CN114288463A

CN114288463A - 一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法

Info

Publication number: CN114288463A
Application number: CN202111514386.4A
Authority: CN
Inventors: 孟国路; 何坤; 毛战强; 崔含蕊
Original assignee: Pengtuo Biotechnology Hangzhou Co ltd
Current assignee: Pengtuo Biotechnology Hangzhou Co ltd
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN114288463B

Abstract

本发明提出了一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，采用Ⅰ型去端肽胶原蛋白，经过特异性酶切处理，免疫原性极低，大大降低了用于颅内、髓腔内引起免疫原性的风险。采用稳定剂保持胶原蛋白的活性，稳定剂可以是选自由白蛋白(人血清白蛋白)、甘露醇、乙酸钠(C2H3NaO2)、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和甘氨酸组成的组中的至少一种。稳定剂还有助于产品的储存。加入2%‑40%wt的聚乙二醇、聚乙烯醇、高分子透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷中的一种或几种促进胶原颗粒的再水合性，缩短与水充分混合时间。

Description

一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法。

背景技术

出血是创伤发生后最常见的临床表现之一，而出血失控被认为是导致病患者/伤员死亡的首要原因。目前，国内外的研究以及现有临床的体外止血材料主要包括海绵、纱布、止血粉等，成分大多为蛋白质类、多肽类、纤维素类、多糖类，以及人工合成材料等。

常规的止血纱布多数是基于纤维素及其衍生物，例如氧化再生纤维素，也可制成粉状物止血，但是由于在水环境下氧化再生纤维素中的羧基极易电离出H+，而呈现出酸性，Surgicel即采用氧化再生纤维素作为止血基材，已被报道出其产生的高酸性环境会通过一种弥漫性化学机制引起神经损伤，造成神经纤维变性，不适用在神经组织周围使用。

其中具有生物活性的材料越来越频繁地出现大众面前。明胶作为止血材料广泛应用，主要产品包括明胶海绵、明胶纤维、明胶膜等。明胶海绵具有疏松的多孔结构，可以吸收大量血液，通过激活部分凝血因子，激活血小板的附着，从而产生释放反应和聚集。此外，明胶海绵类止血产品，还可以通过其支架结构，通过对创伤部位进行机械压迫或填塞，起到对渗血创面的粘附作用，最终达到止血的目的。可吸收明胶海绵的降解速度较快，一般会在4～6周内被人体吸收，临床数据表明，在骨损伤止血手术中，明胶海绵比骨蜡的止血效果更好。但是，可吸收明胶植入体内后，会因吸收大量体液，其体积会膨胀至两倍以上，进而对周围组织产生压力。此外，明胶海绵的使用超过一定剂量后，还存在增加伤口部位感染率的危险。

胶原蛋白具有较低的抗原性、止血作用和细胞粘附能力，常用作止血剂和人工组织替代品的主要成分。另外，胶原蛋白提供了一个成纤维细胞可以通过使弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMPs)失活的环境，来增殖并诱导伤口愈合。但年化等开发了胶原基复合止血粉剂，（公布号CN103721247A）以及杨冰等开发了胶原止血粉（公布号CN105597144A），胶原材料经过一定处理后，止血性能经验证，有较好的效果止血效果。

无论是止血粉、纱布、海绵、或是其他形态的止血材料，共同的缺陷都在于应用场景无法满足在颅内腔，脊髓术后的止血，由于应用场景更为错综复杂，这些常规的止血产品并不能起到明显的作用。

目前国内临床应用体腔内止血的产品有美国强生公司的Surgiflo，以及尚未在中国应用的美国百特公司（Baxter）的产品--Floseal。强生公司的Surgiflo它有较好的止血功能，基于患者体内天然的凝血级联反应，通过将混合在氯化钙溶液中的凝血酶加入到明胶基质中而显示出止血效果。可用于结扎或常规手术无法有效控制或控制的出血，尤其是眼部以外部位的多区域手术时。它主要分为凝血酶、明胶和氯化钠三种溶液，需要一些时间来进行术前混合。植入后，一般在4-6周内被完全吸收。但目前已报道相关并发症：例如曾出现血肿、不吸收等情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，采用Ⅰ型去端肽胶原蛋白，经过特异性酶切处理，免疫原性极低，大大降低了用于颅内、髓腔内引起免疫原性的风险。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本申请公开了一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，具体包括如下步骤：

S1、胶原制备：将特异性胃蛋白酶进行酶切处理，制备得Ⅰ型去端肽胶原蛋白，得到质量分数为0.5%~15%的胶原蛋白溶液；

S2、冻干海绵：将再水合性物质与胶原蛋白溶液充分混合，再进行真空冻干处理，得到多孔海绵；所述再水合性物质为聚乙二醇、聚乙烯醇、高分子透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷中的一种或几种。

S3：交联：将多孔海绵完全浸没在EDC交联溶剂中进行交联浸泡处理，所述EDC交联溶剂中加入NHS，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：（0.5~4）；

S4：去残留：交联结束后，将多孔海绵浸入到去离子水中浸泡，去除残留，重复3-5次，每20-30分钟更换一次水；

S5：冻干：再次将去残留后的多孔海绵进行冻干处理，时间为24-48小时；

S6：研磨、过筛：将二次冻干的多孔海绵进行磨粉处理，并筛选出直径在150-750µm的颗粒；

S7：将筛选后的颗粒装入特殊定制的注射器中。

S8：另一特殊定制的注射器装有1-8mL的生理盐水，与步骤S7中的注射器相连，推动注射杆，来回6-8次，将生理盐水与止血粉混合，得到流体止血材料。

作为优选，具体包括如下子步骤：

S11、预处理：牛跟腱牛跟腱用乙醇、碳酸钠浸泡进行预处理、脱水

S12、酶解：加入胃蛋白酶，酶解3-4天；

S13、盐析：加入氯化钠，转速为100-250r/min，静置后过滤；

S14、将过滤后的胶原装入透析袋中，每12-18小时换一次水，透析4-6天，得到Ⅰ型去端肽胶原蛋白。

作为优选，所述步骤S2中再水合物质的质量分数为2%~25%，所述真空冻干处理的时间为36~72小时。

作为优选，所述步骤S3中交联浸泡处理的溶剂环境为60%~100%的乙醇，温度为4~37℃。

作为优选，每g多孔海绵使用20~150mL的交联溶液。

作为优选，所述步骤S5中冻干处理的时间为36~48小时。

作为优选，所述步骤S6中筛选的粉末颗粒直径为150-500µm。

作为优选，所述步S8所要求的生理盐水量为2-7mL。

本发明的有益效果：

采用Ⅰ型去端肽胶原蛋白，经过特异性酶切处理，免疫原性极低，大大降低了用于颅内、髓腔内引起免疫原性的风险。采用稳定剂保持胶原蛋白的活性，稳定剂可以是选自由白蛋白(人血清白蛋白)、甘露醇、乙酸钠(C2H3NaO2)、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和甘氨酸组成的组中的至少一种。稳定剂还有助于产品的储存。加入2%-40%wt的聚乙二醇、聚乙烯醇、高分子透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷中的一种或几种促进胶原颗粒的再水合性，缩短与水充分混合时间；

冻干后的胶原蛋白须经过磨粉、过筛处理。再与注射用水进行充分混合，形成水凝胶，由于水凝胶是多孔的，所以作为止血剂时，吸血率高，吸血后仍能保持水凝胶的形状，不降低止血效果，从而显示出优良的止血效果。此外，水凝胶的平均孔径可为50㎛至750㎛。如果平均孔径小于50㎛，则血液吸收率降低，如果超过750㎛，则吸收血液后水凝胶的形状不能保持，从而降低止血效果，其孔隙率维持在65%—90%，在去离子水和醋酸溶液中能保持较长时间，且未观察到明显溶胀，促进凝血效果优异；

本发明采用更安全更绿色的碳化二亚胺及其盐酸盐作为交联剂，其水溶性高，在制作过程中更易于去除残留。同时碳化二亚胺在体内引起组织钙化的量要远低于戊二醛导致的组织钙化；

本发明采用经过特殊工艺处理的去端肽Ⅰ型去端肽胶原蛋白。胶原蛋白可促进细胞粘附和增殖，从而加速受损组织的伤口愈合过程，相比之下，明胶是一种水解或热变性胶原蛋白，与胶原蛋白相比，它对细胞粘附、细胞增殖和血小板聚集的促进作用较小，胶原蛋白在体内降解后的产物为氨基酸，可被人体吸收或排出体外；

本发明流体止血材料经过再水合处理以及性能改造后，清理伤口后，能保持一定的量继续保护出血点，但同时不至于粘附性太强对创面造成二次伤害；

本发明采用干燥的胶原蛋白粉末为主基材，产品稳定性以及有效性更容易得到保证，贮存、搬运条件也更为简单。

本发明的特征及优点将通过实施例结合进行详细说明。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1：

S1 牛跟腱经处理后，制备得Ⅰ型去端肽胶原蛋白，胶原溶液质量分数为2.5%wt。

S2: 冻干海绵：将2%wt聚乙二醇、5%wt聚乙烯醇与胶原溶液充分混合，再将其冻干成海绵，时间为36小时。

S3：交联：将冻干后的海绵完全浸没在EDC交联溶剂中，溶剂环境为75%乙醇，温度为4℃。EDC摩尔浓度为5mM，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：0.5并且每g胶原海绵干品使用30mL的交联液。

S4：去残留：交联结束后，将海绵浸入到去离子水中浸泡，去除残留，重复3次，每30分钟更换一次水。

S5：冻干：再次将水洗后的样品进行冻干处理，时间为30小时。

S6：研磨、过筛：将二次冻干的海绵进行磨粉处理，过筛处理。

S7：将筛选后的粉末取1.0g装入特殊定制的注射器中，适度按压使颗粒紧密。

S8：另一注射器吸入3mL的生理盐水，与S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-400µm，EDC交联剂残留量小于20ppm。混合后，流体材料较干燥，注射器中的粉末未能全部充分混合，未混合部分约占针管的1/5，挤出时未能连续不间断挤出。样品孔隙率为79%，该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没24小时，不被醋酸或者水溶解；最终流体材料能够吸收4-5ml的新鲜羊血，未出现溢出，吸收性好，未引起溶胀反应。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为220±7s。

实施例2：

S1 牛跟腱经处理后，制备得Ⅰ型去端肽胶原蛋白，胶原溶液质量分数为3%wt。

S2: 冻干海绵：将3%wt聚乙烯醇、5%wt聚乙烯吡咯烷酮与胶原溶液充分混合，再将其冻干成海绵，时间为72小时。

S3：交联：将冻干后的海绵浸没在EDC交联溶剂中，溶剂环境为80%乙醇，温度为4℃。其摩尔浓度为5mM，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：1，且每g胶原海绵干品使用40mL的交联液。

S6：研磨、过筛：将二次冻干的海绵进行磨粉、过筛处理。

S8：另一注射器吸入4mL的生理盐水，与S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-400µm，EDC交联剂残留量小于10ppm。混合后，样品挤出时连续性较好，未出现断续状态，样品孔隙率为该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没8小时，不被醋酸或者水溶解；最终流体材料能够吸收5-7mL的新鲜羊血，未出现溢出，吸收性优异，且未引起溶胀反应。产品具有微粘性。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为180±11s。

实施例3：

S1 牛跟腱经处理后，制备得Ⅰ型去端肽胶原蛋白，胶原溶液质量分数为5%wt。

S2: 冻干海绵：将5%wt聚乙烯吡咯烷酮、10%wt右旋糖苷与胶原溶液充分混合，再将其冻干成海绵，时间为48小时。

S3：交联：将冻干后的海绵完全浸没在EDC交联溶剂中，溶剂环境为80%乙醇，温度为25℃。其摩尔浓度为10mM，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：1，且每g胶原海绵干品使用50mL的交联液。

S4：去残留：交联结束后，将海绵浸入到去离子水中浸泡，去除残留，重复4次，每30分钟更换一次水。

S5：冻干：再次将水洗后的样品进行冻干处理，时间为40小时。

S6：研磨、过筛：将二次冻干的海绵进行磨粉、过筛处理。

S7: 将筛选后的粉末取1.2g装入特殊定制的注射器中，适度按压使颗粒紧密。

S8：另一注射器吸入8mL的生理盐水，与S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-400µm，EDC交联剂残留量小于20ppm。充分混合后，样品挤出时，稠度较低，样品孔隙率为83%，该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没24小时，不被醋酸或者水溶解；由于共混时加入生理盐水量较多，最终流体材料能够吸收3-4mL的新鲜羊血，未引起溶胀反应。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为323±8s。

实施例4：

S1 牛跟腱经处理后，制备得Ⅰ型去端肽胶原蛋白，胶原溶液质量分数为5.5%wt。

S2: 冻干海绵：将10%wt聚乙二醇、8%wt高分子透明质酸与胶原溶液充分混合，再将其冻干成海绵，时间为72小时。

S3：交联：将冻干后的海绵完全浸没在EDC交联溶剂中，溶剂环境为80%乙醇，温度为25℃。其摩尔浓度为15mM，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：2，且每g胶原海绵干品使用50mL的交联液。

S6：研磨、过筛：将二次冻干的海绵进行磨粉、过筛处理。

S7：将筛选后的粉末取1.2g装入特殊定制的注射器中，适度按压使颗粒紧密。

S8：另一注射器吸入6mL的生理盐水，与步骤S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-400µm，EDC交联剂残留量小于20ppm。充分混合后，稠度适中，样品挤出时，在注射器管口，遇较大阻力，较难挤出，样品孔隙率为77%，该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没24小时，不被醋酸或者水溶解；由于共混时加入生理盐水量较多，最终流体材料能够吸收3-4mL的新鲜羊血，且未引起溶胀反应。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为280±6s。

实施例5：

S1 牛跟腱经处理后，制备得Ⅰ型去端肽胶原蛋白，胶原溶液质量分数为5%wt。。

S2: 冻干海绵：将5%wt聚乙二醇、5%wt聚乙烯醇、8%wt聚乙烯吡咯烷酮与胶原溶液充分混合，再将其冻干成海绵，时间为72小时。

S3：交联：将冻干后的海绵完全浸没在EDC交联溶剂中，溶剂环境为90%乙醇，温度为37℃。其摩尔浓度为20mM，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：2，且每g胶原海绵干品使用60mL的交联液。

S5：冻干：再次将水洗后的样品进行冻干处理，时间为48小时。

S6：研磨、过筛：将二次冻干的海绵进行磨粉、过筛处理。

S8：另一注射器吸入5mL的生理盐水，与步骤S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-500µm，EDC交联剂残留量小于20ppm。充分混合后，稠度适中，样品挤出时，能成型挤出，在注射器管口未遇到明显的阻力。样品孔隙率为68%，该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没24小时，不被醋酸或者水溶解；由于共混时加入生理盐水量较多，最终流体材料能够吸收5-7mL的新鲜羊血，且未引起溶胀反应。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为205±3s。

实施例6：

S1 牛跟腱经处理后，制备得Ⅰ型去端肽胶原蛋白，胶原溶液质量分数为3%wt。。

S2: 冻干海绵：将10%wt聚乙二醇、8%wt聚乙烯醇、6%wt聚乙烯吡咯烷酮与胶原溶液充分混合，再将其冻干成海绵，时间为60小时。

S3：交联：将冻干后的海绵完全浸没在EDC交联溶剂中，溶剂环境为100%乙醇（无水乙醇），温度为37℃。其摩尔浓度为35mM，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：4，且每g胶原海绵干品使用20mL的交联液。

S6：研磨、过筛：将二次冻干的海绵进行磨粉、过筛处理。

S8：另一注射器吸入4.8mL的生理盐水，与步骤S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-500µm，EDC交联剂残留量小于20ppm。充分混合后，稠度稍偏高，样品挤出时，能成型挤出，在注射器管口遇到略微的阻力。样品孔隙率为66%，该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没18小时，不被醋酸或者水溶解；由于共混时加入生理盐水量较多，最终流体材料能够吸收5-7mL的新鲜羊血，无溶胀反应。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为266±5s。

实施例7：

S2: 冻干海绵：将10%wt聚乙二醇、3%wt聚乙烯醇胶原溶液充分混合，再将其冻干成海绵，时间为36小时。

S3：交联：将冻干后的海绵完全浸没在EDC交联溶剂中，溶剂环境为60%乙醇，温度为37℃。其摩尔浓度为20mM，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：4，且每g胶原海绵干品使用150mL的交联液。

S5：冻干：再次将水洗后的样品进行冻干处理，时间为24小时。

S6：研磨、过筛：将二次冻干的海绵进行磨粉、过筛处理。

S7：将筛选后的粉末取1g装入特殊定制的注射器中，适度按压使颗粒紧密。

S8：另一注射器吸入4.5mL的生理盐水，与步骤S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-400µm，EDC交联剂残留量小于20ppm。充分混合后稠度适中，样品挤出时，在注射器管口遇到略微的阻力。样品孔隙率约为71%，该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没18小时，不被醋酸或者水溶解；由于共混时加入生理盐水量较多，最终流体材料能够吸收3-5mL的新鲜羊血，有略微溶胀反应。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为356±4s。

表一：

实施例	血凝结时间/S	实施例	血凝结时间/S
				实施例1	220±7	实施例5	205±3
实施例2	180±11	实施例6	266±5
				实施例3	323±8s	实施例7	356±4
实施例4	280±6

对比例1：将实施例1的S1中胶原浓度提高，且S2中去掉聚乙烯醇，冻干72小时。

S2: 冻干海绵：将8%wt聚乙二醇与胶原溶液充分混合，再将其冻干成海绵，时间为72小时。

S8：另一注射器吸入4mL的生理盐水，与步骤S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-500µm，EDC交联剂残留量小于20ppm。混合后，止血材料流体性能较好，注射器中的粉末未能全部充分混合，未混合部分约占针管的1/6，挤出时未能连续挤出。样品孔隙率为74%，该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没24小时，不被醋酸或者水溶解；最终材料能够吸收5-7ml的新鲜羊血，未出现溢出，未引起溶胀反应。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为245±4s。

对比例2：将实施例2中胶原浓度提高，且提高步骤S3中的交联浓度。

S3：交联：将冻干后的海绵浸没在EDC交联溶剂中，溶剂环境为80%乙醇，温度为4℃。其摩尔浓度为20mM，NHS与EDC的摩尔浓度比为EDC：NHS=4：1，且每g胶原海绵干品使用40mL的交联液。

S6：研磨、过筛：将二次冻干的海绵进行磨粉、过筛处理。

S8：另一注射器吸入4.5mL的生理盐水，与S7中的胶原颗粒相互混合。

由上述的方法制备而得的止血粉，颗粒直径在200-400µm，EDC交联剂残留量小于20ppm。混合后，止血材料流体性能较好，注射器中的粉末全部充分混合，挤出时，前端呈喷射状挤出，后续可连续挤出。样品孔隙率为81%，该流体止血材料在去离子水或 pH为4的醋酸溶液中浸没24小时，不被醋酸或者水溶解；最终材料能够吸收5-7ml的新鲜羊血，未出现溢出，溶胀等情况。轻微晃动试管，观察血液凝结时间为172±6s。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S2、冻干海绵：将再水合性物质与胶原蛋白溶液充分混合，再进行真空冻干处理，得到多孔海绵；所述再水合性物质为聚乙二醇、聚乙烯醇、高分子透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷中的一种或几种；

S6：研磨、过筛：将二次冻干的多孔海绵进行磨粉处理，并筛选出直径在150~750µm的颗粒；

S7：将筛选后的颗粒装入特殊定制的注射器中；

2.如权利要求1所述的一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，其特征在于，具体包括如下子步骤：

S12、酶解：加入胃蛋白酶，酶解3-4天；

S13、盐析：加入氯化钠，转速为100-250r/min，静置后过滤；

3.如权利要求1所述的一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，其特征在于：所述步骤S2中再水合物质的质量分数为2%~25%，所述真空冻干处理的时间为36~72小时。

4.如权利要求1所述的一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，其特征在于：所述步骤S3中交联浸泡处理的溶剂环境为60%~100%的乙醇，温度为4~37℃。

5.如权利要求1或4所述的一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，其特征在于：每g多孔海绵使用20~150mL的交联溶液。

6.如权利要求1所述的一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，其特征在于：所述步骤S5中冻干处理的时间为36~48小时。

7.如权利要求1~6所述的一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，其特征在于：所述步骤S6中筛选出直径为150~500µm的颗粒。

8.如权利要求1~6所述的一种流体胶原蛋白止血材料的研制方法，其特征在于：所述步骤S8中另一特殊定制的注射器装有2-7mL的生理盐水。