CN114272394A - 一种纳米探针的构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种纳米探针的构建与应用，本发明首先将载药前体分子、金属离子以及待包载药物溶于有机溶剂中，再将该有机溶剂滴入抗体蛋白溶液中完成自组装，最后除去有机溶剂并纯化溶液，从而通过非共价键方式将载药前体小分子与可对小分子结构域进行响应的抗体蛋白或白蛋白体系，以及金属离子、功能药物分子、纳米无机晶体相结合，最终制备得到纳米探针系统。本发明利用小分子和抗体蛋白的自组装构建得到纳米药物探针系统可以包载多种有机小分子、粒径均一、包裹效率高、具备目标细胞识别性能，同时本发明的制备成本低，可用于造影成像、药物靶向递送等领域，具有良好的医用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种纳米探针的构建与应用。
背景技术
纳米探针的研究在生物医学等领域有着广泛应用与潜在的价值。常规纳米探针的构建主要是利用抗体蛋白与具有影像作用的小分子或纳米粒子进行共价键化学修饰而获得；这类探针的尺寸一般在纳米尺度，具备良好的生物代谢性能，同时也具备抗体分子对病变目标区域的高效识别性能。
然而，许多具有影像作用的分子或纳米晶体具有疏水性，如超顺磁性四氧化三铁纳米晶体(SPIO)、IR780、吲哚菁绿(ICG)等，这些材料分子的超疏水性需要进行水相转化才能够实现生物学应用。同时，显影用的金属离子(如Fe3+、Mn2+等)由于具有较快的体内代谢性能而难以维系长效的显影需求。但实现靶向性及降低毒性是当前和今后治疗的重大需求。因此，如何增强金属离子的代谢性，以及疏水纳米材料和疏水性药物的水溶性是研究重点和热点。可见，有必要构建一种纳米药物系统以实现多种药物体系的包载需求；并使该体系对正常细胞具有良好的生物相容性以及对目标细胞的靶向性。
现有的纳米药物探针系统主要是先采用人造高分子聚合物体系装载疏水性纳米晶体与分子，再通过人造高分子聚合物与抗体蛋白结构上的氨基、巯基或羧基等进行化学偶联而制备得到。然而，由于抗体蛋白结构精细，化学基团的改变极易造成结构破坏，从而影响其生物功能。中国发明专利CN202110716626.2应用生物蛋白材料自身的结构特点实现了纳米晶体与药物的包载；但由于白蛋白体系缺少靶向性作用，难以实现特定目标识别，仍存在弊端。
因此，有必要开发一种新型纳米探针系统，以实现多种药物包载、粒径适中且分布均一、对目标细胞具有良好靶向性等特点。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法。
本发明的第二个目的是提供采用上述的基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法构建得到的基于蛋白自组装的纳米药物探针系统。该探针系统可包载多种有机小分子、粒径均一、包裹效率高、具备目标细胞识别性能。
本发明的第三个目的是提供上述的基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的应用。该探针系统可用于造影成像(磁学成像、光学成像)、药物靶向递送等领域，具有良好的医用前景。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，包括以下步骤：
S1、将药物、去铁斯若和金属离子溶解于有机溶剂中，制得溶液A，所述药物包括药物分子或/和无机晶体，所述药物为一种或多种，所述去铁斯若作为载药前体小分子；
S2、将抗体蛋白溶解于水中，制得溶液B；
S3、将溶液A逐滴超声滴入溶液B中，混匀后制得溶液C；
S4、溶液C去除有机溶剂后经超速离心制备得到基于蛋白自组装的纳米药物探针系统。
优选地，所述药物分子包括但不限于盐酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)、IR780、吲哚菁绿(ICG)，所述无机晶体包括但不限于SPIO、MnFe2O4。所述药物可以是单独的药物分子，或者多种药物分子，也可以是单独的无机晶体，或者多种无机晶体，还可以是无机晶体与药物分子的混合物体系。
优选地，所述金属离子为含有Mn2+、Fe2+、Fe3+其中之一的金属基氯化物。具体地，所述金属基氯化物为氯化铁。更优选地，所述金属基氯化物与去铁斯若的质量比为1:(1.5-10)。
优选地，所述去铁斯若与药物的质量比为(2-20):1。具体地，所述去铁斯若与药物的质量比为20:1。
优选地，所述去铁斯若在溶液A中的浓度为(1-5)mg/500uL。具体地，所述去铁斯若在溶液A中的浓度为2mg/500uL。
优选地，所述抗体蛋白包括但不限于CD133抗体蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白。具体地，所述抗体蛋白为CD133抗体蛋白。
本发明提供的纳米药物探针系统构建方法，先将载药前体去铁斯若与待包载药物及金属离子的混合物溶于有机溶剂中，通过芳香杂环间的π-π共轭和疏水相互作用以及金属离子的配位作用形成功能域，随后将该有机溶剂滴入含有多个疏水子结构域和氢键位点的抗体蛋白溶液中，使上述有机溶剂与抗体蛋白溶液在非共价相互作用下完成自组装，最后除去有机溶剂并经超速离心进行纯化后制备得到基于蛋白自组装的纳米探针探针系统。该探针系统实现了多种药物包载及对目标细胞具有靶向性等功能，可以满足生物医用需求。其机理如图1所示，待包载药物(如IR780等)及无机晶体【如SPIO(Fe3+)】在去铁斯若的作用下通过疏水相互作用以及配位作用形成功能域，该功能域可以与含多个疏水子结构域的抗体蛋白进行自组装，从而构建得到纳米探针系统。
本发明的纳米药物探针系统可以负载IR780等光热试剂；盐酸阿霉素、SPIO等抗肿瘤药物；Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+等金属离子。本发明通过小分子和抗体蛋白自组装制备得到的纳米探针系统可以包载多种药物、粒径均一、稳定性强、包裹效率高、并具备目标分子靶向识别作用，同时本发明的制备成本低，可用于磁学成像、药物递送、肿瘤靶向杀伤等领域，具有良好的医用前景。
优选地，所述有机溶剂为药物与去铁斯若载药前体混合后的优良溶剂。具体地，所述有机溶剂为四氢呋喃。
优选地，所述药物与抗体蛋白的质量比为(1-5):(10-20)。具体地，所述药物与抗体蛋白的质量比为2:10，以及2:20。
优选地，所述抗体蛋白在溶液B中的浓度为(10-20)mg/(2-20)mL。具体地，抗体蛋白在溶液B中的浓度为10mg/5mL，以及40mg/10mL。
优选地，溶液A与溶液B的体积比为1：(10-30)。具体地，溶液A与溶液B的体积比为1：10。
优选地，所述超速离心的离心速度为2000-8000rpm，分子截留量(MWCO)为3-10kDa，时间为5-30min。具体地，所述超速离心的离心速度为5000rpm，分子截留量(MWCO)为10kDa，时间为20min。
优选地，去除有机溶剂的方法为旋转蒸发法，旋转蒸发法的转速为10-120rpm，温度为20-45℃，时间为5-60min。具体地，旋转蒸发法的转速为120rpm，温度为45℃，时间为45min。
优选地，步骤S3的超声滴入时间控制在30s-5min，例如：30s-1min，1min-1min30s，1min30s-2min，4min30s-5min。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
采用上述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法构建得到的基于蛋白自组装的纳米药物探针系统。
本发明提出了一种基于抗体蛋白自组装的纳米药探针系统的构建方法，利用小分子和抗体蛋白的自组装构建得到纳米探针系统，该系统可以包载多种药物、粒径均一、稳定性强、包裹效率高、可针对目标细胞进行靶向识别。
本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：
上述的基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的应用，所述应用的领域包括但不限于药物靶向递送(比如制备肿瘤靶向治疗药物)，造影成像(磁学成像、光学成像)。
本发明构建得到纳米探针系统，除了可以包载多种药物或造影剂外，还可以针对目标细胞进行靶向识别(比如靶向识别神经干细胞)，从而改善了当前的蛋白体系纳米递药系统缺少靶向性作用，难以实现特定目标识别的缺陷，在靶向肿瘤药物等医学领域具有重要的应用价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种通过非共价键的方式构建基于蛋白自组装的纳米探针系统的方法，首先将待包载药物、去铁斯若小分子及金属离子溶于有机溶剂中，再将该有机溶剂滴入抗体蛋白溶液中完成自组装，最后除去有机溶剂并纯化溶液，从而使载药前体小分子与可对小分子结构域进行响应的抗体蛋白体系，以及功能药物分子、纳米晶体(无机晶体)相结合，最终制备得到纳米药物探针系统。总体而言，本发明具有以下优点：
(1)采用抗体蛋白与小分子体系自组装的方式构建纳米探针系统，可以实现药物分子、纳米晶体的单一组装，也可以实现多种协同组装，且装载成分可以更换，具备包载药物多样性的特点；
(2)构建得到的纳米探针系统以非共价键结合的方式为主，未破坏蛋白原有的化学键，生物功能稳定；
(3)以抗体蛋白作为生物大分子，为药物提供多种类型的氢键、疏水空间结构，使得该系统可以包载多种药物分子，并且具有良好的药物/无机晶体包载率，包载率达到25％-85％；
(4)以去铁斯若作为载药前体小分子，去铁斯若中的氨基、酚羟基化学极性强，易于形成氢键，并可以与金属螯合，也可以与含有多个疏水子结构域和氢键位点的蛋白实现自组装，从而使载药前体去铁斯若的增溶效果与蛋白的生物相容性共同作用于系统，最终使制得的纳米药物探针系统热力学稳定性高，粒径均一且适中；
(5)制备过程中所需的外界能量仅为通过超声法将有机溶液逐滴滴入蛋白溶液完成自组装所产生的能量，由于本发明的超声时长短，功率低，不会使系统由于过热而发生解组装的现象；
可见，本发明利用去铁斯若小分子和抗体蛋白的自组装构建纳米探针系统的方法，制备方法简单，制备成本低，且所得的纳米探针系统可以包载多种药物、粒径均一、稳定性强、包裹效率高，可用于造影成像(磁学成像、光学成像)、药物靶向递送、肿瘤靶向杀伤等领域，具有良好的医用前景。
附图说明
图1为纳米药物探针系统自组装的原理图；
图2为Anti-CD133@IR780纳米探针系统的粒径测试图；
图3为不同小分子与IR 780药物的质量比对纳米探针系统的包封率的影响；
图4为AntiCD133@SPIO纳米探针系统的粒径测试图；
图5为Anti-CD133@IR780&SPIO探针与Anti-CD133@IR780&SPIO探针对神经干细胞的识别效果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
第一类：基于抗体蛋白的自组装实现药物分子(单种或多种药物)的装载
实施例1IR780纳米探针系统的构建
(1)取2.0mg IR780、20mg去铁斯若(购买于上海源叶生物科技有限公司)、4mgFeCl3解于500uL四氢呋喃中，制得溶液A；
(2)取10.0mgAnti-CD133抗体蛋白溶解于5.0mL超纯水中，制得溶液B；
(3)将溶液A逐滴超声滴入溶液B中(即将溶液B置于超声波处理机上，然后在超声状态下逐滴滴入溶液A，超声滴入时间控制在1min30s)，滴完后继续超声处理1min30s，制得溶液C；
(4)溶液C在45℃下以120rpm的转速旋转蒸发45min，去除有机溶剂四氢呋喃，制得溶液D；
(5)在10kDa的分子截留量(MWCO)以及5000rpm的转速条件下对溶液D进行超速离心(20min)，得到抗体蛋白@IR780纳米粒子复合物，即IR780纳米药物探针系统，并将其命名为Anti-CD133@IR780。
采用多角度粒度分析仪(Brookhaven Omni)测得抗体蛋白Anti-CD133@IR780纳米体系的平均粒径约为80nm(如图2所示)；同时，通过超滤法分离游离药物，并根据《中国药典》中公布的包封率计算方法【包封率＝(系统中包封的药量/系统中包封及未包封的药量)×100％】，测定得到BSA@DOX的包载率约为87％。
实施例2携带阿霉素药物的纳米探针系统的构建
制备方法同实施例1，不同之处在于，将实施例1中的IR780替换为阿霉素，且步骤(2)为取40.0mgAnti-CD133抗体蛋白溶解于10mL超纯水中制得溶液B，且步骤(3)的超声滴入时间控制在5min，其他步骤同实施例1，得到蛋白@阿霉素纳米粒子复合物，即喜树碱药物纳米药物探针系统，并将其命名为样品Anti-CD133@阿霉素。
实施例3IR780-白蛋白纳米药物探针系统的构建
制备方法同实施例1，不同之处在于，将实施例1中的抗体CD133替换为牛血清白蛋白(BSA)，得到白蛋白@IR780纳米粒子复合物，即阿霉素纳米药物探针系统，并将其命名为样品BSA@IR780。
实施例4小分子与被包载药物的质量比对IR 780纳米探针系统的影响
制备方法同实施例1，不同之处在于，将实施例1中去铁斯若与IR780的质量比分别设置为：2，5，10，20，IR 780的用量为2.0mg。得到蛋白@IR780纳米粒子复合物，即IR 780纳米药物探针系统，并将其命名为样品BSA@IR780。
以小分子与被包载药物的质量比(去铁斯若与IR780的质量比)为横纵标，以包封率为纵坐标构建曲线图。如图3所示，在2-20的比例范围内，药物的包载率达到25％-85％。当小分子与被包载药物的质量比为20：1时，包封率最好，包封率约为85％。
实施例5ICG&IR780纳米探针系统的构建
制备方法同实施例1，不同之处在于，实施例5的步骤(1)为：取2.0mg ICG、取2.0mgIR780紫杉醇、7.5mg去铁斯若、5mg FeCl3解于500uL四氢呋喃中，制得溶液A；步骤(2)为：取20.0mg CD133抗体蛋白溶解于5.0mL超纯水中，制得溶液B；
最后制备得到Anti-CD133@ICG&IR780纳米粒子复合物，即ICG&IR780纳米探针系统，并将其命名为Anti-CD133@ICG&IR780。
第二类：基于蛋白的自组装实现无机晶体的装载
实施例6超顺磁氧化铁(SPIO)药物纳米药物探针系统的构建
制备方法同实施例1，不同之处在于，将实施例1中的IR780替换为SPIO，得到抗体蛋白@SPIO纳米粒子复合物，即SPIO药物纳米探针系统，并将其命名为样品Anti-CD133@SPIO。
采用多角度粒度分析仪(Brookhaven Omni)测得AntiCD133@SPIO的平均粒径约为95nm。
第三类：基于蛋白的自组装实现无机晶体与药物分子的协同装载
无机晶体与药物共同负载，在肿瘤治疗中可以增强对肿瘤细胞的杀伤作用，并且具有成像功能。
实施例7IR780&SPIO药物纳米探针系统的构建
制备方法同实施例1，不同之处在于，实施例12的步骤(1)为：取2.0mg IR780、2.0mg SPIO、50mg去铁斯若、5mg FeCl3解于500uL四氢呋喃中，制得溶液A；
最后制备得到抗体蛋白@IR780&SPIO纳米粒子复合物，即IR780&SPIO纳米药物探针系统，并将其命名为Anti-CD133@IR780&SPIO。
以BSA@IR780&SPIO(其制备见专利CN202110716626.2)探针系统为对照；将本实施例制备所得的Anti-CD133@IR780&SPIO探针系统与BSA@IR780&SPIO探针系统分别与人神经干细胞(购置于武汉赛奥斯生物科技有限公司)共孵育2小时，然后在808nm激发光下进行光学成像探究，发射光采用的滤光片为长通1000nm。
结果如图5所示，与BSA@IR780&SPIO相比，Anti-CD133@IR780&SPIO纳米探针系统呈现出较高的光学信号强度，显示出一定的靶向识别性能。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将药物、去铁斯若和金属离子溶解于有机溶剂中，制得溶液A，所述药物包括药物分子或/和无机晶体，所述药物为一种或多种；
S2、将抗体蛋白溶解于水中，制得溶液B；
S3、将溶液A逐滴超声滴入溶液B中，混匀后制得溶液C；
S4、溶液C去除有机溶剂后经超速离心制备得到基于蛋白自组装的纳米药物探针系统。
2.根据权利要求1所述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，其特征在于，所述金属离子为含有Mn2+、Fe2+、Fe3+其中之一的金属基氯化物。
3.根据权利要求2所述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，其特征在于，所述金属基氯化物与去铁斯若的质量比为1:(1.5-10)。
4.根据权利要求2所述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，其特征在于，所述金属基氯化物为氯化铁。
5.根据权利要求1所述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，其特征在于，所述去铁斯若与药物的质量比为(2-20):1。
6.根据权利要求1所述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，其特征在于，所述去铁斯若在溶液A中的浓度为(1-5)mg/500uL。
7.根据权利要求1所述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，其特征在于，所述抗体蛋白包括但不限于CD133抗体蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白。
8.根据权利要求1所述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法，其特征在于，所述药物分子包括但不限于盐酸阿霉素、IR780、吲哚菁绿，所述无机晶体包括但不限于SPIO、MnFe2O4。
9.采用权利要求1至8任一项所述的一种基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的构建方法构建得到的基于蛋白自组装的纳米药物探针系统。
10.权利要求9所述的基于蛋白自组装的纳米药物探针系统的应用，其特征在于，所述应用的领域包括但不限于药物靶向递送，造影成像。
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|---|---|---|---|---|
| CN116549657A (zh) * | 2023-07-12 | 2023-08-08 | 中国农业大学 | 一种促进动物白蛋白细胞内吞的方法及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2021148939A1 (en) * | 2020-01-20 | 2021-07-29 | Cage Chemicals S.R.L. | Iron complexes and salts thereof as contrast agents for mri |
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