CN114225983B - 用于长dna分子长度筛分的微流芯片、装置及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于长DNA分子长度筛分的微流芯片、装置及其应用方法，本方案通过在单分子DNA与单个磁性微米球进行连接，形成DNA‑磁性微球组合体，通过作用在磁性微球上的磁场力和作用在DNA分子上的电场力共同作用，使得不同长度的DNA组成的DNA‑磁性微球组合体运动到对应的力平衡位置，从而实现DNA分子长度筛分；本方案具有设备简单，操作简易，通用性强等优点，相较于传统装置，本方案不依赖含空隙基质或微纳结构对DNA运动的阻力，同时也不受固定的基质空隙或微纳结构尺寸的约束，因此其能显著提高长DNA分子的筛分速度(秒级)和可筛分的DNA分子量范围(几百到几十万碱基对)，该方案对长DNA分子的筛分和操控以及微流芯片技术的发展具有重要意义。

Description

用于长DNA分子长度筛分的微流芯片、装置及其应用方法
技术领域
本发明涉及微纳米技术和分子生物技术领域，尤其涉及用于长DNA分子长度筛分的微流芯片、装置及其应用方法。
背景技术
DNA分子操控和分析是当前生物和医学研究应用的基础。其中，DNA长度筛分是实现DNA制备、提纯、长度分析和信息检测的重要技术。
当前DNA长度筛分主要是利用基于分离基质的电泳方法。电泳方法通过作用在带负电荷的DNA磷酸骨架上的电场力驱动DNA穿过带有空隙的分离基质(通常为凝胶类物质)，电场力和分离基质阻力的共同作用导致不同大小DNA运动速度不同，进而实现DNA长度筛分。直流电泳是应用最广泛的电泳方法(Smisek，1990，DOI：10.1126/science.2349481；TJamil，1985，DOI：10.1080/07391102.1985.10507612；刘永峰，CN107365857A)。然而，由于分子量较大的DNA难以通过分离基质的空隙，运动速度差异较小，因此直流电泳方法难以对高分子量DNA(大于2万碱基对)进行有效筛分。
随着单分子DNA信息分析、单细胞染色体提取分析、人工染色体构建与检测等生物医学研究的发展，对较宽分子量范围DNA样品进行和筛分的需求日益增加。例如，交流(脉冲)电泳通过给DNA更大驱动力和更多运动自由度，实现较高分子量DNA的筛选(陈洪友，2017，DOI：10.13590/j.cjfh.2017.06.002；田云屏，2019，DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2019.22.045；王林林，CN105671166A；韩辉，CN102305823A；杨弘，CN103196980A)。然而，随之而来的问题是交流(脉冲)电泳方法耗时长(小时到天)并且产生不利于DNA稳定的高温。
含有微结构的微流芯片通过芯片中的含空隙基质或微纳结构提供和DNA分子大小相关的运动阻力，从而实现DNA分子的长度筛分(Lee，2020，DOI：10.1186/s40580-019-0212-3；Baba，2003，DOI：10.1063/1.1602555；Fu，2006，DOI：10.1103/PhysRevLett.97.018103)。该方法可以实现微量DNA样品的长度筛分和操控，并且具有发展成一体化微流芯片检测系统的潜力。然而，该方法具有以下缺点：
(1)该方法筛分的DNA分子的长度范围和微流沟道中固定的基质空隙或微纳结构的尺寸直接相关，因此可筛分的DNA分子量的范围有限；
(2)由于该方法依然需要加工具有特定尺寸的微纳结构，因此芯片加工较昂贵，并且有芯片容易堵塞等问题。近期，基于组合力场的无分离基质(或微纳结构)微流芯片技术开始崭露头角，例如，利用介电泳方法(Gallo，2009，DOI：10.1002/elps.20090035；Jones，2017，DOI：10.1021/acs.analchem.6b03369；水玲玲，CN112034029A)。该方法避免了在微流芯片中构建微纳米结构，从而避免了上述含微结构微流芯片存在的问题。然而该类方法依然存在不足，例如，利用介电泳分离出DNA，可能会出现分离出来的DNA带模糊、DNA带缺失、不规则DNA带迁移、带弱或无DNA带等现象；无基质微流芯片的装置和芯片加工也比较复杂。
综上所述，目前适用于较宽分子量(几百到几十万碱基)、小样品量DNA的快速长度筛分和实时检测的方法尚需构建。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于长DNA分子长度筛分的微流芯片、装置及其应用方法，通过将单分子DNA与单个磁性微球进行连接，形成DNA-磁性微球组合体，通过作用在磁性微球上的磁场力和作用在DNA分子上的电场力共同作用下实现不同长度的DNA组成的DNA-磁性微球组合体运动到对应的力平衡位置，进而实现DNA分子的操控和长度筛分。
为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
一种用于长DNA分子长度筛分的微流芯片，其包括芯片主体、电源和磁场组件，所述芯片主体内设置有延伸至芯片主体两端的微流沟道，且微流沟道的一端设为输入端，其另一端设为输出端，所述微流沟道的输入端至输出端方向上依序设有变截面沟道和收缩通道；所述变截面沟道的截面轮廓为喇叭形，其小口端与收缩通道的一端连通；所述变截面沟道的大口端和小口端均设有电极，所述电极分别与电源连接且电极之间形成的电场覆盖变截面沟道，所述芯片主体的一侧设有磁场组件，该磁场组件与电源连接且用于生成覆盖变截面沟道的磁场。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述电极之间形成的电场强度为-100～100V/m；所述电场向DNA磷酸骨架上的负电荷施加静电力；磁场组件可以为线圈组件，而线圈组件通电后，其覆盖所述变截面沟道的磁场为匀强磁场；匀强磁场是指内部磁场的强弱和方向处处相同的磁场，它的磁感线是一系列疏密间隔相同的平行直线，匀强磁场的施加方法借助于两块条形磁铁平行放置，两磁铁之间会产生匀强磁场，或者通过电磁线圈产生均匀磁场。所述的磁场在变截面微流沟道区域强度一致，并且使得磁性微球所受磁场力方向和DNA分子所受静电力方向相反。
作为一种较优的实施选择，优选的，所述变截面沟道的长度为50～5000μm，高度为10～1000μm，其大口端和小口端的收缩比为5～50；所述微流沟道的宽度为600μm；所述微流沟道的高度为50μm；所述收缩通道与所述微流沟道之间的连接部形成的收缩比为100∶1～2∶1。
作为一种较优的实施选择，优选的，所述变截面沟道的长度为300或400μm；所述收缩通道与微流沟道之间的形成的收缩比为10∶1。
作为一种较优的实施选择，优选的，所述芯片主体为PDMS、PMMA、COC、玻璃、硅或金属材料通过紫外光刻、热压、离子束刻蚀、湿法腐蚀、3D打印、机械加工中的一种以上加工方法加工成型，其中，PDMS是聚二甲基硅氧烷主链的高分子聚合物，在侧链上可以进行一些功能性基团的化学性能的修饰，具有良好的介电性能与一定的透气效果；PMMA俗称有机玻璃，化学名称为聚甲基丙烯酸甲酯，具有高透明度、低价格、易于机械加工等优点，可以形成良好的薄膜和良好的介电性能。COC材料是具有环状烯结构的非晶体透明共聚高分子物体，具有良好的耐化学性、成塑性等优点；另外，紫外光刻首先在硅片表面覆盖一层具有高度光敏感性光刻胶；其次再利用紫外线透过掩模照射在硅片表面；最后被光线照射到的光刻胶会发生反应；离子束刻蚀是利用具有一定能量的离子轰击材料表面，利用化学反应过程去除待刻蚀区域的薄膜材料。
作为一种较优的实施选择，优选的，所述电极为通过电化学沉积、机械装配、物理沉积、蒸镀中的一种以上方法加工成型，所述微流芯片为封闭结构，其通过热压结合、阳极键合、等离子键合中的一种以上进行封装；其中，电化学沉积是指在外电场作用下电流通过电解质溶液中正负离子的迁移并在电极上发生得失电子的氧化还原反应而形成镀层的技术。机械装配是指按照设计的技术要求实现机械零件或部件的连接，把机械零件或部件组合成机器。物理沉积中的物理气相沉积是指在真空条件下采用物理方法将材料源表面气化成气态原子或分子，或部分电离成离子，并且通过低气压气体过程，在基体表面沉积具有某种特殊功能的薄膜的技术。蒸镀是将材料在真空环境中加热，使之气化并沉积到基片而获得薄膜材料的方法。
基于上述方案，本发明还提供一种用于长DNA分子长度筛分的装置，其包括上述所述的用于长DNA分子长度筛分的微流芯片；其还包括：
驱动单元，用于提供输入动力；
注射器，用于容置溶液样品，其固定在驱动单元上，所述注射器的输出端通过样品注入管与微流芯片的微流沟道输入端连通，所述注射器的推杆端与驱动单元的动力输出端连接，由驱动单元的动力输出端推动注射器的推杆进行输出溶液样品，令溶液样品被注入到微流沟道中；
收集容器，通过收集管与微流芯片的微流沟道输出端连通，且用于收集被筛分分析后的DNA分子溶液。
作为一种较优的实施选择，优选的，所述长DNA分子的长度范围为102碱基对到106碱基对。
作为一种较优的实施选择，优选的，所述驱动单元包括高压注射泵驱动单元、气压驱动单元、手动驱动单元或离心力驱动单元，优选通过注射泵驱动，并可通过改变注射泵的注入速率或驱动气压的大小实现DNA分子溶液驱动速率的调整。
基于上述方案，本发明还提供一种长DNA分子长度筛分方法，其应用有上述所述的用于长DNA分子长度筛分的装置，所述方法包括如下步骤：
S01、将不同长度的单分子DNA与单个磁性微球进行连接形成DNA-磁性微球组合体；
S02、将DNA-磁性微球组合体加入到注射器中，通过驱动单元将注射器中的DNA-磁性微球组合体注入到微流芯片的输入端；
S03、将变截面沟道的电极与电源连通，同时接通磁场组件和电源，令DNA-磁性微球组合体在途经微流沟道内设置的变截面沟道和收缩通道时，受到变截面沟道内电极产生的电场和磁场组件产生的磁场作用，使不同长度的单分子DNA组成的DNA-磁性微球组合体受电场、磁场作用而运动到对应的力平衡位置，实现DNA分子长度筛分，其中，DNA-磁性微球组合体受到电场的作用力和受到磁场的作用力相反，简而言之，本步骤通过在变截面的微流沟道两端施加电压，沟道内离子溶液中将产生电场强度大小与沟道截面积成反比的电场，优选的电场强度变化范围为-100～100V/m。所述电场向DNA磷酸骨架上的负电荷施加静电力，另外，所述磁场在变截面微流沟道区域强度一致，并且使得磁性微球所受磁场力方向和DNA分子所受静电力方向相反；
S04、被筛分分析后的DNA分子溶液被收集至收集容器中。
作为一种较优的实施选择，优选的，S01中，不同长度的单分子DNA与单个磁性微球通过静电作用、壳聚糖包覆或链霉亲和素处理连接形成DNA-磁性微球组合体；其中，磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型的磁性材料，其制作可以通过适当的方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性以及特殊结构的复合微小球；另外，静电作用包括静电引力和静电斥力；“壳聚糖包覆”具有相容性和成膜性好，现目前壳聚糖原料主要是在虾壳或者蟹壳中提取；“链霉亲和素”是与亲和素具有相似生物特性的一种蛋白质，是从细菌阿维丁链霉菌中纯化出的一种60kDa的蛋白质。
作为一种较优的实施选择，优选的，S02中，驱动单元将注射器中的DNA-磁性微球组合体以0.05ml/min～8ml/min的速度注入到微流芯片的输入端。
本方案中，所述DNA-磁性微球组合体的力平衡位置是由作用在磁性微球上的磁场力和作用在DNA分子上的电场力共同作用确定的。其中，DNA上的静电力大小与DNA分子量和当地电场强度的乘积成正比；磁性微球上的磁场力保持不变。特定分子量的DNA-磁性微球组合体在微沟道中有特定的受力平衡位置。当DNA-磁性微球组合体偏离平衡位置时，磁力和静电力的合力作用将驱动DNA-磁性微球组合体回到平衡位置。
本方案中，所述的DNA分子长度筛分可以通过光学显微镜观察磁性微球或者通过荧光显微镜观察DNA分子的荧光实现；其中，光学显微镜使用可见光作为光源，荧光微镜是光学显微镜当中的一种，用特定波长的激发光照射样品。其中，操作方法可以是多条沟道并行化实施，分别对未知长度的DNA样品和已知长度的DNA长度标记物进行长度筛分，从而判断DNA样品中DNA分子的长度。
除上述所述之外，本方案的微流芯片可以设置多组微流沟道，以实现分别对未知长度的DNA样品和已知长度的DNA长度标记物进行长度筛分，从而判断DNA样品中DNA分子的长度。
采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案巧妙性在于通过在微流芯片的微流沟道中设置变截面沟道和收缩通道，同时在变截面沟道中设置电极以产生电场作用力，在此基础上进一步在芯片主体一侧设置磁场组件，通过该磁场组件与电源连接且生成覆盖变截面沟道的磁场，来使得通过变截面沟道的DNA-磁性微球组合体受到作用力不同的磁场和电场作用力，通过作用在磁性微球上的磁场力和作用在DNA分子上的电场力共同作用下实现不同长度的DNA组成的DNA-磁性微球组合体运动到对应的力平衡位置，进而实现DNA分子的操控和长度筛分；而需要强调的是，本方案没有采用传统方案惯用的在微流沟道中设置空隙基质或微纳结构的方案，因此DNA筛分速度快；不存在固定的基质空隙或微纳结构的尺寸，也就不存在固定的DNA分子量筛分范围，因此可筛分的DNA分子量范围广；能够操纵和分析微量DNA样品，适合痕量DNA检测技术发展趋势；能够与其他DNA处理和分析的微流平台进行集成，具有发展成一体化微流芯片检测系统的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明用于长DNA分子长度筛分的装置的实施结构示意图。
图2为本方案装置的电极和磁场组件通电后所产生的电场力和磁场力在变截面流道内的作用力方向示意简图。
图3为本发明装置用于不同长度DNA分子在微流沟道内的装置中进行长度筛分的示意图；其中，图3(a)为微流芯片原理示意图，彩色云图代表电场强度(由蓝到红数值增大)；图3(b)为特定分子量的DNA-磁性微球组合体在沟道中具有特定受力平衡位置；图3(c)为不同分子量的DNA-磁性微球组合体在沟道中具有不同受力平衡位置；图3(d)为不同长度的DNA分子形成的组合体在微流芯片中具有不同的受力平衡位置，这是微流芯片实现DNA长度筛分的机理。
图4为本发明方案为单个DNA-磁性小球组合体在不同的时间的分布位置和分子构象。
图5为本发明方案通过电场力和磁场力共同作用实现λDNA(48.5kbp)分子形成的DNA-磁性小球组合体在微流芯片中的长度筛分。
图6为本发明方案用于不同长度的DNA分子的筛分的示意图，所挑选三种不同长度的DNA分子分别含有48.5kbp，72kbp，96kbp。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本方案一种用于长DNA分子长度筛分的装置，其包括微流芯片、驱动单元3、注射器2和收集容器，其中，微流芯片包括芯片主体5、电源和磁场组件12，所述芯片主体5内设置有延伸至芯片主体5两端的微流沟道6，且微流沟道6的一端设为输入端，其另一端设为输出端，所述微流沟道6的输入端至输出端方向上依序设有变截面沟道7和收缩通道8；所述变截面沟道7的截面轮廓为喇叭形，其小口端与收缩通道8的一端连通；所述变截面沟道7的大口端和小口端均设有电极71，所述电极71分别与电源连接且电极之间形成的电场覆盖变截面沟道7，所述芯片主体5的一侧设有磁场组件12，该磁场组件12与电源连接且用于生成覆盖变截面沟道7的磁场；所述驱动单元3用于提供输入动力；所述注射器2用于容置溶液样品1，其固定在驱动单元3上，所述注射器2的输出端通过样品注入管4与微流芯片的微流沟道6输入端连通，所述注射器2的推杆端与驱动单元3的动力输出端连接，由驱动单元3的动力输出端推动注射器2的推杆进行输出溶液样品1，令溶液样品1被注入到微流沟道6中；所述收集容器10通过收集管11与微流芯片的微流沟道6输出端连通，且用于收集被筛分分析后的DNA分子溶液9。
本方案中，所述长DNA分子的长度范围为102碱基对到106碱基对。
作为一种较优的实施选择，优选的，所述驱动单元3可以为高压注射泵驱动单元、气压驱动单元、手动驱动单元或离心力驱动单元，优选通过注射泵驱动，并可通过改变注射泵的注入速率或驱动气压的大小实现DNA分子溶液驱动速率的调整。
本方案中，所述电极71之间形成的电场强度为-100～100V/m；所述电场向DNA磷酸骨架上的负电荷施加静电力；磁场组件12可以为线圈组件，而线圈组件通电后，其覆盖所述变截面沟道的磁场为匀强磁场；线圈组件通过磁感线圈形成磁场，电磁线圈是利用通过导线周围所存在磁场而建立的，把它绕成螺旋形加强磁场(图1中仅简要示出了磁场组件12所生成的左右各两圈磁感线)，线圈组件可以用表面裹有一层绝缘漆的导线代替普通导线是为了节省空间，即用最小的空间来实现最高的磁场强度。
本方案中，作为一种规格选择，所述变截面微流沟道7的长度可以为50～1000微米，微流沟道6的宽度可以为600微米，微流沟道6的高度可以为50微米，变截面微流沟道7的长度优选为300或400微米，收缩通道8与微流沟道6之间的形成的收缩比为100∶1～2∶1，收缩通道与微流沟道之间的形成的收缩比为10∶1。
作为一种较优的实施选择，优选的，所述变截面沟道的长度为300或400μm；所述收缩通道与微流沟道之间的形成的收缩比为10∶1。
基于上述装置，其应用于长DNA分子长度筛分的方法包括如下步骤：
S01、将不同长度的单分子DNA与单个磁性微球进行连接形成DNA-磁性微球组合体；
S02、将DNA-磁性微球组合体加入到注射器中，通过驱动单元将注射器中的DNA-磁性微球组合体注入到微流芯片的输入端；
S03、将变截面沟道的电极与电源连通，同时接通磁场组件和电源，令DNA-磁性微球组合体在途经微流沟道内设置的变截面沟道和收缩通道时，受到变截面沟道内电极产生的电场和磁场组件产生的磁场作用，使不同长度的单分子DNA组成的DNA-磁性微球组合体受电场、磁场作用而运动到对应的力平衡位置，实现DNA分子长度筛分，其中，DNA-磁性微球组合体受到电场的作用力和受到磁场的作用力相反，简而言之，本步骤通过在变截面的微流沟道两端施加电压，沟道内离子溶液中将产生电场强度大小与沟道截面积成反比的电场，优选的电场强度变化范围为-100～100V/m。所述电场向DNA磷酸骨架上的负电荷施加静电力，另外，所述磁场在变截面微流沟道区域强度一致，并且使得磁性微球所受磁场力方向和DNA分子所受静电力方向相反(如图2所示)；
S04、被筛分分析后的DNA分子溶液被收集至收集容器中。
本方案中，DNA和磁性小球连接形成DNA-磁性微球组合体是在室温条件下，将生物素化生物抗体与链霉亲和素磁性微球混合，反应时间为30-40min，制备成DNA-磁性微球组合体。
本方案中，DNA-磁性小球组合体的溶液样品1在微流芯片中的移动可以通过注射泵驱动、气压驱动、手动驱动、离心力驱动等方法中的一种或多种实现，优选通过注射泵驱动，并可通过改变注射泵的注入速率或驱动气压的大小实现高分子溶液驱动速率的调整；而作为一种较优的选择实施方式，优选的，所述不同片段的DNA-磁性小球组合体的样品溶液1驱动速度为0.05ml/min～8ml/min。
在变截面微流沟道7中，通过变截面微流沟道7的两端施加电压，沟道内离子溶液中将产生强度大小与沟道截面积成反比的电场，并向DNA磷酸骨架上的负电荷施加静电力；外加均匀磁场，使DNA-磁性微球组合体所受磁力和静电力方向相反；通过电场和磁场的共同作用，实现对DNA-磁性小球的操控，进而实现DNA长度的筛分。在此引用图3介绍筛分的原理。如图3所示,图3a为DNA和磁性微球组合体在微流芯片中受到电场力和磁场力共同作用。图3b-d为不同长度的DNA分子形成的组合体在微流芯片中具有不同的受力平衡位置，这是微流芯片实现DNA长度筛分的机理。
如图3所示，在磁性微米小球上的磁力大小恒定，作用在DNA上的静电力大小与DNA分子量和当地电场强度的乘积成正比，因此特定分子量的DNA-磁性微球组合体在微沟道中有特定的受力平衡位置，当DNA-磁性微球组合体偏离平衡位置时，磁场力和静电力的合力作用将驱动DNA-磁性微球组合体回到平衡位置；当DNA分子较短时，较短的DNA分子所带的负电荷较少，当足电场力和磁场力平衡时，DNA-磁性小球组合体位于电场强度较大区域(图3b)；当DNA分子长度适中时，适中长度的DNA分子所带的负电介于较短DNA分子和较长DNA分子之间，当足电场力和磁场力平衡时，DNA-磁性小球组合体位于电场强度适中区域(图3c)；当DNA分子长度过长时，较长的DNA分子所带的负电较多，当足电场力和磁场力平衡时，DNA-磁性小球组合体位于电场强度较弱区域(图3d)；基于上述机理，本发明的微流芯片能够实现DNA分子的长度筛分。
通过控制沟道中溶液的流动速度，可将更多DNA-磁性微球组合体传输至该变截面沟道7区域实现DNA在收缩沟道8区域的富集，通过调控流体粘度，可控制DNA-磁性微球组合体运动速度、芯片操作稳定性和检测精度。
其中，所述DNA-磁性小球组合体在微流沟道6中的运动、汇集和长度筛分可以通过显微镜进行观察监控。另外，所述的片段长度的表征可以通过凝胶电泳分析、光谱分析、单分子荧光成像测量、原子力呈像测量、扫描电镜呈像测量等方法中的一种或多种实现。
本方案的DNA长度筛分微流芯片在进行单个λDNA-磁性小球组合体的操控过程中，一个λDNA-磁性小球组合体从位置①运动到位置⑥的过程中(图4a)，DNA分子构象发生伸展(图4b)。图4c为DNA分子的轮廓长度随时间的变化。
本方案的DNA长度筛分微流芯片在进行多个λDNA-磁性小球组合体的操控过程中，微流芯片中的电场分布强度为20～140V/m,芯片的几何形状为宽口600微米，芯片中的电场强度分布是通过位于芯片宽口和窄口的电极形成的电势差形成(图5a)；DNA和磁性微球组合体是通过λDNA和直径为4微米的微球组装形成的(图5b)；DNA和磁性微球组合体在微流芯片中的分布随时间的变化显示，当时间为0s，DNA-磁性微球分布均匀，随着时间增加，λDNA-磁性小球组合体收到电场力和磁场力的共同作用，逐渐运动到相近的力平衡状态。在此过程中，DNA分布统计图(图5c)、DNA分布云图(图5d)和DNA分子的伪荧光图(图5e)显示了这种DNA分子在微流沟道中的聚集。
本方案的DNA长度筛分微流芯片在进行不同长度的DNA分子组成的DNA-磁性小球组合体的操控过程中，DNA和磁性微球组合体在微流芯片中的分布随时间的变化显示，当时间为0s，DNA-磁性微球分布均匀，随着时间增加，λDNA-磁性小球组合体受到电场力和磁场力的共同作用，逐渐运动到相近的力平衡状态。当DNA分子较短时(碱基对为48.5kbp),较短的DNA分子所带的负电荷较少，当电场力和磁场力平衡时，DNA-磁性小球组合体位于电场强度较大区域；当DNA分子长度适中时(碱基对为72kbp)，适中长度的DNA分子所带的负电介于较短DNA分子和较长DNA分子之间，当足电场力和磁场力平衡时，DNA-磁性小球组合体位于电场强度适中区域；当DNA分子长度过长时(碱基对为96kbp)，较长的DNA分子所带的负电较多，当足电场力和磁场力平衡时，DNA-磁性小球组合体位于电场强度较弱区域。在此过程中，对于三种长度的DNA分子形成的DNA-磁性小球组合体的混合样品进行DNA长度筛分的结果如图6所示。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于长DNA分子长度筛分的微流芯片，其特征在于，其包括芯片主体、电源和磁场组件，所述芯片主体内设置有延伸至芯片主体两端的微流沟道，且微流沟道的一端设为输入端，其另一端设为输出端，所述微流沟道的输入端至输出端方向上依序设有变截面沟道和收缩通道；所述变截面沟道的截面轮廓为喇叭形，其小口端与收缩通道的一端连通；所述变截面沟道的大口端和小口端均设有电极，所述电极分别与电源连接且电极之间形成的电场覆盖变截面沟道，所述芯片主体的一侧设有磁场组件，该磁场组件与电源连接且用于生成覆盖变截面沟道的磁场；
其中，微流沟道用于注入不同长度的单分子DNA与单个磁性微球连接形成的DNA-磁性微球组合体；
微流芯片工作时，将变截面沟道的电极与电源连通，同时接通磁场组件和电源，令DNA-磁性微球组合体在途经微流沟道内设置的变截面沟道和收缩通道时，受到变截面沟道内电极产生的电场和磁场组件产生的磁场作用，使不同长度的单分子DNA组成的DNA-磁性微球组合体受电场、磁场作用而运动到对应的力平衡位置，实现DNA分子长度筛分；
另外，DNA-磁性微球组合体受到电场的作用力和受到磁场的作用力相反；所述DNA-磁性微球组合体的力平衡位置是由作用在磁性微球上的磁场力和作用在DNA分子上的电场力共同作用确定的。
2.如权利要求1所述的用于长DNA分子长度筛分的微流芯片，其特征在于，所述电极之间形成的电场强度为-100～100V/m；覆盖所述变截面沟道的磁场为匀强磁场。
3.如权利要求2所述的用于长DNA分子长度筛分的微流芯片，其特征在于，所述变截面沟道的长度为50～5000μm，高度为10～1000μm，其大口端和小口端的收缩比为5～50；所述微流沟道的宽度为600μm；所述微流沟道的高度为50μm；所述收缩通道与所述微流沟道之间的连接部形成的收缩比为100∶1～2∶1。
4.如权利要求3所述的用于长DNA分子长度筛分的微流芯片，其特征在于，所述变截面沟道的长度为300或400μm；所述收缩通道与微流沟道之间的形成的收缩比为10∶1。
5.如权利要求1所述的用于长DNA分子长度筛分的微流芯片，其特征在于，所述芯片主体为PDMS、PMMA、COC、玻璃、硅或金属材料通过紫外光刻、热压、离子束刻蚀、湿法腐蚀、3D打印、机械加工中的一种以上加工方法加工成型，所述电极为通过电化学沉积、机械装配、物理沉积、蒸镀中的一种以上方法加工成型，所述微流芯片为封闭结构，其通过热压结合、阳极键合、等离子键合中的一种以上进行封装。
6.一种用于长DNA分子长度筛分的装置，其特征在于，其包括权利要求1至5之一所述的用于长DNA分子长度筛分的微流芯片；其还包括：
驱动单元，用于提供输入动力；
注射器，用于容置溶液样品，其固定在驱动单元上，所述注射器的输出端通过样品注入管与微流芯片的微流沟道输入端连通，所述注射器的推杆端与驱动单元的动力输出端连接，由驱动单元的动力输出端推动注射器的推杆进行输出溶液样品，令溶液样品被注入到微流沟道中；
收集容器，通过收集管与微流芯片的微流沟道输出端连通，且用于收集被筛分分析后的DNA分子溶液。
7.如权利要求6所述的用于长DNA分子长度筛分的装置，其特征在于，所述长DNA分子的长度范围为102碱基对到106碱基对；
所述驱动单元包括高压注射泵驱动单元、气压驱动单元、手动驱动单元或离心力驱动单元。
8.一种长DNA分子长度筛分方法，其特征在于，其应用于 权利要求6或7所述的用于长DNA分子长度筛分的装置，所述方法包括如下步骤：
S01、将不同长度的单分子DNA与单个磁性微球进行连接形成DNA-磁性微球组合体；
S02、将DNA-磁性微球组合体加入到注射器中，通过驱动单元将注射器中的DNA-磁性微球组合体注入到微流芯片的输入端；
S03、将变截面沟道的电极与电源连通，同时接通磁场组件和电源，令DNA-磁性微球组合体在途经微流沟道内设置的变截面沟道和收缩通道时，受到变截面沟道内电极产生的电场和磁场组件产生的磁场作用，使不同长度的单分子DNA组成的DNA-磁性微球组合体受电场、磁场作用而运动到对应的力平衡位置，实现DNA分子长度筛分，其中，DNA-磁性微球组合体受到电场的作用力和受到磁场的作用力相反；
S04、被筛分分析后的DNA分子溶液被收集至收集容器中。
9.如权利要求8所述的长DNA分子长度筛分方法，其特征在于，S01中，不同长度的单分子DNA与单个磁性微球通过静电作用、壳聚糖包覆或链霉亲和素处理连接形成DNA-磁性微球组合体。
10.如权利要求8所述的长DNA分子长度筛分方法，其特征在于，S02中，驱动单元将注射器中的DNA-磁性微球组合体以0.05ml/min～8ml/min的速度注入到微流芯片的输入端。
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