CN114206350A - 从多糖生产寡糖 - Google Patents
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Abstract
描述了类似于由植物、酵母和其他真菌、细菌和藻类产生的多糖的合成寡糖及其混合物。本文提供的寡糖和组合物可用作合生元、益生元、免疫调节剂、助消化剂和食品添加剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月5日提交的美国临时申请号62/857,685和2019年12月19日提交的美国临时申请号62/950,483的权益，其公开通过引用全文纳入本文。
发明背景
寡糖是通常含有3-20个共价连接的单糖单元的糖类。由于许多单糖组分、可变糖苷键位置和相关立体化学、分支和官能团修饰的可能性，寡糖可具有高度可变的结构，从而引发许多不同的生物活性。许多寡糖的生物活性尚未被研究或确定。然而，一些寡糖来源，特别是人乳1-4、牛乳5和乳糖反式半乳糖基化产生的低聚半乳糖6中的寡糖已经得到了充分的研究，并显示其作为益生元、免疫调节剂、抗腹泻剂、病原体保护剂和矿物质吸收刺激剂的作用。因此，来自其他来源的寡糖有望引发类似的生物活性。多糖是一种大生物分子，可达到或可能超过100万个单糖残基。7多糖构成了植物细胞壁、细菌、酵母、真菌以及以更限制性的方式，构成动物。8-9多糖以其物理和流变特性而闻名，包括提供结构刚性、水结合和抗氧化能力。然而，多糖的生物活性远不如寡糖，但在某些情况下，可以提供相似的益生元和免疫调节益处。10-12尽管结构成分相似，但生物活性的差异可归因于其低溶解度和有限的胞内转运。
虽然寡糖在动物体内含量很高，但大多数植物物质包含多糖，寡糖的贡献几乎没有甚至没有。多糖通常是通过将UDP活化的单糖添加到通常与蛋白质或脂质结合的碳水化合物起始物质中来合成的。13-14这没有留下寡糖生物合成的直接机制，导致几乎没有内源性寡糖。自然界中最丰富的植物多糖包括直链淀粉、支链淀粉和纤维素。然而，植物含有许多其他多糖，可以根据其结构功能进行分组。果胶指带负电的阴离子聚合物，如鼠李糖半乳糖醛酸I、鼠李糖半乳糖醛酸II和聚半乳糖醛酸，而半纤维素指结合纤维素原纤维的中性聚合物，如木葡聚糖、葡甘聚糖和阿拉伯半乳糖醛酸。此外，植物次级细胞壁主要含有阿拉伯聚糖和木聚糖。15-17
寡糖通常以三种方式生产，以下按使用频率排序：1)使用化学和/或酶和/或生物合成方法从头合成，以构建寡糖18-20，2)通过酶或化学法从蛋白质和/或脂类释放21，3)用酶通过多糖解聚22。由于寡糖从头合成的开发成本高，该策略目前仅适用于哺乳动物寡糖。此外，植物没有大量可释放的与蛋白质和脂类结合的寡糖。因此，利用酶解聚多糖是目前生产植物寡糖的主要方法。然而，酶的底物特异性导致产生高度特异性的寡糖，结构变化很小。此外，酶并不能适用于所有多糖。
发明概述
本文提供了类似于由植物、酵母和其他真菌、细菌和藻类产生的多糖的合成寡糖及其混合物。
在一些实施方式中，合成寡糖包括含有葡萄糖单体的主链，其中每个葡萄糖单体任选地键合到侧链木糖单体。在一些实施方式中，合成寡糖包括含有甘露糖单体的主链，其中每个甘露糖单体任选地键合到侧接的半乳糖单体。在一些实施方式中，合成寡糖包含甘露糖单体和葡萄糖单体。在一些实施方式中，合成寡糖包括含有阿拉伯糖单体的主链，其中每个阿拉伯糖单体任选地键合到侧接的阿拉伯糖单体。在一些实施方式中，合成寡糖包括β1-4连接的葡萄糖单体和β1-3连接的葡萄糖单体。在一些实施方式中，合成寡糖包括含有木糖单体的主链，其中每个木糖单体任选地键合到侧接的阿拉伯糖单体或侧接的葡萄糖醛酸(例如，4-O甲基化GlcA)。在一些实施方式中，合成寡糖中单体的总数在3到30之间。
本文提供的寡糖和组合物可用作合生元、益生元、免疫调节剂、助消化剂和食品添加剂、补剂、药物赋形剂和分析标准品。
附图简要说明
图1A-1C显示a)特征化木葡聚糖衍生寡糖标注的基峰色谱图；b)771.27m/z的提取的离子色谱图显示四种异构体；c)四个771.27m/z异构体的标注的串联质谱及其最终阐明的结构。
图2A-2N显示从多糖标准品中提取的寡糖的标注基峰色谱图：a)热凝聚糖，b)纤维素，c)β-葡聚糖，d)地衣聚糖，e)半乳聚糖，f)甘露聚糖，g)葡甘聚糖，h)半乳甘露聚糖，i)阿拉伯聚糖，j)木聚糖，k)阿拉伯木聚糖，l)直链淀粉，m)支链淀粉和n)木葡聚糖。
图3显示a)多糖标准品解聚产生的合并寡糖的标注基峰色谱图；以及来自b)麦麸和c)燕麦麸的特征性寡糖的标注基峰色谱图。
图4显示木葡聚糖多糖的代表。聚合度可达100,000个单糖。
图5显示了似木葡聚糖的寡糖的基峰色谱图。提取色谱图以确定m/z 400-3000之间的质量，排除校准离子m/z 922.00。标记的寡糖对应于表4中所述的寡糖。
图6A-6D显示a)保留时间为11.04分钟时m/z 477.19的片段化谱。该寡糖代表表4中的#3。b)在保留时间为15.12分钟时，m/z 771.28的片段化谱。该寡糖代表表4中的#12。c)在保留时间为20.41分钟时，m/z 903.32的片段化谱。该寡糖代表表4中的#20。d)在保留时间为26.59分钟时，m/z 1227.43的片段化谱。该寡糖代表表4中的#42。
图7显示了阐明寡糖结构的概述策略流程图。
图8A显示了完全阐明的来自半乳甘露聚糖的寡糖的标注色谱图，其使用逻辑策略4确定。
图8B显示了构建的色谱图，表示各级分中半乳糖和甘露糖的单糖浓度以及饼图所示级分的相对糖苷键组成。
图8C显示寡糖的NMR分析。
图8D通过整合寡糖、单糖、糖苷键和NMR分析显示了已阐明的半乳甘露聚糖结构的示意图。
具体实施方式
本文提供了新型合成寡糖，当彼此共同配制时，类似于由植物、酵母和其他真菌、细菌和藻类产生的多糖。寡糖可用于多种应用，包括益生元、免疫调节、肠道健康和分析标准品。长度范围为3-20个单糖的寡糖保持构成其亲本多糖的相同可识别表位，因此可提供广泛的生物活性。尺寸的减小使它们更容易被细胞识别和内化。
I.发明的实施方式
本文所用的术语“合成寡糖”指通过多糖解聚产生的寡糖。本发明的合成寡糖可通过根据本文所述方法解聚杂聚多糖和均聚多糖获得。本文所用的术语“杂聚多糖”是指含有通过相同类型的糖苷键或不同类型的糖苷键连接在一起的两种或更多种单糖亚基的多糖；杂聚多糖还包括含有通过不同类型的糖苷键连接在一起的同一类的重复单糖亚基的多糖。杂聚多糖中的糖苷键可以是β1-2键、β1-3键、β1-4键、β1-6键、α1-3键、α1-4键、α1-6键或其组合。杂聚多糖的例子包括但不限于木葡聚糖、地衣聚糖、β-葡聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯聚糖、木聚糖和阿拉伯木聚糖。
本发明的一些实施方式提供合成寡糖，其包含含有葡萄糖单体的主链，其中每个葡萄糖单体任选地键合到侧接的木糖单体，并且其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。例如，可通过根据本文所述方法解聚木葡聚糖来获得此类合成寡糖。已知木葡聚糖含有具有一个单位的木糖支链的葡萄糖主链，其中木糖支链可以用半乳糖封端或阿拉伯糖封端修饰。例如，罗望子木葡聚糖含有一个β1,4-连接的葡萄糖主链，该主链具有频繁的α1,6-连接的一个单位的木糖支链，其偶尔可以进一步连接一个β1,2-连接的半乳糖封端。在木葡聚糖的其他来源中，阿拉伯糖可以α1,2与木糖残基连接。来自其他来源的木葡聚糖可含有与半乳糖α1,2-连接的单个岩藻糖残基。
在一些实施方式中，寡糖包含2、3、4、5或6个己糖残基。在一些实施方式中，寡糖含有1、2、3或多个戊糖残基。在一些实施方式中，寡糖包含相等数量的己糖和戊糖残基。在一些实施方式中，寡糖所含戊糖残基少于己糖残基。
在一些实施方式中，合成寡糖主链中的葡萄糖单体为β1-4-连接的葡萄糖单体。在一些实施方式中，每个侧接的木糖单体通过α1-6键与主链中的葡萄糖单体键合。
在一些实施方式中，合成寡糖进一步包括与一个或多个侧接的木糖单体键合的一个半乳糖单体。在一些实施方式中，每个半乳糖单体通过β1-2键与侧接的木糖单体键合。在一些实施方式中，合成寡糖进一步包括与一个或多个半乳糖单体键合的一个岩藻糖单体。在一些实施方式中，每个岩藻糖单体通过α1-2键与半乳糖单体键合。
在一些实施方式中，合成寡糖进一步包括与一个或多个侧接的木糖单体键合的一个阿拉伯糖单体。在一些实施方式中，阿拉伯糖单体通过α1-2键与侧接的木糖单体键合。
在一些实施方式中，合成寡糖在主链中包含2-4个葡萄糖单体，与主链中的不同葡萄糖单体键合的1-2个侧接木糖单体，以及与不同木糖单体键合的0-2个半乳糖单体。
在一些实施方式中，合成寡糖选自下表4中所述的化合物。在一些实施方式中，所述合成寡糖选自由以下化合物中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34种组成的组：
((Galβ1-2)Xylα1-6)Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Glu,
((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4Glu,
Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Glu,
((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
Gluβ1-4Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Glu,
Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4Glu,
Gluβ1-4Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4Glu,
Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4Gluβ1-4Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Glu,
Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Glu,
Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Glu,
((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4((Galβ1-2)Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,
Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
(Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4Glu,
Gluβ1-4(Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu,和
(Xylα1-6)Gluβ1-4Gluβ1-4Gluβ1-4(Xylα1-6)Glu。
本发明的一些实施方式提供合成寡糖，其包含含有甘露糖单体的主链，其中每个甘露糖单体任选地键合到侧接的半乳糖单体，并且其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。例如，可通过根据本文所述方法解聚半乳甘露聚糖来获得此类合成寡糖。半乳甘露聚糖由曲霉(Aspergillus)等来源产生，含有一个β1-4甘露糖主链，其频繁的α1-6半乳糖分枝包含单一单元(34)。
在一些实施方式中，合成寡糖选自下表5-9中所述的化合物。在一些实施方式中，所述合成寡糖选自由以下化合物中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种组成的组：
Manβ1-4Manβ1-4Man,
(Galα1-6)Manβ1-4Man,
Manβ1-4(Galα1-6)Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Man,
(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Man,
(Galα1-6)Manβ1-4(Galα1-6)Man,
Manβ1-4[Manβ1-4]3Man,
(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Man,
(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Man,
(Galα1-6)Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Man,
Manβ1-4[Manβ1-4]4Man,
(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Man,
(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4(Galα1-6)Man
Manβ1-4[Manβ1-4]5Man,
Manβ1-4[Manβ1-4]6Man,和
Manβ1-4[Manβ1-4]7Man。
本发明的一些实施方式提供合成寡糖，其包含含有甘露糖单体和葡萄糖单体的主链，其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。例如，可通过根据本文所述方法解聚葡甘露聚糖来获得此类合成寡糖。葡甘露聚糖是一种在魔芋(konjac)根中发现的多糖。聚合物含有β1-4连接的葡萄糖和甘露糖残基，这些残基被认为以非重复模式随机分布(38)。
在一些实施方式中，合成寡糖选自下表5-8中所述的化合物。在一些实施方式中，所述合成寡糖选自由以下化合物中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25种组成的组：
Manβ1-4Manβ1-4Man,
Glcβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Glcβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-4Man,
Glcβ1-4Manβ1-4Glc,
Manβ1-4Glcβ1-4Glc,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Glcβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Glcβ1-4Glcβ1-4Manβ1-4Man,
Glcβ1-4Manβ1-4Glcβ1-4Man,
Glcβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-4Glcβ1-4Man,
Glcβ1-4Glcβ1-4Manβ1-4Glc,
Glcβ1-4Manβ1-4Glcβ1-4Glc,
Manβ1-4Glcβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Glcβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Glc,
Manβ1-4Glcβ1-4Glcβ1-4Man,
Manβ1-4Glcβ1-4Manβ1-4Glc,
Manβ1-4Manβ1-4Glcβ1-4Glc,
Manβ1-4Glcβ1-4Glcβ1-4Glc,
Manβ1-4[Manβ1-4]3Man,
Manβ1-4[Manβ1-4]4Man,和
Manβ1-4[Manβ1-4]5Man。
本发明的一些实施方式提供合成寡糖，其包含含有阿拉伯糖单体的主链，其中每个阿拉伯糖单体任选地键合到侧接的阿拉伯糖单体，并且其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。例如，可通过根据本文所述方法解聚阿拉伯聚糖来获得此类合成寡糖。阿拉伯聚糖作为侧链存在于果胶多糖聚鼠李糖半乳糖醛酸I上，也存在于一些分枝杆菌的细胞壁中(37)。阿拉伯聚糖含有α1-5阿拉伯糖主链，带有短的α1-3阿拉伯糖分支。
在一些实施方式中，合成寡糖选自下表5-12中所述的化合物。在一些实施方式中，所述合成寡糖选自由以下化合物中的任何1、2、3、4、5、6或7组成的组：
Araα1-5Araα1-5Ara,
(Araα1-3)Araα1-5Ara,
Araα1-5(Araα1-3)Ara,
Araα1-5Araα1-5Araα1-5Ara,
(Araα1-3)Araα1-5Ara1-5Ara,
Araα1-5(Araα1-3)Ara1-5Ara,和
Araα1-5Ara1-5(Araα1-3)Ara。
例如，在谷物(如水稻、小麦、燕麦、麸皮、大麦和麦芽)中发现的β-葡聚糖由β1-4连接的葡萄糖主链以及在每两到三个β1-4连接的葡萄糖残基之间分散着的单个β1-3葡萄糖残基组成(31)。地衣聚糖是一种存在于地衣中的多糖，其结构类似于β-葡聚糖，其中键(linkage)由β1-4和β1-3葡萄糖残基组成(32)。然而与β-葡聚糖不同的是，地衣聚糖具有更频繁的β1-3键。
在一些实施方式中，合成寡糖选自下表5-6或表5-7中所述的化合物。在一些实施方式中，所述合成寡糖选自由以下化合物中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、或17种组成的组：
Glcβ1-4Glcβ1-3Glc,
Glcβ1-3Glcβ1-4Glc,
Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-3Glc1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-3Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-3Glc
Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-3Glc,
Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-4Glc1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-3Glc1-4Glc1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-3Glc1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-4Glc1-3Glc,
Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-4Glc1-4Glc1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-3Glc1-4Glc1-4Glc1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-3Glc1-4Glc1-4Glc,
Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-4Glc1-3Glc1-4Glc,
Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-4Glc1-4Glc1-3Glc,和
Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-4Glc1-4Glc1-3Glc。
本发明的一些实施方式提供合成寡糖，其包含含有木糖单体的主链，其中每个木糖单体任选地键合到侧接阿拉伯糖单体或葡糖醛酸(例如4-O甲基化GlcA)，并且其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。例如，可通过根据本文所述方法解聚木聚糖和/或阿拉伯木聚糖来获得此类合成寡糖。木聚糖是一种多糖，通常存在于双子叶植物的次级细胞壁和大多数禾本科植物的细胞壁中。该结构包含β1-4木糖主链，通常包含α1-2葡糖醛酸分枝，该分枝可包含一个甲基。在本实验中，使用了已知含有大量4-O-甲基-葡糖醛酸分支的山毛榉木聚糖(35)。阿拉伯木聚糖是一种常见于谷物中的多糖，含有β1-4木糖主链，具有α1-2和α1-3阿拉伯糖分支(36)。
在一些实施方式中，合成寡糖选自下表5-10中所述的化合物。在一些实施方式中，所述合成寡糖选自由以下化合物中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种组成的组：
Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xyl,
Xylβ1-4[Xylβ1-4]3Xyl,
(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xyl,
Xylβ1-4[Xylβ1-4]4Xyl,
(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4[Xylβ1-4]3Xyl,
Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4[Xylβ1-4]2Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
[Xylβ1-4]3(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xyl,
[Xylβ1-4]4(OMe-4-GlcAα1-2)Xyl,
Xylβ1-4[Xylβ1-4]5Xyl,
(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4[Xylβ1-4]4Xyl,
Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4[Xylβ1-4]3Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4[Xylβ1-4]2Xyl,
[Xylβ1-4]3(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
[Xylβ1-4]4(OMe-4-GlcAα1-2)Xylβ1-4Xyl,
[Xylβ1-4]5(OMe-4-GlcAα1-2)Xyl,和
Xylβ1-4[Xylβ1-4]6Xyl。
在一些实施方式中，合成寡糖选自下表5-11中所述的化合物。在一些实施方式中，所述合成寡糖选自由以下化合物中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15种组成的组：
(Araα1-3)Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4(Araα1-3)Xyl,
((Araα1-2)(Araα1-3))Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
(Araα1-3)Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4(Araα1-3)Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4(Araα1-3)Xyl,
(Araα1-3)Xylβ1-4(Araα1-3)Xyl,
((Araα1-2)(Araα1-3))Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4((Araα1-2)(Araα1-3))Xyl,
Xylβ1-4Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl,
Xylβ1-4[Xylβ1-4]3Xyl,
Xylβ1-4[Xylβ1-4]4Xyl,
Xylβ1-4[Xylβ1-4]5Xyl,和
Xylβ1-4[Xylβ1-4]6Xyl。
根据本文所述的方法，也可通过解聚均聚多糖获得合成寡糖。如本文所用，术语“均聚多糖”是指含有相同种类的重复单糖亚基的多糖，通过相同类型的糖苷键连接在一起，包括但不限于β1-3键、β1-4键、β1-6键、α1-3键、α1-4键和α1-6键的组合。均聚物的例子包括但不限于热凝聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖。均聚物包括但不限于热凝聚糖(一种作为农杆菌胞外多糖被发现的β1-3连接的葡萄糖线性聚合物；28)、半乳聚糖(一种β1-4连接半乳糖的线性聚合物，在随后的阿拉伯呋喃糖苷酶处理以去除阿拉伯糖单元之前以阿拉伯半乳聚糖的形式分离出来；29)，甘露聚糖(β1-3连接的葡萄糖线性聚合物，作为农杆菌和一些坚果的胞外多糖被发现；30)。
在一些实施方式中，合成寡糖选自下表5-3、表5-4和表5-5中所述的化合物。在一些实施方式中，所述合成寡糖选自由以下化合物中的任何1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种组成的组：
Glcβ1-3Glcβ1-3Glc,
Glcβ1-3Glcβ1-3Glcβ1-3Glc,
Glcβ1-3[Glcβ1-3]3Glc,
Glcβ1-3[Glcβ1-3]4Glc,
Galβ1-4Galβ1-4Gal,
Galβ1-4Galβ1-4Galβ1-4Gal,
Galβ1-4[Galβ1-4]3Gal,
Galβ1-4[Galβ1-4]4Gal,
Galβ1-4[Galβ1-4]5Gal,
Galβ1-4[Galβ1-4]6Gal,
Galβ1-4[Galβ1-4]7Gal,
Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4Manβ1-4Manβ1-4Man,
Manβ1-4[Manβ1-4]3Man,
Manβ1-4[Manβ1-4]4Man,
Manβ1-4[Manβ1-4]5Man,
Manβ1-4[Manβ1-4]6Man,和
Manβ1-4[Manβ1-4]7Man。
合成寡糖可通过任何合适的方法制备，包括但不限于向特定寡糖基团的芬顿式引发(Fenton's Initiation Toward Defined Oligosaccharide Groups，FITDOG)，这是一种多糖受控降解为寡糖的方法。例如，在美国专利申请公开号2018/0363016A1中描述了示范性的FITDOG法，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，粗多糖首先经历过氧化氢和过渡金属或碱土金属(例如硫酸铁(III))催化剂的引发氧化处理，使得糖苷键更不稳定。然后用NaOH或其他碱进行碱诱导性切割，得到各种寡糖。立即进行中和以减少剥落反应(peeling reaction)。该方法能够从多种碳水化合物来源产生大量具有生物活性的寡糖。
如需要，可任选地用一种或多种多糖降解酶处理多糖，以减小多糖的平均大小或复杂度，然后用氧化性处理和金属催化剂处理得到的多糖。多糖酶的非限制性例子包括例如淀粉酶、异淀粉酶、麦芽糖酶、葡聚糖酶或其组合。
初始氧化处理可包括过氧化氢和过渡金属或碱土金属。已测试不同氧化态、大小、周期元素表的族和配位数的金属以理解FITDOC过程的应用。每种不同的金属在FITDOG反应中都表现出活性。虽然这些金属对于任何多糖都可用，可用不同的金属产生具有优势聚合度的寡糖。氧化处理后用碱处理。该方法能够从具有不同程度分支和具有不同单糖组成的多糖，包括天然和改性多糖产生寡糖。
还提供含有本文所述两种或多于两种不同合成寡糖的混合物。未纯化或半纯化的解聚产物可用于制备寡糖混合物，或者，也可纯化寡糖以产生具有特别组成的库。例如，可通过解聚多糖均聚物、多糖杂聚物或其组合来获得混合物中的合成寡糖。在一些实施方式中，混合物中的至少一种合成寡糖通过木葡聚糖、热凝聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖、地衣聚糖、β-葡聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖或其组合的解聚获得。所述组合物可包括表4-1、5-3、5-4、5-5、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11和5-12中所述的任何数量的合成寡糖。在一些实施方式中，混合物中至少一种合成寡糖的量基于混合物中寡糖的总量至少为1％。例如，合成寡糖的存在量范围为约1％至约99％，或约5％至约95％，或约10％至约90％，或约20％至约80％，或约30％至约70％。例如，合成寡糖的存在量范围为约1％至约10％，或约10％至约20％，或约20％至约30％，或约30％至约40％，或约40％至约50％，或约50％至约60％，或约60％至约70％，或约70％至约80％，或由约80％至约90％，或由约90％至约99％。百分比可以是基于混合物中寡糖总摩尔数的摩尔％，或基于混合物中寡糖总重量的重量％。在一些实施方式中，至少一种合成寡糖的量为至少5摩尔％。
如本文所使用的，术语“约”和“左右”表示当用于修改该特定值时围绕数值的近似范围。例如，如果“X”是值，“约X”或“X左右”表示0.9X到1.1X的值，例如，0.95X到1.05X的值，或0.98X到1.02X的值，或0.99X到1.01X的值。当提到“大约X”或“X左右”时特别表示至少X、0.9X、0.91X、0.92X、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X和1.1X的值以及该范围内的值。
本文提供的寡糖和组合物可用作合生元、益生元、免疫调节剂、助消化剂和食品添加剂、药物赋形剂或分析标准品。合成寡糖可与其他成分组合，生产食品和补剂，包括婴儿配方食品、老年补剂、烘焙粉和休闲食品。合成寡糖可与有益细菌结合形成合生元。合成的寡糖也可用作医药产品。
合成寡糖可用于人类、其他哺乳动物或植物根际中特定微生物的生长或维持。合成寡糖可含有特定的糖苷键，不能被特定宿主(例如，人、家畜或伴侣动物)消化，但能被特定的共生微生物或益生菌群代谢。因此，合成寡糖可作为载体将外源微生物(益生菌或生物治疗剂)运输至特定生态龛，或作为宿主中已存在微生物的营养源。
木葡聚糖可用于特定拟杆菌物种的选择性生长，如卵形拟杆菌(Bacteroidesovatus)(39)。已经证明，含有糖苷水解酶基因的木聚糖利用位点属于GH5和GH31家族，可在卵形拟杆菌中找到。当作为唯一的碳源使用时，这些基因的存在允许该物种生长。肠道中的其他主要拟杆菌物种，如多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)、粪拟杆菌(B.caccae)和脆弱拟杆菌(B.fragilis)在其基因组中缺乏该基因座或其部分，因此无法代谢木葡聚糖。
当它们的基因组编码属于GH16家族的特定类型的糖苷水解酶时，热凝聚糖可德兰可用于特定拟杆菌物种的选择性生长，如多形拟杆菌或吉氏拟杆菌(B.distasonis)。其他拟杆菌物种(如粪拟杆菌或卵形拟杆菌)的基因组中不存在该基因的直系同源物，因而不能在热凝聚糖上生长(40)。
β葡聚糖或地衣聚糖可用于特定拟杆菌物种，如卵形拟杆菌的选择性生长。该物种在其基因组中编码一种特定类型的GH16，具有β1-3,4葡聚糖活性(41)。已经证明，这种多糖可促进粪肠球菌(Enterococcus faecium)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)、食葡糖罗斯氏菌(Roseburia inulinivorans)和粪便罗斯氏菌(R.faecis)等厚壁菌的生长(42,43)。
半乳聚糖可以选择特定拟杆菌物种的生长，例如多形拟杆菌、多氏拟杆菌(B.dorei)和卵形拟杆菌。不同类型的内半乳聚糖酶可能负责这种选择性生长，属于GH53和GH147家族(44；45)。一些双歧杆菌物种(短双歧杆菌(Bif.breve)、长双歧杆菌(Bif.longum)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bif long subsp.Infantis))也描述了消耗半乳聚糖的能力(46)。
甘露聚糖可以选择性地使特定拟杆菌物种生长，如脆弱拟杆菌或卵形拟杆菌，其编码GH26内-β1-4-甘露糖苷酶(48)。这种基因在主要肠道物种，例如多形拟杆菌的基因组中并不存在，因此其不能在甘露聚糖或葡甘聚糖上生长。肠道罗斯氏菌(R.intestinalis)和粪便罗斯氏菌可以消耗甘露聚糖键(49)，梭状芽孢杆菌簇XIVa的成员(47,43)也可以，它们的基因座中有GH26编码。此外，GH26是特定种类的双歧杆菌中特征性的，如青春双歧杆菌(Bif.adolescentis)(50)，证实了该物种在甘露聚糖上生长的能力。半乳甘露聚糖仅被在其基因组中编码内-β1-4-甘露糖苷酶GH26和α-半乳糖苷酶GH27的微生物消耗，如卵形拟杆菌、解木糖拟杆菌(B.xylanisolvens)(51)或肠道罗斯氏菌(47,49)。
木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖可用于特定种类的拟杆菌的选择性生长。木聚糖可由卵形拟杆菌和单形拟杆菌(B.uniformis)代谢，而多形拟杆菌或粪拟杆菌不能在此底物上生长。阿拉伯聚糖促进了多形拟杆菌和卵形拟杆菌生长，而阿拉伯木聚糖对卵形拟杆菌的生长具有高度选择性(52,47)。已经证明，肠道罗斯氏菌、直肠大肠杆菌和直肠真杆菌(E.rectale)和粪便罗斯氏菌菌株可以消耗木聚糖或阿拉伯木聚糖作为唯一的碳源(47,43)。某些双歧杆菌具有发酵含木聚糖或含阿拉伯呋喃糖基的寡糖的能力。体外实验显示，青春双歧杆菌在木糖和阿拉伯木聚糖衍生的聚糖上选择性生长(53)。另外，附加的实验证实长双歧杆菌长亚种(B.longum subsp.longum)也能代谢阿拉伯木聚糖(54)。
II.实施例
实施例1.材料和方法
实验材料：乙酸钠、过氧化氢(H2O2)、氢氧化钠(NaOH)、硼氢化钠(NaBH4)、五水硫酸铁(III)(Fe2(SO4)3)和冰醋酸都购自Sigma-Aldrich公司(密苏里州圣路易斯)。支链淀粉来自Carbosynth(英国康普顿)。直链淀粉、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、木聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖、甘露聚糖、热凝聚糖、半乳聚糖、β-葡聚糖、阿拉伯聚糖和地衣聚糖购自Megazyme(爱尔兰布瑞)。微晶纤维素购自ACROS Organics。甲酸(FA)购自Fisher Scientific(比利时，英国)。乙腈(HPLC级)购自Honeywell(密歇根马斯基根)。所有实验均使用纳米纯水。
向特定寡糖基团的芬顿式引发(FITDOG)产生寡糖。制备了含有95％(v/v)40mM乙酸钠缓冲液(用冰醋酸调至pH5)、5％(v/v)过氧化氢(30％v/v)和65nM硫酸铁(III)的溶液。涡旋该混合物，加到干的多糖标准品中，以实现最终溶液为1mg/ml。反应在100℃孵育1小时。通过添加一半反应体积的冷2M NaOH停止反应。加入冰醋酸进行中和。
在65℃下与1M NaBH4孵育1小时还原寡糖。用无孔石墨化碳芯分离寡糖。使用80％乙腈和0.1％(v/v)TFA在水中洗涤滤芯。装载寡糖，用5个柱体积的水洗涤。用含0.05％(v/v)TFA的40％乙腈洗脱寡糖。通过蒸发离心完全干燥样品，并在-20℃下储存，直至分析。
制备样品用于粪便指纹分析。为了从多糖中分离内源性寡糖，梨和粪便样品在-80℃下用80％乙醇沉淀过夜。样品以3000rpm离心20分钟，形成多糖级分沉淀，并将其从上清液中的内源性寡糖中分离出来。沉淀的级分经FITDOG处理以产生代表性寡糖。用上述章节所述的方案还原和纯化FITDOG处理产生的寡糖。
MALDI MS分析。为了用MALDI-MS分析，将1μl铺到不锈钢MALDI板上。为此，添加0.3μl 0.01M NaCl和0.7μl 25mg/ml 2,5-二羟基苯甲酸，并在移液管尖端内混合。样品在真空下干燥，并在Bruker UltraFlextreme MALDI串联飞行时间(MALDI-TOF/TOF)仪器上进行分析。仪器以正模式运行，最大激光功率为95％。
纳米HPLC芯片/Q-TOF分析。在纳米纯水中重建样品，然后用纳米-HPLC-芯片/Q-TOF MS分析。该系统包括两个泵，一个用于加样载的毛细管泵和一个用于分析级分离的纳米泵。在该系统中，一台Agilent 1200系列HPLC和Agilent 6520Q-TOF质谱仪通过芯片数据集接口(chip cube interface)偶联。该芯片包含一个40nl富集柱和一个75μm×43mm分析柱；两根柱均以PGC为固定相。用3％(v/v)乙腈/水+0.1％甲酸以4μl/分钟的流速装样。使用溶剂A：(3％(v/v)乙腈/水+0.1％甲酸)和溶剂B：(90％乙腈/水+0.1％甲酸)的二元梯度进行色谱分离，流速为0.4μl/分钟。梯度运行60分钟，1-5％B，0-2分钟；5-30％，2-33分钟；30-99％，33-38分钟；99-99％，38-48分钟；99-1％，48-50分钟；1-1％，50-60分钟，然后开始下一次运行。
以阳性模式收集数据，并在m/z 118.086到2721.895范围内以内部校准离子校准。干燥气体设定为325℃，流速为5l/分钟。片段、分离器和Octapole 1RF电压分别设定为175、60和750伏。以0.63光谱/秒的速率进行片段化。碰撞能量基于化合物质量，表示成线性函数(碰撞能量)＝1.8*(m/z)-2.4。
HPLC Q-TOF分析。在纳米纯水中重建样品，然后用HPLC Q-TOF MS分析。使用Agilent 1260Infinity IIHPLC与Agilent 6530Accurate-Mass Q-TOF MS进行分析级分离。色谱分离在Thermo Scientific的150mm x 1mm的Hypercarb柱上进行，该柱的粒径为5μm。采用由溶剂A(3％(v/v)乙腈/水+0.1％甲酸)和溶剂B(90％乙腈/水+0.1％甲酸)组成的二元梯度。采用流速为0.150ml/分钟的45分钟梯度进行色谱分离：3-25％B，0-15分钟；25-25％B，15-18分钟；25-99％B，18-30分钟；99-99％B，30-32分钟；99-3％B，32-34分钟；3-3％B，34-45分钟。样品以阳性模式运行。内部校准离子的范围为m/z 121.051至m/z 2421.914。干燥气体温度和流速分别设置为150℃和11l/分钟。片段、分离器和Octapole 1RF的操作电压分别设定为175、60和750伏。采集速率设置为0.63光谱/秒。当采用片段化时，使用线性函数：碰撞能量＝1.45*(m/z)-3.5。
婴儿粪便样本。粪便样本采集自6个月大的健康足月婴儿，该婴儿完成了加州大学戴维斯分校婴儿微生物组营养与发育(婴儿MiND)研究。婴儿在招募时完全用母乳喂养。让婴儿在母乳同时食用梨(地球最好(Earth’s Best)，第一阶段)七天。七天后，指导父母用无菌餐具刮脏尿布，将粪便样本置于无菌管中，并将样本密封并储存在厨房冷柜中。粪便样品在干冰上运输回加利福尼亚大学戴维斯分校，并在-80℃保存直至分析。加利福尼亚大学戴维斯学术审查委员会批准了这项研究的所有方面，并从参与者那里获得了知情同意书。这项研究在clinicaltrials.gov中进行了登记(NCT01817127)。
单糖分析。采用Amicucci等人24的方法分析单糖。简而言之，使用三氟乙酸(TFA)水解寡糖，并用3-甲基-1-苯基吡唑啉-5-酮(PMP)衍生。衍生寡糖用氯仿和水提取两次，并用UHPLC/QqQ MS进行分析，如Xu等人25所述。
糖苷键分析。按照Galermo等人的方法分析糖苷键。26简而言之，寡糖首先在氢氧化钠和二甲基亚砜存在下用碘甲烷过甲基化。用水和DCM萃取过甲基寡糖，以去除二甲基亚砜。然后用TFA水解寡糖并用PMP衍生。然后在Galermo等人26描述的相同条件下，通过UHPLC-QqQ MS分析部分过甲基化的单糖。
实施例2.通过FITDOG生产寡糖
用一种具有已知结构的多糖，木葡聚糖，确定该方法的特征。木葡聚糖包含具有常出现的β(1→6)木糖分枝的β(1→4)主链，这些木糖分枝通常以单个β(1→2)半乳糖残基结束。13,30-32通过纳米-HPLC-芯片/Q-TOF MS测定，木葡聚糖反应产生了20多种结构独特的寡糖。丰度最大的寡糖如图1A所示。
木葡聚糖的寡糖纳米LC-MS图谱包括二糖到六糖。为了获得色谱图，首先使用硼氢化钠还原产物混合物，如果存在还原性糖，则产生醛糖醇。按照方法一节中的说明富集混合物并纯化。对产物的精确质量分析和串联MS表明，该反应主要产生完整的寡糖种类。对通过CID获得的片段化质谱进行解释，并得出图1A中插入的结构。色谱图中存在具有不同聚合度(DP)的寡糖组合。较少量的寡糖表明FITDOG反应具有一定程度的特异性。
虽然DP可以从准确的质量中获得，但结构信息需要串联MS。具有相同DP但不同结构的异构体也存在于几种DP中，阐明如下。在16.0、18.9、21.0和31.2分钟时，分别观察到四种异构体，成分为三种己糖和两种戊糖(m/z 771.27)(图1B)。这些异构体可通过其MS/MS谱进行区分(图1C)。在16.0(I)和18.9(II)分钟洗脱的化合物被确定为含有2Hex主链，这是因为缺少代表三个己糖和一个还原单糖的峰(m/z 507.19)，以及存在代表两个己糖而没有还原单糖的峰(m/z 325.11)。两种异构体均含有代表两个己糖、两个戊糖和一个还原端的峰(m/z 609.22)，但不存在代表两个戊糖而无还原端的峰(m/z 265.09)。这表明每个己糖有一个戊糖分支。因为主链只包含两个己糖，所以剩余的己糖必须是从其中一个戊糖延伸出来的。异构体(I)显示一个峰，代表两个己糖，一个戊糖，没有还原端(m/z 457.15)，将剩余的己糖定位到不位于还原端己糖上的戊糖。异构体(II)缺少m/z 457.15的片段，将剩余的己糖定位到连接到还原端己糖的戊糖。最后两个异构体在21.0(III)和31.2(IV)分钟时均显示出一个强峰，对应于三个己糖和一个还原端(m/z 507.19)，这表明所有三个己糖构成寡糖主链。这两种异构体还显示出一个丰度大的峰，代表一个己糖、一个戊糖和一个还原端(m/z 315.13)，这提供了戊糖从还原端分支的证据。最后，剩余的戊糖必须从两个非还原端己糖之一支化。异构体(III)显示出一个对应于两个己糖、两个戊糖和一个还原端的峰(m/z609.22)，这表明第二个戊糖位于与还原端己糖相邻的己糖上。异构体(IV)缺少片段m/z609.22，因此第二个戊糖定位到距离还原端最远的己糖。采用这种严格的方法对本报告中显示的所有寡糖进行了表征。根据已知木葡聚糖结构，发现衍生的寡糖主要由己糖主链组成，具有频繁的戊糖分支，偶尔末端为己糖。
其他多糖标准品也进行FITDOG，并且都产生了具有代表性的寡糖(图2A-2N)。多糖标准品由许多单糖组合、键类型和分支模式组成。有些含有单糖修饰。标准品包括直链淀粉、支链淀粉、纤维素、热凝聚糖、地衣聚糖、β-葡聚糖、阿拉伯聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳聚糖和木葡聚糖。FITDOG处理后各多糖的标注的色谱图示于图2A-2N。显著的峰用DP及其单糖组分缩写(己糖/Hex、戊糖/Pent、己糖醛酸/HexA)标记。
其中最简单的一组多糖是均聚多糖，其由单一的单糖和糖苷键组成。预计这些多糖得到寡糖，观察到每个DP具有一个结构。例如，热凝聚糖是一种线性β(1→3)连接的葡萄糖聚合物，产生的寡糖的组成对应于3Hex(RT 12.56分钟)、4Hex(19.28分钟)和5Hex(26.44分钟)(图2A)。其他均聚多糖如纤维素和直链淀粉每DP也产生一个低聚物，表明它们具有单一的单糖和连接组成(图2B和2C)。在半乳聚糖、aβ(1→4)连接的半乳糖多糖和甘露聚糖，β(1→4)连接的甘露糖多糖中也反映出类似的趋势。然而，由于厂商进行多糖分离的处理步骤，观察到一些固有杂质(图2D和2E)。
线性杂多糖包含多于一种单糖或糖苷键。结构异质性使得对于每个DP产生几种寡糖异构体。其中，β-葡聚糖和地衣聚糖的结构相似，由β(1→3)和β(1→4)连接的葡萄糖残基组成，但比例不同。实际上，LC-MS分析产生了与每个DP相关的几种异构体。因此，观察到对应于6Hex的组成从地衣聚糖产生八种异构体，从β-葡聚糖生成四种异构体(图2F和2G)。此外，地衣聚糖和β-葡聚糖之间的单糖结构和连接组成的相似性从两种多糖中产生了许多相似的寡糖。例如，3Hex(13.73分钟)、4Hex(19.46、19.70、20.41分钟)、5Hex(24.92、25.79分钟)和6Hex(30.90分钟)可能是地衣聚糖和β-葡聚糖之间共有的类似结构(图2F和2G)。同样，葡甘聚糖，另一种含有β(1→4)连接的葡萄糖和甘露糖残基的线性杂多糖为每个DP产生几个异构体(图2H)。
支化杂多糖具有一层附加的复杂性，其源于分支和/或糖苷键和单糖组分变化的频率。正如预期的那样，分支位置和频率的变化为每个DP产生了许多异构体。例如，半乳甘露聚糖含有一种β(1→4)连接甘露糖主链和末端半乳糖分支，产生三个3Hex异构体。在缺乏半乳糖分支的多糖主链部分，单糖排列类似于甘露聚糖。通过比较由结构相似的多糖生成的寡糖，我们推断出有关其寡糖结构的附加信息。因此，3Hex的三种异构体可以由甘露糖主链或具有半乳糖分支的甘露糖主链产生。我们确定在1.51分钟洗脱的3Hex包含三个β(1→4)连接的甘露糖残基，因为它同时来自两个来源(图2I)。通过推断，我们得出结论，在1.78分钟和2.55分钟洗脱的3Hex寡糖源自两个β(1→4)连接的具有半乳糖分支的甘露糖组分(图2J)。其他支化杂多糖，如阿拉伯聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖和木葡聚糖被成功解析，并在每个DP中类似生成几个异构体(图2J-2M)。这种不同结构的解聚进一步证明了该方法对含戊糖多糖的反应性。出乎意料的是，支链淀粉，含有α(1→4)连接的葡萄糖主链和α(1→4,6)两分葡萄糖支链的另一支化杂多糖中每个DP仅产生一个结构，这可能是由于已报道的(1→6)连接的高氧化不稳定性所致(图2N)。33
还检测了含有修饰的单糖残基的多糖。木聚糖为β(1→4)-连接的木糖多糖，具有末端4-O-甲基葡糖醛酸(GlcAOMe)残基。在FITDOG条件下，产生了几种具有独特组成的寡糖，包括3Pent：1GlcAOMe异构体(13.06、14.00、14.27和16.47分钟)、4Pent：1GlcAOMe异构体(17.68、18.87和19.55分钟)、5Pent：1GlcAOMe异构体(20.93、22.82、23.13和23.46分钟)、6Pent:1GlcAOMe异构体(24.51、26.88和27.34分钟)，和7Pent:1GlcAOMe异构体(27.61和29.69分钟)。这些寡糖的存在表明FITDOG处理后末端葡糖醛酸上的O-甲基化得以保留(图2J)。
实施例3.通过寡糖指纹分析法(fingerprinting)鉴定多糖
对于每种多糖独特的寡糖成分，我们研究了寡糖是否可以作为复杂混合物(如常见食品中的多糖)中多糖鉴定的诊断标志物。寡糖产物被用作各自亲本多糖的唯一标识符。从含有近400种独特寡糖的多糖标准品创建了寡糖参考文库。包含所有寡糖的库与未知样品一起运行，以进行保留时间比对(图3A)。
选择小麦和燕麦麸验证寡糖指纹分析法，因为已知它们含有大量非淀粉多糖，包括阿拉伯木聚糖34、混合连接的β-葡聚糖35和纤维素36。燕麦和麦麸各自产生50多种不同的寡糖，其中大部分与参考文库中的条目相匹配(图3B和3C)。
为了确定这两种麸质的多糖组成，我们使用了一种类似于用于鉴定蛋白质的肽指纹分析的方法。主要需注意的是，蛋白质由特定长度的多肽组成，而多糖由一定分布的糖长度组成。在该方法中，我们利用单个标准品中产生的寡糖数量来确定混合物中观察到的多糖产物的级分。各标准品多糖产生的寡糖数量各不相同。对于纤维素，在我们的色谱窗口中仅观察到四种寡糖，而对于支链淀粉，观察到超过20种寡糖，对于阿拉伯木聚糖，观察到超过40种寡糖。我们提出，混合物中发现的寡糖峰的数量可以表示为纯标准品中发现的寡糖峰的比例，并用作“覆盖率百分比”。如果样品中的寡糖数量接近标准品中产生的寡糖数量，则覆盖率预计会更高。
根据分析，发现小麦麸含有直链淀粉/支链淀粉(20个峰，100％覆盖率)、纤维素(3个峰，75％)、β-葡聚糖(11个峰，34％)和地衣聚糖(9个峰，24％)。燕麦麸含有直链淀粉/支链淀粉(20个峰，100％覆盖率)、纤维素(3个峰，75％)、β-葡聚糖(12个峰，38％)和地衣聚糖(9个峰，24％)。燕麦麸还含有阿拉伯木聚糖(5个峰，20％)和木聚糖(7个峰，32％)。有趣的是，燕麦麸含有不匹配的戊糖低聚物(3个峰)和混合的含己糖和戊糖的低聚物(7个峰)，表明一种尚未鉴定的多糖。尽管如此，结果与预期的麸皮多糖组成基本一致。34-36
实施例4.似木葡聚糖的寡糖的生产
从罗望子中提取木葡聚糖多糖，并通过FITDOG法生产代表其结构的寡糖。27罗望子木葡聚糖已知包含β1,4葡萄糖主链，具有常见的α1,6木糖的单亚基分支，偶尔可进一步连接到一个β1,2连接的半乳糖封端。来自其他来源的木葡聚糖可含有与半乳糖α1,2-连接的单个岩藻糖残基。在木葡聚糖的其他来源中，阿拉伯糖可以α1,2连接到木糖残基。因此，似木葡聚糖(xyloglucan resembling)的寡糖是那些可以由3-30个单糖链描述的寡糖，其基本结构包含β1,4-连接的葡萄糖和1到n个分支木糖残基，其中n是寡糖中的葡萄糖数。木糖可以通过α1,6键与任何葡萄糖连接。木糖可以(但不需要)主要通过β1,2键进一步连接到半乳糖残基。此外，木糖可以(但不需要)主要通过β1,2键进一步连接到阿拉伯糖残基。半乳糖可以(但不需要)主要通过β1,2键进一步连接到岩藻糖残基。木葡聚糖结构的例子如图4所示。
FITDOG过程产生了超过45种非天然存在的寡糖。表4总结了通过HPLC/Q-TOF MS观察到的寡糖。所观察到的寡糖聚合度(DP)在3-9之间，包含可从葡萄糖或半乳糖衍生的己糖和从木糖衍生的戊糖的组合。在表4中，标记为“Hex”的每个亚单位独立地选自：未取代的β1-连接的Glu、6-取代的β1-连接的Glu(例如，(Xylα1-6)Glu)和未取代的β1-连接的Gal。每个未取代的β1-连接的Glu或6-取代的β1-连接的Glu连接到相邻Glu或6-取代的Glu的4位，且每个Gal连接到相邻Xyl的2位。在表4中，标记为“Pent”的每个亚单位独立地选自：未取代的α-连接的Xyl和2-取代的α-连接的Xyl(例如，(Galβ1-2)Xyl)。
表4.
寡糖片段化用于阐明寡糖的二级结构。硼氢化钠还原用于将醛还原为醛糖醇，在片段化谱中，可以观察到增加的m/z 2.014。这种附加的质量清晰鉴定出还原端残基，并为确定区域特异性单糖排列提供了附加的证据。
表4所述的峰的HPLC-MS色谱图如图5所示。分析寡糖混合物的广泛属性，包括单糖和糖苷键分析。单糖分析证实，FITDOG法在加工过程中不会显著改变多糖的单糖组成。单糖分析表明，葡萄糖、半乳糖和木糖是似木葡聚糖的寡糖的三个主要组成部分。对库进行的糖苷键分析进一步证实，FITDOG过程并没有显著改变组成。正如预期的那样，末端葡萄糖、4-连接葡萄糖、4,6-支化葡萄糖、末端木糖、2-连接木糖和末端半乳糖是主要的糖苷键。观察到的单糖和糖苷键分析与MS/MS标注一起用于推断绝对寡糖结构。
图6A显示了DP为3的较小寡糖的标注质谱。该寡糖对应于表4中的寡糖#3。片段m/z345.14证实寡糖主链中有两个己糖。这进一步表征为β1,4-葡萄糖主链，因为4-连接的葡萄糖是从糖苷键分析中发现的唯一连接的己糖。此外，片段m/z315.13显示，戊糖部分与还原端葡萄糖连接。木糖是单糖分析中的主要戊糖，已知通过木葡聚糖中的β1,6糖苷键直接连接到葡萄糖主链。
图6B所示的标注串联质谱对应于表4中的寡糖#12，其DP为5。同样，片段m/z345.14显示了两个己糖主链，对应于两个β1,4连接的葡萄糖残基，其中m/z315.13对应于还原端葡萄糖上的木糖。片段m/z 609.22对应于连接到两个葡萄糖的木糖。m/z 265.08处缺少峰表明两个戊糖未连接在一起，并且必须每个己糖上有一个戊糖。此外，未观察到m/z507.17峰，其对应于三个己糖。这表明三个己糖没有连接在一起，其中一个必须连接到一个戊糖残基。最后，通过片段m/z 457.15发现该己糖的区域位置位于木糖残基上，该木糖残基从非还原性己糖残基延伸，该片段对应于一个戊糖和两个己糖，不具有还原端。根据糖苷键分析中观察到的末端半乳糖，木糖封端的己糖被确定为半乳糖。同样，通过与已知的木葡聚糖结构进行比较，进一步证实了该寡糖结构，其中木糖可以α1,6连接到末端半乳糖残基。
图6C中标注的片段化谱图对应于表4中的寡糖#20，它是一种高度支化的DP六寡糖。几个关键片段有助于阐明这种寡糖。例如，具有m/z 295.10和m/z 315.13的片段分别对应于连接到戊糖的非还原端己糖和连接到戊糖的还原端己糖。m/z265.08和m/z 397.12处分别对应于两个戊糖和三个戊糖的峰缺失表明，所有戊糖均未连接在一起，且必须全部与己糖残基连接。此外，峰m/z 589.20对应于两个非还原性己糖和两个戊糖，而m/z 609.32对应于两个具有还原端的己糖和两个戊糖。这两个峰共同表明存在一个三己糖主链，每个己糖包含一个戊糖分支。根据对单糖组成和糖苷键的了解，可以得出结论，该峰对应于一个具有三个β1,4连接的葡萄糖残基，每个残基具有各自的β1,6支化木糖残基的寡糖。
图6D中的标注片段化图谱对应于表4中的寡糖#42，其高度支化且DP为8。该寡糖的主链可以从m/z 831.29处的峰推断，该峰代表具有五个己糖和一个还原端的主链。该寡糖缺少m/z 315.13处的峰，其对应于一个还原端己糖和戊糖。这意味着寡糖缺少来自还原端己糖的戊糖分支。峰m/z 883.29代表三个己糖非还原端己糖和三个戊糖，进一步证实还原端缺少戊糖。此外，峰m/z 883.29表明所有三个戊糖都与相邻的己糖残基相连。最后，由于存在峰m/z 477.21，戊糖区域-位置可限制在从还原端起的第2、第3和第4个己糖，该峰对应于具有还原端的两个己糖和一个戊糖。由于上述戊糖未连接到还原端的证据，可以推断峰m/z 477.21表示二己糖主链，具有连接到非还原性己糖的戊糖。因此，确定该寡糖含有五个β1,4连接的葡萄糖，其中三个中间的葡萄糖含有β1,6支化木糖残基。
表4中峰对应的化合物的特性如下所示。如果个体寡糖不能与特定的峰联系，但具有相同质量的寡糖组可以与组峰联系，则将峰分组在一起。
实施例5.均聚物和杂聚物多糖的寡糖制备与表征
FITDOG解聚前多糖的单糖组成如下表5-1所示。符号“--”表示存在量小于聚合物总重量2％的单糖。
表5-1.
| 葡萄陶 | 半乳糖 | 甘露糖 | 阿拉伯糖 | 木糖 | 鼠李糖 | GalA | 果糖 | 其它 | |
| 半乳聚糖 | -- | 88.2 | -- | 2.95 | -- | 2.20 | 2.83 | -- | 3.80 |
| 地衣聚糖 | 80.16 | 10.58 | 5.53 | -- | -- | -- | -- | -- | 3.72 |
| β-葡聚体 | 95.97 | -- | -- | -- | -- | -- | -- | 2.80 | 1.24 |
| 葡甘聚糖 | 34.6 | -- | 60.9 | -- | -- | -- | -- | 2.37 | 2.11 |
| 半乳甘露聚糖 | 23.3 | -- | 73.2 | -- | -- | -- | -- | -- | 3.52 |
| 阿拉伯聚糖 | 13.3 | -- | -- | 81.6 | -- | -- | -- | -- | 5.15 |
| 木聚糖 | -- | -- | -- | -- | 94.2 | -- | -- | -- | 5.77 |
| 阿拉伯木聚糖 | -- | -- | -- | 36.3 | 59.7 | -- | -- | -- | 3.97 |
FITDOG解聚前多糖的糖苷键组成如下表5-2所示。符号“--”表示存在量小于聚合物总重量2％的单糖。
表5-2.
热凝聚糖。由热凝聚糖的结构是一种均聚多糖，这意味着连接和单体都是一致不变的，因此每个聚合度(DP)预期只有一种异构体。事实上，如表5-3所示，至少有四种寡糖不含任何异构体。很可能会产生聚合度较高的寡糖；但是，它们不在色谱范围内。
表5-3：
半乳聚糖。由于半乳聚糖是一种均聚多糖，因此预期每个聚合度(DP)只有一个异构体。事实上，如表5-4所示，至少产生7种不含任何异构体的寡糖。很可能会产生聚合度较高的寡糖；但是，它们不在色谱范围内。
表5-4
甘露聚糖。由于甘露聚糖的结构是一种均聚多糖，这意味着连接和单体都是一致不变的，因此每个聚合度(DP)预期只有一个异构体。事实上，如表5-5所示，至少产生7种不含任何异构体的寡糖。很可能会产生聚合度较高的寡糖；但是，它们不在色谱范围内。
表5-5.
谷物β-葡聚糖FITDOG法生产的寡糖与上述β-葡聚糖的多糖结构一致。例如，三糖可以有三种可能的结构组合：Glcβ1-4Glcβ1-4Glc,Glcβ1-4Glcβ1-3Glc,Glcβ1-3Glcβ1-4Glc。事实上，观察到对应于三个己糖的质量的三种异构体。此外，保留时间(RT)为13.73分钟时的异构体与纤维素中也发现的结构的相同RT对应，可鉴定为Glcβ1-4Glcβ1-4Glc。因此，RT 11.38和15.17分钟的峰被指定为在第一个和第二个葡萄糖之间或第二个和第三个葡萄糖之间具有一个β1-3键的结构。由于缺少预计不存在于β-葡聚糖中的第四种三糖异构体，该指定更为可信，而且其对应于Glcβ1-3Glcβ1-3Glc，后者出现在热凝聚糖中的RT12.57分钟处。类似的逻辑用于确认FITDOG对谷物β-葡聚糖降解中观察到的至少22种寡糖的产生(表5-6)。列出了多种化合物的峰，这些峰不能完全确定与单个寡糖有关，而是与具有相同质量的寡糖组有关。
在表5-6中，标记为“Hex”的每个亚单位独立选自未取代的β1-连接的Glu，其连接到相邻未取代Glu的3位或4位。
表5-6
地衣聚糖。如上所述，地衣聚糖均聚物和β-葡聚糖均聚物之间的这种结构差异反映在从地衣聚糖获得的寡糖产物中观察到的异构体数量上。例如，β-葡聚糖的解聚不能产生四糖Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-3Glc，因为每个β1-3葡萄糖残基之间必须至少有两个β1-4葡萄糖残基。然而，发现地衣聚糖具有与β-葡聚糖相同的所有异构体，外加一个附加的异构体，因此必须与Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-3Glc寡糖相关。类似的逻辑用于确认至少42种其他寡糖的建立(表5-7)。
在表5-7中，标记为“Hex”的每个亚单位独立选自未取代的β1-连接的Glu，其连接到相邻未取代Glu的3位或4位。
表5-7.
表5-7中的化合物6鉴定为Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-3Glc。表5-7中的化合物8和9确定为Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-4Glc、Glcβ1-4Glcβ1-3Glc1-4Glc或Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-3Glc，尽管尚未确定特定峰与特定寡糖的相关性。表5-7中的化合物15被确定为Glcβ1-3Glcβ1-4Glc1-4Glc1-4Glc、Glcβ1-4Glcβ1-3Glc1-4Glc1-4Glc、Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-3Glc1-4Glc或Glcβ1-4Glcβ1-4Glc1-4Glc1-3Glc。
葡甘聚糖。从葡甘聚糖获得的产物中寡糖异构体的数量可以描述为(#异构体的数量＝n2)，其中“n”等于单体的数量。例如，一个三糖有8个异构体，一个四糖有16个异构体，等等。这在每个DP产生的异构体数量中得到了证实。当DP大于5时，观察到的异构体数量少于预期数量，这可通过单个重复单体长链的概率低、灵敏度低或共洗脱来解释。观察到的化合物混合物数据如表5-8所示。
在表5-8中，标记为“Hex”的每个亚单位独立选自未取代的β1-连接的Glu或未取代的β1-连接的Man，其中每一个连接到相邻未取代Glu或未取代的Man的4位。
表5-8：
表5-8中峰对应的化合物的特性如下所示。如果个体寡糖不能与特定的峰联系，但具有相同质量的寡糖组可以与组峰联系，则将峰分组在一起。
半乳甘露聚糖。由于半乳甘露聚糖和甘露聚糖具有相同的β1-4甘露糖主链，因此通过比较两种色谱图中出现的峰的保留时间，很容易识别出对应于非支化主链的峰。据推测，仅在半乳甘露聚糖而非甘露聚糖中发现的峰至少包含一个分支。例如，在甘露聚糖和半乳甘露聚糖中都在RT 1.51分钟处发现了三糖Manβ1-4Manβ1-4Man，这证实了这种三糖的产生。此外，半乳甘露聚糖预计还含有两种附加的异构体，(Galα1-6)Manβ1-4Man和Manβ1-4(Galα1-6)Man。事实上，在RT 1.78和2.56分钟处观察到另外两种异构体，可以描述为前面提到的两种异构体。类似的逻辑用于确认至少47种其他寡糖的产生(表5-9)。
在表5-9中，标记为“Hex”的每个亚单位独立选自未取代的β1-连接的Man或β1-连接的(Galα1-6)Man，其中每一个连接到相邻未取代的Man或(Galα1-6)Man的4位。
表5-9.
表5-9中峰对应的化合物的特性如下所示。如果个体寡糖不能与特定的峰联系，但具有相同质量的寡糖组可以与组峰联系，则将峰分组在一起。
木聚糖。木聚糖中木糖和葡萄糖醛酸残基之间的质量不均为测定线性和支化结构提供了便利。例如，发现四糖羧基β1-4Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl的质量为546.18道尔顿，三种可能的支化三糖的质量为604.19道尔顿，在RT 14.00、15.33和16.47分钟处观察到。类似的逻辑用于确认至少27种其他寡糖的产生(表5-10)。
在表5-10中，标记为“Pent”的每个亚单位独立选自未取代的β1-连接的Xyl或β1-连接的(GlcAOMeα1-2)Xyl，其中每一个连接到相邻未取代的Xyl或(GlcAOMeα1-2)Xyl的4位。每个“GlcAOMe”代表一种葡糖醛酸，在4-O位置甲基化。
表5-10：
表5-10中峰对应的化合物的特性如下所示。如果个体寡糖不能与特定的峰联系，但具有相同质量的寡糖组可以与组峰联系，则将峰分组在一起。
阿拉伯聚糖。根据其多糖结构，阿拉伯木聚糖预计有四种三糖异构体。在木聚糖中还发现了一个异构体，在RT 9.83分钟处，这证实了该结构仅含主链，没有分支，即Xylβ1-4Xylβ1-4Xyl。此外，在RT 2.00、4.40和12.78处观察到另外三种异构体，它们对应于三种预期结构(Araα1-3)Xylβ1-4Xyl,Xylβ1-4(Araα1-3)Xyl,((Araα1-2)(Araα1-3))Xyl。类似的逻辑用于确认至少39种其他寡糖的产生(表5-11)。
在表5-11中，标记为“Pent”的每个亚单位独立选自未取代的β1-连接的Xyl、β1-连接的(Araα1-3)Xyl、和β1-连接的(Araα1-2)(Araα1-3)Xyl，其中每一个连接到相邻Xyl、(Araα1-3)Xyl或(Araα1-2)(Araα1-3)Xyl的4位。
表5-11：
表5-11中峰对应的化合物的特性如下所示。如果个体寡糖不能与特定的峰联系，但具有相同质量的寡糖组可以与组峰联系，则将峰分组在一起。
阿拉伯聚糖。用于解聚的阿拉伯多糖来源于甜菜根。预计阿拉伯聚糖产生三种三糖异构体：Araα1-5Araα1-5Ara,(Araα1-3)Araα1-5Ara,和Araα1-5(Araα1-3)Ara。事实上，在RT 2.97、3.94和4.77分钟的色谱图中观察到三种异构体。对于四种预期的四糖异构体Araα1-5Araα1-5Araα1-5Ara,(Araα1-3)Araα1-5Ara1-5Ara,Araα1-5(Araα1-3)Ara1-5Ara,Araα1-5Ara1-5(Araα1-3)Ara，这种趋势也持续下去。正如所料，在RT 10.55、11.03、11.66和12.26分钟处发现了四种异构体。共有34种寡糖来自甜菜根阿拉伯多糖(表5-12)。
在表5-12中，标记为“Pent”的每个亚单位独立选自未取代的β1-连接的Ara和β1-连接的(Araα1-3)Ara，其中每一个连接到相邻的Ara或(Araα1-3)Ara的5位。
表5-12
表5-12中的化合物1-3确定为Araα1-5Araα1-5Ara，(Araα1-3)Araα1-5Ara和Araα1-5(Araα1-3)Ara，尽管每个峰对应的特定寡糖尚未确定。化合物4-7确定为Araα1-5Araα1-5Araα1-5Ara,(Araα1-3)Araα1-5Ara1-5Ara,Araα1-5(Araα1-3)Ara1-5Ara,和Araα1-5Ara1-5(Araα1-3)Ara，尽管每个峰对应的特定寡糖尚未确定。
实施例6.寡糖结构表征的策略。
寡糖的结构表征复杂且不是流线式的；因此，当发现新类型和种类的寡糖时，往往会开发出新的策略。根据本发明制备的寡糖分为不同类别，例如，1)来源于均聚多糖的寡糖，含有单一类型的单糖和单一类型的糖苷键(例如，直链淀粉、半乳聚糖、甘露聚糖、热凝聚糖和纤维素)；2)来自杂聚多糖的寡糖，含有不同分子量的非异构单体和不同的糖苷键(木聚糖和木葡聚糖)；3)源自杂聚多糖的寡糖，含有具有相同分子量的异构单体和/或不同类型糖苷键(葡甘聚糖、半乳甘露聚糖和阿拉伯木聚糖)；和4)由均聚多糖衍生的寡糖，含有单一的单糖单元和不同类型的糖苷键(阿拉伯糖、地衣聚糖和β-葡聚糖)。创建流程图(图7)以将寡糖组分与可用于其表征的相应逻辑匹配。例子如下所述。
策略1：均聚物的结构表征
均聚物是用于表征的最简单寡糖。当通过单糖分析确定时，通过单个单体单元的存在来鉴定均聚物，并且当通过糖苷键分析确定时，仅通过末端和一种类型的线性键来识别。确定均聚物后，通过HPLC-MS进行寡糖分析，以确定聚合度。例如，半乳聚糖含有88％的半乳糖(表5-1)，只有两个主要的糖苷键，58.84％为4-键，30.53％为末端(表5-2)，这表明它是均聚物。HPLC-MS寡糖分析显示七个峰，对应于3-9的DP。因此，寡糖被指定为Galβ1-4Gal的聚合物(表5-4)。
策略2：含异-质量(hetero-mass)单体的杂聚物的结构表征
具有异-质量单体的杂聚物可以是结构最复杂的寡糖，然而，质量的不均匀性导致寡糖可以通过在质谱仪中片段化来区分。木葡聚糖是具有异-质量单体的杂聚物例子，因为它包含葡萄糖和半乳糖(180.16Da)以及木糖(150.13Da)。实施例4和图6中显示了基于片段化的逻辑流的表征方法的完整描述。
策略3：含同-质量(homo-mass)单体的杂聚物的结构表征
具有同-质量单体的杂聚合物是阐明结构时最复杂的寡糖，因为可能的结构数量很多，而又缺乏通过MS片段化获得的信息。可用于表征寡糖的一种策略是通过分组策略，其中寡糖异构体组被指定给具有相同质量的色谱峰组。当每个DP的异构体数量与单体和糖苷键分布描述的可能异构体数量一致时，该策略特别有用。例如，该策略用于含有β1-3和β1-4葡萄糖聚合物混合物的β-葡聚糖(实施例5，表5-2，5-3)。当寡糖分组不够时，可使用从头表征法进行结构表征，如下文实施例6策略4所述。
策略4：聚合物的从头和无偏向表征
不能用逻辑策略1-3描述的本文生产的寡糖产物的结构根据以下的从头方法进行了表征和/或描述。
寡糖的分级分离
寡糖的分级分离和检测在配有Agilent 6530Q-TOF质谱仪和Teledyne Isco Foxy200级分收集仪的Agilent 1260Infinity II系列HPLC上进行。在Thermo Scientific的150mm x 4.6mm的Hypercarb柱上首先分离寡糖，该柱的粒径为5μm。采用二元梯度，其由溶剂A(3％(v/v)乙腈/水+0.1％甲酸)和溶剂B(90％乙腈/水+0.1％甲酸)组成。采用流速为1ml/分钟的90分钟梯度进行色谱分离：5-12％B，0-90分钟；12-99％B，90-90.01分钟；99-99％B，90.01-110分钟；99-5％B，110-110.01分钟；5-5％B，110.01-120分钟。过柱后，一个90:10的分流器将较大的流束分到级分收集仪，将较小的流束分到Q-TOF质谱仪。以阳性模式收集来自QTOF的数据，并在m/z 118.086-2721.895范围内以内部校准离子校准。干燥气体设定为150℃，流速为11l/分钟。片段、分离器和Octupole 1RF电压分别设定为75、60和750伏。以1光谱/秒的速率进行片段化。碰撞能量基于化合物质量，表示成线性函数(碰撞能量)＝1.3*(m/z)-3.5。在96孔板上以每个级分30秒的速率收集各级分。收集的级分在真空离心下干燥至完全，并在100μl纳米纯(nano-pure)水中重建。将10μl等份转移到单独的96孔板上进行单糖组成分析，而剩余的90μl进行糖苷键分析。
级分化寡糖的单糖组成分析
简单地说，经分级分离的(fractionated)寡糖在100℃下用4M TFA酸水解2小时。真空离心样品至完全干燥。样品和单糖标准品(0.001-100μg/ml)在70℃下用0.2M PMP在甲醇和28％NH4OH中衍生30分钟。衍生的级分在真空离心下干燥至完全，并在纳米纯水中重建。氯仿萃取除去过量PMP。通过配有Agilent 6495A QqQ MS的Agilent 1290infinity IIUHPLC使用动态多反应监测(dMRM)模式对水层进行分析。使用包含单糖标准品(果糖、甘露糖、阿洛糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖胺)的0.001-100μg/ml的外部标准曲线对级分中的每种单糖进行绝对定量。该方法的详细说明见Xu等人25和Amicucci等人24。
分级分离寡糖的键分析
糖苷键分析采用Galermo等人的方法进行。26简而言之，分级分离的寡糖和一组寡糖标准品(2-O-(α-D-甘露糖吡喃糖基)-D-甘露糖吡喃糖，1,4-D-木二糖，1,5-α-L-阿拉伯三糖，1,3-α-1,6-α-D-甘露三糖，异麦芽三糖，4-O-(β-D-半乳吡喃糖基)-D-半乳吡喃糖，乳糖，2'-岩藻糖乳糖，黑曲霉糖(Nigerose)，3-O-(β-D-半乳吡喃糖基)-D-半乳吡喃糖，3-(α-D-甘露吡喃糖基)-D-甘露吡喃糖，1,4-β-D-甘露三糖，麦芽六糖，1，6-α-D-甘露三糖，和carbosynth(Copton，英国)获得的支链淀粉，半乳聚糖(Lupin)，3’3-α-L-阿拉伯呋喃糖基木四糖，槐糖，半乳聚糖，木葡聚糖，甘露聚糖，半乳甘露聚糖，山毛榉木聚糖，阿拉伯木聚糖，阿拉伯糖，从Megazyme(伊利诺伊州芝加哥)获得的葡甘聚糖；如Galermo等人55)所述，合成剩余的部分过甲基化的单糖，并在DMSO中与饱和NaOH和碘甲烷反应。剩余NaOH和DMSO通过DCM和水萃取去除。DCM层通过真空离心完全干燥。样品以与单糖分析相同的方式进行水解和衍生。样品未经氯仿萃取，在70％(v/v)甲醇/水中重建。在Agilent 1290infinity IIUHPLC上分析级分，该UHPLC装有Agilent 6495A QqQ MS，以多反应监测(MRM)模式运行。上述寡糖标准品库用于根据其m/z、片段化图谱和保留时间指定存在的糖苷键。
分级分离寡糖的NMR分析
在配有5毫米Bruker CPTCI低温探针的Bruker AVANCE III 800MHz光谱仪上，在303K下记录NMR谱。通过合并HPLC-QTOF MS和MS/MS数据验证的相同组分的10个分级分离寡糖集合，获得样品。根据单糖和连接信息，选择丰度最高的寡糖进行NMR分析。在用0.4mLD2O重建前，真空离心干燥每个选定的合并级分，并使用1D 1H(松弛豫延迟(D1)2s；扫描次数(NS)128)、13C NMR(D1 1.5秒；NS 6000-15000)和2D 1H-1H COSY(D1 1.5秒；NS 8)、1H-13C HSQC(D1 2秒；NS 4)、HMBC(D1 1.5秒；NS 16)和H2BC(D1 1.5秒；NS 16)测定。然后用Bruker TopSpin 3.2处理谱图，并用MestReNova进行分析。使用CASPER程序计算实验化学位移以及所需的单糖和连接数据，其中寡糖结构(包括连接的异头特征)通过分级评分进行预测。56
方法概况
对于实施例6，策略1-3中所述的简易方法无法表征的寡糖的结构分析，我们在此描述了一种成功将其从头阐明的方法。该策略还可用于完全表征本文所述任何剩余未经表征的寡糖的结构。在这一策略中，寡糖产物经色谱分离成数量较少的化合物库，许多化合物包含单一的独特结构。在MS和MS/MS的QTOF和96孔收集板之间分离LC洗脱液。QTOF MS和MS/MS质谱提供了与单糖组成和在独特保留时间收集的化合物的寡糖聚合度有关的结构信息。然而，仅使用QTOF MS和MS/MS质谱数据可能无法识别单糖组分、连接或连接的异头特征(α或β)。在这种情况下，通过快速输出的单糖和连接分析进一步分析收集的级分(例如，约200)，以提供每个寡糖组分的几乎完整的结构。
在一个这样的例子中，半乳甘露聚糖多糖被用来说明这些工作流的功能。LC-MS色谱主要生成具有未知单糖组成(半乳糖和甘露糖的组合)、连接或分支的己糖聚合物(图8A)。以30秒递增收集LC-MS中的级分，总共得到192个级分。如上文“分级分离寡糖的单糖组成分析”中所述，对每一级分进行单糖组成分析，结果示于图8B。连接信息同样是通过上文“分级分离寡糖的连接分析”中所述的综合连接分析的单独工作流程获得的。当整合三个工作流程(单糖、糖苷键和寡糖分析)，它们产生了描述具有单糖组成和糖苷键信息的寡糖的结构信息。
为了获得最终的结构特征、连接的异头特征，选择分离的寡糖级分进行NMR分析，使用1H、13C NMR以及上文“分级分离寡糖的NMR分析”中所述的COSY、HSQC、HMBC和H2BC等技术组合，结果如图8C所示。MS获得的连接和单糖组成通过限制确定准确结构所需的分辨率，极大地促进了NMR解析。这种多工作流的方法获得了绝对寡糖结构，也用于再现亲本聚合结构(图8D)。
因此，表格(表4、5-3、5-4、5-5、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10和5-11)中所述的任何寡糖峰的结构可通过策略1-4中所述的策略来阐明。具体而言，表4中的寡糖1-24以策略2表征，而同一表中的寡糖25-35则以策略3表征，并可进一步以策略4表征。表5-3、5-4和5-5中的所有寡糖均采用策略2进行表征。表5-6中的寡糖通过策略3进行表征，并可进一步通过策略4进行表征。寡糖2、5、10和18的结构表征为与热凝聚糖中鉴定的化合物同源的化合物，因为它们具有相同的质量和保留时间。表5-7中的寡糖通过策略3进行表征，并可进一步通过策略4进行表征。
表5-8中的寡糖1、9、27、47和79通过其与甘露聚糖中发现的结构的同源性进行表征；寡糖2-7和10-23由策略3表征，并可由策略4进一步表征；寡糖8、24-26、28-46、48-78和80-164可通过策略4进行表征。
表5-9中的寡糖1、4、17、26、36和43通过其与甘露聚糖中的相同结构的同源性进行表征；寡糖2、3、5-7、10-16、18-22和27-32通过策略3表征，并且可以通过策略4进一步表征；寡糖23-25、27-35、37-42和44-47可通过策略4进行表征。
表5-10中的寡糖1、2、6、11、17和24通过策略2进行表征；寡糖3-5、7-10、12-16和18-23由策略3表征，并可由策略4进一步表征；寡糖25-27可通过策略4进行表征。
表5-11中的寡糖3、11、19、25、30和35通过其与木聚糖中发现的结构的同源性进行表征；寡糖1、2、4和5-10由策略3表征，并可由策略4进一步表征；寡糖12-18、20-24、26-29、31-34可通过策略4进行表征。
表5-12中的寡糖1-3和4-7通过策略3进行表征，并且可以通过策略4进一步表征；寡糖8-34可通过策略4进行表征。
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虽然通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明以清晰理解，但本发明技术人员应理解可在所附权利要求书范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的各参考文献通过引用全文纳入本文，就如同各参考文献单独通过引用纳入本文。
Claims (39)
1.一种合成寡糖，其包含含有葡萄糖单体的主链，其中每个葡萄糖单体任选地键合到侧链木糖单体，并且其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。
2.如权利要求1所述的合成寡糖，其中主链中的葡萄糖单体是β1-4连接的葡萄糖单体。
3.如权利要求1或2所述的合成寡糖，其中每个侧链木糖单体通过α1-6键与主链中的葡萄糖单体键合。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的合成寡糖，其进一步包含键合到一个或多个侧链木糖单体的一个半乳糖单体。
5.如权利要求4所述的合成寡糖，其中每个半乳糖单体通过β1-2键与侧链木糖单体键合。
6.如权利要求4或5所述的合成寡糖，进一步包含键合至一个或多个半乳糖单体的一个岩藻糖单体。
7.如权利要求6所述的合成寡糖，其中每个岩藻糖单体通过α1-2键与半乳糖单体键合。
8.如权利要求1-3任一所述的合成寡糖，进一步包含键合至一个或多个侧链木糖单体的一个阿拉伯糖单体。
9.如权利要求8所述的合成寡糖，其中阿拉伯糖单体通过α1-2键与侧链木糖单体键合。
10.如权利要求1-9任一所述的合成寡糖，其在主链中包含2-4个葡萄糖单体，与主链中的不同葡萄糖单体键合的1-2个侧链木糖单体，以及与不同木糖单体键合的0-2个半乳糖单体。
11.一种合成寡糖，其包含含有甘露糖单体的主链，其中每个甘露糖单体任选地键合到侧链半乳糖单体，并且其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。
12.如权利要求11所述的合成寡糖，其中主链中的甘露糖单体是β1-4连接的甘露糖单体。
13.如权利要求11或12所述的合成寡糖，其中每个侧链半乳糖单体通过α1-6键与主链中的甘露糖单体键合。
14.如权利要求11-13中任一权利要求所述的合成寡糖，其中所述寡糖包含2-9个甘露糖主链单体和0-9个侧链半乳糖单体。
15.一种合成寡糖，其包含甘露糖单体、葡萄糖单体或其组合，其中所述合成寡糖中的单体总数在3到30之间。
16.如权利要求15所述的合成寡糖，其中该合成寡糖是线性的，且其中该合成寡糖包含至少一个甘露糖单体及至少一个葡萄糖单体。
17.如权利要求15或16所述的合成寡糖，其中葡萄糖单体与葡萄糖或甘露糖单体β1-4连接，且甘露糖单体与甘露糖或葡萄糖单体β1-4连接。
18.一种合成寡糖，其包含含有阿拉伯糖单体的主链，其中每个阿拉伯糖单体任选键合到侧链阿拉伯糖单体，并且其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。
19.如权利要求18所述的合成寡糖，其中主链中的阿拉伯糖单体是α1-5连接的阿拉伯糖单体。
20.如权利要求19所述的合成寡糖，其中每个侧链阿拉伯糖单体通过α1-3键与主链中的阿拉伯糖单体键合。
21.如权利要求20所述的合成寡糖，其中每个侧链阿拉伯糖单体通过α1-3或α1-5键任选地键合到另一个阿拉伯糖单体。
22.如权利要求18所述的合成寡糖，其中主链中的阿拉伯糖单体是α1-3连接的阿拉伯糖单体。
23.如权利要求22所述的合成寡糖，其中每个侧链阿拉伯糖单体通过α1-5键与主链中的阿拉伯糖单体键合。
24.如权利要求23所述的合成寡糖，其中每个侧链阿拉伯糖单体通过α1-3或α1-5键任选地键合到另一个阿拉伯糖单体。
25.一种合成寡糖，其包含β1-4连接的甘露糖单体和β1-3连接的葡萄糖单体，其中所述合成寡糖中的单体总数在3到30之间。
26.如权利要求25所述的合成寡糖，其中每个β1-4连接的葡萄糖单体任选地键合到另一个β1-4连接的葡萄糖单体或键合到β1-3连接的葡萄糖单体，并且每个β1-3葡萄糖单体任选地结合到另一个β1-3连接的葡萄糖单体或键合到β1-4连接的葡萄糖单体。
27.一种合成寡糖，其包含含有木糖单体的主链，其中每个木糖单体任选键合到侧链阿拉伯糖单体或侧链(4-O甲基化)葡糖醛酸单体，并且其中合成寡糖中的单体总数在3到30之间。
28.如权利要求27所述的合成寡糖，其中主链中的木糖单体是β1-4连接的木糖单体。
29.如权利要求28所述的合成寡糖，其中每个侧链阿拉伯糖单体通过α1-2或α1-2或α1-3键任选地键合到主链木糖单体。
30.如权利要求27或28所述的合成寡糖，其中两个侧链阿拉伯糖单体通过α1-2和α1-3键键合到相同的主链木糖上。
31.如权利要求27或28所述的合成寡糖，其中每个侧链4-O-甲基葡糖醛酸单体通过α1-2键与木糖单体键合。
32.如权利要求1-31中任一项所述的合成寡糖，其列于表4、表5-3、表5-4、表5-5、表5-6、表5-7、表5-8、表5-9、表5-10、表5-11或表5-12任一项中。
33.如权利要求1-32中任一项所述的合成寡糖，其获自植物衍生的多糖。
34.如权利要求33所述的合成寡糖，其中该植物衍生的多糖源自罗望子、魔芋根、地衣或谷粒。
35.一种组合物，其包含多于两种不同的权利要求1-34中任一权利要求所述的合成寡糖。
36.一种包含多于两种不同合成寡糖的组合物，其中所述合成寡糖通过一种或多种多糖的解聚获得。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述每种多糖独立地选自木葡聚糖、热凝聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖、地衣聚糖、β-葡聚糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯多糖、木聚糖和阿拉伯木聚糖。
38.如权利要求35-37中任一权利要求所述的组合物，其中所述合成寡糖中至少一种的量基于所述组合物中寡糖的总量为至少5摩尔％。
39.如权利要求1-34中任一权利要求所述的合成寡糖或根据权利要求35-38中任一权利要求所述的组合物作为合生元、益生元、免疫调节剂、助消化剂、食品添加剂、补剂、药物赋形剂或分析标准品的用途。
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