CN114250168A

CN114250168A - 便秘致病菌及其用途

Info

Publication number: CN114250168A
Application number: CN202011023676.4A
Authority: CN
Inventors: 朱敏生; 陈鑫
Original assignee: Shaanxi Anning Yunsheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shaanxi Anning Yunsheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2022-03-29

Abstract

本发明涉及新的便秘致病菌及其筛选方法和用途。本发明还涉及包含所述便秘致病菌的组合物、鉴定所述便秘致病菌的试剂以及它们的用途。

Description

便秘致病菌及其用途

技术领域

本发明涉及细菌及其用途，具体涉及便秘致病菌及其用途。

背景技术

随着饮食结构改变、生活节奏加快和社会心理因素的影响，慢性便秘已成为一个高发慢性病症，其中我国成人慢性便秘患病率约4-10％，全球平均患病率高达16％。由于慢性便秘对患者的生活质量、身心健康、乃至生命安全产生巨大影响，同时也极大的增加社会医疗负担，慢性便秘的研究已成为慢性病研究的重大课题。虽然人们对慢性便秘进行了广泛的基础研究和临床研究，也取得了一些重要进展，但仍有72.9％的患者对目前便秘治疗效果不满意，尤其是顽固性慢性便秘除创伤极大的手术治疗外几乎无法治疗。目前研究认为，慢性便秘的发生过程十分复杂，但关键发病原因还不清楚，导致治疗新策略的发展十分缓慢。

便秘是一种症状，表现为排便困难(或)排便次数减少(每周少于3次)、粪便干硬，慢性便秘的病程至少为6个月。与慢性便秘相关的功能性疾病有：功能性便秘、阿片引起的便秘、便秘型肠易激综合征和功能性排便障碍，其中前三种属功能性肠病，后者属肛门直肠疾病(罗马IV标准)。根据慢性便秘病理特征可分为：慢传输型便秘(slow-transitconstipation,STC)、出口梗阻型便秘(rectal evacuation disorders)和混合型便秘。STC的形成是由于胃肠道传输功能障碍，即：肠内容物从结肠近端到结直肠远端的通过时间减慢，其临床主要表现为排便次数减少、无便意和排便困难，是慢性便秘的主要类型。目前的研究发现，引起STC的原因多种多样，主要分为功能性和器质性两种病因，其中器质性病因包括胃肠道病变、累及消化道的系统性疾病、硬化病、神经系统疾病等；功能性病因包括药物性、神经心理等。有意思的是，相当多的STC患者的发病原因并不清楚，呈原发性。这就提示：慢性便秘可能存在有未曾发现的未知病因。

关于慢性便秘的治疗主要有1.一般治疗：排便生理教育、改变饮食习惯等；2.药物治疗：通便药物、膨松剂、渗透性通便剂等；3.心理与生物反馈疗法：认知治疗、消除紧张等。许多患者通过解除病因和上述综合治疗，可以缓解或治愈慢性便秘，但仍有大量患者经上述治疗后依然无效或反复发作，表现为症状顽固性，这种功能性STC为顽固性便秘(intractable chronic constipation,ICC)。由于该类便秘对患者的身心健康影响极大，可考虑施行手术治疗，但手术治疗伤害很大，临床适应症选择十分谨慎。ICC是一种反复发作、顽固性慢性便秘，其发病机制也将更为复杂。ICC的难治性也提示该病症可能是某未知原因引起的，阐明其发病原因将可能改善治疗效果。

与其他STC一样，ICC的基本特征也是肠道传输速度变慢。关于传输变慢的原因，目前认为与胃肠神经-起搏细胞-平滑肌功能异常密切相关，但无法证实该功能异常是始发原因还是继发病变。通过大量的临床样本研究发现：在便秘时，肠神经系统(enteric nervoussystem，ENS)(如肠神经丛、神经结、肌间Cajal细胞等)发生了退行性改变，肠道细胞分泌活性分子的能力也发生明显改变。由此有人提出：ENS的退行性病变或肠道活性分子的异常分泌是肠道慢传输的重要机制。由于无法知晓引起ENS退行性病变和活性分子的异常分泌的原因，上述ENS等异常变化可能是便秘的继发过程。还有大量的证据支持这一观点，如：Cajal细胞网络破坏、ENS等病变是肠道异常收缩的继发病变；Cajal细胞缺陷(C-Kit基因突变)小鼠并不引起明显便秘。

近年来已发现肠道微生物与慢性便秘具有相关性，但也无法确定与慢性便秘的因果关系。有研究发现，慢性便秘发生时肠道微生物不但伴有菌群失调，而且改变患者肠道微生物组成往往可以改善便秘症状。这一现象提示慢性便秘与菌群失调有关，但遗憾的是仍然不能确定它是便秘的始发原因。众所周知，排便过程或肠道动力是肠道微生物更替的最主要机制，而便秘可导致肠道微生物更替减弱、乃至菌群失调。因此，菌群失调极可能是慢性便秘的继发改变。肠道慢传输的机制研究还任重道远，迫切需要寻求新的研究思路。因此，研究关键发病原因和发病机制、探讨新疗法是慢性便秘防治的关键课题。

发明内容

发明人发现抑制肠蠕动的细菌PIB(peristalsis inhibition bacteria)。

因此，本发明提供一种肠杆菌科细菌，其中，

(1)细菌的基因组在选自以下的一个或多个位置具有相应核苷酸：PIB2013.g.331A、PIB2324.g.562G、PIB2324.g.601A、PIB2629.g.1126T、PIB3156.g.2396T，

(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：

由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为A；

由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为G；

由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为A；

由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸为T；

由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为T；

(3)细菌的基因组具有选自SEQ ID NO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，或

(4)细菌的16S rDNA具有SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述细菌是志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)。

在一个或多个实施方案中，所述细菌是保藏登记号为CGMCC 20603的细菌菌株。

在一个或多个实施方案中，所述细菌抑制肠道蠕动，包括降低动物肠道蠕动的幅度、张力和/或频率。在一个或多个实施方案中，所述细菌使动物肠道蠕动幅度降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一个或多个实施方案中，所述细菌使动物肠道蠕动张力降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一个或多个实施方案中，所述细菌使动物肠道蠕动频率降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。

在一个或多个实施方案中，所述细菌降低肠传输速度。在一个或多个实施方案中，所述细菌降低肠传输速度至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％，优选降低20-30％，更优选降低约25％。

在一个或多个实施方案中，所述细菌降低动物粪便中的水含量至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％。

在一个或多个实施方案中，所述动物是哺乳动物，优选人。

在一个或多个实施方案中，所述肠道是小肠和/或大肠。在一个或多个实施方案中，小肠包括十二指肠、空肠、回肠。在一个或多个实施方案中，大肠包括盲肠、结肠、直肠。

本发明还提供一种组合物，包含本文任一实施方案所述的细菌或其无细胞提取物、过滤物、上清液或裂解液。

在一个或多个实施方案中，所述组合物是药物组合物，所述组合物还包含药学上可接受的辅料。

在一个或多个实施方案中，所述组合物是细菌培养物，所述组合物还包含培养基。在一个或多个实施方案中，所述培养基包含蛋白胨、牛肉提取物、NaCl、琼脂和无菌去纤维蛋白羊血。在一个或多个实施方案中，所述培养基包含蛋白胨、酵母提取物和NaCl。

在一个或多个实施方案中，所述组合物还包含其他抑制动物肠道蠕动的细菌或其无细菌提取物、过滤物、上清液或裂解液。

本发明还提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子：

(1)在对应于登记号为CGMCC 20603的细菌菌株的基因组的选自以下的一个或多个位置的位置处具有相应核苷酸：PIB2013.g.331A、PIB2324.g.562G、PIB2324.g.601A、PIB2629.g.1126T、PIB3156.g.2396T，

(2)具有选自以下的一个或多个特征：

由SEQ ID NO:9和10作为引物的扩增片段的第21个核苷酸为A；

由SEQ ID NO:11和12作为引物的扩增片段的第21个核苷酸为G；

由SEQ ID NO:13和14作为引物的扩增片段的第21个核苷酸为A；

由SEQ ID NO:15和16作为引物的扩增片段的第20个核苷酸为T；

由SEQ ID NO:17和18作为引物的扩增片段的第21个核苷酸为T；

(3)具有选自SEQ ID NO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，或

(4)具有SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。

(5)具有(1)-(4)中任一项的互补序列。

本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的核酸分子。

本发明还提供一种宿主细胞，包含本文所述的核酸分子或核酸构建物。

本发明还提供一种寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物扩增细菌基因组的产物包含：

(1)所述细菌的基因组中位于与登记号为CGMCC 20603的细菌菌株的基因组的选自以下的一个或多个位置对应的位置的核苷酸：PIB2013.g.331、PIB2324.g.562、PIB2324.g.601、PIB2629.g.1126、PIB3156.g.2396，

(2)选自以下的一个或多个位置的核苷酸：

由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；

由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；

由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；

由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸；

由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；

(3)选自SEQ ID NO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，或

(4)SEQ ID NO:1所示16S rDNA序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述细菌是志贺氏菌属细菌。优选地，所述细菌的保藏号为CGMCC 20603。

在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸引物识别本文所述的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸引物识别SEQ ID NO:1-6中任一所述序列，优选识别SEQ ID NO:2-6中任一所述序列。

在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸引物的扩增产物包含SEQ ID NO:1-6中任一所述序列，优选包含SEQ ID NO:2-6中任一所述序列。

在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸引物选自SEQ ID NO:7-18中任一种或多种。优选地，所述寡核苷酸引物是SEQ ID NO:9和/或10。

在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸引物用于扩增细菌基因组。

本发明还提供一种寡核苷酸探针，所述探针识别细菌的基因组的片段，所述片段包含

(2)所述细菌的选自以下的一个或多个位置的核苷酸：

由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；

由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；

由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；

由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸；

由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；或

所述探针识别SEQ ID NO:1所示16S rDNA序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。

在一个或多个实施方案中，所述探针识别SEQ ID NO:1-6中任一所述序列，优选识别SEQ ID NO:2-6中任一所述序列。

在一个或多个实施方案中，所述探针识别本文所述的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，所述探针用于与细菌基因组或其片段或本文所述引物的扩增产物杂交。

本发明还提供一种鉴定细菌或其基因组的试剂盒，包含检测细菌基因组中的SNP或点突变的试剂，

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含本文所述的寡核苷酸引物和/或探针和任选的作为对照的本文所述的核酸分子、细菌或组合物。所述试剂盒还包含使用所述引物和/或探针和任选的核酸分子鉴定细菌所需的其他试剂，例如缓冲液、核酸聚合酶、dNTP、荧光染料等。在一个或多个实施方案中，所述细菌是志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)。优选地，所述细菌是保藏登记号为CGMCC 20603的细菌菌株。

本发明还提供一种筛选抑制肠蠕动的细菌的方法，包括：使细菌或其提取物与肠道或其细胞或组织接触，和测量肠道蠕动参数。

在一个或多个实施方案中，所述细胞选自肠道平滑肌细胞、上皮细胞、神经细胞。

在一个或多个实施方案中，肠道组织包括平滑肌组织、上皮组织以及神经组织。

在一个或多个实施方案中，所述肠道组织的长度至少5mm，优选为管状。

在一个或多个实施方案中，所述细菌来自人或动物的肠或粪便。

在一个或多个实施方案中，所述参数是肠道蠕动幅度、张力、频率、肠道受去极化或配体刺激后的收缩反应和肠道的舒张效应。

在一个或多个实施方案中，所述肠道是哺乳动物肠道。优选8-10周龄的小鼠肠道。

在一个或多个实施方案中，所述肠道是空肠和/或结肠。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括：使所述细菌或其提取物与空肠接触，测量空肠蠕动参数，和所述细菌与结肠接触，测量结肠蠕动参数。

在一个或多个实施方案中，肠道蠕动幅度、张力和/或频率降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％的细菌是抑制肠蠕动的细菌。

在一个或多个实施方案中，所述测量通过力传感器(例如ADInstruments的MLT0202)进行。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括在使细菌与肠道或其细胞或组织接触前使用缓冲液平衡所述肠道或其细胞或组织。优选地，所述平衡液是不含Ca2+的HEPES-Tyrode(H-T)缓冲液。更优选地，所述平衡液包含140.6mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl,1.0mmol/L MgCl₂、10mmol/L HEPES和5.6mmol/L葡萄糖，pH为7.4。在一个或多个实施方案中，所述平衡持续约20-30分钟。

本发明还提供一种细菌培养方法，包括用适于培养细菌的培养基孵育本文所述的细菌或组合物。

在一个或多个实施方案中，所述培养基包含蛋白胨、牛肉提取物、NaCl、琼脂和无菌去纤维蛋白羊血。

在一个或多个实施方案中，所述培养基包含蛋白胨、酵母提取物和NaCl。

在一个或多个实施方案中，所述孵育的pH为6-8，优选7.2-7.4。

在一个或多个实施方案中，所述孵育的温度为35-40℃，优选37℃。

本发明还提供一种鉴定细菌的方法，所述方法包括检测细菌基因组中的SNP或点突变。

在一个或多个实施方案中，所述细菌是志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)。优选地，所述细菌是保藏登记号为CGMCC 20603的细菌菌株。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括鉴定：

(1)细菌的基因组在对应于登记号为CGMCC 20603的细菌菌株的基因组的选自以下的一个或多个位置的位置处具有相应核苷酸：PIB2013.g.331A、PIB2324.g.562G、PIB2324.g.601A、PIB2629.g.1126T、PIB3156.g.2396T，

(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：

在一个或多个实施方案中，所述方法包括鉴定细菌具有本文所述的核酸分子或其序列。

在一个或多个实施方案中，具有一个或多个所述相应核苷酸、核酸分子或序列的菌株被鉴定为CGMCC 20603。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括用本文任一实施方案所述的引物和/或探针检测细菌基因组的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括用识别SEQ ID NO:1-6中任意一个或多个序列的寡核苷酸引物扩增细菌的基因组的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括用SEQ ID NO:9-18中任一项所述的寡核苷酸引物扩增细菌的基因组的步骤。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括用16S rDNA的引物扩增细菌的基因组的步骤。在一个或多个实施方案中，所述16S rDNA的引物是扩增志贺氏菌属细菌的16S rDNA的引物。在一个或多个实施方案中，所述引物具有SEQ ID NO:7-8所示的序列。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括用选自以下的一组或多组的寡核苷酸引物扩增细菌的基因组的步骤：(1)SEQ ID NO:7和8，(2)SEQ ID NO:9和10，(3)SEQ ID NO:11和12，(4)SEQ ID NO:13和14，(5)SEQ ID NO:15和16，(6)SEQ ID NO:17和18。

在一个或多个实施方案中，所述方法是非诊断或治疗方法。

本发明还提供本文所述鉴定细菌的方法鉴定到的细菌。

本发明还提供本文任一实施方案所述的细菌或组合物在制备试剂中的用途，所述试剂用于抑制动物肠道蠕动、降低肠传输速度、降低动物粪便中的水含量或治疗受益于肠道蠕动能力下降的疾病，例如肠易激综合症，功能性胃肠病，腹泻、肠痉挛、肠炎、消化不良等。

本发明还提供一种体外抑制动物肠道蠕动或降低肠传输速度的方法，包括使所述肠道与本文任一实施方案所述的细菌或组合物接触。

本发明还提供本文任一实施方案所述的细菌或组合物的用途，用于抑制动物肠道蠕动、降低肠传输速度、降低动物粪便中的水含量或治疗受益于肠道蠕动能力下降的疾病，例如肠易激综合症，功能性胃肠病，腹泻等。

本发明还提供一种抑制动物肠道蠕动、降低肠传输速度、降低动物粪便中水含量或治疗受益于肠道蠕动能力下降的疾病的方法，包括向所述动物施用本文任一实施方案所述的细菌或组合物。

本发明还提供本文所述的寡核苷酸引物和/或探针，和任选的作为对照的核酸分子、细菌和/或组合物在鉴定细菌中的用途。在一个或多个实施方案中，所述细菌是志贺氏菌属细菌。优选地，所述细菌的保藏号为CGMCC 20603。

本发明还提供检测细菌基因组中的SNP或点突变的试剂在制备鉴定细菌基因组、鉴定肠道蠕动能力下降或诊断由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病的试剂盒中的用途，所述试剂寡核苷酸引物和/或探针，优选地，所述试剂是本文任一实施方案所述的寡核苷酸引物和/或探针，和任选的作为对照的核酸分子、细菌和/或组合物。

在一个或多个实施方案中，所述核酸分子、细菌和/或组合物是本文所述的核酸分子、细菌、组合物。

在一个或多个实施方案中，由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病包括慢性便秘、功能性便秘、阿片引起的便秘、便秘型肠易激综合征、功能性排便障碍。

在一个或多个实施方案中，慢性便秘包括慢传输型便秘(STC)、出口梗阻型便秘、混合型便秘。

在一个或多个实施方案中，慢传输型便秘(STC)是顽固性便秘(ICC)。

本发明还提供一种装置，其特征在于，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：

(a)鉴定细菌或肠道样品中是否包含细菌，所述细菌：

(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：

(4)细菌的16S rDNA具有SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少98％序列相同性的序列，

(b)根据(a)的结果鉴定菌株、鉴定肠道蠕动能力下降或诊断由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病。

在一个或多个实施方案中，(a)是鉴定细菌或肠道样品中是否具有本文所述的核酸分子或其序列。

在一个或多个实施方案中，(a)的结果显示具有所述一个或多个所述核苷酸、核酸分子或序列，则鉴定菌株为CGMCC 20603，或鉴定肠道蠕动能力下降，或诊断患有由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病。

在一个或多个实施方案中，(a)包括用本文任一实施方案所述的引物和/或探针检测细菌基因组的步骤。

在一个或多个实施方案中，(a)包括用识别SEQ ID NO:1-6中任意一个或多个序列的寡核苷酸引物扩增细菌的基因组的步骤。

在一个或多个实施方案中，(a)包括用SEQ ID NO:9-18中任一项所述的寡核苷酸引物扩增细菌的基因组的步骤。

在一个或多个实施方案中，(a)包括用16S rDNA的引物扩增细菌的基因组的步骤。在一个或多个实施方案中，所述16S rDNA的引物是扩增志贺氏菌属细菌的16S rDNA的引物。在一个或多个实施方案中，所述引物具有SEQ ID NO:7-8所示的序列。

在一个或多个实施方案中，(a)包括用选自以下的一组或多组的寡核苷酸引物扩增细菌的基因组的步骤：(1)SEQ ID NO:7和8，(2)SEQ ID NO:9和10，(3)SEQ ID NO:11和12，(4)SEQ ID NO:13和14，(5)SEQ ID NO:15和16，(6)SEQ ID NO:17和18。

本发明还提供一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述存储介质上存储有计算机程序，当所述计算机程序被处理器执行时，实现下述步骤：

(a)鉴定细菌或肠道样品中是否包含细菌，所述细菌：

(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：

本发明还提供一种筛选能提高或降低肠道蠕动能力或杀伤本文所述细菌的物质的方法，包括

(1)使候选物质与本文所述的细菌或其提取物或含有本文所述细菌的模型接触，

(2)接触后，本文所述细菌的数量、活性、和/或肠收缩等是候选物质作为目标物质的指示。

在一个或多个实施方案中，所述物质是生物体或化合物。

在一个或多个实施方案中，所述物质是细菌、噬菌体、抗生素、小分子化合物或大分子化合物。

在一个或多个实施方案中，模型为动物或其肠道、组织或细胞。

在一个或多个实施方案中，模型为小鼠。

本发明还包括由所述筛选能提高或降低肠道蠕动能力或杀伤本文所述细菌的物质的方法筛选的物质，所述物质优选噬菌体。

本发明的优点：

1、本文的图1和图4的体内外直接和间接结果共同证实PIB影响肠道运输。因此，本发明首次发现顽固性便秘的致病菌PIB，首次确定了细菌与慢性便秘的因果关系，提出顽固性便秘可能是感染性疾病。这与目前的研究中提示慢性便秘可能与肠道菌有关是完全不同的。

2、首次建立了PIB的检测方法：在复杂粪菌中检测某种单一菌是非常困难的，因为很难找到独有序列。本发明通过单核苷酸多态性(SNP)，成功建立了特定细菌(PIB)的检测方法。

3、根据本发明可进行慢性便秘的快速诊断、预警和治疗药物开发，具有广阔的产业前景。

附图说明

图1显示PIB抑制肠道蠕动的结果。A，在用PIB培养物治疗之前或之后的代表性结肠蠕动记录。B和C，在用PIB治疗之前或之后对结肠自发性张力和频率的定量。该值代表6个独立实验。*P<0.05；**P<0.01。

图2显示基于16S rRNA编码序列测序的PIB遗传学定位。通过PIB 16S核糖体RNA基因序列(rrs，1464bp)构建了系统进化树，并通过最大似然法将距离作为每个位点的碱基取代数进行了计算。在分支节点上列出了基于1000个复制的引导值(>80％)，系统树的分支长度与进化距离成正比。从GeneBank提取相关细菌的16S rrs。系统发育分析通过分子进化遗传分析软件7.0版进行。

图3显示通过PCR特异性检测粪便中的PIB。A，从健康人(20-29岁)收集粪便样品，并进行PCR2013分析。B，健康粪便与1至10⁶PIB细胞混合的PIB2013分析。M，核酸分子量标志；PIB，阳性对照。

图4显示野生型小鼠的植入和便秘诱导。每周一次给成年C57BL/6小鼠口服1x10⁹PIB细菌(0.1ml)，并在给药后第8周评估便秘表型。A，在给药后第一周末通过PCR2013测量粪便中PIB的存在。B，全肠道运输时间(CTR，n＝26；PIB，n＝25)。C，粪便含水量(CTR，n＝26；PIB，n＝25)。D，体重(CTR，n＝15；PIB，n＝15)。E，粪便重量(CTR，n＝21；PIB，n＝20)。用PIB培养基处理的小鼠用作对照(CTR)。F，小鼠的代表性结肠蠕动记录。G和H，在用PIB处理的小鼠和CTR小鼠中结肠自发张力和频率的定量(CTR，n＝15；PIB，n＝13)。I，PIB处理和CTR小鼠结肠的代表性组织学切片。**P<0.01。

具体实施方式

目前的研究提示慢性便秘可能与肠道菌有关，其主要证据是：慢性便秘肠道菌群发生改变、移植慢性便秘肠道菌可导致动物便秘表型的发生、粪菌移植有一定的治疗效果，但这些研究无法确定细菌与慢性便秘的因果关系。

本发明设计了致病菌筛选策略，从ICC黏膜中分离细菌，在有氧条件下培养细菌得到大量细菌克隆，然后鉴定各克隆是否具有抑制肠蠕动的能力。发明人经5年的寻找，发现具有抑制肠蠕动的细菌克隆，称之为PIB(peristalsis inhibition bacteria)。通过发现PIB菌，本发明首次确定了细菌与慢性便秘的因果关系，提出顽固性便秘可能是感染性疾病。

PIB

PIB菌从口腔或其他途径进入肠道，在肠道粘膜繁殖、产生致病物质，并抑制肠道的正常蠕动，导致肠传输速度减慢和便秘的发生。由于便秘的形成，肠道菌更新速度减慢，间接加重PIB在肠道局部的繁殖，引起肠道传输速度的进一步减慢，如此循环往复导致便秘持续发生。由于PIB具有粘膜菌特征，极难清除，从而导致顽固性便秘的发生。

本发明提供一种肠杆菌科细菌，优选志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)，所述细菌的基因组具有选自以下的SNP或点突变：PIB2013(g.331G>A),PIB2324(g.562A>G),PIB2324(g.601G>A),PIB2629(g.1126C>T),PIB3156(g.2396C>T)。具体地，所述细菌中，(1)细菌的基因组在选自以下的一个或多个位置具有相应核苷酸：PIB2013.g.331A、PIB2324.g.562G、PIB2324.g.601A、PIB2629.g.1126T、PIB3156.g.2396T，(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为A；由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为G；由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为A；由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸为T；由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为T；(3)细菌的基因组具有选自SEQ ID NO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，或(4)细菌的16S rDNA具有SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。本文所述志贺氏菌属细菌是保藏登记号为CGMCC 20603的细菌菌株。

术语“PIB2013(g.331G>A)”的SNP表示PIB细菌第2013个基因的第331个核苷酸由其他细菌(例如其他贺氏菌属细菌)的相应基因的相应位置处的G变为A。术语“PIB2013.g.331”则表示PIB细菌第2013个基因的第331个核苷酸。因此，术语“PIB2013.g.331A”表示PIB细菌第2013个基因的第331个核苷酸是A。以此类推。本文所述“点突变”主要指PIB细菌基因组相对其他细菌(例如其他贺氏菌属细菌)基因组相应位置处的碱基突变。

CGMCC 20603可在本领域周知的适合细菌的培养基中培养。示例性的培养基包含包含蛋白胨、牛肉膏提取物、NaCl、琼脂和无菌去纤维蛋白羊血，或包含蛋白胨、酵母提取物和NaCl。

核酸、核酸构建物和细胞

本发明还提供一种分离的核酸分子，其(1)在对应于登记号为CGMCC 20603的细菌菌株的基因组的选自以下的一个或多个位置的位置处具有相应核苷酸：PIB2013.g.331A、PIB2324.g.562G、PIB2324.g.601A、PIB2629.g.1126T、PIB3156.g.2396T，(2)具有选自以下的一个或多个特征：由SEQ ID NO:9和10作为引物的扩增片段的第21个核苷酸为A；由SEQID NO:11和12作为引物的扩增片段的第21个核苷酸为G；由SEQ ID NO:13和14作为引物的扩增片段的第21个核苷酸为A；由SEQ ID NO:15和16作为引物的扩增片段的第20个核苷酸为T；由SEQ ID NO:17和18作为引物的扩增片段的第21个核苷酸为T；(3)具有选自SEQ IDNO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，(4)具有SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少98％序列相同性的序列，或(5)(1)-(4)中任一项的互补序列。本发明还提供所述核酸分子的核酸构建物以及包含所述核酸分子或核酸构建物的宿主细胞。

本发明还提供寡核苷酸引物或探针，其识别上述核酸分子。在讨论引物或探针时，本文所述“识别”或“杂交”指探针与模板序列在严谨或高度严谨条件下杂交，所述严谨或高度严谨条件本领域周知，例如所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

本发明的寡核苷酸引物，其用于扩增细菌基因组，扩增产物包含：(1)所述细菌的基因组中位于与登记号为CGMCC 20603的细菌菌株的基因组的选自以下的一个或多个位置对应的位置的核苷酸：PIB2013.g.331、PIB2324.g.562、PIB2324.g.601、PIB2629.g.1126、PIB3156.g.2396，(2)选自以下的一个或多个位置的核苷酸：由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第212个核苷酸；由SEQ IDNO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸；由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；(3)选自SEQ ID NO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，或(4)SEQ ID NO:1所示16S rDNA序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。所述寡核苷酸引物识别SEQ IDNO:1所示的16S rDNA，或者识别SEQ ID NO:2-6所述序列。这些寡核苷酸引物可以用于鉴定志贺氏菌属细菌，例如本文所述的细菌。优选地，所述寡核苷酸引物的扩增产物包含本文所述细菌的16S rDNA或SEQ ID NO:2-6中任一所述序列。更优选地，所述寡核苷酸引物选自SEQ ID NO:7-18中任一种或多种。

本发明的探针是寡核苷酸探针，所述探针识别细菌(例如CGMCC 20603)的基因组的片段，所述片段包含(1)所述细菌的基因组中位于与登记号为CGMCC 20603的细菌菌株的基因组的选自以下的一个或多个位置对应的位置的核苷酸：PIB2013.g.331、PIB2324.g.562、PIB2324.g.601、PIB2629.g.1126、PIB3156.g.2396，(2)所述细菌的选自以下的一个或多个位置的核苷酸：由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸；由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；(3)选自SEQ ID NO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，或(4)SEQ ID NO:1所示16S rDNA序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。具体地，所述探针用于与细菌(例如志贺氏菌属细菌)基因组或其片段或本文所述引物的扩增产物杂交。所述探针识别本文所述细菌的16S rDNA和SEQID NO:2-6中任一所述序列。

肠道蠕动

本文所述细菌可以抑制肠道蠕动，包括降低动物肠道蠕动的幅度、张力和/或频率。例如，所述细菌使动物肠道蠕动幅度降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％；所述细菌使动物肠道蠕动张力降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％；所述细菌使动物肠道蠕动频率降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。本文所述细菌可以降低肠运输速度，例如降低肠传输速度至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％，优选降低20-30，更优选降低约25％。此外，所述细菌降低动物粪便中的水含量至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％。在一个或多个实施方案中，所述动物是哺乳动物，优选人。在一个或多个实施方案中，所述肠道是小肠和/或大肠。在一个或多个实施方案中，小肠包括十二指肠、空肠、回肠。在一个或多个实施方案中，大肠包括盲肠、结肠、直肠。测量动物肠道蠕动的幅度、张力和/或频率的方法本领域周知，例如全肠道运输分析(排便时间)和排便频率的测量、通过力传感器的肠蠕动(包括幅度、张力、频率)测量，木炭运输测试、钢珠排出测试、全肠传输速度测量等。示例性的测量全肠传输速度的方法包括：将动物禁食过夜，并用管饲法对其喂养100μL测试餐-5％伊文思蓝和1.5％甲基纤维素，记录第一次排泄蓝色粪便的时间。

筛选PIB

本发明包括筛选抑制肠蠕动的细菌的方法，包括：使本文所述的细菌或其提取物与肠道或肠道组织或肠道细胞接触，和测量肠道蠕动参数。所述细菌来自动物的肠或粪便。本文所述肠道蠕动参数是肠道蠕动幅度、张力和/或频率，肠道受去极化或配体刺激后的收缩反应，肠道的舒张效应。所述肠道是哺乳动物肠道，优选空肠和/或结肠。肠道组织和细胞可以是源自哺乳动物肠道的任何组织或其部分和其细胞，包括上皮组织、平滑肌组织，神经组织。肠道组织主要是含有肠道内表面的组织等。肠道或肠道组织或肠道细胞在与所述细菌接触前还可包括预处理步骤，本领域知晓测量肠道蠕动参数所用样品的预处理步骤，例如使用HEPES-Tyrode(H-T)缓冲液平衡所述肠道。

根据测量结果，肠道蠕动幅度、张力和/或频率降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％的细菌是抑制肠蠕动的细菌。所述测量可通过力传感器进行。

细菌培养

本发明还提供细菌培养方法，包括用适于培养细菌的培养基孵育本文所述的细菌或组合物。所述培养基可包含蛋白胨、牛肉提取物、NaCl、琼脂和无菌去纤维蛋白羊血，或包含蛋白胨、酵母提取物和NaCl。所述孵育的pH为6-8，优选7.2-7.4。所述孵育的温度为35-40℃，优选37℃。

组合物

本发明提供组合物，包含本文任一实施方案所述的细菌或其无细胞提取物、过滤物、上清液或裂解液。

本发明组合物可以是药物组合物，还包含药学上可接受的辅料。所述组合物还可包含其他抑制动物肠道蠕动的细菌或其提取物、过滤物、提取物、裂解物。所述药物组合物可以抑制动物肠道蠕动、降低肠传输速度、降低动物粪便中的水含量或治疗受益于肠道蠕动能力下降的疾病，例如腹泻。本文中，药学上可接受的辅料是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体、稀释剂和/或赋形剂，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂和防腐剂。更具体而言，合适的药学上可接受的辅料可以是本领域常用于肝细胞给药的辅料。通常，药物组合物中含有治疗有效量的细菌或其过滤物、提取物、裂解物。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。

本发明组合物还可以是包含本文所述的细菌的细胞培养物，所述组合物还包含培养基。所述培养基包含蛋白胨、牛肉提取物、NaCl、琼脂和无菌去纤维蛋白羊血，或包含蛋白胨、酵母提取物和NaCl。所述组合物还可包含其他抑制动物肠道蠕动的细菌。

细菌鉴定

发明人发现，除了16S rDNA之外，可通过鉴定不同种细菌的特征性SNP或点突变来实现细菌鉴定。所以，本发明包括通过确定细菌基因组中的SNP或点突变来鉴定细菌的方法、含检测所述SNP或点突变的试剂的试剂盒以及该试剂在鉴定细菌中的用途。本文使用此方法鉴定志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)。具体地，通过鉴定CGMCC 20603细菌的16S rDNA或SNP可鉴定CGMCC 20603。所述SNP包括CGMCC 20603的PIB2013(g.331G>A),PIB2324(g.562A>G),PIB2324(g.601G>A),PIB2629(g.1126C>T),PIB3156(g.2396C>T)。本文中，鉴定细菌的方法通常是非诊断或治疗方法。具体地，鉴定细菌的方法包含鉴定(1)细菌的基因组在对应于登记号为CGMCC 20603的细菌菌株的基因组的选自以下的一个或多个位置的位置处具有相应核苷酸：PIB2013.g.331A、PIB2324.g.562G、PIB2324.g.601A、PIB2629.g.1126T、PIB3156.g.2396T，(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为A；由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为G；由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为A；由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸为T；由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为T；(3)细菌的基因组具有选自SEQ ID NO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，或(4)细菌的16S rDNA具有SEQ ID NO:1所示序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。

本领域知晓实现所述鉴定所用的常规方法及其步骤、试剂。例如，可通过全基因组测序并比对上述SNP或PCR扩增含细菌特异序列的片段(例如本文所述的16S rDNA或SNP)以及任选的探针识别来获取鉴定结果。所以，在某些实施方案中，所述方法可包括用本文任一实施方案所述的引物和/或探针检测细菌基因组的步骤。在一个或多个实施方案中，所述方法包括用识别SEQ ID NO:1-6中任意一个或多个序列的寡核苷酸引物扩增细菌的基因组的步骤，示例性地所述引物如SEQ ID NO:9-18所示。其中，扩增的产物(1)所述细菌的基因组中位于与登记号为CGMCC 20603的细菌菌株的基因组的选自以下的一个或多个位置对应的位置的核苷酸：PIB2013.g.331、PIB2324.g.562、PIB2324.g.601、PIB2629.g.1126、PIB3156.g.2396，(2)选自以下的一个或多个位置的核苷酸：由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；由SEQ IDNO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸；由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸；(3)选自SEQ ID NO:2-6的任意一个或多个序列或其具有(2)中所述核苷酸的片段或与它们具有至少98％序列相同性的变体，或(4)SEQ ID NO:1所示16S rDNA序列或与其具有至少98％序列相同性的序列。具体地，所述方法包括用选自以下的一组或多组的寡核苷酸引物扩增细菌的基因组的步骤：(1)SEQ ID NO:9和10，(2)SEQID NO:11和12，(3)SEQ ID NO:13和14，(4)SEQ ID NO:15和16，(5)SEQ ID NO:17和18。在扩增上述序列的同时或之后，可通过测序或使扩增序列与探针杂交来确定序列是否含有上述特异性SNP。具有上述SNP的菌株被鉴定为CGMCC 20603。

或者，鉴定CGMCC 20603的方法包含用扩增志贺氏菌属细菌的16S rDNA的引物扩增细菌的基因组的步骤。示例性的扩增志贺氏菌属细菌的16S rDNA的引物具有SEQ ID NO:7-8所示的序列。

本领域知晓上述测序、PCR扩增、或探针杂交的步骤和除引物和探针之外的常规试剂，例如dNTP、聚合酶、连接酶、缓冲液、NaCl、KCl等。

鉴定肠道蠕动能力下降和诊断

通过鉴定肠道样品中是否含有本文所述的细菌，可以鉴定肠道蠕动能力下降或诊断由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病。因此，本文任一实施方案所述的寡核苷酸引物、探针可用于制备鉴定细菌或其基因组、鉴定肠道蠕动能力下降或诊断由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病的试剂盒。本文所述的核酸分子、细菌、组合物可作为试剂盒的阳性对照。

本文中，由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病包括慢性便秘、功能性便秘、阿片引起的便秘、便秘型肠易激综合征、功能性排便障碍。慢性便秘包括慢传输型便秘(STC)、出口梗阻型便秘、混合型便秘。示例性地，慢传输型便秘(STC)是顽固性便秘(ICC)。

装置

此外，本发明还揭示了存储计算机程序的计算机可读存储介质，存储介质上所存储的计算机程序运行后执行本文所述的诊断由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病的方法。结合本文中公开的实施方案描述的方法或算法的步骤可直接在硬件中、在由处理器执行的软件模块中、或在这两者的组合中体现。如果在软件中实现为计算机程序产品，则各功能可以作为一条或更多条指令或代码存储在计算机可读介质上或藉其进行传送。计算机可读介质包括计算机存储介质和通信介质两者，其包括促成计算机程序从一地向另一地转移的任何介质。存储介质可以是能被计算机访问的任何可用介质。作为示例而非限定，这样的计算机可读介质可包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其它光盘存储、磁盘存储或其它磁存储设备、或能被用来携带或存储指令或数据结构形式的合意程序代码且能被计算机访问的任何其它介质。示例性存储介质耦合到处理器以使得该处理器能从/向该存储介质读取和写入信息。在替换方案中，存储介质可以被整合到处理器。处理器和存储介质可驻留在ASIC中。ASIC可驻留在用户终端中。在替换方案中，处理器和存储介质可作为分立组件驻留在用户终端中。

治疗方法和用途

本发明提供一种体外抑制动物肠道蠕动或降低肠传输速度的方法，包括使所述肠道与本文任一实施方案所述的细菌或组合物接触。本发明还提供本文任一实施方案所述的细菌或组合物的用途，用于抑制动物肠道蠕动、降低肠传输速度、降低动物粪便中的水含量或治疗受益于肠道蠕动能力下降的疾病，例如腹泻。本发明还提供一种抑制动物肠道蠕动、降低肠传输速度、降低动物粪便中水含量或治疗受益于肠道蠕动能力下降的疾病的方法，包括向所述动物施用本文任一实施方案所述的细菌或组合物。

筛选物质

本文发现的细菌还可用于筛选能提高或降低肠道蠕动能力或杀伤本文所述细菌的物质。通过使候选物质与本文所述的细菌或含有本文所述细菌的模型(例如小鼠)接触，并在接触后检测本文所述细菌的数量和/或活性、和/或肠收缩，可以指示候选物质作为目标物质。筛选的物质可以是生物体或化合物。例如，细菌、噬菌体、抗生素、小分子化合物或大分子化合物。本文所述的“模型”可以是任何源自动物的具有感兴趣疾病或病症的模型，包括模型动物本身或其器官、组织或细胞。例如哺乳动物或其肠道、肠道组织或细胞。示例性的疾病模型是小鼠。

实施例

实施例1，实验方法：

标本和粪便细菌培养

从金陵医院(中国)的结肠大部切除术加改良Duhamel手术的ICC患者中收集新鲜的结肠节段。用普通溶液洗涤标本，并将细菌沉淀涂在血板上(1％蛋白胨，0.3％牛肉膏提取物，0.5％NaCl，1.5％琼脂和5％无菌去纤维蛋白羊血，pH7.3±0.1)，然后在37℃下培养12-16小时。将单克隆细菌接种到装有3ml LB培养基(1％蛋白胨胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl，pH7.3±0.1)的培养管中。收集培养物上清液并进行筛选。

肠蠕动检测和细菌筛选

对来自ICC结肠的细菌培养物上清液进行结肠的张力测量。简单地说，从8-10周龄的C57BL/6小鼠中分离出结肠段(长度约5mm)，并用不含Ca²⁺的HEPES-Tyrode(H-T)缓冲液(140.6mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,1.0mmol/L MgCl₂,10mmol/L HEPES,和5.6mmol/L葡萄糖,pH 7.4)平衡，然后安装在力传感器(MLT0202；ADInstruments)上连接到PowerLab(ADInstruments，中国上海)记录设备。在添加或不添加100uL细菌上清液的情况下记录结肠蠕动的幅度和频率。

全肠道运输分析

将小鼠禁食过夜，并用管饲法对其喂养100μL测试餐(5％伊文思蓝和1.5％甲基纤维素)。记录第一次排泄蓝色粪便的时间。

排便频率和含水量

自由喂食的小鼠在安静的环境中放置12h，最后2h收集粪便。粪便的数量代表排便的频率。通过比较新鲜粪便重量与干燥后的重量来测定粪便中的水含量。

系统发育树分析

用一对引物：PIB 16S-F，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO:36)和PIB 16S-R，GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:37)进行PIB 16S核糖体RNA基因(rrs)的PCR扩增。将所得的具有高度相似性的基因序列(SEQ ID NO:1)和rrs序列(细菌和古细菌)进行比对，并使用ClustalW软件进行聚类。使用分子进化遗传学分析软件(版本7.0.14)构建了系统树。结果如图2所示。

基因组测序和组装

在北京基因组研究所(中国深圳)，结合下一代测序平台(Illumina HiSeq 4000)和SMRT测序(PacBio RS II)对PIB基因组DNA进行了测序。根据制造商的方案进行了库构建、自校正和数据分析。

基因组成分预测和注释

是通过GLIMMER3(http://www.cbcb.umd.edu/software/glimmer/)使用HiddenMarkov模型预测蛋白质编码序列。使用三个数据库(tRNAscan-SE，RNAmmer和Rfam)对tRNA，rRNA和sRNA进行分析。串联重复序列由Tandem Repeat Finder(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)鉴定，并且根据重复单元的数量和长度识别小卫星DNA和微卫星DNA。使用The Genomic Island Suite of Tools(GIST，http://www5.esu.edu/cpsc/bioinfo/software/GIST/)、PHAge Search Tool(PHAST,http://phast.wishartlab.com/)和CRISPRFinder进行基因组岛(genomic island)、Prophage区和CRISPR区的预测。

CDS注释基于BLASTP，使用了七个数据库(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes；COG,Clusters of Orthologous Groups；NR,Non-Redundant ProteinDatabase databases；Swiss-Prot；GO,Gene Ontology；TrEMBL和EggNOG)。毒力因子和抗性基因分别根据VFDB(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria)和ARDB(AntibioticResistance Genes Database)数据库进行识别。通过EffectiveT3鉴定III型分泌系统效应蛋白。

粪便PIB细菌的检测

基于PIB基因组的特定区域，合成引物用于PCR测定。示例性的引物是PIB2013(g.331G>A)-F(SEQ ID NO:9)和-R(SEQ ID NO:10)，PIB2324A(g.562G>A)-F(SEQ ID NO:11)和-R(SEQ ID NO:12)，PIB2324B(g.601G>A)-F(SEQ ID NO:13)和-R(SEQ ID NO:14)，PIB2629(g.1126G>A)-F(SEQ ID NO:15)和-R(SEQ ID NO:16)，PIB3156(g.2396C>T)-F(SEQID NO:17)和R(SEQ ID NO:18)。

将收集的新鲜粪便或结肠段在37℃下培养过夜，然后用LB洗涤。

研究批准

所有动物实验均得到南京大学模式动物研究中心动物保护和使用委员会的批准，该委员会是实验室动物保护评估与鉴定协会(AAALAC)的成员。

统计学

所有数据均以平均值±SEM表示。两组之间的差异是使用GraphPad Prism版本7的双尾Student t检验分析确定。P<0.05被认为具有显著差异。

实施例2，蠕动抑制细菌的鉴定

从4例顽固性慢性便秘患者中收集了4例结肠活检样品，在血平板中进行细菌单克隆培养。然后，在所得菌落中，将数千个单克隆分别转移至3mL不含抗生素的LB培养基中，并在37℃下培养过夜。检测细菌培养物对肠蠕动的影响。由于空肠相对于结肠蠕动收缩频率更快，因此首先测量培养物对空肠蠕动的影响，然后证实对结肠的影响。经过大量筛选后，获得了具有明显抑制作用的三个菌落，且这些菌落即使传到第六代扔保持相同抑制作用。这些菌落均表现出相似的形态，其抑制活性也相似，尤其rrs序列相似性高达99.7％。因此认为这些菌落是相同的菌株(Shigella sp.PIB，于2020年9月7日以保藏号CGMCC 20603保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC))。在功能上，将该菌株命名为蠕动抑制细菌(PIB)。图1显示由力传感实验直接检测的添加PIB前后结肠蠕动的变化。PIB培养物对结肠蠕动的典型抑制作用如图1A所示，其中蠕动幅度和频率发生了显著变化(图1B和C)。对空肠蠕动的抑制作用类似于结肠。

实施例3，PIB的遗传表征

对PIB 16S核糖体RNA基因(1464bp)进行测序。系统发生树分析表明，PIB16S rrs最接近志贺氏菌属，具有较高的自举值(97％)。由于进化距离不接近痢疾志贺氏菌菌株(图2)，因此PIB是志贺氏菌属的新型菌株。与报道的志贺氏菌菌株相比，PIB的全基因组序列包含更多的非编码RNA和更少的基因(表1)。另外，这些菌株之间的基因组大小也不同。因此，PIB鉴定为志贺氏菌属的新型菌株。

表1，PIB基因组特征

实施例4，PIB检测的方法学建立

为了建立有效的PIB检测方法，分析了PIB基因组序列，但未找到PIB独有的独特基因或区域。然后分析了PIB DNA的单核苷酸多态性(SNP)或点突变。经过实质性筛选和优化后，找到特异性位点并开发了用于PIB检测的PCR测定法。为了评估这些位点测定的敏感性，分别将1至1000000个PIB细菌与健康粪便混合，然后进行PCR测定。示例性的五个候选位点分别为山梨醇脱氢酶编码区的g.331G>A突变，NADPH依赖性姜黄素还原酶编码区的g.562A>G突变，g.601G>A突变，3-氧酰基-(酰基载体蛋白)合酶II编码区的g.1126C>T突变和肠菌素合成酶编码区的g.2396C>T突变，引物如实施例1所述。为了评估这些位点的特异性，选取了24位健康成年人的粪便细菌各进行了PCR反应。结果表明，即使仅含有一个PIB，PCR2013也可以从粪菌检测到，显示出对PIB检测的高灵敏度(图3A)；PCR2013在24位健康成年人的粪便细菌中未产生阳性信号(图3B)。其余四个候选位点结果类似(结果未显示)。

实施例5，植入PIB诱导的便秘表型

为了测试PIB是否诱发便秘表型，每周对未经抗生素治疗的C57BL/6野生型小鼠口服PIB(0.1ml中含1x10⁹细菌)。给药后第一周结束时，在粪便中检测到PIB细菌，表明已成功植入小鼠体内(图4A)。给药后第八周，检查小鼠的肠蠕动，粪便性质和结肠组织学。与对照相比，用PIB处理的小鼠的胃肠运输时间(GTT)增加了126％(CTR:114±5分钟vs PIB:144±6分钟，p<0.01，图4B)，粪便中的水含量明显降低(CTR:30±2％vs PIB:18±2％，p<0.01，图4C)。这些组的体重和粪便干重是相当的(图4D和E)。离体张力测量显示，来自PIB处理的小鼠的结肠蠕动幅度和频率受到抑制(降低30％-100％)(图4F-H)，但未观察到明显的组织学改变(图4，I)。上述体内外结果共同表明，PIB能够有效地植入野生型小鼠，并足以诱导便秘表型。

实施例6，ICC患者中粪便PIB的存在

从三组人群中收集粪便细菌，即健康成年人(n＝17)，ICC患者(n＝19)和非ICC患者(n＝47)(表2)。健康的成年人的男/女比＝10/7。所有ICC患者均经金陵医院诊断并接受手术治疗。47例非ICC患者全部在金陵医院消化内科住院，其中40例被确诊为溃疡性结肠炎。接受治疗的7例自诊断为慢性便秘的患者未经ICC临床诊断。PCR2013分析表明，所有健康的成年人和非ICC患者均未显示粪便PIB，而13/19ICC患者则显示粪便PIB阳性。值得注意的是，PIB阳性的ICC患者随机分布于所有年龄段，并且与年龄无关。此外，PIB的出现与疾病史、治疗史和综合症严重程度无明显相关性(表3)。

表2，ICC患者信息

表3，人群统计学特征

本发明鉴定了一种来自ICC患者结肠粘膜的新型细菌菌株志贺氏菌Shigellasp.nov.PIB。PIB在离体和体内均显著抑制胃肠蠕动。在野生型小鼠中口服PIB能够诱导便秘表型。通过建立敏感的PCR方法，发现约68％的ICC患者粪便中PIB阳性，而所有对照人群均为PIB阴性，表明PIB与ICC密切相关，因此认为PIB是一些ICC的病原菌。

人体中PIB的鉴定具有重要的临床意义。由于所有对照组均表现为粪便PIB阴性，因此可将PIB阳性者视为ICC或潜在的ICC患者。粪便PIB的检测将成为ICC的重要诊断方法。通过使用分离出的PIB细菌，可以筛选合适的物质来杀死或修饰细菌，从而为ICC提供新的治疗药物。

序列表

<110> 陕西安宁云生生物技术有限公司

<120> 便秘致病菌及其用途

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4392

<212> DNA

<213> Unknown

<400> 1

attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac ggtaacagaa atcagcttgc 60

tgatttgctg acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgcct gatggagggg 120

gataactact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc 180

ttcgggcctc ttgccatcgg atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaacggc 240

tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga 300

cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct 360

gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg 420

aggaagggag taaagttaat acctttgctc attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc 480

taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 540

gcgtaaagcg cacgcaggcg gtttgttaag tcagatgtga aatccccggg ctcaacctgg 600

gaactgcatc tgatactggc aagcttgagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgta 660

gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa 720

gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780

cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg 840

cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg 960

gtcttgacat ccacagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac tgtgagacag 1020

gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaaccctta tcctttgttg ccagcggtcc ggccgggaac tcaaaggaga ctgccagtga 1140

taaactggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgac cagggctaca 1200

cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcata 1260

aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag 1320

taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc 1440

actttgtgat tcatgactgg ggtgattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc 1500

gaacggtaac agaaatcagc ttgctgattt gctgacgagt ggcggacggg tgagtaatgt 1560

ctgggaaact gcctgatgga gggggataac tactggaaac ggtagctaat accgcataac 1620

gtcgcaagac caaagagggg gaccttcggg cctcttgcca tcggatgtgc ccagatggga 1680

ttagctagta ggtggggtaa cggctcacct aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga 1740

tgaccagcca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 1800

atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gccatgccgc gtgtatgaag aaggccttcg 1860

ggttgtaaag tactttcagc ggggaggaag ggagtaaagt taataccttt gctcattgac 1920

gttacccgca gaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt 1980

gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggtttgt taagtcagat 2040

gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg catctgatac tggcaagctt gagtctcgta 2100

gaggggggta gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggag gaataccggt 2160

ggcgaaggcg gccccctgga cgaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 2220

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gacttggagg ttgtgccctt 2280

gaggcgtggc ttccggagct aacgcgttaa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 2340

ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 2400

atgcaacgcg aagaacctta cctggtcttg acatccacag aactttccag agatggattg 2460

gtgccttcgg gaactgtgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat 2520

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttt gttgccagcg gtccggccgg 2580

gaactcaaag gagactgcca gtgataaact ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 2640

atggccctta cgaccagggc tacacacgtg ctacaatggc gcatacaaag agaagcgacc 2700

tcgcgagagc aagcggacct cataaagtgc gtcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg 2760

actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tggatcagaa tgccacggtg aatacgttcc 2820

cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg ttgcaaaaga agtaggtagc 2880

ttaaccttcg ggagggcgct taccactttg tgattcatga ctggggtgat tgaacgctgg 2940

cggcaggcct aacacatgca agtcgaacgg taacagaaat cagcttgctg atttgctgac 3000

gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga taactactgg 3060

aaacggtagc taataccgca taacgtcgca agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt 3120

gccatcggat gtgcccagat gggattagct agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga 3180

cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac 3240

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg 3300

ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcggggag gaagggagta 3360

aagttaatac ctttgctcat tgacgttacc cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc 3420

agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca 3480

cgcaggcggt ttgttaagtc agatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcatctg 3540

atactggcaa gcttgagtct cgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 3600

gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacgaaga ctgacgctca 3660

ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 3720

tgtcgacttg gaggttgtgc ccttgaggcg tggcttccgg agctaacgcg ttaagtcgac 3780

cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 3840

cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggt cttgacatcc 3900

acagaacttt ccagagatgg attggtgcct tcgggaactg tgagacaggt gctgcatggc 3960

tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 4020

ctttgttgcc agcggtccgg ccgggaactc aaaggagact gccagtgata aactggagga 4080

aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgacca gggctacaca cgtgctacaa 4140

tggcgcatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg acctcataaa gtgcgtcgta 4200

gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgtggatc 4260

agaatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 4320

tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgcttaccac tttgtgattc 4380

atgactgggg tg 4392

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcaaatataa catctgcccg aacgttgatt ttatggcgac acaacctaac taccgcggcg 60

cattaacgca ctatctgtgt catccggaga gctttactta caaactgccc gacaatatgg 120

acacgatgga aggggcgctg gtggagcctg ccgcagtcgg gatgcatgcc gcgatgctgg 180

cagatgttaa accgggtaag aagataatta ttctgggagc gggttgtatt ggtttgatga 240

cgttgcaagc 250

<210> 3

<211> 393

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aaggttgcag ggtggtgggg gttgccggtg gcgcggaaaa atgccgccat gctaccgaga 60

tgttaggctt cgatgtatgc cttgatcacc acgcggatga ttttgccgaa caactggcga 120

aagcgtgccc gaaaggcgtt gatatctatt atgaaaacgt tggcggtaag gtattcgatg 180

cggtgctacc gttacttaat acatctgcgc gcattcccgt ctgcggctta gtgagcagct 240

ataacgctac agagctacca cccggcccgg atcgattacc tctgttgatg gctacggtgc 300

tgaaaaaacg tattcgcctg caaggattta ttatcgctca ggattatggt caccgcatcc 360

atgagtttca gaaggagatg gggcaatggg tga 393

<210> 4

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aatgccgcca tgctaccgag atgttaggct tcgatgtatg ccttgatcac cacgcggatg 60

attttgccga acaactggcg aaagcgtgcc cgaaaggcgt tgatatctat tatgaaaacg 120

ttggcggtaa ggtattcgat gcggtgctac cgttacttaa tacatctgcg cgcattcccg 180

tctgcggctt agtgagcagc tataacgcta cagagctacc acccggcccg gatcgattac 240

ctctgttgat ggctacggtg ctgaaaaaac gtattcgcct gcaaggattt attatcgctc 300

aggattatgg tcaccgcatc catgagtttc agaaggagat ggggcaatgg g 351

<210> 5

<211> 468

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gatggtgccg gtatgctggt acttgaagag tacgaacacg cgaaaaaacg cggtgcgaaa 60

atttacgctg aactcgtcgg ctttggtatg agcagcgatg cttatcatat gacgtcaccg 120

ccagaaaatg gcgcaggcgc agctctggca atggcaaatg ctttgcgtga tgcaggcatt 180

gaagcgagtc agattggcta cgttaacgca cacggtactt ctactccggc tggcgataaa 240

gctgaagcgc aggcggtgaa aaccatcttc ggtgaagctg caagccgtgt gttggtaagc 300

tccacgaaat ctatgaccgg tcacctgtta ggtgcggcgg gtgcagtaga atctatctac 360

tccatcctgg cgctgcgcga tcaggctgtt ccgccaacca ttaacctgga taacccggat 420

gaaggttgcg atctggattt cgtaccgtac gaagcgcgtc aggtcagc 468

<210> 6

<211> 426

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atgcatccgg tgccgccagg tgtggtgggt gatctctatc tcaccggtat tcaactggcg 60

caggggtatc tgggacgacc cgatctgacc gccagtcgct ttattgccga tccttttgcc 120

ccaggtgaac ggatgtaccg taccggagac gttgcccgct ggctggataa cggcgcagtg 180

gagtacctcg ggcgcagtga cgatcagcta aaaattcgcg ggcagcgtat cgaactaggc 240

gaaattgatc gcgtgatgca ggcgctgccg gatgtcgaac aggccgttac ccacgcctgt 300

gtgattaacc aggcggcagc cactggtggt gatgcgcgtc agttggtggg ctatctggtg 360

tcgcaatcgg gcctgccgtt ggataccact gcattgcagg cgcagttgcg cgaaacattg 420

ccaccg 426

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gcaaatataa catctgcccg a 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gcttgcaacg tcatcaaacc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aaggttgcag ggtggtgggg g 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tcacccattg ccccatctcc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

aatgccgcca tgctaccgag a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cccattgccc catctccttc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gatggtgccg gtatgctggt 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gctgacctga cgcgcttcgt a 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

atgcatccgg tgccgccagg t 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

cggtggcaat gtttcgcgca 20

Claims

1.一种肠杆菌科细菌，其特征在于，

(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：

由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为A，

由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为G，

由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为A，

由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸为T，

由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸为T，

优选地，所述细菌是志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)，

优选地，所述细菌抑制肠道蠕动。

2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，

所述细菌使动物肠道蠕动幅度降低至少30％，

所述细菌使动物肠道蠕动张力降低至少30％，

所述细菌使动物肠道蠕动频率降低至少30％，

所述细菌降低肠传输速度至少10％，和/或

所述细菌降低动物粪便中的水含量至少20％。

3.一种组合物，包含本文权利要求1或2所述的细菌或其提取物、过滤物、上清液或裂解液，

优选地，所述组合物是药物组合物，所述组合物还包含药学上可接受的辅料，

优选地，所述组合物是细菌培养物，所述组合物还包含培养基。

4.寡核苷酸引物或探针，其特征在于，

所述寡核苷酸引物扩增细菌基因组的产物包含：

(2)选自以下的一个或多个位置的核苷酸：

由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸，

由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸，

由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸，

由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸，

由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸，

(4)SEQ ID NO:1所示16S rDNA序列或与其具有至少98％序列相同性的序列；或者

所述探针识别的细菌基因组的片段包含：

(2)所述细菌的选自以下的一个或多个位置的核苷酸：

由SEQ ID NO:9和10作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸，

由SEQ ID NO:11和12作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸，

由SEQ ID NO:13和14作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸，

由SEQ ID NO:15和16作为引物的基因组扩增片段的第20个核苷酸，

由SEQ ID NO:17和18作为引物的基因组扩增片段的第21个核苷酸，或

所述探针识别SEQ ID NO:1所示16S rDNA序列或与其具有至少98％序列相同性的序列，

优选地，所述细菌是志贺氏菌属细菌。

5.一种鉴定细菌或其基因组的试剂盒，包含检测细菌基因组中的SNP或点突变的试剂，

优选地，所述细菌是志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)

优选地，所述试剂是寡核苷酸引物或探针，更优选是权利要求4所述的寡核苷酸引物或探针。

6.一种筛选抑制肠蠕动的细菌的方法，包括：使细菌或其提取物与肠道或其细胞或组织接触，和测量肠道蠕动参数，

优选地，所述细菌是志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)，

优选地，所述参数选自肠道蠕动幅度、张力、频率、肠道受去极化或配体刺激后的收缩反应和肠道的舒张效应，更优选地，所述肠道蠕动幅度、张力和/或频率降低至少30％的细菌是抑制肠蠕动的细菌，

优选地，所述肠道是哺乳动物肠道，优选是空肠和/或结肠。

7.一种鉴定细菌的方法，所述方法包括鉴定细菌基因组中的SNP或点突变，

优选地，所述细菌是志贺氏菌属细菌(Shigella sp.)，

优选地，所述方法包括鉴定：

(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：

其中，所述方法是非诊断或治疗方法。

8.检测细菌基因组中的SNP或点突变的试剂在制备鉴定细菌基因组、鉴定肠道蠕动能力下降或诊断由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病的试剂盒中的用途，

优选地，所述试剂是寡核苷酸引物或探针，更优选是权利要求4所述的寡核苷酸引物或探针，

优选地，由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病包括慢性便秘、功能性便秘、阿片引起的便秘、便秘型肠易激综合征、功能性排便障碍。

9.一种装置，其特征在于，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：

(a)通过检测细菌基因组中的SNP或点突变来鉴定细菌或肠道样品中是否包含细菌，和

(b)根据(a)的结果鉴定菌株、鉴定肠道蠕动能力下降或诊断由肠道蠕动能力下降引起的肠道疾病，

优选地，所述细菌中：

(2)细菌的基因组具有选自以下的一个或多个特征：

10.一种筛选能提高或降低肠道蠕动能力或杀伤权利要求1所述细菌的物质的方法，包括

(1)使候选物质与权利要求1的细菌或权利要求2所述的组合物或含有所述细菌或组合物的模型接触，

(2)接触后，所述细菌的数量、活性、和/或肠道蠕动增强是候选物质作为目标物质的指示。