(TIANGEN)；
步骤5，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，51.5℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；
步骤6，Alphalmager200型凝胶成像系统拍照记录；所用的分子量标准为B500350(550bp)。
作为本发明的一种优选技术方案，所述PCR反应体系为25μL，ddH2O 8.5μL，上下引物各0.5μL，DNA模板3μL，2×TAP PCR Master Mix(TIANGEN)12.5μL。
作为本发明的一种优选技术方案，基因组DNA用含有五毒核酸染料的4SGreenPlus 1.0％琼脂糖凝胶(1×TAE配制)电泳检测。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，作为本发明的一种优选技术方案，包括以下步骤：
步骤1，对沙漠蓝藻进行纯种培养：(1)：沙漠蓝藻培养的培养基的配制：沙漠蓝藻藻种用BG11培养基培养：NaNO3 125g/L、K2HPO4.3H2O 0.04g/L、MgSO4.7H2O 0.075g/L、CaCl2.2H2O 0.036g/L、citricacid 0.006g/L、ferric ammonium citrate 0.006g/L、EDTANa2 0.001g/L、Na2CO3 0.02g/L，pH值为7.4，依次加入好每个成分，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，置于4℃冰箱中，储存；
(2)：沙漠蓝藻细胞的液体培养：向150mL的三角瓶中倒入100mL新鲜培养基，盖上封口膜，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，过夜处理，第二天接藻，蓝藻细胞接种前，用20％氢氧化钾(KOH)将培养基调到藻种最适pH值，调好pH值，直接将10％接种比例将藻种接种至新鲜培养在基中；
(3)：沙漠蓝藻细胞的固体培养：沙漠蓝藻的固体培养是沙漠蓝藻细胞不断纯化和保藏纯种的关键，使用培养各种蓝藻所对应的BG11液体培养基，按照2％的比例加入琼脂粉，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，冷却到60℃，在无菌条件下倒入培养皿，直到完全冷却，用接种环，挑取单藻落划线培养，直到长出单藻落后将单藻落挑到装有30mL液体培养基的小型培养皿内静置培养，待培养液颜色变绿，接种在三角瓶中扩大培养，得到纯藻种；
步骤2，用生工生物Ezup柱式植物基因组DNA抽取试剂盒，提取蓝藻细胞基因组DNA；
步骤3，以提取的沙漠蓝藻基因组DNA为模板，以mcyE基因序列作为扩增的目标区域片段，引物序列为mcyE-F2：5'-GAAATTTGTGTAGAAGGTGC-3'；mcyE-R4：5'-AATTCTAAAGCCCAAAGACG-3'；
步骤4，PCR反应体系，ddH2O，上下引物，DNA模板，2×TAP PCR Master Mix(TIANGEN)；
步骤5，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，51.5℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；
步骤6，Alphalmager200型凝胶成像系统拍照记录；所用的分子量标准为B500350(100bp)。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，作为本发明的一种优选技术方案，包括以下步骤：
步骤1，对沙漠蓝藻进行纯种培养：(1)：沙漠蓝藻培养的培养基的配制：沙漠蓝藻藻种用BG11培养基培养：NaNO3 125g/L、K2HPO4.3H2O 0.04g/L、MgSO4.7H2O 0.075g/L、CaCl2.2H2O 0.036g/L、citricacid 0.006g/L、ferric ammonium citrate 0.006g/L、EDTANa2 0.001g/L、Na2CO3 0.02g/L，pH值为7.4，依次加入好每个成分，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，置于4℃冰箱中，储存；
(2)：沙漠蓝藻细胞的液体培养：向150mL的三角瓶中倒入100mL新鲜培养基，盖上封口膜，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，过夜处理，第二天接藻，蓝藻细胞接种前，用20％氢氧化钾(KOH)将培养基调到藻种最适pH值，调好pH值，直接将10％接种比例将藻种接种至新鲜培养在基中；
(3)：沙漠蓝藻细胞的固体培养：沙漠蓝藻的固体培养是沙漠蓝藻细胞不断纯化和保藏纯种的关键，使用培养各种蓝藻所对应的BG11液体培养基，按照2％的比例加入琼脂粉，然后在121℃下，进行20min的灭菌后，冷却到70℃，在无菌条件下倒入培养皿，直到完全冷却，用接种环，挑取单藻落划线培养，直到长出单藻落后将单藻落挑到装有30mL液体培养基的小型培养皿内静置培养，待培养液颜色变绿，接种在三角瓶中扩大培养，得到纯藻种；
步骤2，用生工生物Ezup柱式植物基因组DNA抽取试剂盒，提取蓝藻细胞基因组DNA；
步骤3，以提取的沙漠蓝藻基因组DNA为模板，以mcyE基因序列作为扩增的目标区域片段，引物序列为mcyE-F2：5'-GAAATTTGTGTAGAAGGTGC-3'；mcyE-R4：5'-AATTCTAAAGCCCAAAGACG-3'；
步骤4，PCR反应体系，ddH2O，上下引物，DNA模板，2×TAP PCR Master Mix(TIANGEN)；
步骤5，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，51.5℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；
步骤6，Alphalmager200型凝胶成像系统拍照记录；所用的分子量标准为B500350(2000bp)。
上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (8)
1.一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，其特征在于：包括以下引物：mcyE-F2：5'-GAAATTTGTGTAGAAGGTGC-3'；mcyE-R4：5'-AATTCTAAAGCCCAAAGACG-3'。
2.根据权利要求1所述的一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，对沙漠蓝藻进行纯种培养；
步骤2，提取蓝藻细胞基因组DNA；
步骤3，以提取的沙漠蓝藻基因组DNA为模板，以mcyE基因序列作为扩增的目标区域片段，引物序列为mcyE-F2：5'-GAAATTTGTGTAGAAGGTGC-3'；mcyE-R4：5'-AATTCTAAAGCCCAAAGACG-3'；
步骤4，PCR反应体系，ddH2O，上下引物，DNA模板，2×TAP PCR Master Mix(TIANGEN)；
步骤5，Alphalmager200型凝胶成像系统拍照记录；所用的分子量标准为B500351(100bp～1000bp)。
3.根据权利要求2所述的一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述PCR反应体系为25μL，ddH2O 8.5μL，上下引物各0.5μL，DNA模板3μL，2×TAPPCR Master Mix(TIANGEN)12.5μL。
4.根据权利要求2所述的一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述步骤2中，用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒。
5.根据权利要求2所述的一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述步骤3中，以mcyE基因序列作为扩增的目标区域片段。
6.根据权利要求2所述的一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述步骤5中，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，51.5℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。
7.根据权利要求3所述的一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述PCR产物用含有五毒核酸染料的4S GreenPlus琼脂糖凝胶(1×TAE配制)电泳检测。
8.根据权利要求4所述的一种利用mcyE基因快速检测沙漠蓝藻微囊藻毒素的方法，其特征在于：所述PCR产物用含有五毒核酸染料的4S GreenPlus的浓度为2.0％。
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| US20070059699A1 (en) * | 2003-05-21 | 2007-03-15 | Kaarina Sivonen | Methods for detecting toxic and non-toxic cyanobacteria |
| CN101216416A (zh) * | 2008-01-17 | 2008-07-09 | 上海交通大学 | 产微囊藻毒素蓝藻的实时荧光定量pcr检测方法 |
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2022
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| CN108018339A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-05-11 | 中国科学院昆明植物研究所 | 高度降解样本中植物性dna的检测引物 |
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