CN114191433A - 盐酸小檗碱在改善蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了盐酸小檗碱在改善蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的应用。本发明进行了蛋白质印迹、代谢物测定、TUNEL染色和行为测试来研究蛛网膜下腔出血后的能量代谢过程。我们推测，盐酸小檗碱可以通过增加线粒体去乙酰化酶SIRT3促进TRAP1蛋白的去乙酰化；盐酸小檗碱促进神经元糖酵解，为神经元提供能量，增加琥珀酸脱氢酶活性，并减少蛛网膜下腔出血后的活性氧。

Description

盐酸小檗碱在改善蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的应用
技术领域
本发明涉及盐酸小檗碱在改善蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的应用。
背景技术
蛛网膜下腔出血是一种严重的脑血管疾病，致残率和死亡率都很高。不同的原因可导致蛛网膜下腔出血，如脑动脉瘤破裂、动静脉畸形、烟雾病和脑淀粉样血管病。虽然在外科手术和临床治疗方面取得了重大进展，但蛛网膜下腔出血的死亡率仍在25％～35％之间。有证据表明，早期脑损伤是导致蛛网膜下腔出血后预后不良的主要原因。三磷酸腺苷是生理活动的一个重要能量底物。在中枢神经系统中，神经元通过补充三磷酸腺苷完成神经递质传导和电信号传输。三磷酸腺苷的合成主要依赖于生理条件下的线粒体有氧呼吸，而氧化磷酸化和三羧酸循环是能量应用的主要途径。电子呼吸链位于线粒体的线粒体外膜，是有氧氧化的必要条件。在生理条件下，中枢神经系统有足够的氧气供应，主要完成有氧氧化过程。然而，蛛网膜下腔出血后由于血管收缩而发生缺血缺氧。在这种情况下，代谢产物和代谢模式仍不清楚。三磷酸腺苷合成紊乱会影响线粒体功能，对早期脑损伤中的神经元凋亡至关重要。因此，蛛网膜下腔出血后神经元的能量模式转换对保护神经元具有重要意义。
在有氧氧化中，该过程需要氧化呼吸链的参与。电子的转移将完全氧化底物，并在此过程中释放大量的三磷酸腺苷。琥珀酸脱氢酶参与了氧化呼吸链中复合体II的形成。抑制琥珀酸脱氢酶的活性将减慢有氧氧化过程，呼吸链中出现电子泄漏。在糖酵解和有氧氧化过程中有多种限速酶。己糖激酶在葡萄糖代谢中起着重要的调节作用。在己糖激酶的催化下，葡萄糖和三磷酸腺苷发生磷酸化反应，产生葡萄糖-6-磷酸和二磷酸腺苷。在有氧氧化中，代谢物丙酮酸进入线粒体，在丙酮酸脱氢酶复合物的催化下，通过氧化脱羧转化为乙酰辅酶A；丙酮酸在无氧条件下转化为乳酸，并在细胞质中形成少量三磷酸腺苷。糖酵解保证了在缺血、缺氧等异常生理条件下的能量生成，同时也避免了有氧氧化中活性氧的产生。目前，已经有研究阐明了蛛网膜下腔出血后发生的潜在机制，但很少有人关注代谢模式的变化。
TRAP1(肿瘤坏死因子受体相关蛋白1)是HSP90家族的成员，是一种高含量和进化保守的分子伴侣，主要位于线粒体中。它可以参与蛋白质折叠和稳定线粒体膜。TRAP1也是代谢模式的开关，因为它可以抑制琥珀酸脱氢酶的活性。乙酰化是一个重要的翻译后修饰过程。通过乙酰化，蛋白质的活性和功能可以得到快速调整。Sirtuins(SIRTs)是NAD+依赖性的蛋白质去乙酰化酶。SIRT3是一种主要的蛋白去乙酰化酶，主要位于线粒体中。SIRT3能感知细胞代谢压力并调节能量和活性氧代谢。研究表明，SIRT3可以调控TRAP1的乙酰化和去乙酰化过程。然而，目前还没有关于TRAP1蛋白的乙酰化修饰在蛛网膜下腔出血中的研究。
盐酸小檗碱(CAS:633-65-8)是一种从中药黄连中分离出来的异喹啉类生物碱，也存在于四科十属等多种植物中。研究表明，盐酸小檗碱可以通过血脑屏障。研究披露，盐酸小檗碱的药理作用表现在止泻、抗糖尿病、抗血脂异常、抗肿瘤、调节糖代谢等方面。目前，盐酸小檗碱被广泛用于中枢神经系统，治疗脑缺血损伤、阿尔茨海默病和帕金森病。研究表明，盐酸小檗碱可以通过上调SIRT3参与乙酰化，促进胰腺中的细胞糖酵解，但在中枢神经系统中对于能量代谢的调节我们知之甚少。
发明内容
本发明进行了蛋白质印迹、代谢物测定、TUNEL染色和行为测试来研究蛛网膜下腔出血后的能量代谢过程。我们推测，盐酸小檗碱可以通过增加线粒体去乙酰化酶SIRT3促进TRAP1蛋白的去乙酰化；盐酸小檗碱促进神经元糖酵解，为神经元提供能量，增加琥珀酸脱氢酶活性，并减少蛛网膜下腔出血后的活性氧。
在一个方面，本发明提供了盐酸小檗碱在改善蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的应用。
在另一个方面，本发明还提供了盐酸小檗碱在调节蛛网膜下腔出血的TRAP1乙酰化中的应用。
在一些实施方案中，所述盐酸小檗碱增加线粒体去乙酰化酶SIRT3的表达并促进TRAP1蛋白的去乙酰化。
在一些实施方案中，所述盐酸小檗碱用于调节蛛网膜下腔出血后的糖酵解功能。
在一些实施方案中，所述盐酸小檗碱用于调节琥珀酸脱氢酶活性，促进有氧呼吸过程，减少电子泄漏引起的活性氧含量。
在一些实施方案中，所述盐酸小檗碱用于增加己糖激酶活性，增加乳酸含量，促进三磷酸腺苷含量的糖酵解。
本发明进行了蛋白质印迹、代谢物测定、TUNEL染色和行为测试，探索蛛网膜下腔出血后的代谢模式转换以及盐酸小檗碱干预后TRAP1乙酰化的影响。研究表明，盐酸小檗碱可以调节琥珀酸脱氢酶的活性，促进有氧呼吸过程，减少电子泄漏引起的活性氧；盐酸小檗碱还可以增加己糖酶活性和乳酸，促进糖酵解中三磷酸腺苷的含量。我们的研究结果探讨了蛛网膜下腔出血后乙酰化TRAP1的变化和代谢模式的转换，验证了盐酸小檗碱对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的保护作用，这表明盐酸小檗碱是一种潜在的临床应用药物。
附图说明
图1为实验设计和流程图；
其中，(a)假手术组和蛛网膜下腔出血组代表图；(b)实验1流程图；将大鼠随机分为假手术组和蛛网膜下腔出血组(1小时，3小时，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时)；测量各组大鼠颞底脑组织中相关代谢物的含量，包括葡萄糖、乳酸、丙酮酸和三磷酸腺苷；同时，进行蛋白质印迹实验，检测SIRT3、TRAP1和乙酰化TRAP1的表达；(c)盐酸小檗碱的化学结构式；(d)实验2的流程图；将大鼠随机分为假手术组、假手术+盐酸小檗碱组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组，取各组大鼠的颞底脑组织做样本；测量相关的代谢物，包括葡萄糖、乳酸、丙酮酸和三磷酸腺苷的含量，以及己糖激酶和琥珀酸脱氢酶活性；蛋白质印迹实验检测了SIRT3、TRAP1和乙酰化TRAP1的蛋白水平；每组都进行了行为测试，包括改良的加西亚测试得分、转轮测试和莫里斯水迷宫测试；用TUNEL染色和活性氧水平来衡量各组的细胞凋亡水平。
图2为蛛网膜下腔出血后72小时内糖酵解代谢物和蛋白质的变化；
其中，(a-d)大鼠颞底脑组织在蛛网膜下腔出血或假手术后1、3、6、12、24、48和72小时的相对糖酵解代谢物含量(相对基线％)；图a显示相对三磷酸腺苷含量；图b显示了相对的葡萄糖含量；图c显示了相对的乳酸含量；图d显示相对丙酮酸的含量；(e,g)大鼠颞底脑组织在蛛网膜下腔出血或假手术后SIRT3表达的时间过程；图e显示SIRT3在蛛网膜下腔出血或假手术后1、3、6、12、24、48和72小时的蛋白质印迹条带；图g显示了相对SIRT3蛋白水平的定量分析；β-actin被用来作为内参对照；(f)蛛网膜下腔出血或假手术后3、6、12小时的乙酰化TRAP1的免疫沉淀带；(h)相对TRAP1蛋白水平的定量分析；β-actin被用作加载对照；(i)显示相对乙酰化TRAP1/TRAP1的定量分析；重链被用作加载对照；数据以平均值±SD表示；a-d中n＝10，g-i中n＝6；*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001，与假手术组相比；N.S.，无显著差异；SIRT3，sirtuins 3；TRAP1，肿瘤坏死因子受体相关蛋白1；Ac-TRAP1，乙酰化肿瘤坏死因子受体相关蛋白1；HC，重链；SD，标准差。
图3为盐酸小檗碱对蛛网膜下腔出血后糖代谢产物的影响；
其中，(a-d)假手术组、假手术+盐酸小檗碱组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组，大鼠颞底脑组织的相对糖代谢产物含量(相对基线％)；图a显示相对三磷酸腺苷含量；图b显示了相对的葡萄糖含量；图c显示相对乳酸含量；图d显示相对丙酮酸含量；(e)在假手术组、假手术+盐酸小檗碱组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组中，盐酸小檗碱干预后大鼠颞部脑组织的相对己糖激酶活性(相对基线％)；数据以平均值±SD表示；a-e中n＝10；蛛网膜下腔出血组和蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组都是在蛛网膜下腔出血造模后6小时；*P≤0.05，与假手术组相比；N.S.，无显著差异。
图4为盐酸小檗碱降低蛛网膜下腔出血后乙酰化TRAP1的水平；
其中，(a，c)通过蛋白质印迹分析显示盐酸小檗碱干预脑组织的功效；图a显示假手术组、假手术组+盐酸小檗碱组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组中SIRT3的蛋白质印迹条带；图c显示了相对SIRT3蛋白水平的定量分析；β-肌动蛋白被用来作为加载对照；(b)假手术组、假手术+盐酸小檗碱组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组中乙酰化TRAP1的蛋白质印迹带；(d)相对TRAP1蛋白水平的定量分析；β-肌动蛋白被用来作为加载对照；(e)相对乙酰化TRAP1/TRAP1蛋白水平的定量分析；重链被用作加载对照；a-e中的n＝6，蛛网膜下腔出血组和蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组都是在蛛网膜下腔出血造模后6小时；*P≤0.05，与假手术组相比，数据以平均值±SD表示；N.S.，无显著差异；SIRT3，sirtuins 3；TRAP1，肿瘤坏死因子受体相关蛋白1；Ac-TRAP1，乙酰化肿瘤坏死因子受体相关蛋白1；HC，重链；SD，标准差。
图5为盐酸小檗碱对蛛网膜下腔出血引起的神经行为结果的影响；
其中，(a)大鼠神经行为测试流程图；(b)盐酸小檗碱干预对大鼠蛛网膜下腔出血后改良加西亚评分的影响；(c)盐酸小檗碱干预对大鼠蛛网膜下腔出血后7天、14天和20天的转轮实验的影响，基线在造模前3天确定；(d)盐酸小檗碱干预后，位置导航实验和空间探针实验的位置图；(e)大鼠在蛛网膜下腔出血后21～25天的莫里斯水迷宫测试中的游泳速度；(f)盐酸小檗碱干预对蛛网膜下腔出血后21～25天位置导航实验的潜伏期的影响；(g)盐酸小檗碱干预对蛛网膜下腔出血后21～25天位置导航实验中游泳距离的影响；(h)盐酸小檗碱干预对蛛网膜下腔出血后26天大鼠空间探针实验停留目标象限时间的影响；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，与假手术组相比；N.S.，无显著差异。
图6为盐酸小檗碱通过降低活性氧水平来调节神经元的凋亡；
其中，(a)蛛网膜下腔出血或假手术后24小时，颞底皮层中TUNEL(绿色)、NeuN(红色)和DAPI(蓝色)的代表图像；标尺＝50μm；(b)颞底皮层中TUNEL阳性神经元与总神经元的比例(％)；(c)假手术组、假手术+盐酸小檗碱组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组中相对活性氧含量的变化；(d)在假手术组、假手术+盐酸小檗碱组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组中，盐酸小檗碱干预后大鼠颞底脑组织的相对琥珀酸脱氢酶活性(相对基线％)；数据以平均值±SD表示；a-c中n＝6；d中n＝10；蛛网膜下腔出血组和蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组都是在蛛网膜下腔出血造模后6小时；；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，与假手术组相比；N.S.，无显著性差异。
图7为机制图
三磷酸腺苷是神经元的重要功能物质，参与各种生理活动；其中，蛛网膜下腔出血后，SIRT3的蛋白水平降低，乙酰化TRAP1蛋白水增加；乙酰化TRAP1抑制了神经元细胞的糖酵解生产力，而且还抑制了琥珀酸脱氢酶的活性；因此，三磷酸腺苷含量减少，活性氧增加，导致神经元凋亡；盐酸小檗碱通过提高SIRT3的水平来抑制乙酰化TRAP1，从而促进神经元糖酵解并提高琥珀酸脱氢酶活性；SIRT3，sirtuins 3；TRAP1，肿瘤坏死因子受体相关蛋白1；A-TRAP1，乙酰化肿瘤坏死因子受体相关蛋白1；SDH，琥珀酸脱氢酶；HK，己糖激酶。
具体实施方式
蛛网膜下腔出血是一种常见的出血性脑血管疾病，具有高致死率以及致残率。线粒体中的肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)在有氧氧化和糖酵解的代谢模式转换中起作用。乙酰化是重要的翻译后修饰过程。然而，目前还不清楚TRAP1和乙酰化TRAP1如何调节蛛网膜下腔出血后的能量代谢。盐酸小檗碱是传统中药中的一种异喹啉生物碱，可调节sirtuins 3(SIRT3)的表达。在我们的实验中，我们进行了蛋白质印迹、代谢物测定、TUNEL染色和行为测试，探索蛛网膜下腔出血后的代谢模式转换以及盐酸小檗碱干预后TRAP1乙酰化的影响。
结果显示，蛛网膜下腔出血后三磷酸腺苷含量、葡萄糖和丙酮酸含量下降，但乳酸含量上升。盐酸小檗碱干预促进三磷酸腺苷含量和葡萄糖、丙酮酸和乳酸含量的增加。SIRT3的表达量增加，而乙酰化的TRAP1/TRAP1比率下降。琥珀酸脱氢酶和己糖激酶活性增加，而活性氧的产生和TUNEL阳性神经元减少。给予盐酸小檗碱可以改善大鼠短期和长期的神经行为结果。我们的研究表明，盐酸小檗碱可以调节琥珀酸脱氢酶的活性，促进有氧呼吸过程，减少电子泄漏引起的活性氧；盐酸小檗碱还可以增加己糖酶活性和乳酸，促进糖酵解中三磷酸腺苷的含量。我们的研究结果探讨了蛛网膜下腔出血后乙酰化TRAP1的变化和代谢模式的转换，验证了盐酸小檗碱对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的改善作用，这表明盐酸小檗碱是一种潜在的临床应用药物。
1.材料和方法
1.1伦理和实验动物
7周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重约250～300g。动物被饲养在温度为25±1℃、湿度为50～60％的标准动物房中，并可自由获得食物和水。动物定期保持12小时的光照和12小时的黑暗。所有SD大鼠均购自苏州大学医学院实验动物中心(江苏苏州)。
1.2蛛网膜下腔出血模型的建立
采用血管内穿刺法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型，方法如下(参考Xie,Z.,etal.,Exendin-4attenuates neuronal death via GLP-1R/PI3K/Akt pathway in earlybrain injury after subarachnoid hemorrhage in rats.Neuropharmacology,2018.128:p.142-151)：
首先，用10％水合氯醛麻醉大鼠，并将其置于合适的位置。接下来，结扎并切断左颈外动脉，将锋利的4-0尼龙线栓插入右颈内动脉，向前推进，直到感觉到阻力。再次推进2～3mm后，感觉有落空感，撤出线栓，缝合切口。假手术组的大鼠用同样的方法完成操作，但没有刺破血管。手术后动物被分开并密切观察1小时，然后放回笼子饲养。图1a显示了蛛网膜下腔出血建模后的代表性图像。为了排除个体差异引起的偏差，我们对大鼠进行了蛛网膜下腔出血评分。安乐死后立即对大鼠大脑的基底部分进行拍照，由两名独立的研究人员进行评估。总分(18分)是根据确定的六个不同区域的分数相加计算出来的。每个区域被划分为0～3分。得分≤7分的大鼠被排除在实验之外(参考Sugawara,T.,et al.,A newgrading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoidhemorrhage rat model.J Neurosci Methods,2008.167(2):p.327-34)。
1.3实验设计
1.3.1实验一：将128只大鼠随机分为8组(n＝16/组)。假手术组、蛛网膜下腔出血组(造模后1、3、6、12、24、48、72小时)。通过蛋白质印迹检测SIRT3、TRAP1和乙酰化TRAP1的颞底脑组织表达(n＝6/组)。通过比色法检测大脑组织代谢物(葡萄糖含量、三磷酸腺苷含量、乳酸含量和丙酮酸含量)(n＝10/组)(图1b)。
1.3.2实验二：将104只大鼠随机分为四组(n＝26/组)：假手术组、假手术+盐酸小檗碱(50mg/kg)组、蛛网膜下腔出血组、蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱(50mg/kg)组。用比色法检测组织代谢物(葡萄糖含量、三磷酸腺苷含量、乳酸含量、丙酮酸含量、己糖激酶活性和琥珀酸脱氢酶活性)的时间(n＝10/组)。通过蛋白质印迹检测SIRT3、TRAP1和乙酰化TRAP1的时间表达。TUNEL染色用于检测神经元凋亡(n＝6/组)。改良加西亚评分被用于短期行为评估。转轮实验、位置导航实验和空间探针实验用于长期行为评估(n＝10/组)(图1d)。
1.4.给药
50mg/kg的盐酸小檗碱与0.2％的羧甲基纤维素进行处理后灌胃。假手术组+盐酸小檗碱组和蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组都是在蛛网膜下腔出血手术后立即给予盐酸小檗碱，剂量为50mg/kg动物体重。本实验中使用的盐酸小檗碱来自于上海源叶生物科技有限公司(CAS:633-65-8)(图1c)。
1.5.聚丙烯酰胺凝胶电泳和转印
将颞底脑组织样本均质化，然后在细胞裂解缓冲液RIPA中裂解30分钟，然后在4℃下以12,000g离心10分钟，收集上清液。使用BCA检测试剂盒(碧云天，上海，中国)来测定蛋白质含量。在准备好的10％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上，装载蛋白质样品(30μg/lane)和分子量标记物(4μl/孔道；Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,美国)，然后分离并转移到PVDF膜(Millipore Corporation,Billerica,美国)电泳。该膜在室温下用5％的脱脂牛奶孵育1小时，然后在4℃下与目标抗体(SIRT3,2627S,1:1000,CST；TRAP1,10325-1-AP,Proteintech)孵育过夜。接着，将辣根过氧化物酶(HRP)连接的二抗(SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,美国)与膜在室温下孵育1小时，并用PBST(PBS+0.1％Tween 20)洗涤三次。最后，用增强化学发光(ECL)检测试剂(Clinx科学仪器公司)检测膜的灰度值。使用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MA，美国)来分析蛋白条带的灰度变化。
1.6.免疫沉淀
为了进行免疫沉淀获得乙酰化TRAP1，将脑组织用裂解液充分均质化，并进行离心处理，以准备免疫沉淀的蛋白样品。将磁珠洗净并用结合缓冲液(50mm Tris，150mM NaCl，0.1％～0.5％洗涤剂，pH 7.5)预处理后，每组样品与50μl磁珠(B23201，bimake)混合成含量为1ug/μL的液体200μL。然后，在IP阴性对照组中加入2μL正常兔IgG(#2729，CST)，在实验组中加入2μL乙酰化赖氨酸抗体(#9441，CST)，在4℃下孵育过夜。磁性分离抗原吸附后的磁珠-抗体-抗原复合物。用IP洗涤缓冲液洗涤复合物三次后，弃去上清液，加入20μL1×SDS-PAGE加载缓冲液。最后，通过蛋白质印迹分析目标蛋白(参考Kim,T.,A.K.Chokkalla,andR.Vemuganti,Deletion of ubiquitin ligase Nedd4l exacerbates ischemic braindamage.J Cereb Blood Flow Metab,2021.41(5):p.1058-1066)。
1.7.代谢物测定
在代谢物测定中，我们使用不同的试剂盒(南京建诚有限公司，南京，中国)来测定葡萄糖(F006-1-1)、乳酸(A019-2-1)、丙酮酸(A081-1-1)和三磷酸腺苷(A095-1-1)的含量。颞部脑组织按照1:10的比例用提取液匀浆。测定三磷酸腺苷含量时，加入等比例的沸水进行均质化。匀浆后的液体在4℃下用8000g离心10分钟，然后取上清液，放在冰上进行测定。根据说明书，在样品中加入不同的试剂。然后，进行标准曲线的含量测定。我们使用分光光度计来测量样品在适当波长下的吸光度。通过标准曲线确定每个样品的含量。
1.8.己糖激酶和琥珀酸脱氢酶活性
我们使用不同的试剂盒(建诚公司，南京，中国)来测定己糖激酶(A077-3)和琥珀酸脱氢酶(A022-1-1)活性。颞部脑组织与提取液按1：10的比例均质。研磨液在4℃下用8000g离心10分钟，然后取上清液进行测定。测量己糖酶活性时，记录20秒时的初始吸光度A1和5分钟后的吸光度A2，波长为340nm。当测量琥珀酸脱氢酶的活性时，记录5秒的初始吸光度A1和1分钟后在600nm波长下的吸光度A2。根据试剂盒提供的公式计算活性。
1.9.改良加西亚评分
改良加西亚评分用于评估蛛网膜下腔出血后大鼠的神经功能缺失。评估内容为自发运动、四肢对称运动、前爪伸展0～3分，爬行、身体本体感觉、触觉反应1～3分。两个独立的研究人员记录实验大鼠的得分(参考Guo,D.,et al.,MRI Characterization in theAcute Phase of Experimental Subarachnoid Hemorrhage.Transl Stroke Res,2017.8(3):p.234-243)。
1.10.转轮实验
采用转轮实验来评估大鼠的运动功能(参考Chung,D.Y.,et al.,Subarachnoidhemorrhage leads to early and persistent functional connectivity andbehavioral changes in mice.J Cereb Blood Flow Metab,2021.41(5):p.975-985、以及Luo,Y.,et al.,Inhibition of EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)AttenuatesNeuroinflammation via H3k27me3/SOCS3/TRAF6/NF-κB(Trimethylation of Histone3Lysine 27/Suppressor of Cytokine Signaling 3/Tumor Necrosis Factor ReceptorFamily 6/Nuclear Factor-κB)in a Rat Model of Subarachnoid Hemorrhage.Stroke,2020.51(11):p.3320-3331)。转动轴的直径为10厘米。当大鼠失去平衡并从转轮上摔下来时记录时间。手术前，每只大鼠每天接受三次训练，连续三天，最后三次记录作为基线。然后，所有大鼠在蛛网膜下腔出血手术后的所有测试日都接受了一次转轮实验。
1.11.莫里斯水迷宫
我们使用改良版的莫里斯水迷宫来评估空间学习和记忆能力(参考Morris,R.,Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in therat.J Neurosci Methods,1984.11(1):p.47-60，以及Jeon,H.,et al.,Learningdeficits after experimental subarachnoid hemorrhage in rats.Neuroscience,2010.169(4):p.1805-14)。莫里斯水迷宫是一个圆形水池，水温为20～25℃。通过池壁上的四个等距点将水池分成四个象限，并在第四象限的中心放置一个直径为10厘米的圆形逃生平台。平台设置在水位以下2厘米处，以便老鼠不能直接看到它。一台数码相机位于水池中心上方，以记录大鼠的运动情况。莫里斯水迷宫试验包括位置导航实验和空间探针实验。场所导航测试持续了五天。大鼠从第二象限被放入迷宫，而平台则被放在第四象限。记录从入水到爬上平台的时间，确定该时间为逃脱潜伏期。在训练过程中，如果大鼠在60秒内找到平台，就让它在平台上站10秒；如果大鼠没有找到，就用棍子引导它到平台上，让大鼠站10秒加强记忆。一个实验结束后，把大鼠从平台上拿下来，休息60秒后再进行下一个实验。经过5天的位置导航实验后，平台被移除，进行空间探针测试。将大鼠从第二象限放入迷宫，并记录60s内在第四象限的时间。
1.12.TUNEL染色
用TUNEL试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit,Roche,德国)对石蜡包埋的脑组织进行TUNEL染色以检测细胞凋亡(Shen,H.,et al.,Role of Neurexin-1beta andNeuroligin-1in Cognitive Dysfunction After Subarachnoid Hemorrhage inRats.Stroke,2015.46(9):p.2607-15)。脑组织切片在70℃下加热去石蜡2～4小时，在二甲苯和分级含量系列的乙醇中复水。用磷酸盐缓冲液洗涤三次后，将切片与TUNEL反应混合物在37℃下孵育一小时。用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后用含有DAPI的防淬灭封片剂覆盖。最后，我们用荧光显微镜(日本尼康)制作的荧光显微镜观察每个样品的TUNEL阳性神经元，并用Image J软件(美国国立卫生研究院)分析图像数据。
1.13.活性氧检测
我们使用活性氧试剂盒(碧云天S0033S，上海，中国)并参考制造商的方案来检测大鼠脑组织中的活性氧水平。首先，用磷酸盐缓冲液将颞部脑组织样品均质化。然后，在4℃下以12000rpm离心10分钟，用BCA试剂盒测定上清液的蛋白质含量。将活性氧检测试剂DCFH-DA(10μl，1mol/L)和上清液(190μl)加入到96孔板中，等量的磷酸盐缓冲液和上清液作为对照。在4℃孵育30分钟后，用480nm激发和520nm发射的荧光分光光度法进行检测。如前所述活性氧的水平以荧光强度/克蛋白质表示(参考Li,J.,et al.,MinocyclineProtects Against NLRP3 Inflammasome-Induced Inflammation and P53-AssociatedApoptosis in Early Brain Injury After Subarachnoid Hemorrhage.Mol Neurobiol,2016.53(4):p.2668-78，以及Teng,L.,et al.,Carnosic Acid Mitigates Early BrainInjury After Subarachnoid Hemorrhage:Possible Involvement of the SIRT1/p66shcSignaling Pathway.Front Neurosci,2019.13:p.26)。
1.14.统计分析
所有数据均以平均值±标准差(SD)表示。所有的统计分析都使用Graph PadPRISM 8.0统计软件进行。单因素方差分析(ANOVA)用于比较多组，非配对t检验用于比较两组之间的差异。行为测试采用双因素方差分析。每个处理都进行了独立的实验。P值小于0.05被认为有统计学差异。P值小于0.01被认为有显著统计学意义。
2.结果
2.1整体观察
各实验性蛛网膜下腔出血组大鼠的体温和体重均无明显变化。假手术组大鼠的死亡率为0％(0/42)，各实验组大鼠的死亡率为17.81％(23/247)。此外，如果大鼠在之前的评估中低于8分，则被排除。
2.2蛛网膜下腔出血诱导后三磷酸腺苷含量和糖酵解代谢物的减少
我们检测了蛛网膜下腔出血诱导后的代谢物变化。蛛网膜下腔出血发生后，脑组织中三磷酸腺苷含量下降，达到12小时点后缓慢上升(图2a)。与假手术组相比，结果显示，颞底脑组织中的葡萄糖含量下降(图2b)。乳酸含量在蛛网膜下腔出血后1～6小时内增加，在6小时内达到峰值后下降(图2c)。脑组织中的丙酮酸含量在蛛网膜下腔出血后下降，在6小时后缓慢上升(图2d)。这些结果表明，在进一步的实验中，蛛网膜下腔出血后6小时可能是干预后代谢物测定的最合适时间。
2.3蛛网膜下腔出血后乙酰化TRAP1的表达增加而SIRT3减少
我们进行蛋白质印迹检测蛛网膜下腔出血后脑组织中SIRT3(图2e)、TRAP1和乙酰化TRAP1(图2f)的表达变化。我们用重链带作为乙酰化TRAP1的对照，β-actin作为SIRT3和TRAP1的对照。我们还进行了乙酰化-TRAP1与TRAP1的比率计算。SIRT3的表达逐渐减少，在蛛网膜下腔出血后24小时达到最低点(图2g)。乙酰化TRAP1表达增加，但TRAP1表达蛋白没有明显变化(图2h)。蛛网膜下腔出血诱导后，乙酰化TRAP1与TRAP1的比率增加(图2i)。
2.4盐酸小檗碱提高三磷酸腺苷含量和糖酵解代谢物
为探讨盐酸小檗碱对蛛网膜下腔出血后代谢物的影响，我们进行了盐酸小檗碱给药，并检测代谢物和酶活性。我们的研究表明，糖酵解功能在蛛网膜下腔出血后6小时发生明显变化。蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组的三磷酸腺苷含量(图3a)、葡萄糖(图3b)、乳酸(图3c)和丙酮酸(图3d)的含量均高于蛛网膜下腔出血组。此外，蛛网膜下腔出血+盐酸小檗碱组的己糖激酶活性也高于蛛网膜下腔出血组(图3e)。根据我们的研究结果，蛛网膜下腔出血后给予盐酸小檗碱可以在一定程度上促进糖酵解功能。
2.5盐酸小檗碱提升SIRT3的表达并抑制TRAP1的乙酰化
我们在蛛网膜下腔出血后的脑组织中进行蛋白质印迹，检测盐酸小檗碱给药后SIRT3(图4a)、TRAP1和乙酰化TRAP1(图4b)的表达变化。我们用重链带作为乙酰化TRAP1的内部对照，用β-actin作为SIRT3和TRAP1的内部对照。与蛛网膜下腔出血组相比，盐酸小檗碱给药增加了SIRT3在颞底脑组织的表达水平(图4c)。蛋白质印迹的结果也显示，与蛛网膜下腔出血组相比，盐酸小檗碱干预后乙酰化-TRAP1表达下降，但TRAP1表达蛋白没有明显变化(图4d)。盐酸小檗碱干预后，乙酰化-TRAP1与TRAP1的比例下降(图4e)。
2.6盐酸小檗碱改善蛛网膜下腔出血诱发的短期和长期神经功能缺失
通过三个行为测试，我们探讨了盐酸小檗碱给药对短期和长期神经行为的影响(图5a)。与假手术组相比，蛛网膜下腔出血组的所有大鼠在蛛网膜下腔出血后一周内表现出较低的改良加西亚评分(图5b)，表明蛛网膜下腔出血诱导短期感觉和运动功能缺失。此外，这种短期感觉和运动缺失在盐酸小檗碱给药后有效恢复。
在蛛网膜下腔出血诱导后的第7、14和20天进行转轮试验(图5c)，以确定盐酸小檗碱给药是否影响长期感觉-运动功能。与假手术组相比，蛛网膜下腔出血组的大鼠从转轮上摔下来时间较短，表明蛛网膜下腔出血诱导的感觉和运动缺失。此外，与蛛网膜下腔出血组相比，盐酸小檗碱给药组的这种缺失得到了恢复。
在蛛网膜下腔出血诱导后21～26天进行莫里斯水迷宫测试，以评估长期空间认知功能。在蛛网膜下腔出血后的第26天，四组之间的游泳速度没有明显差异，表明记忆测试不受游泳能力的明显差异影响(图5e)。所有大鼠的逃逸潜伏期呈下降趋势，蛛网膜下腔出血大鼠找到隐藏平台的时间总是比假手术组的时间长(图5d、5f和5g)。此外，在探针实验中盐酸小檗碱的给药可以明显改善蛛网膜下腔出血引起的空间认知障碍，表现为停留在目标象限的时间明显增加，代表空间学习和记忆的改善(图5h)。
2.7盐酸小檗碱通过促进琥珀酸脱氢酶活性缓解活性氧含量和神经元凋亡
我们用TUNEL染色法分析了盐酸小檗碱给药对神经元凋亡的影响。TUNEL染色的结果显示，与假手术组相比，蛛网膜下腔出血后颞底皮层细胞的凋亡明显增加。通过与神经元标志物NeuN共染，我们发现这些细胞是神经元。与蛛网膜下腔出血组相比，盐酸小檗碱给药组的神经元凋亡明显减少(图6a和6b)。此外，蛛网膜下腔出血后给予盐酸小檗碱可以改善琥珀酸脱氢酶的活性(图6c)，从而降低细胞活性氧的水平，发挥保护作用(图6d)。
在本研究中，我们通过蛋白质印迹、代谢物测定、TUNEL染色和行为测试来探讨有氧和糖酵解的变化以及降低神经元糖酵解水平的可能途径。我们证明，盐酸小檗碱可能通过SIRT3/乙酰化-TRAP1途径调节蛛网膜下腔出血后的糖酵解功能。盐酸小檗碱可以调节琥珀酸脱氢酶活性，促进有氧呼吸过程，减少电子泄漏引起的活性氧；盐酸小檗碱还可以增加己糖激酶活性和乳酸，促进三磷酸腺苷含量的糖酵解(图7)。盐酸小檗碱可以改善蛛网膜下腔出血诱导后大鼠的短期和长期神经行为结果。
盐酸小檗碱是一种从传统中药黄连中分离出来的异喹啉生物碱，它也存在于四科十属等许多植物中。研究表明，盐酸小檗碱具有抗炎和抗氧化作用，被广泛用于治疗各种神经系统疾病，包括脑缺血损伤、阿尔茨海默氏病和帕金森病。通过激活PI3K/AKT途径，盐酸小檗碱给药对缺血性卒中起到了神经保护作用。盐酸小檗碱还可以抑制帕金森病中海马神经元的凋亡和多巴胺能神经元的损伤。
大脑葡萄糖代谢受损会导致跨膜运输囊泡恢复和突触信号的失调。神经元葡萄糖摄取减少，有氧糖酵解和三羧酸循环受损，轴突运输功能障碍，以及胶质细胞对神经元的能量供应损失，都会导致葡萄糖代谢不足。在生理条件下，有氧呼吸和糖酵解都参与神经元三磷酸腺苷的含量。在我们的研究中，盐酸小檗碱可以促进三磷酸腺苷的含量。所以我们进一步确定有氧氧化和糖酵解过程中发生的代谢物变化。
葡萄糖是细胞生理活动的一个重要底物。葡萄糖的摄入和分解会影响脑组织中的葡萄糖含量。结果显示，在蛛网膜下腔出血干预后，葡萄糖含量下降，我们推测在这个过程中可能出现葡萄糖摄取和葡萄糖利用的减少。给予盐酸小檗碱后增加了葡萄糖含量，其机制需要进一步说明。葡萄糖不能直接生物利用，需要通过糖酵解限速酶己糖激酶转化为活性形式。我们的结果显示，当蛛网膜下腔出血发生时，己糖激酶的活性下降。盐酸小檗碱干预促进己糖激酶活性的恢复，这将促进代谢物丙酮酸的产生。
丙酮酸是一种三碳酮酸。它是糖酵解途径的最终产物。丙酮酸在有氧条件下可以转移到线粒体，在氧化脱羧后形成乙酰辅酶A。相关产物将进入线粒体内膜的电子呼吸链，进一步氧化形成水和二氧化碳。这个过程可以产生大量的三磷酸腺苷用于生命活动。在缺氧情况下，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下转变为乳酸。在异常的生理条件下，乳酸也可以进行不完全氧化，形成少量的三磷酸腺苷。我们的结果显示，在这个过程中，乳酸增加，盐酸小檗碱干预后乳酸含量增加。一方面，乳酸的增加是因为神经元在缺血和缺氧的情况下不能被完全氧化。另一方面，增加的乳酸也可以作为一种重要的能量底物参与神经元的代谢。乳酸对神经系统来说是一把双刃剑。适量的乳酸会促进糖酵解过程，并在极端条件下保证身体的三磷酸腺苷供应。然而，最近的研究也表明，过量的乳酸将引起神经毒性。已有的研究发现，周围胶质细胞的线粒体代谢紊乱诱发神经元氧化应激，导致周围轴突变性，揭示了胶质细胞提供的过量乳酸会损害周围轴突的完整性。在蛛网膜下腔出血后，脑组织倾向于将丙酮酸转化为乳酸以完成三磷酸腺苷供应。盐酸小檗碱给药将改善神经元糖酵解过程，促进能量产生。
为了进一步探讨氧化呼吸链的影响，我们关注了呼吸链中复合物II的重要亚单位，琥珀酸脱氢酶。氧化磷酸化是一个重要的能量供应环节，相关研究表明，复合物II在氧化呼吸链的电子泄漏中至关重要。琥珀酸脱氢酶是电子呼吸链的重要成员，而TRAP1可以抑制其活性。我们的实验表明，TRAP1的表达在蛛网膜下腔出血的早期阶段没有变化。因此，我们注意到了该蛋白的翻译后修饰。对胶质瘤的研究表明，SIRT3可以使TRAP1去乙酰化，而且乙酰化过程是可逆的。在我们的实验中，SIRT3在蛛网膜下腔出血后的早期阶段下降，而TRAP1的乙酰化形式增加。在盐酸小檗碱给药后，SIRT3水平的增加导致乙酰化TRAP1的水平进一步下降，而与此同时，琥珀酸脱氢酶活性增加。我们推测乙酰化TRAP1对琥珀酸脱氢酶有抑制作用，而琥珀酸脱氢酶的抑制将导致电子在氧化呼吸链中积累，进一步促进电子泄漏。盐酸小檗碱可以促进SIRT3的上调，减少乙酰化的TRAP1，降低琥珀酸脱氢酶的抑制作用，促进电子呼吸链的进程，从而降低活性氧的水平。
在本实验中，我们注意到了代谢调节关键蛋白TRAP1及其翻译后修饰的变化。阐明了蛛网膜下腔出血后早期的有氧氧化和糖酵解的变化，发现糖酵解在蛛网膜下腔出血后早期起到了至关重要的作用。盐酸小檗碱可以增加SIRT3的表达，促进TRAP1的去乙酰化。一方面，通过调节氧化呼吸链中琥珀酸脱氢酶的活性，盐酸小檗碱可以减少电子泄漏和活性氧的产生；另一方面，盐酸小檗碱可以促进己糖激酶的活性，增加乳酸含量，为缺血缺氧条件下的神经元提供能量，减少神经元凋亡。通过评估三磷酸腺苷和活性氧的生成，我们的研究探索了盐酸小檗碱作为蛛网膜下腔出血后早期脑损伤保护药物的可能性。
在我们的研究中，TRAP1乙酰化位点的突变将进一步验证乙酰化调节氧化呼吸过程。氧气消耗率和细胞外酸化率的评估将帮助我们确定代谢调节，葡萄糖同位素标记方法将阐明代谢过程。胶质-神经元网络中的代谢物传输也需要进一步考虑。
我们的研究表明，盐酸小檗碱可以调节琥珀酸脱氢酶活性，促进有氧呼吸过程，减少电子泄漏引起的活性氧；盐酸小檗碱还可以增加己糖激酶活性和乳酸，促进三磷酸腺苷含量糖酵解。我们的研究结果探讨了蛛网膜下腔出血后乙酰化TRAP1的变化和代谢模式的转换，验证了盐酸小檗碱对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的保护作用，这表明盐酸小檗碱是一种潜在的临床应用药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.盐酸小檗碱在改善蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的应用。
2.盐酸小檗碱在调节蛛网膜下腔出血后TRAP1乙酰化中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征是，所述盐酸小檗碱增加线粒体去乙酰化酶SIRT3的表达并促进TRAP1蛋白的去乙酰化。
4.权利要求3所述的应用，其特征是，所述盐酸小檗碱用于调节蛛网膜下腔出血后的糖酵解功能。
5.权利要求4所述的应用，其特征是，所述盐酸小檗碱用于调节琥珀酸脱氢酶活性，促进有氧呼吸过程，减少电子泄漏引起的活性氧含量。
6.权利要求4所述的应用，其特征是，所述盐酸小檗碱用于增加己糖激酶活性，增加乳酸含量，促进三磷酸腺苷含量的糖酵解。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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XIANG-HUA ZHANG 等: "Berberine Ameliorates Subarachnoid Hemorrhage Injury via Induction of Sirtuin 1 and Inhibiting HMGB1/Nf-kB Pathway" *
席刚明等: "小檗碱对脑梗死患者血浆ICAM-1和E-Selectin的影响" *

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