CN114222616A - Rna和包含该rna的核酸载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及RNA、核酸载体和包括它们的用于预防或治疗癌症的药物组合物。此外，本发明涉及包括CpG‑ODN‑RNA缀合物和在孔内携带该缀合物的多孔二氧化硅颗粒的核酸载体。在这一点上，本发明的核酸载体可以将负载的核酸分子稳定地递送至体内并且将其释放至靶点，由此使1型干扰素增多并且显示RNA固有的功能。

Description

RNA和包含该RNA的核酸载体
技术领域
本发明涉及RNA和包含该RNA的核酸载体。
背景技术
肿瘤可以利用吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)构建针对免疫反应的屏障。IDO基本上是由胚胎用来避免妊娠母亲的排异的酶，其涉及强力的调节性T细胞(Treg)来抑制免疫反应。Treg是在预防自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎或1型糖尿病方面起关键作用的免疫细胞。然而，肿瘤细胞涉及的Treg比存在于人体的其它部位的Treg更具攻击性，同时具有优异的抑制能力。尽管癌症患者具有大量的激活的肿瘤特异性T细胞，但是在很多情况下，肿瘤无法被清除。原因在于Treg抑制肿瘤特异性CTL(CD8T细胞毒性)细胞和Th(CD4辅助)细胞，从而癌症可以避免免疫系统的攻击。因此，抑制IDO可以改善癌症治疗效果。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供包含siRNA的核酸分子以抑制与免疫或疾病相关的基因的表达。
此外，本发明的另一目的在于提供还包含CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)的核酸分子。
此外，本发明的另一目的在于提供负载有包含siRNA和CpGODN的核酸分子的核酸递送系统(“载体”)。
此外，本发明的另一目的在于提供用于预防或治疗癌症的药物组合物。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明中采用了以下技术方案。
1.一种核酸载体，其包括CpG-ODN-RNA缀合物和在孔内携带所述CpG-ODN-RNA缀合物的多孔二氧化硅颗粒，其中多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为7至30nm。
2.根据上述1的核酸载体，其中RNA为mRNA、tRNA、miRNA、snRNA、snoRNA、aRNA、siRNA、环状RNA或piRNA。
3.根据上述1的核酸载体，其中RNA为吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)siRNA。
4.根据上述1的核酸载体，其中CpG-ODN和RNA通过连接基团偶联。
5.根据上述4的核酸载体，其中连接基团为饱和烷基链(C3至C18)、三唑连接基团或4-甲基-6,7,8,9,10,10a-六氢-5H-3λ2-环辛[d]哒嗪连接基团。
6.根据上述3的核酸载体，其中IDO siRNA包括SEQ ID NO：1和2的siRNA；SEQ IDNO：3和4的siRNA；SEQ ID NO：5和6的siRNA；SEQ ID NO：7和8的siRNA；或SEQ ID NO：9和10的siRNA。
7.根据上述3的核酸载体，其中siRNA还包含与IDO mRNA在N末端或C末端互补的1至10nt的序列。
8.根据上述3的核酸载体，其中IDO siRNA包含SEQ ID NO：11和12的siRNA。
9.根据上述1的核酸载体，其中CpG-ODN为CpG-AODN、CpG-B ODN或CpG-C ODN。
10.根据上述1的核酸载体，其中CpG-ODN包含SEQ ID NO：13至15中的任一核苷酸。
11.根据上述1的核酸载体，其中多孔二氧化硅颗粒在孔内带正电荷。
12.根据上述1的核酸载体，其中，在负载缀合物之前，多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为5至80mV。
13.根据上述1的核酸载体，其中缀合物与颗粒的重量比的范围为1:1至20。
14.根据上述1的核酸载体，其中颗粒的BET表面积的范围为200至700m2/g，并且粒径的范围为50至1000nm。
15.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包括根据上述1的核酸载体，其中RNA为吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)siRNA。
16.根据上述15的药物组合物，其中癌症选自卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵泡囊肿、妇科癌症、泌尿科癌症、前列腺癌、肾癌、睾丸癌、阴茎癌、泌尿生殖道癌症、睾丸肿瘤、膀胱癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、恶性骨肿瘤、软组织肉瘤、角化棘皮瘤、黑色素瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、乳突癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、乳腺内分泌癌、肝胆胰腺癌、肝癌、胆管癌(cholangiocarcinoma)、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌、骨癌、骨髓病症、淋巴病症、毛细胞癌、口腔和咽(口腔)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽癌、甲状腺癌、喉癌、食管癌、胃癌、胃肠癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、脑癌、胶质瘤、非胶质瘤肿瘤、恶性胶质瘤、转移性脑癌、脑膜瘤、前庭神经鞘瘤、垂体肿瘤、头颈癌、中枢神经系统癌、腹膜癌、肝细胞癌、头癌、颈癌、原发性肿瘤、转移性肿瘤、淋巴瘤、鳞状细胞癌、血液系统恶性肿瘤、内分泌癌、霍奇金病或白血病。
17.一种RNA，其包含以下序列：
(1)SEQ ID NO：1和2的siRNA，
(2)SEQ ID NO：3和4的siRNA，
(3)SEQ ID NO：5和6的siRNA，
(4)SEQ ID NO：7和8的siRNA，或
(5)SEQ ID NO：9和10的siRNA。
18.根据上述17的RNA，其中siRNA还包含与IDO mRNA在N末端或C末端互补的1至10nt的序列。
19.根据上述17的RNA，其中RNA由SEQ ID NO：11和12的siRNA组成。
20.根据上述17的RNA，其中RNA还包含与其N末端或C末端偶联的CpG-ODN。
21.根据上述20的RNA，其中CpG-ODN为CpG-A ODN、CpG-B ODN或CpG-C ODN。
22.根据上述20的RNA，其中CpG-ODN包含SEQ ID NO：13至15中的任一核苷酸。
23.根据上述20的RNA，其中CpG-ODN和siRNA通过连接基团偶联。
24.根据上述23的RNA，其中连接基团为饱和烷基链(C3至C18)、三唑连接基团或4-甲基-6,7,8,9,10,10a-六氢-5H-3λ2-环辛[d]哒嗪连接基团。
发明的效果
根据本发明的包含RNA的核酸分子可以高效抑制吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达。
根据本发明的包含RNA和CpG-ODN的核酸分子可以使1型干扰素增多并且显示其RNA固有的功能。
本发明的核酸载体可以将负载的核酸分子稳定地递送至体内并且将其释放至靶点，从而在显示其RNA固有的功能的同时使1型干扰素增加。
本发明的组合物可以表现出优异的抗癌活性。
附图说明
图1为根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。
图2为根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。
图3为在根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的制造过程中获得的小孔颗粒的显微照片。
图4为根据本发明的一个实施方案的小孔颗粒的显微照片。
图5为根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的显微照片。可降解的递送载体(Degradable Delivery Vehicle(DDV))为根据实施方案的颗粒，其中括号中的数字意指颗粒的直径并且下标的数字意指孔径。例如，DDV(200)10是指根据实施方案的颗粒直径(particle diameter)(即，粒径(particle size))为200nm且孔径为10nm的颗粒。
图6为鉴定根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性的显微照片。
图7为示出根据一个说明性实例的具有圆筒状渗透膜的管的视图。
图8为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。
图9为示出根据本发明的一个实施方案的各粒径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。
图10为示出根据本发明的一个实施方案的各孔径的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。
图11为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度针对各环境的pH随时间降低的结果的图。
图12为示出根据本发明的一个实施方案的多孔二氧化硅颗粒的吸光度随时间降低的结果的图。
图13(a)示出根据本发明的实施方案的负载有核酸分子的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的特性的分析结果。图13(a)中的a表示针对CpG-ODN-siIDO递送而优化的DegradaBALL的物性(表面积、孔径、ζ电位、平均尺寸、孔径和负载能力)以及TEM图像，在图13(a)中的a的左下角的条形(bar)表示长度为200nm，并且图13(a)中的b示出用于人类和动物研究的LEM-S403序列。
图13(b)示出根据本发明的实施方案的负载有核酸分子的多孔二氧化硅颗粒(LEM-S403)的特性的分析结果。图13(b)中的c表示不同量的DegradaBALL负载CpG-ODN-siIDO的负载能力。其中，当重量比为1:5(Cargo对DegradaBALL)时，在室温下、在30分钟内，负载能力为约90％CpG-ODN-siIDO负载在DegradaBALL中。图1(b)中的d表示LEM-S403在生物相似溶液(bio-similar solution)中、在37℃下的累积释放动力学曲线。图1(b)中的e通过RT-PCR示出在A549细胞和CT26肿瘤中由LEM-S403的IDO1的敲低。此外，图13(b)中的f示出LEM-S403在小鼠PBMC中的细胞吸收效率试验，其中将小鼠PBMC分离，然后分别用缓冲液、CpG-ODN-siIDO(FITC)(100nM)或具有DegradaBALL的CpG-ODN-siIDO(FITC)(100nM)处理6小时。本文中，CpG-ODN-siIDO(FITC)的负载效率通过流式细胞术来分析。此外，图13(b)中的h示出基于上述f的门控结果的PBMC的浆细胞样树突细胞(pDC)和非pDC中的细胞内CpG-ODN-siIDO(FITC)的定量分析。数据(每组n＝3)由平均值±SD表示(相对于其它组，***P<0.001)。
图14示出LEMIDO的IDO1基因敲低效率和I型IFN诱导效率。具体地，在图14的a中，将A549细胞分别用具有不同浓度(10、50和150nM)的LEM-S403和比较对照样品处理12小时。此后，进一步添加80ng/ml的IFN-γ12小时以诱导IDO1基因表达。数据(每组n＝3)由平均值±SEM表示。组间比较通过单向ANOVA来进行。(相对于仅IFN-γ处理组，*p<0.05和***p<0.001)。图14的b示出LEM-S403在A549细胞中的长期IDO1基因敲低效率。为了比较，分别用150nM LEM-S403和负载在LNP中的CpG-ODN-siIDO处理细胞。将细胞分别培养24、48和72小时，同时进行IFN-γ诱导12小时。组间比较通过单向ANOVA来进行。**p<0.01和***P<0.001。图14的c示出在用不同浓度(7.82、15.63、31.25、62.5、125、250和500nM)的LEM-S403分别处理人PMBC 12小时之后，使用HEK-BlueTM INF-a/b细胞对存在于上清液中的所分泌的I型IFN的分析结果。图由每组平均值±SEM表示，n＝3。图14的d示出在将人PMBC分别用具有或不具有DegradaBALL的siIDO(125nM)、CpG-ODN(125nM)和CpG-ODN-siIDO(125nM)进行处理、然后进一步培养细胞22小时之后，使用上清液、使用HEK-BlueTM INF-a/b细胞对存在于上清液中的所分泌的I型IFN的分析结果。数据(每组n＝4)由平均值±SD表示。组间比较通过单向ANOVA来进行。相对于未处理组，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。图14的e示出在五个(5)不同设置中使用人PMBC的LEM-S403的I型IFN诱导试验。数据(每组n＝5)由平均值±SD表示。组间比较通过单向ANOVA来进行。*p<0.05。
图15(a)示出LEM-S403的缓释系统和在CT26同源小鼠模型中增强的生物分布。图15(a)中的a示出用于肿瘤成像试验和流式细胞术试验的治疗方案。在肿瘤成像试验中，分别用缓冲液、70μg DegradaBALL(TAMRA)、14μgCpG-ODN-siIDO(Cy5)或14μg LEMIDO(具有DegradaBALL(TAMRA)的CpG-ODN-siIDO(Cy5))处理小鼠。治疗后第1天和第3天，将肿瘤分离用于离体成像和免疫荧光染色。在流式细胞术试验中，分别用70μg DegradaBALL、14μgCpG-ODN-siIDO(FITC)或LEMIDO(具有DegradaBALL(TAMRA)的CpG-ODN-siIDO(Cy5))处理小鼠。治疗后第1天和第3天，将肿瘤和淋巴结分离用于流式细胞术。图15(a)中的b示出与DegradaBALL偶联或未与DegradaBALL偶联的CpG-ODN-siIDO的缓释情况。图15(a)中的c示出肿瘤组织的组织学横截面图像以分别证明树突细胞(cd11c)、DegradaBALL和CpG-ODN-siIDO的分布。
图15(b)示出LEM-S403在CT26同源小鼠模型中的缓释系统和增强的生物分布。具体地，图15(b)中的d示出淋巴细胞、非淋巴细胞(主要是肿瘤细胞)和肿瘤的总细胞中CpG-ODN-siIDO(FITC)的时间依赖性包含(time-dependent inclusion)(第1天和第3天)。FITC缀合的CpG-ODN-siIDO的百分比通过流式细胞术来测定。数据(n＝3只小鼠/组)由平均值±SD表示。两组之间的比较通过学生t检验(双尾)来进行。*p<0.05和***p<0.001。图3(b)中的e示出引流淋巴结中CpG-ODN-siIDO(FITC)的时间依赖性包含(第1天和第3天)。两组之间的比较通过学生t检验(双尾)来进行。***p<0.001。
图16(a)示出瘤内注射LEMIDO在CT26同源小鼠模型中的治疗功效。图16(a)中的a示出治疗方案和总结关于aPD-1ab、CpG-ODN-siIDO和LEM-S403的给药途径和每次注射的剂量(活性药物成分(API)和DegraBALL)的表格。图16(a)中的b示出CT26同源小鼠模型(n＝6只小鼠/组)中使用平均肿瘤体积的肿瘤生长曲线。数据由平均值±SEM表示。两组之间的比较通过学生t检验(双尾)来进行。相对于溶媒组，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。图16(a)中的c示出分别用缓冲液、溶媒、aPD-1Ab、CpG-ODN+溶媒、siIDO+溶媒、LEM-S403(3.5/7/14μg)或LEM-S403(14μg)与aPA-1ab处理的小鼠的存活百分比。证明了所得值与缓冲液组、溶媒组、aPD-1ab组、CpG-ODN+溶媒组、siIDO+溶媒组和LEM-S403 3.5μg组的值明显不同(**p<0.01，对数秩Mantel-Cox检验)。图16(a)中的d示出总结关于aPD-1ab、aCTLA-4ab和LEM-S403的给药途径和每次注射的剂量(活性药物成分(API)和DegraBALL)的表格。图16(a)中的e示出CT26同源小鼠模型(n＝6只小鼠/组)中平均肿瘤体积的肿瘤生长曲线。数据由平均值±SEM表示。两组之间的比较通过学生t检验(双尾)来进行。相对于溶媒组，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。相对于LEM-S403组，#p<0.05和##p<0.01。图16(a)中的f示出根据图16(a)的e的小鼠的存活百分比。证明了所得值与LEM-S403组的值明显不同(***p<0.001，对数秩Mantel-Cox检验)。
图16(b)示出瘤内注射LEMIDO在CT26同源小鼠模型中的治疗功效。图16(b)中的g示出用于LEM-S403在CT26同源小鼠模型中的抗肿瘤机理试验的治疗方案。在该情况下，在第0天和第3天分别用缓冲液、溶媒、CpG-ODN+溶媒、siIDO+溶媒或LEM-S403处理小鼠两次，然后，在最后一次处理后24小时，将各小鼠处死。如图16(b)中的h所示，在使用膜联蛋白V和PI复染之后，肿瘤中细胞的比例通过流式细胞术来测定。数据由平均值±SD表示(n＝6只小鼠/组)。组间比较通过单向ANOVA来进行。相对于缓冲液组、溶媒组和CpG-ODN+溶媒组，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。相对于siIDO+溶媒组，#p<0.05。图16(b)中的i示出肿瘤碎片的TUNEL染色。比例尺表示100μm。图16(b)中的j分别示出肿瘤中phspho-STAT1、IDO1和犬尿氨酸的免疫荧光染色。图16(b)中的k示出基于图16(b)中的j所示图像的荧光信号的定量数据。数据由平均值±SD表示(n＝3只小鼠/组)。组间比较通过单向ANOVA来进行。***p<0.001。在第1天和第4天，IDO1的mRNA表达水平通过RT-PCR来测量。数据由平均值±SD表示(n＝3只小鼠/组)。组间比较通过单向ANOVA来进行。***p<0.001。
图17(a)示出LEM-S403在CT26同源小鼠模型中的抗肿瘤免疫反应。图17(a)中的a示出用于在上述模型中进行的抗肿瘤免疫反应分析的治疗方案。图17(a)中的b示出最后一次处理后24小时肿瘤微环境(TME)和引流淋巴结(dLNs)中的树突细胞的成熟频率。数据由平均值±SD表示(n＝5只小鼠/组)。组间比较通过单向ANOVA来进行。相对于缓冲液组，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。图17(a)中的c为显示TME中的CD86的代表性流式细胞图。
图17(b)示出LEM-S403在CT26同源小鼠模型中的抗肿瘤免疫反应。图17(b)中的d和e分别示出肿瘤中NK 1.1+细胞和NK1.1+CD69+细胞的免疫细胞浸润和免疫荧光染色。两组之间的比较通过单向ANOVA进行。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。图17(b)中的f和g分别示出肿瘤中CD8+细胞和CD8+CD69+细胞的免疫细胞浸润和免疫荧光染色。两组之间的比较通过单向ANOVA进行。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。图17(b)中的h示出最后一次治疗后24小时肿瘤中的Treg细胞频率。两组之间的比较通过单向ANOVA进行。***p<0.001。图17(b)中的i示出肿瘤中的CD8/Treg细胞比率。两组之间的比较通过单向ANOVA进行。***p<0.001。
图18(a)示出LEM-S403在CT26同源小鼠模型中对远端肿瘤的治疗效果(远端效应(abscopal effects))。图18(a)中的a示出用于评估在模型中的远端效应的治疗方案。小鼠分别接受缓冲液、溶媒、aPD-1ab、CpG-ODN+溶媒、siIDO+溶媒、LEM-S403(14μg)、具有aPD-1ab的LEM-S403(14μg)或具有aCTLA-4ab的LEM-S403(14μg)以3至4天的间隔给药四(4)次。图18(a)中的b示出涉及Balb/c小鼠(n＝6只小鼠/组)的相对平均肿瘤体积的终末肿瘤(未注射)生长曲线。数据由平均值±SEM表示。两组之间的比较通过学生t检验(双尾)来进行。相对于溶媒组，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。相对于LEM-S403组，#p<0.05。图18a中的c示出用于分析在远端肿瘤中的抗肿瘤活性和肿瘤浸润淋巴结(TIL)的治疗方案。
图18(b)示出LEM-S403在CT26同源小鼠模型中对远端肿瘤的治疗效果(远端效应)。图18(b)中的d示出切除的远端肿瘤的TUNEL染色，其中比例尺表示100μm。图18(b)中的e示出关于白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的细胞数，其中关于循环白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的细胞数使用Hemavet在全血中测定。数据(n＝5只小鼠/组)由平均值±SD表示。两组之间的比较通过学生t检验(双尾)来进行。相对于缓冲液组，*p<0.05。图18(b)中的f、g和h为通过流式细胞术分析免疫细胞群(f，NK1.1+细胞和NK1.1+CD69+细胞；g，CD8+细胞和CD8+CD69+细胞；h，Treg细胞)的结果。两组之间的比较通过单向ANOVA进行。*p<0.05和***p<0.001。
图19示出SEQ ID NO：7和8的siRNA(#4)和具有4mer的延伸的siRNA(#4’，总计24mer)的IFNγ诱导作用。
图20示出肿瘤中的CD8细胞和Treg细胞的比例。具体地，说明了当将LEM-S403和CpG ODN+siIDO的组合用于治疗时的差异，并且证明了连接CpG ODN和siIDO的碳连接基团的重要性。
图21为根据实施方案将颗粒递送至细胞中的示意图。
图22示出确认在对根据本发明的实施方案的多孔二氧化硅颗粒与核酸分子之间的含量比不同地进行调整时是否会将颗粒顺利引入至细胞(B16F10)中。
图23为示出根据本发明的实施方案的多孔二氧化硅颗粒的示意图。
图24为示出根据本发明的实施方案的负载有CpG-ODN-siIDO的核酸载体的功能的示意图。
图25示出偶联CpG A类、B类或C类时的IDO1表达水平。
图26示出根据CpG类别的1型IFN诱导作用。
具体实施方式
下文中，将详细描述本发明。
本发明涉及核酸载体。
本发明的核酸载体可以包括CpG-ODN-RNA缀合物和在孔内负载有所述CpG-ODN-RNA缀合物的多孔二氧化硅颗粒。
CpG-ODN-RNA缀合物可以为CpG-ODN(寡脱氧核苷酸)和RNA的缀合物。CpG-ODN为包括未甲基化的CpG二核苷酸的合成的短单链寡核苷酸。包含未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸可以为包括未甲基化的胞嘧啶-胍二核苷酸序列(即，“CpG DNA”或其中3’胍连接至5’胞嘧啶并且通过磷酸酯键与其偶联的DNA)并且激活免疫系统的核酸分子。虽然整个CpG寡核苷酸可能未被甲基化或可能未被部分甲基化，但是至少5’CG3’中的C不应当被甲基化。除非本文另有说明，否则如本文中所使用的术语“CpG寡核苷酸”或“CpG核酸”可以指免疫刺激性CpG寡核苷酸或核酸。
由于缀合有CpG-ODN，因此可以使1型干扰素增多。
对CpG-ODN的类别没有特别限制，例如，可以包括A类、B类或C类，并且优选A类(CpG-A ODN)。在1型IFN诱导的方面，优选使用A类(CpG-AODN)。
作为CpG-ODN，可以使用本领域已知的任何序列而不限于此。例如，包含SEQ IDNO：13至15的序列。具体地，可以使用序列SEQ ID NO:13。
CpG-ODN的长度可以为例如10至100nt、10至80nt、10至50nt、15至80nt、15至50nt、10至40nt、10至30nt、15至40nt、15至30nt、10至25nt、15至25nt或20至25nt，但是不限于此。
CpG-ODN可以通过连接基团与RNA偶联。连接基团可以使用本领域已知的任一者而不限于此。例如，可以使用饱和烷基链(C3至C18)、三唑连接基团、4-甲基-6,7,8,9,10,10a-六氢-5H-3λ2-环辛[d]哒嗪连接基团等。在体内附加反应和最小副作用的方面，优选使用饱和烷基链。本文中使用的饱和烷基链可以包括C3至C18链、C3至C15链、C3至C12链、C3至C10链、C4至C15链、C4至C12链、C4至C10链、C4至C8链、C5至C15链、C5至C12链、C5至C10链、C3至C8链、C3至C6链、或C4至C6链。由于CpG ODN和RNA通过连接基团强偶联，因此不会发生由于使用CpG ODN导致的副作用，即，引入Treg细胞的问题。
RNA可以包括任一者而没有限制，只要需要递送即可。例如，可以使用mRNA、tRNA、miRNA、snRNA、snoRNA、aRNA、siRNA、环状RNA或piRNA。例如，可以使用具有药理活性的RNA。
具体地，RNA可以为IDO siRNA。
RNA可以与CpG-ODN的5’末端或3’末端偶联。
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)可以为IDO1或IDO2。IDO siRNA可以靶向人IDO mRNA或犬IDO mRNA。例如，可以靶向mRNASEQ ID NO:32(人IDO1mRNA)或mRNASEQ ID NO:33(犬IDO1mRNA)。
IDO siRNA在序列、长度等方面没有特别限制，只要其可以抑制IDO mRNA的表达即可。例如，可以包括siRNA SEQ ID NO：1和2、siRNA SEQ ID NO：3和4、siRNASEQ ID NO：5和6、siRNA SEQ ID NO：7和8、或siRNA SEQ ID NO：9和10。此外，在表达率的方面，优选包括siRNASEQ ID NO：5和6、siRNA SEQ ID NO：7和8、或siRNA SEQ ID NO：9和10。
IDO siRNA可以进一步包括与N末端或C末端偶联的长度为1至10nt的碱基。可以进行此类长度延伸以提高稳定性。可以使用额外添加的碱基而没有限制，只要碱基不抑制对靶mRNA的表达抑制效率即可。例如，碱基可以为靶标的互补碱基。此外，碱基的长度可以为1至10nt、1至8nt或1至6nt等。例如，可以使用siRNA SEQ ID NO：11和12。
RNA的长度可以为例如10至50nt、10至30nt、10至25nt、15至25nt、17至25nt、18至25nt、17至23nt或18至23nt等，但是不限于此。
缀合物可以进一步具有可以在CpG ODN或RNA的一端或两端与多孔二氧化硅颗粒结合的官能团。在生物和/或化学领域，能够彼此偶联的官能团或包含能够彼此偶联的官能团的化合物可适用，而不限于此。此外，可以在缀合物中和颗粒的孔内使用要偶联的官能团，从而由于官能团之间的偶联，可以将缀合物负载在多孔二氧化硅颗粒中。
使用多孔二氧化硅颗粒以将缀合物负载在孔内。使缀合物负载在孔内，由此免受外部环境影响。
此外，CpG-ODN和RNA以缀合物形式负载在孔内。因此，与仅负载和递送CpG-ODN的情况相比，可以实现Treg细胞收集抑制效果。此外，与仅负载和递送RNA的另一情况相比，可以通过使用CpG-ODN表现出免疫改善效果。此外，与分别负载和递送上述两种物质的更进一步的情况相比，可以使Treg细胞群进一步减少，由此在肿瘤中具有更高的CD8/Treg比率。
本发明的多孔二氧化硅颗粒为基于二氧化硅(SiO2)材料的颗粒并且具有纳米级粒径。
多孔二氧化硅纳米颗粒为多孔颗粒，其各自具有纳米级的孔，并且可以在其外表面上和/或孔内携带核酸分子。
多孔二氧化硅颗粒的平均孔径可以为7至30nm.
平均孔径在上述范围内，例如，7至25nm。在上述范围内，其可以为例如7至25nm、7至23nm、10至25nm、13至25nm、7至20nm、7至18nm、10至20nm、10至18nm、12至18nm、12至16nm、14至18nm、14至16nm、15至16nm，但是不限于此。
多孔二氧化硅颗粒可以具有上述平均孔径，由此将核酸分子充分地负载在孔内并且将其递送。
多孔二氧化硅颗粒可以在孔内带正电荷，并且ζ电位可以为5至80mV。在上述范围内，ζ电位可以为例如5至80mV、5至70mV、5至60mV、5至55mV、10至80mV、10至70mV、10至60mV、10至55mV、20至80mV、20至70mV、20至60mV、20至55mV、30至80mV、30至70mV、30至60mV、30至55mV、40至80mV、40至70mV、40至60mV、40至55mV、50至80mV、50至70mV、50至60mV、50至55mV等，但是不限于此。
当带电颗粒被吸收至靶细胞中时(例如，通过例如内吞作用等过程)，进入细胞的颗粒会由于内体中的低pH而具有强正电荷，这可能会由于水通过内体的膜扩散而引起渗透作用，由此导致液泡的形成。
当颗粒具有强正电荷时，细胞膜比其包裹在颗粒周围时更宽，从而会使颗粒外的细胞外液或者例如包含有各种蛋白质等的外来物质一起引入至靶细胞中。在这样的情况下，由于异物的流入导致可能会产生不期望的作用，或者，与没有异物流入的情况相比，颗粒可能会相对较少地流入。因此，可能难以通过颗粒的充分递送来产生药物作用。然而，本发明可以通过优化携带CpG ODN-RNA复合物的颗粒的电荷来防止上述问题。
当颗粒的正电荷低时，会使负载效率变差。因此，本发明可以优化携带CpG-ODN-RNA复合物的颗粒的电荷，由此防止上述问题。
如果缀合物在CpG ODN或RNA的任一端或两端具有偶联官能团，则可以对多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰以在孔内具有可以与其偶联的官能团。
核酸分子(缀合物)对颗粒的负载率，例如，核酸分子与多孔二氧化硅颗粒的重量比的范围可以为1:1至20。当重量比在上述范围内时，可以充分地负载核酸分子，同时防止产生不携带核酸分子的空的多孔二氧化硅颗粒。结果，可以防止带强正电荷的颗粒被递送至细胞中。在上述范围内，例如，上述比可以在1:1至20、1:3至20、1:3至15、1:3至12、1:3至10、1:5至20、1:5至15、1:5至10等的范围内，但是不限于此。
具体地，为了对受试者给予本发明的组合物，可以将携带核酸分子的多孔二氧化硅颗粒分散在分散介质中，这可以通过在分散介质中添加并且搅拌多孔二氧化硅颗粒和核酸分子来获得。在这一点上，如果颗粒相对于核酸分子的量过大，则可能会出现未充分地携带核酸分子的空颗粒，并且如果颗粒相对于核酸分子的量过小时，则可能会产生未被颗粒负载的残余的核酸分子。
根据本发明的实施方案，多孔二氧化硅颗粒可以具有以下规格。例如，孔径的范围可以为7至30nm，具体地，12至18nm，并且更具体为14至16nm。粒径的范围可以为50至1000nm，具体为200至500nm，并且更具体为250至350nm。表面积的范围可以为200至700m2/g，并且具体地，360至480m2/g。在负载核酸分子之前，ζ电位可以为5mV以上，具体为20至70mV，并且更具体为40至60mV。颗粒可以携带核酸分子以达到重量比为1:1至20，并且具体为1:5至10。
如图23所示，多孔二氧化硅颗粒可以具有多个孔，并且孔可以从颗粒的表面延伸至内部。因此，可以使核酸分子充分地负载在孔内。孔可以相互连通。
本发明的多孔二氧化硅颗粒为负载核酸分子的可生物降解的颗粒并且当给予至体内时在体内可生物降解以释放核酸分子。本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在体内缓慢地分解，从而所负载的核酸分子可以以持续方式释放。例如，在下式1中的吸光度比为1/2时的t可以为24以上：
[式1]
At/A0
(其中A0为通过将5ml包含1mg/ml多孔二氧化硅颗粒的悬浮液置于具有孔径为50kDa的孔的圆筒状渗透膜中来测量的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，
使15ml与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在37℃下以60rpm水平地搅拌渗透膜的内部/外部，
悬浮液的pH为7.4，和
At表示从测量A0开始经过“t”小时后测得的多孔二氧化硅颗粒的吸光度)。
上式1意指多孔二氧化硅颗粒在类似于体内的环境中降解的速率。
如图34所示，例如，可以在将多孔二氧化硅颗粒和悬浮液置于圆筒状渗透膜中并且还将相同的悬浮液置于渗透膜的外部之后测量上式1中的吸光度A0和At。
本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的，并且可以在悬浮液中缓慢地降解。50kDa的直径相当于约5nm，其允许可生物降解的多孔二氧化硅颗粒通过直径为50kDa的渗透膜，并且以60rpm水平搅拌圆筒状渗透膜以将悬浮液均匀地混合，以使降解的多孔二氧化硅颗粒可以从渗透膜中出来。
可以例如在其中用新的悬浮液替换渗透膜外部的悬浮液的环境下测量上式1中的吸光度。悬浮液可以连续替换或者每周期替换，其中所述周期是定期的或不规律的。例如，可以在1小时至1周的范围内以1小时间隔、2小时间隔、3小时间隔、6小时间隔、12小时间隔、24小时间隔、2天间隔、3天间隔、4天间隔、7天间隔等替换悬浮液，但是不限于此。
吸光度比为1/2意味着在t小时后吸光度为初始吸光度的一半，简言之，意味着约一半的多孔二氧化硅颗粒被降解。
悬浮液可以是缓冲溶液，例如，选自由磷酸盐缓冲盐水(PBS)和模拟体液(SBF)组成的组中的至少一种，并且更具体地为PBS。
在吸光度比达到1/2时，本发明的上式1中的“t”可以为20以上，例如，t的范围可以为24至120。即，在上述范围内，t的范围可以为20至96、24至96、24至72、30至70、40至70、50至65等，但是不限于此。
对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/5的范围时，t可以为70至140。例如，t的范围可以为在上述范围内的80至140、80至120、80至110、70至140、70至120、70至110等，但是不限于此。
对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到1/20的范围时，t可以为130至220。例如，t的范围可以为在上述范围内的130至200、140至200、140至180、150至180等，但是不限于此。
对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，在上式1中的吸光度比达到0.01以下时，t可以为250以上。例如，t可以为300以上、350以上、400以上、500以上、1000以上等，并且上限可以为2000，但是不限于此。
对于本发明的多孔二氧化硅颗粒，上式1中的吸光度比与t具有高的正相关性。例如，皮尔森相关系数可以为0.8以上，例如0.9以上和0.95以上。
上式1中的“t”意味着多孔二氧化硅颗粒在类似于体内的环境下降解的速度。即，可以通过调整例如表面积、粒径、孔径、在多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔内的取代基、和表面的致密性等来调节t。
例如，可以增加颗粒的表面积来使t减小，或者可以减小表面积来使t增大。可以通过调整颗粒的粒径和孔径来调节表面积。此外，如果通过将取代基置于颗粒的表面上和/或孔内来减少多孔二氧化硅颗粒对环境(例如溶剂)的直接暴露，则可以使t增大。此外，当多孔二氧化硅颗粒负载或携带核酸分子时，并且当使核酸分子与多孔二氧化硅颗粒之间的亲和性提高时，可以减少多孔二氧化硅颗粒对环境的直接暴露，由此使t增大。此外，可以通过制备具有更致密的表面的颗粒来使t增大。如上所述，已描述了调整上式1中的t的各种实例，但是不限于此。
本发明的多孔二氧化硅颗粒可以具有球形形状，但是不限于此。
本发明的多孔二氧化硅颗粒的平均直径可以为例如50至1000nm。例如，平均直径的范围可以为在上述范围内的50至1000nm、50至500nm、50至400nm、50至350nm、100至1000nm、100至500nm、100至450nm、100至400nm、100至350nm、150至400nm.150至350nm、200至400nm、200至350nm、250至400nm、250至350nm、280至350nm等，但是不限于此。
本发明的多孔二氧化硅颗粒的BET表面积可以为例如200至700m2/g。例如，BET表面积的范围可以为在上述范围内的200m2/g至700m2/g、220m2/g至680m2/g、220m2/g至620m2/g、280m2/g至680m2/g、280m2/g至580m2/g、280m2/g至520m2/g、280m2/g至480m2/g、320m2/g至620m2/g、320m2/g至580m2/g、320m2/g至520m2/g、320m2/g至480m2/g、320m2/g至450m2/g、320m2/g至420m2/g、360m2/g至480m2/g、360m2/g至420m2/g等，但是不限于此。
本发明的多孔二氧化硅纳米颗粒的每克的体积可以为例如0.7至2.2ml。例如，该体积的范围可以为在上述范围内的0.7至2.0ml、0.8至2.2ml、0.8至2.0ml、0.9至2.0ml、1.0至2.0ml等，但是不限于此。
多孔二氧化硅颗粒可以包括扩张至平均直径为7至30nm的平均孔径小于5nm的小孔颗粒的孔。结果，孔径大，从而可以在孔内携带大的核酸分子，并且粒径自身与孔径相比并不大，从而容易递送和吸收至细胞内。
本发明的多孔二氧化硅颗粒可以在其外表面上和/或孔内带正电荷。例如，颗粒的表面和孔内二者均可以带正电荷，或者仅颗粒的表面或孔内可以带正电荷。可以例如借助阳离子取代基的存在来进行带电荷。
阳离子物质可以包括例如氨基或任何其它含氮基团。此外，阴离子取代基可以包括例如作为酸性基团的羧基(-COOH)、磺酸基(-SO3H)、硫醇基(-SH)等，但是不限于此。
调整多孔二氧化硅颗粒与核酸分子的释放环境的相互作用以调节纳米颗粒的降解速率，从而可以调节核酸分子的释放速率。此外，核酸分子可以从纳米颗粒中扩散和释放，其中调整取代基可以调节核酸分子与纳米颗粒的结合力，由此控制核酸分子的释放。
此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以包含取代基用于以下目的：在颗粒的表面上和/或孔内负载核酸分子；将核酸分子递送至靶细胞中；负载其它物质用于其它目的；或者结合其它取代基。此外，多孔二氧化硅颗粒还可以包括与其结合的抗体、配体、细胞穿透肽(cell permeable peptide)或适体。
可以通过例如表面修饰来添加上述在颗粒的表面上和/或孔内的取代基、电荷、粘合剂等。
可以例如通过使具有要引入的取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。烷氧基硅烷具有一个或多个烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被烷氧基取代的取代基。
本发明的多孔二氧化硅颗粒可以例如通过小孔颗粒制备和孔扩张工序来制造，并且，如果需要，可以进一步通过煅烧或表面修饰工序等来制造。如果实施煅烧和表面修饰工序二者，则可以在煅烧后对颗粒进行表面修饰。
小孔颗粒可以为例如平均孔径为1至5nm的颗粒。
可以通过在溶剂中添加表面活性剂和二氧化硅前体、然后进行搅拌和均匀化来收获小孔颗粒。
溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。
当使用水和有机溶剂的混合溶剂时，水与有机溶剂的相对比例可以为例如以体积比计1:0.7至1.5，例如，1:0.8至1.3，但是不限于此。
表面活性剂可以包括例如鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基溴化铵(TMABr)、十六烷基三甲基氯化吡啶鎓(TMPrCl)、四甲基氯化铵(TMACl)等，并且具体地，可以使用CTAB。
可以例如以每1升溶剂1至10g例如在上述范围内的1至8g、2至8g或3至8g的量添加表面活性剂，但是不限于此。
在将表面活性剂添加至溶剂的情况下，可以在搅拌后添加二氧化硅前体。二氧化硅前体可以为例如原硅酸四甲酯(TMOS)，但是不限于此。
搅拌可以进行例如10至30分钟，但是不限于此。
可以以每1升溶剂0.5至5ml，例如，在上述范围内的0.5ml至4ml、0.5至3ml、0.5至2ml、1至2ml等的量添加二氧化硅前体，但是不限于此。
如果需要，可以进一步使用氢氧化钠作为催化剂，并且，具体地，可以在向溶剂中添加表面活性剂之后并且在向溶剂中添加二氧化硅前体之前在搅拌下添加。
可以基于1M氢氧化钠水溶液以每1升溶剂0.5至8ml，例如，在上述范围内的0.5至5ml、0.5至4ml、1至4ml、1至3ml、2至3ml等的量添加氢氧化钠，但是不限于此。
在添加二氧化硅前体之后，可以使溶液在搅拌下反应。搅拌可以进行2至15小时，例如，在上述范围内的3至15小时、4至15小时、4至13小时、5至12小时、6至12小时、6至10小时等，但是不限于此。如果搅拌时间(反应时间)过短，则成核(nucleation)可能不充分。
搅拌后，可以使溶液老化。老化可以进行8至24小时，例如，在上述范围内的8至20小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至16小时、10至14小时等，但是不限于此。
此后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获多孔二氧化硅颗粒，并且，如果需要，可以在清洗前进行未反应的材料的分离。
可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。例如，可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间的范围可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。
可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。
可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间的范围可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。
可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。
在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
在通过上述方法制造的颗粒中，用于反应的残留有机物质(表面活性剂等)可能会残留在表面和孔内，并且可以进行洗涤以去除它们。通常，可以进行酸处理(或酸性有机溶剂处理)以除去此类有机物质，但是在本发明中，由于未进行此类酸处理，因此残留的有机物质即使在清洗后也可能会残留在孔中。
可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。
此后，可以使收获的多孔二氧化硅颗粒的孔扩张，并且此类孔扩张可以使用孔扩张剂来进行。
孔扩张剂可以包括例如三甲基苯、三乙基苯、三丙基苯、三丁基苯、三戊基苯、三己基苯、甲苯、苯等，并且具体地，可以使用三甲基苯，但是不限于此。
此外，本文中使用的孔扩张剂可以为例如N,N-二甲基十六烷基胺(DMHA)，但是不限于此。
可以例如通过使多孔二氧化硅颗粒与孔扩张剂在溶剂中混合并且加热混合物以诱导反应来进行孔扩张。
溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。
可以以每1升溶剂10至200g，例如，在上述范围内的10至150g、10至100g、30至100g、40至100g、50至100g、50至80g、60至80g等的比例添加多孔二氧化硅颗粒，但是不限于此。
可以将多孔二氧化硅颗粒均匀地分散在溶剂中。例如，可以将多孔二氧化硅颗粒添加至溶剂中并且进行超声分散。在使用混合溶剂的情况下，可以将多孔二氧化硅颗粒分散在第一溶剂中，然后向其中添加第二溶剂。
可以以基于100体积份溶剂为10至200体积份(“体积份(vol.parts)”)，例如，在上述范围内的10至150体积份、10至100体积份、10至80体积份、30至80体积份、30至70体积份等的比例添加孔扩张剂，但是不限于此。
可以在120至190℃，例如，在上述范围内的120至190℃、120至180℃、120至170℃、130至170℃、130至160℃、130至150℃、130至140℃等进行反应，但是不限于此。
反应可以进行6至96小时，例如，在上述范围内的30至96小时、30至96小时、30至80小时、30至72小时、24至80小时、24至72小时、36至96小时、36至80小时、36至72小时、36至66小时、36至60小时、48至96小时、48至88小时、48至80小时、48至72小时、6至96小时、7至96小时、8至80小时、9至72小时、9至80小时、6至72小时、9至96小时、10至80小时、10至72小时、12至66小时、13至60小时、14至96小时、15至88小时、16至80小时、17至72小时等，但是不限于此。
可以在以上示例的范围内根据期望调整时间和温度，从而可以使反应充分地进行但不会过度进行。例如，当使反应温度降低时，可以增加反应时间，并且当使反应温度提高时，可以缩短反应时间。如果反应没有充分地进行，则孔扩张可能不充分。另一方面，如果反应过度进行，则颗粒可能会由于孔的过度扩张而塌陷。
反应可以例如通过逐渐升高温度来进行。具体地，可以通过将温度以0.5至15℃/min的速率从室温逐渐升高至以上限定的温度来进行反应。例如，可以使温度以1至15℃/min、3至15℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率升高，但是不限于此。
反应可以在搅拌下进行。例如，可以以100rpm以上的速度，并且具体地，以100至1000rpm的速度进行搅拌，但是不限于此。
反应后，可以例如通过逐渐降低温度来使反应溶液缓慢地冷却。具体地，可以通过将温度以0.5至20℃/min的速率从以上限定的温度逐渐降低至室温来进行反应。例如，可以使温度以在上述范围内的1至20℃/min、3至20℃/min、3至12℃/min、3至10℃/min等的速率降低，但是不限于此。
如果在生产颗粒之后不通过酸处理来清洗颗粒，则孔内的残留物质也可以参与孔扩张，从而可以使孔更加充分均匀地扩张。
冷却后，可以将反应产物清洗并且干燥以收获具有扩张的孔的多孔二氧化硅颗粒。如果需要，可以在清洗前首先分离未反应的材料。
可以通过例如借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。本文中，可以例如以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间的范围可以为3分钟至60分钟。例如，离心可以进行在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。
可以用水和/或有机溶剂进行清洗。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次、4次、5次、6次、7次、8次等。
有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。
可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间的范围可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。
可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。
在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
如果在生产颗粒之后不通过酸处理来清洗颗粒，则即使在孔扩张之后，孔内残留物质也可能会残留，因此，即使在孔扩张之后进行清洗，也可以进行酸处理，但是本发明不进行酸处理，取而代之，残留物质可以通过以下要描述的煅烧来除去。
可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。
此后，可以对收获的颗粒进行煅烧，其为加热颗粒以除去存在于颗粒的表面上和孔内的硅烷醇基从而降低颗粒的反应性、提供更致密的结构并且除去填充孔的有机物质的工序。例如，可以将颗粒加热至400℃以上的温度。对温度的上限没有特别限制，但是可以为1000℃、900℃、800℃、700℃等。加热可以进行例如3小时以上、4小时以上等。对加热时间的上限没有特别限制，但是可以为24小时、12小时、10小时、8小时、6小时、5小时等。更具体地，加热可以在400至700℃下进行3至8小时或者在500至600℃下进行4至5小时，但是不限于此。
除去填充孔的有机物质可以防止由残留的有机物质导致的细胞毒性或起泡的一些问题。
然后，可以对收获的多孔二氧化硅颗粒进行表面修饰，并且可以在颗粒的表面上和/或孔内进行表面修饰。颗粒表面和孔内二者可以以相同的方式进行表面修饰，或者可以以不同的方式进行表面修饰。
可以通过表面修饰使颗粒带电荷。
可以例如通过使具有要引入的阳离子取代基的化合物与颗粒反应来进行表面修饰，其中该化合物可以为例如具有C1至C10烷氧基的烷氧基硅烷，但是不限于此。
烷氧基硅烷具有一个或多个烷氧基，例如，1至3个烷氧基。此外，可以存在要引入至未键合有烷氧基的部位的取代基、或被烷氧基取代的取代基。
当烷氧基硅烷与多孔二氧化硅颗粒反应时，在硅原子和氧原子之间形成共价键以使烷氧基硅烷可以键合至多孔二氧化硅颗粒的表面和/或孔内。由于烷氧基硅烷具有要引入的取代基，因此可以将相应的取代基引入至多孔二氧化硅颗粒的表面和/或孔内。
反应可以通过使分散在溶剂中的多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷反应来进行。
溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且有机溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、γ-丁内酯、1,3-二甲基-咪唑啉酮、甲基乙基酮、环己酮、环戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯、四甲基苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等；二醇醚类(溶纤剂类)，例如乙二醇单乙醚、乙二醇单甲醚、乙二醇单丁醚、二甘醇单乙醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单丁醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇二乙醚、三甘醇单乙醚等；其它，例如二甲基乙酰胺(DMAc)、N,N-二乙基乙酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、N,N-二甲基甲氧基乙酰胺、二甲亚砜、吡啶、二甲砜、六甲基膦酰胺、四甲基脲、N-甲基己内酰胺、四氢呋喃、间二噁烷、对二噁烷、和1,2-二甲氧基乙烷等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。
带正电荷可以通过使多孔二氧化硅颗粒与具有例如含氮基团(例如，氨基或氨基烷基)等碱性基团的烷氧基硅烷反应来进行。具体地，可以使用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]苯胺、三甲氧基[3-(甲基氨基)丙基]硅烷、3-(2-氨基乙基氨基)丙基二甲氧基甲基硅烷等，但是不限于此。
此外，表面修饰可以组合进行。例如，可以在颗粒的外表面上或孔内进行表面修饰两次以上。作为具体实例，可以使含有羧基的化合物通过酰胺键结合至其中引入有氨基的二氧化硅颗粒，从而改变带正电荷的颗粒以具有不同的表面性质，但是不限于此。
多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷的反应可以例如在加热下进行。加热可以在80至180℃，例如，在上述范围内的80至160℃、80至150℃、100至160℃、100至150℃、110至150℃等进行，但是不限于此。
多孔二氧化硅颗粒与烷氧基硅烷的反应可以进行4至20小时，例如，在上述范围内的4至18小时、4至16小时、6至18小时、6至16小时、8至18小时、8至16小时、8至14小时、10至14小时等，但是不限于此。
可以根据表面修饰的程度根据期望来选择反应温度、时间和用于表面修饰的化合物的量。换言之，反应条件将取决于核酸分子的电荷水平而变化。具体地，通过控制多孔二氧化硅颗粒的电荷水平，可以控制核酸分子的释放速率。例如，如果核酸分子在中性pH下具有强的负电荷，则可以提高反应温度、可以延长反应时间或者可以增加所处理的化合物的量，从而使多孔二氧化硅颗粒具有强的正电荷，但是不限于此。
此外，本发明的多孔二氧化硅颗粒可以通过例如小孔颗粒的制备、孔扩张、表面修饰和孔内部修饰来制造。
小孔颗粒的制备和孔扩张可以通过上述工序来进行，并且，在小孔颗粒的制备之后和孔扩张之后，可以进行清洗工序和干燥工序。
如果需要，可以在清洗之前将未反应的材料分离，并且可以通过借助离心将上清液分离来进行未反应的材料的分离。
可以以6,000至10,000rpm进行离心，并且离心时间的范围可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。
小孔颗粒的制备之后的清洗可以通过在上述范围内的方法/条件来进行，但是不限于此。
孔扩张之后的清洗可以在比上述实施方案更宽松的条件下进行。例如，清洗可以进行三次以下，但是不限于此。
表面修饰和孔内部修饰可以分别通过上述工序来进行。本文中，表面修饰和随后的孔内部修饰可以按该顺序进行，并且可以在上述两个工序之间进一步进行清洗工序。
当在小孔颗粒的制备和孔扩张之后在更宽松的条件下进行清洗时，例如用于颗粒生产和孔扩张的表面活性剂等反应溶液填充在孔中，以使在表面修饰期间不会使孔内被修饰，而是仅可以修饰颗粒的表面。此后，可以将在孔内的反应溶液洗去并除去。
在表面修饰工序与孔内部修饰工序之间的颗粒清洗可以使用水和/或有机溶剂来进行。具体地，由于不同的物质溶解于不同的溶剂中，因此水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
可以在例如以6,000至10,000rpm进行的离心下进行清洗，并且离心时间的范围可以为3至60分钟，例如，在上述范围内的3至30分钟、3至30分钟、5至30分钟等，但是不限于此。
可选地，可以在不离心的情况下通过使颗粒通过过滤器滤出来进行清洗。过滤器可以具有尺寸小于或等于多孔二氧化硅颗粒的直径的孔。当用如上所述的此类过滤器来过滤反应溶液时，只有颗粒保留在过滤器上，所述颗粒可以通过在过滤器上倒水和/或有机溶剂来清洗。
在清洗中，水和有机溶剂可以交替使用一次或数次，或者可以单独用水或有机溶剂进行清洗一次或数次。上述数次可以为2次以上且10次以下，例如，3次以上且10次以下、4次以上且8次以下、4次以上且6次以下。
可以例如在20至100℃下进行干燥，但是不限于此，并且还可以在真空状态下进行干燥。
核酸分子可以负载在多孔二氧化硅颗粒的表面上和/或孔内。本文中，可以例如通过将多孔二氧化硅颗粒与核酸分子在溶剂中混合来进行负载。
溶剂可以为水和/或有机溶剂，并且溶剂可以包括例如：醚类，例如1,4-二噁烷(特别是环醚)；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二氯丙烷、戊基氯、1,2-二溴乙烷等；酮类，例如丙酮、甲基异丁基酮、环己酮等；芳香族碳基材料，例如苯、甲苯、二甲苯等；烷基酰胺，例如N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二丁基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等；醇类，例如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇等。具体地，可以使用醇，更具体地为甲醇，但是不限于此。
此外，可以使用PBS(磷酸盐缓冲盐水溶液(phosphate buffered saline溶液))、SBF(模拟体液(simulated body fluid))、硼酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水作为溶剂。
负载在多孔二氧化硅颗粒上的核酸分子可以在延长的时间内逐渐释放。此类持续释放可以是连续或不连续的、或者线性或非线性的。此外，该释放可以取决于多孔二氧化硅颗粒的特性和/或多孔二氧化硅颗粒与核酸分子之间的相互作用而变化。
当多孔二氧化硅颗粒生物降解时，负载在多孔二氧化硅颗粒上的核酸分子释放。具体地，使根据本发明的多孔二氧化硅颗粒缓慢地降解从而使得以持续方式释放核酸分子。此类释放可以通过例如调整多孔二氧化硅颗粒的表面积、粒径、孔径、在颗粒的表面上和/或孔内的取代基、表面致密性等来控制，但是不限于此。
负载在多孔二氧化硅颗粒上的核酸分子可以在从多孔二氧化硅颗粒分离并且扩散的同时释放。此类释放受到多孔二氧化硅颗粒、核酸分子及其释放环境之间的关系的影响。因此，调节该关系可以控制核酸分子的释放。例如，通过借助表面修饰来增强或减弱多孔二氧化硅颗粒对核酸分子的结合力，可以控制核酸分子的释放。
核酸分子可以释放例如7天至1年以上的时间，这取决于所需处理的类型、释放环境和要使用的多孔二氧化硅颗粒的类型。
此外，如果本发明的多孔二氧化硅颗粒是可生物降解的，则这些颗粒可以100％降解。因此，其上负载的核酸分子可以100％释放。
此外，本发明涉及用于预防或治疗癌症的药物组合物.
本发明的药物组合物可以包括核酸载体。
核酸分子和多孔二氧化硅颗粒可以在上述范围内。
本发明的组合物可以具有抗癌功效，其中，可以将其中负载的核酸分子稳定地递送至体内、释放至靶点，由此抑制吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)的表达。
由于抑制IDO1表达，因此可以在抑制Treg细胞的分化的同时防止由IDO1产生犬尿氨酸(KYN)。
要使用本发明的组合物来预防或治疗的作为靶点的癌症可以为可以通过上述途径来预防或治疗的任何癌症，并且可以包括例如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵泡囊肿、妇科癌症(gynecologic cancer)、泌尿科癌症(urologic cancer)、前列腺癌、肾癌、睾丸癌、阴茎癌、泌尿生殖道癌症、睾丸肿瘤、膀胱癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、恶性骨肿瘤、软组织肉瘤、角化棘皮瘤、黑色素瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、乳突癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、乳腺内分泌癌、肝胆胰腺癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌、骨癌、骨髓病症、淋巴病症、毛细胞癌、口腔和咽(口腔)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽癌、甲状腺癌、喉癌、食管癌、胃癌、胃肠癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、脑癌、胶质瘤、非胶质瘤肿瘤、恶性胶质瘤、转移性脑癌、脑膜瘤、前庭神经鞘瘤、垂体肿瘤、头颈癌、中枢神经系统癌、腹膜癌、肝细胞癌、头癌、颈癌、原发性肿瘤、转移性肿瘤、淋巴瘤、鳞状细胞癌、血液系统恶性肿瘤、内分泌癌、霍奇金病或白血病等，但是不限于此。
本发明的药物组合物可以进一步包括药学上可接受的载体，并且可以与此类载体一起配制。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指不刺激生物体并且不抑制所给予的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。在配制为液体溶液的组合物中可接受的药用载体是无菌的和生物相容的，并且可以包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、和这些组分中的一种或多种的混合物。此外，如果需要，可以添加其它通常的添加剂例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以将药物组合物配制成例如水溶液剂、混悬剂和乳剂等可注射制剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。
本发明的药物组合物适用于含有本发明的核酸分子作为活性成分的任意制剂形式，并且可以以口服制剂或肠胃外制剂来制备。本发明的药物制剂可以包括适合于口服给药、直肠给药、经鼻给药、局部(包括脸颊和舌下)给药、皮下给药、阴道给药或肠胃外(肌内、皮下)给药的形式。可选地，还可以包括适合于通过吸入或吹入来给药的形式。
本发明的药物组合物以药学有效量来给药。可以取决于患者的疾病类型、严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和释放速率、治疗持续时间、包括同时存在的药物的因素、和医学领域公知的其它因素来确定有效剂量水平。本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合来给药，可以与常规治疗剂顺序或同时给药，并且可以以单剂量或多剂量给药。考虑到所有上述因素，重要的是以可以以最小量达到最大效果而没有副作用的量来给予药物组合物，这可以由本领域技术人员容易地确定。
根据本发明的药物组合物的剂量可以取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况或饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的严重程度而有很大变化，并且合适的剂量取决于例如蓄积在患者体内的药物量和/或本发明使用的载体的特定功效。例如，所述量可以为每kg体重0.01μg至1g。此外，本发明的药物组合物可以在例如每天、每周、每月或每年等单位时间周期期间每单位时间给药一次或数次，或者可以使用输液泵长时间连续给药。考虑到药物在体内的保留时间、体内的药物浓度等来确定重复给药的次数。根据疾病治疗的过程，即使在治疗后也可以进一步给予组合物以防止复发(recurrence)，即，疾病的复发(relapse)。
本发明的组合物可以瘤内给药。
本发明的药物组合物可以进一步包括保持/增加显示相同或相似的与伤口的治疗相关的功能的一种或多种活性成分、或者保持/增加至少一种活性成分的溶解度和/或吸收的化合物。
此外，可以使用本领域已知的任何方法来配制本发明的药物组合物，以允许在对哺乳动物给药后活性成分的快速释放、持续释放或延迟释放。可以以散剂、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊剂、无菌注射液、无菌粉末的形式来生产制剂。
此外，本发明涉及RNA。
本发明的RNA可以由以下序列组成。
(1)SEQ ID NO：1和2的siRNA
(2)SEQ ID NO：3和4的siRNA
(3)SEQ ID NO：5和6的siRNA
(4)SEQ ID NO：7和8的siRNA、或
(5)SEQ ID NO：9和10的siRNA。
本发明的siRNA可以为靶向IDO mRNA的siRNA。
本发明的siRNA可以进一步包括与其N末端或C末端偶联的长度为1至10nt的碱基。可以进行如上所述的长度延伸来改善稳定性。添加的碱基可以为任何碱基而没有限制，只要其不妨碍对siRNA中的mRNA的表达抑制效率即可。例如，碱基可以为靶标的互补碱基。碱基的长度可以为1至10nt、1至8nt、1至6nt等。例如，可以使用SEQ ID NO：11和12的siRNA。
IDO siRNA的长度可以为例如10至50nt、10至30nt、10至25nt、15至25nt、17至23nt、17至25nt等，但是不限于此。
本发明的RNA可以还包含CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)。例如，本发明的RNA可以为CpG-ODN-IDO siRNA缀合物。
CpG-ODN在类别方面没有特别限制，并且例如可以包括A类、B类或C类，并且具体为A类(CpG-A ODN)。在1型IFN诱导方面，优选使用A类。
对于CpG-ODN，可以使用本领域已知的序列而不限于此。例如，可以使用SEQ IDNO：13至15的序列，具体地，可以使用SEQ ID NO:13的序列。
CpG-ODN的长度可以为例如10至100nt、10至80nt、10至50nt、15至80nt、15至50nt、10至40nt、10至30nt、15至40nt、15至30nt、10至25nt、15至25nt或20至25nt，但是不限于此。
CpG-ODN可以通过siRNA的连接基团偶联。本文中使用的连接基团可以为本领域已知的任一者而不限于此。例如，可以使用饱和烷基链(C3至C18)、三唑连接基团、4-甲基-6,7,8,9,10,10a-六氢-5H-3λ2-环辛[d]哒嗪连接基团等。在体内附加反应和最小副作用的方面，优选使用饱和烷基链。本文中使用的饱和烷基链可以包括C3至C18链、C3至C15链、C3至C12链、C3至C10链、C4至C15链、C4至C12链、C4至C10链、C4至C8链、C5至C15链、C5至C12链、C5至C10链、C3至C8链、C3至C6链、或C4至C6链。
为了在颗粒中负载RNA，RNA可以进一步在CpG ODN或IDO siRNA的任一端或两端具有官能团，其中所述官能团可以与多孔二氧化硅颗粒偶联。此外，在生物和化学领域，可以采用可彼此偶联的官能团或具有可彼此偶联的官能团的化合物而不限于此。可以在颗粒的孔内和缀合物中使用此类用于偶联的官能团，因此，由于官能团之间的偶联，可以使缀合物负载在多孔二氧化硅颗粒中。
下文中，将参考以下实施例详细地描述本发明。
实施例
实施例1.多孔二氧化硅颗粒(DDV或DegradaBALL)
1.多孔二氧化硅颗粒的制备
(1)多孔二氧化硅颗粒的制备
1)小孔颗粒的制备
将960mL蒸馏水(DW)和810mL MeOH置于2L圆底烧瓶中。将7.88gCTAB添加至烧瓶中，然后在搅拌下快速添加4.52mL 1M NaOH。在搅拌10分钟的同时添加均匀的混合物之后，进一步添加2.6mL TMOS。在搅拌6小时以均匀地混合之后，将反应溶液老化24小时。
然后，将反应溶液在8000rpm和25℃下离心10分钟以除去上清液，在8000rpm和25℃下离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。
此后，将所得产物在70℃的烘箱中干燥以收获1.5g粉末状小孔多孔二氧化硅颗粒(孔平均直径为2nm并且粒径为200nm)。
2)孔扩张
将1.5g小孔多孔二氧化硅颗粒粉末添加至10ml乙醇中并且进行超声分散，并且进一步添加10ml水和10ml TMB(三甲基苯)，然后进行超声分散。
此后，将分散液置于高压釜中，并且在160℃下反应48小时。
在高压釜中，反应在25℃下开始并且在使温度以10℃/min的速率升高的同时进行，然后以1至10℃/min的速率缓慢地冷却。
将冷却的反应溶液在25℃下以8000rpm离心10分钟以除去上清液，在25℃下以8000rpm离心10分钟，并且用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。
然后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获粉末状多孔二氧化硅颗粒(孔径为10至15nm，并且粒径为200nm)。
3)煅烧
将在2)中制备的多孔二氧化硅颗粒放入玻璃小瓶中，在550℃下加热5小时，并且在反应完成之后缓慢地冷却至室温以制备颗粒。
(2)多孔二氧化硅颗粒的制备
除了将孔扩张时的反应条件改变为140℃和72小时以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(3)多孔二氧化硅颗粒(10L规模)的制备
除了使用大5倍的容器并且每种物质以5倍容量使用以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(4)多孔二氧化硅颗粒(粒径为300nm)的制备
除了使用920mL蒸馏水和850mL甲醇来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(5)多孔二氧化硅颗粒(粒径为500nm)的制备
除了使用800mL蒸馏水、1010mL甲醇和10.6g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(6)多孔二氧化硅颗粒(粒径为1000nm)的制备
除了使用620mL蒸馏水、1380mL甲醇和7.88g CTAB来制备小孔颗粒以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(7)多孔二氧化硅颗粒(孔径为4nm)的制备
除了使用2.5mL TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(8)多孔二氧化硅颗粒(孔径为7nm)的制备
除了使用4.5mL TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(9)多孔二氧化硅颗粒(孔径为17nm)的制备
除了使用11mL TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(10)多孔二氧化硅颗粒(孔径为23nm)的制备
除了使用12.5mL TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
(11)多孔二氧化硅颗粒的制备
除了在小孔颗粒的制备中使用900mL蒸馏水、850mL甲醇和8g CTAB以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。
2.多孔二氧化硅颗粒的表面修饰
(1)使实施例1-1-(1)的多孔二氧化硅颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)反应，以使其带正电荷。
具体地，用浴超声仪(bath sonicator)将100mg多孔二氧化硅颗粒分散在100mL圆底烧瓶中的10mL甲苯中。然后，添加1mL APTES并且在400rpm和130℃下搅拌12小时。
反应后，将产物缓慢地冷却至室温并且以8000rpm离心10分钟以除去上清液，进一步在8000rpm和25℃下离心10分钟，然后用乙醇和蒸馏水交替清洗五次。
此后，将产物在70℃的烘箱中干燥以收获在颗粒的表面上和孔内具有氨基的粉末状多孔二氧化硅颗粒。
(2)除了使用1.8mL APTES以外，通过上述相同的方法对实施例1-1-(11)的产物进行表面修饰，由此获得在颗粒的表面上和孔内具有氨基的粉末状多孔二氧化硅颗粒。
3.颗粒形成和孔扩张的鉴定
在显微镜下观察在实验例1-1-(1)至(3)中制备的小孔颗粒和多孔二氧化硅颗粒，以确定小孔颗粒是否均匀形成或者孔是否充分扩张以均匀形成多孔二氧化硅颗粒(图1至4)。
图1为实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，并且图2为实施例1-1-(2)中的多孔二氧化硅颗粒的照片，并且从这些图可以看到，均匀地形成了具有充分扩张的孔的球形多孔二氧化硅颗粒。
图3为实施例1-1-(1)中的小孔颗粒的照片，并且图4为实施例1-1-(1)和1-1-(3)中的小孔颗粒的比较照片，并且从这些图可以看到，均匀地形成了球形小孔颗粒。
4.BET表面积和孔径的计算
计算实施例1-1-(1)中的小孔颗粒和实施例1-1-(1)、(7)、(8)、(10)和(11)的多孔二氧化硅颗粒的表面积。通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)法来计算表面积，并且通过Barrett-Joyner-Halenda(BJH)法来计算孔径分布。
各颗粒的显微照片在图5中示出，并且计算结果在下表1中示出。
[表1]
Figure BDA0003386263690000361
5.生物降解性的鉴定
为了鉴定实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的生物降解性，在0小时、120小时和360小时在显微镜下观察在37℃下在SBF(pH 7.4)中的生物降解性，并且其结果在图6中示出。
参照图6，可以看出多孔二氧化硅颗粒被生物降解并且在360小时之后几乎完全降解。
6.吸光度比的测量
根据下式1来测量随时间推移的吸光度比。
[式1]
At/A0
(其中A0为通过将5mL包含1mg/mL多孔二氧化硅颗粒的悬浮液置于具有孔径为50kDa的孔的圆筒状渗透膜中来测量的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，
使15mL与悬浮液相同的溶剂与渗透膜的外部接触，并且在60rpm和37℃下水平地搅拌渗透膜的内部/外部，并且
At表示从测量A0开始经过“t”小时后测得的多孔二氧化硅颗粒的吸光度)。
具体地，将5mg多孔二氧化硅颗粒粉末溶解于5ml SBF(pH 7.4)中。此后，将5ml多孔二氧化硅颗粒溶液置于图7中示出的具有孔径为50kDa的孔的渗透膜中。将15ml SBF添加至外膜(outer membrane)，并且每12小时更换外膜的SBF。多孔二氧化硅颗粒的降解在37℃下、在水平搅拌下以60rpm来进行。
然后，吸光度通过UV-可见光谱法来测量并且在λ＝640nm处分析。
(1)吸光度比的测量
根据上述方法来测量实施例1-1-(1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度比，并且其结果在图8中示出。
参照图8，可以看出，在吸光度比达到1/2时，t为约58小时，以证明非常缓慢的降解。
(2)粒径
根据上式1来测量实施例1-1-(1)、(5)和(6)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图9中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。
参照图9，可以看出t随着粒径的增加而降低。
(3)平均孔径
根据上式1来测量实施例1-1-(1)和(9)中的多孔二氧化硅颗粒以及作为对照的实施例1-1-(1)中的小孔多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图10中示出(SBF用作悬浮液和溶剂)。
参照图10，可以看出本发明实施例的多孔二氧化硅颗粒具有比对照显著更大的t。
(4)pH
测量实施例1-1-(4)中的多孔二氧化硅颗粒针对每种pH的吸光度。在pH 2、5和7.4下在SBF和Tris中测量吸光度，并且其结果在图11中示出。
参照图11，可以看出，虽然针对pH，t存在差异，但是在所有吸光度比达到1/2时，t为24以上。
(5)带电荷
测量实施例1-2-(1)-1)中的多孔二氧化硅颗粒的吸光度，并且其结果在图12中示出(Tris(pH 7.4)用作悬浮液和溶剂)。
参照图12，可以看出，在带正电荷的颗粒的吸光度比达到1/2时，t为24以上。
实施例2：DegradaBALL的制备以及CpG ODN和siIDO的选择
1.DegradaBALL的制备
除了将920mL蒸馏水和850mL甲醇用于制备小孔颗粒并且将11mL TMB用于孔扩张以外，通过与实施例1-1-(1)相同的方法来制备多孔二氧化硅颗粒。此后，使用2mL APTES通过实施例2-(1)中的方法来进行表面修饰。结果，获得DegradeBALL，如图13(a)中的a所示。
2.siIDO选择和敲低效率
[表2]
Figure BDA0003386263690000391
为了SEQ ID NO：7和8的siRNA的稳定性，进行进一步延伸4mer的实验。即使在包括4mer进一步延伸的SEQ ID NO：11和12的序列中，观察到优异的K/D效果(图19)，因此，在本实验中选择SEQ ID NO：11和12的序列作为siIDO。
3.CpG-ODN选择
使所选择的siIDO 1(#4、#4')分别与不同类别的CpG(A、B、C)连接，从而测定其效果。通过将上述材料负载在DegradaBALL中来进行各试验。
不依赖于CpG类别，确认到所有上述类别均被siIDO1K/O(图25)。
作为实验的结果，证实了连接至CpG A类的siIDO1相比于连接至B类或C类的siIDO1具有更优异的1型IFN诱导作用(图26)。
因此，选择CpG-ODN A类作为本实验的CpG-ODN。
实施例3：包含负载在DegradaBALL中的CpG-ODN-siIDO的LEM-S403的制备
1.用于负载CpG-ODN-siIDO的材料
本文中使用的DegradaBALL为实施例2-1中的颗粒。乙醇购自Sigma-aldrich(Misourries State，USA)。Ficoll-paque购自GE Healthcare Bio Sciences AB(Uppsala，瑞典)。TAMRA NHS酯购自Thermo Fisher Scientific(Massachusetts，USA)。10×磷酸盐缓冲盐水(10×PBS)、Ham's F-12K培养基(F-12K)、极限必需培养基(MEM)、Roswell ParkMemorial Institute 1640(RPMI1640)、胎牛血清(FBS)、小牛血清(BCS)、青霉素-链霉素和胰蛋白酶-EDTA购自WelGene(Seoul，韩国)。抗小鼠PD-1和CTLA-4抗体购自Bio X Cell(NH，USA)。人和小鼠CpG-ODN、siIDO、CpG-ODN-siIDO、FITC缀合的CpG-ODN-siIDO、Cy5缀合的CpG-ODN-siIDO和PCR引物由Bioneer,Inc(Daejeon，韩国)合成。PCR引物的序列信息在表3中示出。流式细胞术抗体(Alexa
Figure BDA0003386263690000401
647抗小鼠CD11c、Alexa
Figure BDA0003386263690000402
R-PE抗Ly6C、Alexa
Figure BDA0003386263690000403
647抗小鼠FOXP3、Alexa
Figure BDA0003386263690000404
488抗小鼠NK-1.1、PE/Cy7抗小鼠CD4、APC抗小鼠CD3、FITC和Alexa
Figure BDA0003386263690000405
488抗小鼠CD8a、PE抗小鼠CD122、PE抗小鼠CD25、Alexa
Figure BDA0003386263690000406
647抗小鼠CD69和Alexa
Figure BDA0003386263690000407
647抗小鼠CD86)购自Biolegend(CA，USA)。抗兔p-STAT-1抗体购自CST(MA，USA)，并且FITC抗小鼠IDO1抗体购自Santa Cruz biotechnology(CA，USA)。抗兔L-犬尿氨酸抗体购自ImmuSmol(CA，USA)。TUNEL分析试剂盒购自Promega(WA，USA)。
Figure BDA0003386263690000408
2000、TRIzol和Power
Figure BDA0003386263690000409
Green PCR Master Mix购自Thermo Fisher Scientific(MA，USA)。重组人干扰素-gamma(IFN-γ)购自Peprotech Inc.(NJ，USA)。HEK-BlueTM IFN-α/β细胞购自Invivogen(CA，USA)。PCR引物的核苷酸序列信息在表3中示出。
[表3]
引物序列
Figure BDA00033862636900004010
Figure BDA0003386263690000411
2.用于生产LEM-S403的DegradaBALL的特征
由LIBRA 120EF-TEM(Carl Zeiss，德国)获得DegradaBLL的TEM图像。DegradaBALL的ζ电位和流体动力学尺寸通过Zetasizer NanoS(Malvern Instruments，UK)来测量。氮吸附等温图通过NOVA吸附装置来测量。DegradaBALL的表面积通过Brunauer-Emmitt-Teller法来校准。
3.LEM-S403负载能力
为了测定负载能力，将不同浓度的DegradaBALL(1、2、3、4、5、7和10μg)与1μg人CpG-ODN-siIDO在10μL 1×PBS溶液中混合。在将溶液在室温下培养30分钟之后，将混合物以8,000rpm离心10分钟。然后，将上清液移至新的微管，同时通过Citation 5(Biotech，VT，USA)测量CpG-ODN-siIDO残余物的浓度。上清液中的CpG-ODN-siIDO残余物的量通过测量在260nm处的吸光度来确定。基于上清液中的CpG-ODN-siIDO残余物的量来计算负载能力。
LEM-S403的剂量表示LEM-S403中CpG-ODN-siIDO的含量。LEM-S403为以1:5(CpG-ODN-siIDO:DegradaBALL)的重量比在DegadaBALL中制备的CpG-ODN-siIDO。
4.LEM-S403释放情况
对于LEM-S403的释放情况，
在37℃下，使LEM-S403(100μg/mL，体积＝100μL)在生物相似溶液(SBF，pH 7.4，[Na+]＝142mM，[K+]＝5mM，[Mg2+]＝1.5mM，[Ca2+]＝2.5mM，[Cl-]＝148.8mM，[HCO3 -]＝4.2mM和[HPO4 2-]＝1.0mM(pH 7.4Tris缓冲液([Tris]＝50mM)))中扩散10天。在预定的时间点(第1、2、3、4、7和10天)，将混合物以8,000rpm离心10分钟以拉下LEM-S403，同时用新鲜的SBF替换上清液。基于在260nm处的吸光度来测量释放的CpG-ODN-siIDO的量。
5.细胞培养
在CO2培养箱(SANYO Electric，Osaka，日本)中、在37℃下、在5％CO2的条件下培养所有细胞。在含有10％FBS(v/v)和10单位/mL青霉素/链霉素的F-12K培养基中培养A549细胞。在含有10％FBS(v/v)和10单位/mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养CT26细胞。人外周血单核细胞(PBMC)购自Lonza(Basel，瑞士)。根据ficoll梯度方案在无Ca2+和Mg2+的条件下从五(5)周龄的Balb/c小鼠中分离小鼠PBMC。
6.LEM-S403在小鼠PBMC中的细胞吸收效率试验
将小鼠PMBC以2.5×104个细胞/孔的密度接种在24孔板中。然后，将含有或不含有DegradaBALL或FITC缀合的CpG-ODN-siIDO的缓冲液(100nM)添加至各孔中。在培养6小时之后，将细胞用1×PBS清洗然后收集细胞用于染色。在室温下将细胞悬浮在培养缓冲液(在1×PBS中的0.5％BSA)中10分钟。封闭后，将细胞以1,250rpm离心2分钟，然后除去上清液。此后，将细胞用一抗溶液(在1×PBS中的0.5％BSA)(1:200稀释)进行处理并且在室温下培养1小时。将细胞离心并且用孵育缓冲液清洗。将经清洗的细胞重悬于200μL培养缓冲液中并且使用Attune NxT流式细胞分析仪(Thermo Fisher，MA，USA)来分析。
7.在A549细胞中的IDO1敲低效率试验
将A549细胞以5×104个细胞/孔的密度接种在24孔板中。培养24小时后，用1×PBS清洗细胞。然后，将DegradaBALL、CpG-ODN-siIDO(150nM)、siIDO(150nM)、CpG-ODN(150nM)、具有DegradaBALL的CpG-ODN-siIDO(10、50和150nM)、具有DegradaBALL的siIDO(150nM)或具有DegradaBALL的CpG-ODN(150nM)分散在500μL F-12K培养基(无血清)中，然后将其添加至各孔中。以5:1(w/w)的相对比例制备DegradaBALL和所负载的材料。培养6小时后，将细胞用1×PBS清洗，然后在含有IFN-γ(80ng/ml)的新鲜生长培养基中额外培养预定的时间。通过实时qPCR检测IDO1抑制。
为了研究敲低效率的持续时间，将A549细胞以5×104个细胞/孔的密度接种在24孔板中。培养24小时后，用1×PBS清洗细胞。此后，将负载在DegradaBALL中的CpG-ODN-siIDO(150nM)或负载在Lipofectamine中的CpG-ODN-siIDO分散在500μL F-12K培养基(无血清)中并且添加至各孔中。培养6小时后，用1×PBS清洗细胞，然后在新的含有IFN-γ(80ng/ml)的生长培养基中额外培养预定的时间。通过实时qPCR检测IDO1抑制。
8.1型IFN分泌的诱导
将人PBMC与50μL MEM培养基一起接种在96孔板中(5×105个细胞/孔)。培养2小时后，将缓冲液、siIDO(125nM)、CpG-ODN(125nM)或CpG-ODN-siIDO(125nM)分散在50μL含有或不含有DegradaBALL的MEM培养基中，然后添加至各孔中。将细胞进一步培养22小时。根据制造商的方案通过报告细胞系统(HEK-BlueTM IFN-α/β细胞)来测定培养基中包含的1型IFN。
将人PBMC与50μL MEM培养基一起接种在96孔板中(5×105个细胞/孔)。培养2小时后，将分散在50μL MEM培养基中的500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.63nM和7.81nMLEM-S403中的每一者添加至各孔中。将细胞进一步培养22小时。根据制造商的方案通过报告细胞系统(HEK-BlueTM IFN-α/β细胞)来测定培养基中的1型IFN。
9.动物实验
根据首尔国立大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)来进行所有动物实验。Balb/c雄性小鼠(5周龄)购自ORIENT BIO(Seongnam，韩国)。在实验期间，将动物饲养在温度为19至25℃、湿度为40％至70％以及光照12小时和黑暗12小时的循环的环境条件下。
10.LEM-S403瘤内注射后的可持续性
通过皮下注射在100μL含有基质胶的无菌1×PBS溶液中的CT26细胞(1×106个细胞)来制备患有肿瘤的小鼠(Balb/c)。当肿瘤的体积达到约200mm3时，通过瘤内注射用缓冲液、TAMRA缀合的DegradaBALL或具有或不具有TAMRA缀合的DegradaBALL的Cy5缀合的CpG-siIDO来处理小鼠。在注射后的第1天或第3天，将肿瘤切除用于分析。整个肿瘤的荧光图像通过FOBI体内成像系统(NeoScience，Seoul，韩国)来获得。在4％PFA溶液中培养肿瘤。蔗糖渗透后，将样品放入最佳切割温度(OCT)化合物然后破碎为厚度为10μm。将切片载玻片用无菌水清洗，然后使用DAPI染色。通过具有10×物镜的BX71显微镜来观察样品。
对于流式细胞术，当肿瘤的体积达到约200mm3时，将FITC缀合的CpG-siIDO在存在或不存在DegradaBALL的情况下注射至患有肿瘤(CT26)的小鼠的肿瘤中。在注射后的第1天或第3天，收集肿瘤。将收集的肿瘤切成薄片并且在37℃下在1mL胶原酶溶液中培养30分钟。使用细胞过滤器来收集细胞，然后进行流式细胞术。
11.LEM-S403单药疗法和使用免疫检查点抑制剂的联合疗法的治疗功效
将在100μL含有基质胶的无菌1×PBS溶液中的CT26细胞(1×106个细胞)皮下注射至Balb/c小鼠的右侧或双侧肋骨。在肿瘤体积达到约100mm3后第0天、第3天、第7天和第10天后，将缓冲液、溶媒(DegradaBALL 70μg)、CpG-ODN(4.5μg)+溶媒(DegradaBALL 22.5μg)、siIDO(9.5μg)+溶媒(DegradaBALL 47.5μg)或LEMIDO(3.5、7和14μg)注射至右侧肋骨。每周测量肿瘤体积3次。通过Kaplan-Meier图得出存活率。
根据上述方法，制备患有肿瘤(CT26)的小鼠。在肿瘤体积达到约100mm3后第0天、第3天、第7天和第10天，注射缓冲液、溶媒(DegradaBALL 70μg)、抗PD-1ab(aPD-1；10mg/kg)、抗CTLA-4ab(aCTLA-4；10mg/kg)、LEMIDO(14μg)、LEMIDO+aPD-1ab或LEMIDO+aCTLA-4ab。分别将缓冲液、溶媒和LEMIDO瘤内注射到右侧肋骨，同时腹腔注射aPD-1和aCTLA-4。每周测量肿瘤体积3次。通过Kaplan-Meier图得出存活率。
12.LEM-S403单药疗法的治疗机理
根据上述方法，制备患有肿瘤(CT26)的小鼠。在肿瘤体积达到约100mm3后第0天和第3天，将缓冲液、溶媒(DegradaBALL 70μg)、CpG-ODN(4.5μg)+溶媒(DegradaBALL 22.5μg)、siIDO(9.5μg)+溶媒(DegradaBALL 47.5μg)或LEMIDO(14μg)瘤内注射至右侧肋骨。在第4天，将各小鼠处死，同时取出注射过的肿瘤或彼此相距较远的肿瘤用于进一步分析。在处死期间，使用用EDTA处理过的管收集小鼠的全血。使用Hemavet 950对收集的血液进行分析。
13.膜联蛋白V
将收集的肿瘤切成薄片并且在37℃下在1mL胶原酶溶液中培养30分钟。通过细胞过滤器来收集细胞。根据制造商的方案，使用FITC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒与PI(Biolegend，CA，USA)一起进行膜联蛋白V和碘化丙啶染色。
14.逆转录酶PCR(RT-PCR)
从基于组合的GITC柱收集的细胞或肿瘤中提取总RNA。cDNA的合成在以下条件下进行：在灭活条件下65℃5分钟,42℃2分钟,42℃50分钟和70℃15分钟的循环。对于凝胶延迟，cDNA的扩增在以下条件下进行：在所需条件下95℃30秒、55℃60秒和72℃30秒的30个循环。通过电泳在2％TAE琼脂糖凝胶延迟产物，然后使用Gel-DOC XR+系统(Bio-rad，CA，USA)进行可视化。根据制造商的方案，使用CFX96 Touch实时PCR检测系统(Bio-rad)和Power
Figure BDA0003386263690000451
Green PCR Master Mix进行qPCR。
15.组织学评估和荧光染色
将取出的肿瘤在4％PFA溶液中进行培养。蔗糖渗透后，使器官进入OCT化合物然后破碎为厚度为10μm。使用H&E染色试剂(BBC Biochemical，Mt Vernon，WA，USA)对碎片化组织进行染色。
对于免疫荧光染色，使用含有5％正常山羊血清的PBS进行封闭45分钟，然后，用结合有荧光染料的抗体或者用一抗然后结合有荧光染料的二抗对组织碎片进行染色。用DAPI对细胞核进行染色。各染色的组织碎片用具有10x物镜的BX71显微镜来观察。
16.流式细胞术
对于肿瘤组织，将取出的肿瘤在37℃下在1mL胶原酶溶液中培养30分钟，然后使用细胞过滤器来收集细胞。将原代细胞(1×105个细胞)在4％PFA中在37℃下培养10分钟，然后用培养缓冲液清洗。在室温下将细胞悬浮于培养缓冲液(在1×PBS中的0.5％BSA)中10分钟。封闭后，将细胞以1,250rpm离心2分钟，然后除去上清液。然后，将细胞用一抗溶液(在1×PBS中的0.5％BAS，1:200稀释)进行处理，并且在室温下培养1小时。将细胞离心并且用孵育缓冲液清洗。将经清洗的细胞重悬于200μL孵育缓冲液中，然后使用Attune NxT流式细胞分析仪(Thermo Fisher，MA，USA)来分析。
17.组合的cpGODN和siIDO碳连接基团的协同效应
为了确认组合形式中的LEM-S403是否具有协同效应，进行比较实验。在第0天和第3天分别用溶媒、CpGODN+溶媒、LEM-S403或鸡尾酒(CpGODN+siIDO+溶媒)处理小鼠。在第4天，将肿瘤取出并且通过流式细胞术来分析。鸡尾酒疗法组显示与CpG-ODN组和LEM-S403组相似的CD8+T细胞的增加。然而，与LEM-S403不同，Treg细胞群没有减少。由于该差异，肿瘤中的CD8/Treg比率优于上述组。该结果证明，将siIDO和CpG-ODN组合的策略对于治疗的优势是必要的。
18.LEM-S403的治疗机理以及使用CpG-ODN和siIDO的鸡尾酒疗法
根据上述方法来制备小鼠中的肿瘤(CT26)。当肿瘤的体积达到约100mm3时，在第0天和第3天将溶媒(70μg DegradaBALL)、CpG-ODN(4.5μg)+溶媒(22.5μg DegradaBALL)、LEM-S403(14μg)或CpG-ODN(4.5μg)+siIDO(9.5μg)+溶媒(70μg DegradaBALL)注射至右侧肋骨中的肿瘤中。在第4天，将小鼠处死并且取出注射下的肿瘤用于流式细胞的测量。
<110> 雷莫内克斯生物制药有限公司(LEMONEX INC.)
<120> RNA和包含该RNA的核酸载体
<130> 20OP07001PCT
<150> US 63/048,072
<151> 2020-07-03
<150> KR 10-2021-0088160
<151> 2021-07-05
<160> 33
<170> KoPatentIn 3.0
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ccacacauau gccaugguga 20
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gatcctaata accccctgac t 21
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tcactgccac ccagaagact g 21
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accccagggc caggtgtgcc a 21
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tggatttgga cgcattggtc 20
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<212> DNA
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tttgcactgg tacgtgttga t 21
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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actgaggggc accagaggag cagactacaa gaatggcaca cgctatggaa aactcctgga 60
caatcagtaa agagtaccat attgatgaag aagtgggctt tgctctgcca aatccacagg 120
aaaatctacc tgatttttat aatgactgga tgttcattgc taaacatctg cctgatctca 180
tagagtctgg ccagcttcga gaaagagttg agaagttaaa catgctcagc attgatcatc 240
tcacagacca caagtcacag cgccttgcac gtctagttct gggatgcatc accatggcat 300
atgtgtgggg caaaggtcat ggagatgtcc gtaaggtctt gccaagaaat attgctgttc 360
cttactgcca actctccaag aaactggaac tgcctcctat tttggtttat gcagactgtg 420
tcttggcaaa ctggaagaaa aaggatccta ataagcccct gacttatgag aacatggacg 480
ttttgttctc atttcgtgat ggagactgca gtaaaggatt cttcctggtc tctctattgg 540
tggaaatagc agctgcttct gcaatcaaag taattcctac tgtattcaag gcaatgcaaa 600
tgcaagaacg ggacactttg ctaaaggcgc tgttggaaat agcttcttgc ttggagaaag 660
cccttcaagt gtttcaccaa atccacgatc atgtgaaccc aaaagcattt ttcagtgttc 720
ttcgcatata tttgtctggc tggaaaggca acccccagct atcagacggt ctggtgtatg 780
aagggttctg ggaagaccca aaggagtttg cagggggcag tgcaggccaa agcagcgtct 840
ttcagtgctt tgacgtcctg ctgggcatcc agcagactgc tggtggagga catgctgctc 900
agttcctcca ggacatgaga agatatatgc caccagctca caggaacttc ctgtgctcat 960
tagagtcaaa tccctcagtc cgtgagtttg tcctttcaaa aggtgatgct ggcctgcggg 1020
aagcttatga cgcctgtgtg aaagctctgg tctccctgag gagctaccat ctgcaaatcg 1080
tgactaagta catcctgatt cctgcaagcc agcagccaaa ggagaataag acctctgaag 1140
acccttcaaa actggaagcc aaaggaactg gaggcactga tttaatgaat ttcctgaaga 1200
ctgtaagaag tacaactgag aaatcccttt tgaaggaagg ttaatgtaac ccaacaagag 1260
cacattttat catagcagag acatctgtat gcattcctgt cattacccat tgtaacagag 1320
ccacaaacta atactatgca atgttttacc aataatgcaa tacaaaagac ctcaaaatac 1380
ctgtgcattt cttgtaggaa aacaacaaaa ggtaattatg tgtaattata ctagaagttt 1440
tgtaatctgt atcttatcat tggaataaaa tgacattcaa taaataaaaa tgcataagat 1500
atattctgtc ggctgggcgc ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga 1560
ggcgggcgga tcacaaggtc aggagatcga gaccatcttg gctaacacgg tgaaaccccg 1620
tctctactaa aaatacaaaa aattagccgg gcgcggtggc gggcacctgt agtcccagct 1680
actcgggagg ctgaggcagg agaatggcgt gaacctggga ggcggagctt gcagtgagcc 1740
aagattgtgc cactgcaatc cggcctgggc taaagagcgg gactccgtct caaaaaaaaa 1800
aaaaaaaaga tatattctgt cataataaat aaaaatgcat aagatataa 1849
<210> 33
<211> 1473
<212> RNA
<213> 家犬(Canis familiaris)
<400> 33
gtggtcattg gctgtggcaa cctttataat aagtagaggc tctgaaactc tatcagaact 60
aaggaccaaa agaggagact gcaagcatgg aagatgatgg aatacttctt atggaaagtc 120
ctcagagaat ttttgaaaaa taccatatag atgaagagat gggcttcgct ttgccaaatc 180
cactggagaa gctacctccg ccttatgatg aatggatttc cattgctaaa aatctgcctg 240
aactgattaa gaaaaatgaa ctacgtaaaa aagttgatga gttaaaaatt ctcagtattg 300
atggccttag tggacacaag ttgcagcgcc ttgcacgtct ggctctgggg tatatcacca 360
tggcatatgt gtggaatcaa ggtgatggag atgttcgaaa ggtcttgcca cagaatattg 420
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actgtgtctt agcaaactgg aagaaaaagg atcccaatgg gcctatgact tatgagaaca 540
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gcatctttca atgctttgac attctgctgg gcatccagca gtgttctggt gaagaattcg 960
ctgctgaatt cctccaggaa atgagaaact atatgccccc agctcaccgg gactttcttc 1020
tcttgttaaa gtcaggcccc tcagtccggg agtttgttcg ttcaagagat gatgttgaac 1080
tgaaggcaga ttataatgag tgtgtgaaag ctatggtctc cctgagaaaa tatcacttga 1140
agatagtagc taagtacatt gtgattcctg caagccagca gcccaagaat aatcaagcat 1200
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acaagggcac attttgtcaa gatgaagatg tctgtatata ttagtgtcac tgctcatgat 1380
atcagaccca tgaattaata gtacacaaca atgttttttt tttacaacaa tgttttaata 1440
gtacttataa aagatttcaa aatatttttc caa 1473

Claims (24)

1.一种核酸载体，其包括CpG-ODN-RNA缀合物和在孔内携带所述CpG-ODN-RNA缀合物的多孔二氧化硅颗粒，其中所述多孔二氧化硅颗粒的平均孔径为7至30nm。
2.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述RNA为mRNA、tRNA、miRNA、snRNA、snoRNA、aRNA、siRNA、环状RNA或piRNA。
3.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述RNA为吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)siRNA。
4.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述CpG-ODN和RNA通过连接基团偶联。
5.根据权利要求4所述的核酸载体，其中所述连接基团为饱和烷基链(C3至C18)、三唑连接基团或4-甲基-6,7,8,9,10,10a-六氢-5H-3λ2-环辛[d]哒嗪连接基团。
6.根据权利要求3所述的核酸载体，其中所述IDO siRNA包含SEQ ID NO：1和2的siRNA；SEQ ID NO：3和4的siRNA；SEQ ID NO：5和6的siRNA；SEQ ID NO：7和8的siRNA；或SEQ IDNO：9和10的siRNA。
7.根据权利要求3所述的核酸载体，其中所述siRNA还包含与IDO mRNA在N末端或C末端互补的1至10nt的序列。
8.根据权利要求3所述的核酸载体，其中所述IDO siRNA包含SEQ ID NO：11和12的siRNA。
9.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述CpG-ODN为CpG-A ODN、CpG-B ODN或CpG-CODN。
10.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述CpG-ODN包含SEQ ID NO：13至15中的任一核苷酸。
11.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述多孔二氧化硅颗粒在孔内带正电荷。
12.根据权利要求1所述的核酸载体，其中，在负载所述缀合物之前，所述多孔二氧化硅颗粒的ζ电位为5至80mV。
13.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述缀合物与所述颗粒的重量比的范围为1:1至20。
14.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述颗粒的BET表面积的范围为200至700m2/g，并且粒径的范围为50至1000nm。
15.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述RNA为吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)siRNA。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述癌症选自卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵泡囊肿、妇科癌症、泌尿科癌症、前列腺癌、肾癌、睾丸癌、阴茎癌、泌尿生殖道癌症、睾丸肿瘤、膀胱癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、恶性骨肿瘤、软组织肉瘤、角化棘皮瘤、黑色素瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、乳突癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、乳腺内分泌癌、肝胆胰腺癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌、骨癌、骨髓病症、淋巴病症、毛细胞癌、口腔和咽(口腔)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽癌、甲状腺癌、喉癌、食管癌、胃癌、胃肠癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、脑癌、胶质瘤、非胶质瘤肿瘤、恶性胶质瘤、转移性脑癌、脑膜瘤、前庭神经鞘瘤、垂体肿瘤、头颈癌、中枢神经系统癌、腹膜癌、肝细胞癌、头癌、颈癌、原发性肿瘤、转移性肿瘤、淋巴瘤、鳞状细胞癌、血液系统恶性肿瘤、内分泌癌、霍奇金病或白血病。
17.一种RNA，其包含以下序列：
(1)SEQ ID NO：1和2的siRNA，
(2)SEQ ID NO：3和4的siRNA，
(3)SEQ ID NO：5和6的siRNA，
(4)SEQ ID NO：7和8的siRNA，或
(5)SEQ ID NO：9和10的siRNA。
18.根据权利要求17所述的RNA，其中所述siRNA还包含与IDO mRNA在N末端或C末端互补的1至10nt的序列。
19.根据权利要求17所述的RNA，其中所述RNA由SEQ ID NO：11和12的siRNA组成。
20.根据权利要求17所述的RNA，其中所述RNA还包含与其N末端或C末端偶联的CpG-ODN。
21.根据权利要求20所述的RNA，其中所述CpG-ODN为CpG-AODN、CpG-B ODN或CpG-CODN。
22.根据权利要求16所述的RNA，其中所述CpG-ODN包含SEQ ID NO：13至15中的任一核苷酸。
23.根据权利要求20所述的RNA，其中CpG-ODN和siRNA通过连接基团偶联。
24.根据权利要求23所述的RNA，其中所述连接基团为饱和烷基链(C3至C18)、三唑连接基团或4-甲基-6,7,8,9,10,10a-六氢-5H-3λ2-环辛[d]哒嗪连接基团。
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