CN114181831B - 一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器，属于生物医学工程技术领域。本发明根据软骨层、软骨下骨层的不同结构特点，采用双通道供给循环系统分离式灌注相应的培养液来提供所需的剪切力环境。同时，针对软骨表层的细胞与胶原纤维平行结构设计弧形活塞，提供弧形可旋转的加载方式，可同时添加静压力和剪切力。本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器可根据骨软骨不同层的结构，提供不同的力学刺激(包括间歇性/持续性的剪切应力、静压力)，可最大程度模仿人体力学环境，有效地促进骨软骨支架初始功能化组织的形成，为骨软骨支架的测试提供良好的环境。

Description

一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其涉及一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器。
背景技术
骨关节炎是一种以关节软骨退行性病变、滑膜炎症和周围骨质变化为病理性特征的慢性进行性的骨关节病，是外科常见的疾病之一，临床表现为顽固性疼痛、运动障碍等，严重者甚至会完全丧失关节运动能力。在超过50岁的人群中，骨关节炎在导致长期残疾的疾病中仅次于心血管疾病，严重威胁着中老年人的健康和日常生活能力。而关节软骨的自我修复能力极差，无法通过组织的再生来达到修复的目的。目前，运用组织工程技术在体外构建功能化的骨软骨支架是解决此难题的有效方法。
一方面，人体的关节软骨是由不同的细胞和大量细胞外基质组成的无血管、无神经的非均质结构组织，按照其结构形态从上至下可分为表面层软骨、中间层软骨、深层软骨和钙化层四层。骨关节炎的病变位置除了上述的四层，还包括作为判断骨关节炎发展标志之一的软骨下骨。由此可见，人体的关节区域是一个由软骨、骨等多种组织细胞组成的多层结构。目前，用于修复人体关节软骨的支架按照结构大致可分为单相、双相及多相骨软骨支架。多相骨软骨支架可根据关节软骨不同层的组织结构特点来定制化的设计支架结构，是所有支架中修复效果最好的一种，也是目前骨关节炎修复的主要方法，是国内外学者的研究热点。
另一方面，关节软骨是动关节的承重部分，它主要功能是以极小摩擦和磨损来将表面的载荷传递到软骨的下骨部分，具有支撑、保护关节的作用。因此，作为称重结构的关节软骨对力学的刺激是十分敏感的。关节软骨的每一层胶原纤维结构都离不开外界负荷的作用，间歇性较高的剪切负载可诱导软骨的胶原取向，同时影响其蛋白多糖的含量。除了细胞基质，力学因素还能直接影响骨软骨相关的细胞，例如剪切应力可影响骨髓间充质干细胞的骨架结构，以及其相关基因的表达，影响干细胞的分化方向。所以，适当的力学刺激对于关节软骨的发育、成熟、维持及细胞增殖、分化、基质合成等都具有重要意义。
综上可知，目前修复骨关节炎效果最好的是多相骨软骨支架，并且给予适当力学刺激可更好的诱导支架各组分的生长。但目前的骨软骨生物反应器多是针对单相支架，缺少针对多相骨软骨支架的反应器。常用的生物反应器例如直接灌流式、旋转壁式生物反应器等虽然能够一定程度模拟人体骨软骨支架受到力学刺激的环境，但重点都是模拟受到的剪切力环境，而对骨软骨的生长发育同样重要的静态压力、压缩力等不同形式的载荷往往被忽略。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器，可同时模拟关节受到的剪切力和压力环境。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器，包括动态生物培养装置、多相骨软骨复合支架、双通道供给循环系统和力学加载系统；所述动态生物培养装置设置有分隔的双层结构；所述多相骨软骨复合支架固定于动态生物培养装置中；
所述动态生物培养装置设置有软骨培养基入口、软骨培养基出口、软骨下骨培养基入口和软骨下骨培养基出口；所述软骨培养基入口和软骨培养基出口设置于所述双层结构的上层；所述软骨培养基入口和软骨培养基出口设置于所述双层结构的下层；
所述双通道供给循环系统包括双通道蠕动泵、第一可控单向阀、第二可控单向阀、软骨培养基和软骨下骨培养基；所述软骨培养基入口、双通道蠕动泵、软骨培养基、第一可控单向阀和软骨培养基出口顺次相连，形成第一通道；所述软骨下骨培养基入口、双通道蠕动泵、软骨下骨培养基、第二可控单向阀和软骨下骨培养基出口顺次相连，形成第二通道；
所述力学加载系统包括设置于所述动态生物培养装置上端的弧形活塞。
优选的，所述多相骨软骨复合支架包括多相支架或含细胞多相骨软骨复合支架；所述多相支架的制备原料包括生物材料；所述含细胞多相骨软骨复合支架的制备原料包括细胞和生物材料，所述细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人脐静脉内表皮细胞、骨细胞、成骨细胞或软骨细胞；所述生物材料包括I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸、糖蛋白、丝素蛋白、海藻酸盐、羟基磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙、硫酸钙、PLGA、PCL和PLA中的一种或几种。
优选的，还包括第一管路过滤器和第二管路过滤器；所述第一管路过滤器设置于所述第一可控单向阀和软骨培养基之间的双通无菌管道上；所述第二管路过滤器设置于所述第二可控单向阀和软骨下骨培养基之间的双通无菌管道上。
优选的，还包括二氧化碳供给系统；所述二氧化碳供给系统分别与所述软骨培养基和软骨下骨培养基相连。
优选的，所述二氧化碳供给系统的出口处设置有空气滤清器。
优选的，还包括集成控制系统；所述集成控制系统分别与所述弧形活塞、双通道蠕动泵和二氧化碳供给系统相连。
优选的，所述集成控制系统还包括分别设置于所述软骨培养基和软骨下骨培养基中的液体压力传感器以及分别设置于所述软骨下骨培养基和软骨培养基中的单悬臂梁式流体剪切应力传感器。
优选的，所述弧形活塞的驱动方式包括机械驱动、流体驱动或电磁控制驱动。
优选的，所述软骨培养基包括以下含量的成分：占所述软骨培养基的体积分数为10～15％的胎牛血清、100～120nmol/L地塞米松、35～37.5ug/ml维生素C、1～2mmol/L丙酮酸钠、100～120mg/L青霉素、100～120mg/L链霉素和第一活性分子。
优选的，所述软骨下骨培养基包括以下含量的成分：占所述软骨下骨培养基的体积分数为10～15％的胎牛血清、100～120nmol/L地塞米松、10～15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.2～0.3mmol/L抗坏血酸、100～120mg/L青霉素、100～120mg/L链霉素和第二活性分子。
本发明提供了一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器，本发明根据不同多相骨软骨支架中软骨层、软骨下骨层的不同结构特点，设置动态生物培养装置为双层结构，隔离软骨层和软骨下骨层，能够实现采用不同培养基分离式灌注软骨层和软骨下骨层的培养液，提供所需的剪切力环境，促进细胞的生长和部分基因的表达，促进功能化骨软骨组织的形成；同时，针对软骨表层的细胞与胶原纤维平行结构设计弧形活塞，提供弧形可旋转的加载方式，也可提供静压力和剪切力。本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器可根据骨软骨支架不同层的结构，提供不同的力学刺激(包括间歇性/持续性的剪切应力、静压力)，可最大程度模仿人体力学环境，有效地促进骨软骨支架初始功能化组织的形成，为骨软骨支架的测试提供良好的环境。
本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器能够同时提供流体剪切应力和压力等多种力学组合加载方式，能更好的模拟人体实际力学环境，并使多相骨软骨支架处在液体和低氧的近关节生理环境中，能够有效的促进培养物的功能初始化。
本发明根据软骨和骨组织的不同特点，可通过调整软骨培养基和软骨下骨培养基的培养液成分诱导组织生产并采用分层灌注方式提供不同大小的剪切应力，有利于软骨相和骨相的形成。同时，采用弧形活塞的结构对软骨相表层进行压力和剪切应力的加载，能够更好的仿生人体关节表层的弧形结构。
本发明提供的多功能动态生物反应器可根据多相骨软骨支架的材料、细胞等特点来定制式提供不同的力学载荷加载方案，提供包括流体剪切应力和压力等多种力学组合加载方式，能够兼容各种多相骨软骨支架，更好的模拟人体实际力学环境，并使多相骨软骨支架处在液体和低氧的近关节生理环境中，能够有效的促进多相骨软骨支架的功能初始化。
附图说明
图1为本发明的多功能动态生物反应器的示意图；
图2为本发明的多功能动态生物反应器中动态生物培养装置的示意图。
具体实施方式
如图1和图2所示，本发明提供了一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器，包括动态生物培养装置、多相骨软骨复合支架、双通道供给循环系统和力学加载系统；所述动态生物培养装置设置有分隔的双层结构；所述多相骨软骨复合支架固定于动态生物培养装置中；
所述动态生物培养装置设置有软骨培养基入口、软骨培养基出口、软骨下骨培养基入口和软骨下骨培养基出口；所述软骨培养基入口和软骨培养基出口设置于所述双层结构的上层；所述软骨培养基入口和软骨培养基出口设置于所述双层结构的下层；
所述双通道供给循环系统包括双通道蠕动泵、第一可控单向阀、第二可控单向阀、软骨培养基和软骨下骨培养基；所述软骨培养基入口、双通道蠕动泵、软骨培养基、第一可控单向阀和软骨培养基出口顺次相连，形成第一通道；所述软骨下骨培养基入口、双通道蠕动泵、软骨下骨培养基、第二可控单向阀和软骨下骨培养基出口顺次相连，形成第二通道；
所述力学加载系统包括设置于所述动态生物培养装置上端的弧形活塞。
在本发明中，若无特殊说明，所需试剂或设备均为本领域技术人员熟知的市售试剂或设备。
本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器包括动态生物培养装置。在本发明中，所述动态生物培养装置优选经过生物无菌处理。本发明利用动态生物培养装置作为多相骨软骨支架的培养容器。在本发明中，所述动态生物培养装置设置有软骨培养基入口、软骨培养基出口、软骨下骨培养基入口和软骨下骨培养基出口；所述软骨培养基入口和软骨培养基出口设置于所述双层结构的上层；所述软骨培养基入口和软骨培养基出口设置于所述双层结构的下层。在本发明中，所述动态生物培养装置设置有分隔的双层结构；本发明优选采用活塞和O型圈将动态生物培养装置分隔为双层结构，以保证不同培养基的培养液独立灌注，防止液体对流。
本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器包括多相骨软骨复合支架；所述多相骨软骨复合支架固定于动态生物培养装置中。
在本发明中，所述多相骨软骨复合支架优选包括多相支架或含细胞多相骨软骨复合支架；所述多相支架的制备原料优选包括生物材料；所述含细胞多相骨软骨复合支架的制备原料优选包括细胞和生物材料，所述细胞优选包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人脐静脉内表皮细胞、骨细胞、成骨细胞或软骨细胞；所述生物材料优选包括I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸、糖蛋白、丝素蛋白、海藻酸盐、羟基磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙、硫酸钙、PLGA、PCL和PLA中的一种或几种；当所述生物材料为上述中的几种时，本发明不同种类生物材料的配比没有特殊的限定，根据实际需求进行调整即可。本发明对所述多相骨软骨复合支架的制备过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的致孔剂制孔、冷冻干燥、模具浇铸或增材制造方式制备即可。
在本发明中，所述多相骨软骨复合支架优选固定在中心直径为10mm、高度为25mm的孔洞中；所述孔洞设置于动态生物培养装置的正中心。
本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器包括双通道供给循环系统；所述双通道供给循环系统包括双通道蠕动泵、第一可控单向阀、第二可控单向阀、软骨培养基和软骨下骨培养基；所述软骨培养基入口、双通道蠕动泵、软骨培养基、第一可控单向阀和软骨培养基出口顺次相连，形成第一通道；所述软骨下骨培养基入口、双通道蠕动泵、软骨下骨培养基、第二可控单向阀和软骨下骨培养基出口顺次相连，形成第二通道。在本发明中，所述顺次连接优选为采用直径为5mm的双通无菌管道连接不同部件。
本发明利用双通道蠕动泵将软骨培养基和软骨下骨培养基中培养液吸收至动态生物培养装置中，能够提供稳定的层间剪切应力，以促进细胞的生长和分化；所述第一可控单向阀或第二可控单向阀保证液体不会回流，提高整体流动的稳定性。
在本发明中，所述软骨培养基所用溶剂优选为PBS缓冲液；本发明对所述PBS缓冲液没有特殊的限定，本领域熟知的市售培养基用缓冲液即可；所述软骨培养基优选包括以下含量的成分：占所述软骨培养基的体积分数为10～15％的胎牛血清、100～120nmol/L地塞米松、35～37.5μg/mL维生素C、1～2mmol/L丙酮酸钠、100～120mg/L青霉素、100～120mg/L链霉素和第一活性分子；所述第一活性分子优选根据多相骨软骨复合支架的特点选择；所述第一活性分子优选包括在软骨培养基中含量分别为10～15mg/L的TGF-β、1～2ng/mL的β-FGF、6～6.25pg/mL的牛胰岛素、6～6.25ug/mL的转铁蛋白和10～15mg/L的BMP-7中的一种或几种；所述软骨培养基中优选还包括软骨血管生成抑制剂CAIF。本发明对所述CAIF的用量没有特殊的限定，根据实际需求进行调整即可。
在本发明中，所述软骨下骨培养基所用溶剂优选为PBS缓冲液；本发明对所述PBS缓冲液没有特殊的限定，本领域熟知的市售培养基用缓冲液即可；，所述软骨下骨培养基优选包括以下含量的成分：占所述软骨下骨培养基的体积分数为10～15％的胎牛血清、100～120nmol/L地塞米松、10～15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.2～0.3mmol/L抗坏血酸、100～120mg/L青霉素、100～120mg/L链霉素和第二活性分子；所述第二活性分子优选根据多相骨软骨复合支架的特点选择；所述第二活性分子优选包括在软骨下骨培养基中含量为10～15mg/L的TGF-β和/或含量为10～15mg/L的BMP-2。
本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器包括力学加载系统；所述力学加载系统包括设置于所述动态生物培养装置上端的弧形活塞。在本发明中，所述弧形活塞优选配有弹簧。在本发明中，所述弧形活塞的驱动方式优选包括机械驱动、流体驱动或电磁控制驱动。本发明利用弧形活塞通过摆动提供剪切力，或者通过直接施压提供静水压力。
作为本发明的一个实施例，本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器还包括第一管路过滤器和第二管路过滤器；所述第一管路过滤器设置于所述第一可控单向阀和软骨培养基之间的双通无菌管道上；所述第二管路过滤器设置于所述第二可控单向阀和软骨下骨培养基之间的双通无菌管道上。本发明利用管路过滤器除去软骨培养基和软骨下骨培养基中培养液在循环过程中包含的杂质。
作为本发明的一个实施例，本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器还包括二氧化碳供给系统；所述二氧化碳供给系统分别与所述软骨培养基和软骨下骨培养基相连。在本发明中，所述二氧化碳供给系统采用空压机来保证软骨培养基和软骨下骨培养基中培养液的碳氧平衡，通过灌注二氧化碳保证整体培养环境的氧气含量(体积含量)为1～10％。
作为本发明的一个实施例，所述二氧化碳供给系统的出口处设置有空气滤清器；所述空气滤清器的滤芯优选为聚氨酯滤芯。本发明利用空气滤清器保证二氧化碳的清洁度。
作为本发明的一个实施例，本发明提供的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器还包括集成控制系统；所述集成控制系统分别与所述弧形活塞、双通道蠕动泵和二氧化碳供给系统相连。本发明利用集成控制系统控制双通道蠕动泵、第一可控单向阀、第二可控单向阀、二氧化碳供给系统中的空压机和弧形活塞的驱动装置。
作为本发明的一个实施例，所述集成控制系统还包括分别设置于所述软骨培养基和软骨下骨培养基中的液体压力传感器以及分别设置于所述软骨下骨培养基和软骨培养基中的单悬臂梁式流体剪切应力传感器。本发明利用集成控制系统根据传感器的数值来调控双通道蠕动泵的流量流速，调控弧形活塞的运动，改变外载荷的加载方式、二氧化碳的供给，从而实现不同的加载方式。
本发明通过调节动态生物培养装置上端弧形活塞的驱动装置对多相骨软骨支架进行旋转剪切力的加载，通过调节软骨培养基和软骨下骨培养基内的液体压力传感器对多相骨软骨支架进行静水压力的加载；通过双通道蠕动泵和软骨下骨培养基和软骨培养基中的剪切应力传感器对多相骨软骨支架进行剪切应力的加载。本发明对采用集成控制系统调节加载的具体过程没有特殊的限定，根据不同组成的多相骨软骨支架的特点进行调节，适应不同多相骨软骨支架即可。
本发明的用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器使用一次后，优选对双通管道进行清理，更换软骨培养基和软骨下骨培养基的培养液，整个装置进行清理和消毒。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，多相骨软骨复合支架优选固定在中心直径为10mm、高度为25mm的孔洞中；所述孔洞设置于动态生物培养装置的正中心；采用直径为5mm的双通无菌管道连接不同部件；
所有生物材料的原料含量，质量体积比(w/v)代表对应材料与溶剂的比例；质量质量比(w/w)代表对应材料占所有材料和溶剂总质量的比例。
实施例1
将生物材料通过模具浇铸制备多相骨软骨支架，生物材料包括壳聚糖10％(w/v)、丝素蛋白5％(w/v)和羟基磷灰石10％(w/w)；溶剂为PBS缓冲液；
软骨培养基(上层)的培养液成分为10％(v/v)胎牛血清、100nmol/L地塞米松、35μg/mL维生素C、1mmol/L丙酮酸钠、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素和15mg/LBMP-7；软骨下骨培养基(下层)的培养液成分为10％(v/v)胎牛血清、100nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.2mmol/L抗坏血酸、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素何15mg/LBMP-2；溶剂均为PBS缓冲液。
通过调节动态生物培养装置上端弧形活塞的驱动进行旋转剪切力的加载，调节软骨培养基和软骨下骨培养基内的液体压力传感器对多相骨软骨支架进行静水压力的加载；通过双通道蠕动泵和软骨下骨培养基和软骨培养基中剪切应力传感器对多相骨软骨支架进行剪切应力的加载，具体的加载方案为：
调节软骨培养基和软骨下骨培养基内的液体压力传感器，提供持续性12MPa静水压力，动态生物培养装置上层通过双通道蠕动泵提供层间剪切力，下层通过双通道蠕动泵提供层间剪切力，培养两周，每天八小时；保持上下层的剪切力不变，上端弧形活塞摆动提供7MPa旋转剪切压力，同时进行往返摆角为20°的摆动，摆动速度为1rad/s，继续培养两周，每天8小时；二氧化碳供给系统保证动态生物培养装置内含氧量为10％。
实施例2
利用生物3D打印制备含细胞多相骨软骨支架，溶剂为PBS缓冲液；软骨层(上层)材料为8％(w/v)壳聚糖+8％(w/v)胶原+5×106cells/g的骨髓间充质干细胞；软骨下骨层(下层)材料为甲基丙烯酰化明胶(10％w/v)、透明质酸(10％w/v)和骨髓间充质干细胞(5×106cells/g)；
软骨培养基的培养液(上层)成分为15％(v/v)的胎牛血清、120nmol/L地塞米松、37.5μg/mL维生素C、2mmol/L丙酮酸钠、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、15mg/LTGF-β、2ng/mLβ-FGF、6.25pg/ml牛胰岛素、6.25μg/mL转铁蛋白、15mg/LBMP-7，1ng/mL软骨血管生成抑制剂CAIF；软骨下骨培养基的培养液(下层)成分为15％(v/v)的胎牛血清、120nmol/L地塞米松、15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.3mmol/L抗坏血酸、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、15mg/LTGF-β和15mg/LBMP-2；溶剂均为PBS缓冲液。
按照实施例1所述方法进行应力加载，具体的加载方案为：
①第一阶段(周期7天)：提供0.098MPa的静水压力，采用加压15min、放压15min的周期加压方式，每天8小时；同时，上下层提供层间剪切力，每天8小时；该阶段主要促进骨髓间充质干细胞的增殖；
②第二阶段(周期14天)：提供0.2MPa的静水压力，采用加压1min，放压14min的周期加压方式，每天12小时；同时，上层提供层间剪切力，下层提供层间剪切力，每天12小时；7天后，改变静水压力，上端弧形活塞向下加压提供4MPa的静水压力，同时进行往返摆角为20°的摆动，摆动速度为0.5rad/s，每天8小时；二氧化碳供给系统保证培养容器内含氧量为7％。
实施例3
利用生物3D打印制备含细胞多相骨软骨支架，溶剂为PBS缓冲液；软骨层(上层)材料为：甲基丙烯酰化明胶(12％w/v)、羟基磷灰石(5％w/w)和骨细胞(5×106cells/g)；软骨下骨层(下层)材料为：海藻酸盐(6％w/v)、透明质酸(6％w/v)和成骨细胞(5×106cells/g)；
软骨培养基的培养液(上层)成分为12％(v/v)的胎牛血清、120nmol/L地塞米松、37.5μg/mL维生素C、2mmol/L丙酮酸钠、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、15mg/LTGF-β、2ng/mLβ-FGF、6.25pg/ml牛胰岛素、6.25μg/mL转铁蛋白、15mg/LBMP-7和1ng/mL软骨血管生成抑制剂CAIF；软骨下骨培养基的培养液(下层)成分为15％(v/v)的胎牛血清、120nmol/L地塞米松、15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.3mmol/L抗坏血酸、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素、15mg/LTGF-β和15mg/LBMP-2；溶剂均为PBS缓冲液。
按照实施例1的方法进行剪切应力的加载，具体的加载方案为：
提供频率为1Hz、大小为10kPa的周期性静水压力，每天4小时，共8天；同时，上层提供30×10-5N/cm2层间剪切应力，下层提供峰值为12×10-5N/cm2，周期为1小时的正弦波剪切应力，每天4小时，共8天；8天后，改变静水压力，上端弧形活塞提供4MPa的静水压力，同时进行往返摆角为20°的摆动，摆动速度为0.5rad/s，提供旋转剪切力，每天8小时，共4天；二氧化碳供给系统保证培养容器内含氧量为8％。
实施例1的方案，仅对多相骨软骨支架支架进行培养，不含有细胞，所以动态培养只改变了其中的蛋白质分布，使其结构和成分更贴近人体，有利于后续的培养。
实施例2的含细胞多相骨软骨支架上下层所含有的细胞均为骨髓干细胞，通过上下层不同的加载方式，使得上层分化为软骨细胞而下层分化为成骨细胞。
实施例3的含细胞多相骨软骨支架上下层所含有的细胞种类不同。其中上层的加载方式促进细胞分化，而下层的加载方式仅促进细胞的增殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于多相骨软骨支架的多功能动态生物反应器，其特征在于，包括动态生物培养装置、多相骨软骨复合支架、双通道供给循环系统和力学加载系统；所述动态生物培养装置设置有分隔的双层结构；所述多相骨软骨复合支架固定于动态生物培养装置中；
所述动态生物培养装置设置有软骨培养基入口、软骨培养基出口、软骨下骨培养基入口和软骨下骨培养基出口；所述软骨培养基入口和软骨培养基出口设置于所述双层结构的上层；所述软骨下骨培养基入口和软骨下骨培养基出口设置于所述双层结构的下层；
所述双通道供给循环系统包括双通道蠕动泵、第一可控单向阀、第二可控单向阀、软骨培养基和软骨下骨培养基；所述软骨培养基入口、双通道蠕动泵、软骨培养基、第一可控单向阀和软骨培养基出口顺次相连，形成第一通道；所述软骨下骨培养基入口、双通道蠕动泵、软骨下骨培养基、第二可控单向阀和软骨下骨培养基出口顺次相连，形成第二通道；
所述力学加载系统包括设置于所述动态生物培养装置上端的弧形活塞；
还包括第一管路过滤器和第二管路过滤器；所述第一管路过滤器设置于所述第一可控单向阀和软骨培养基之间的双通无菌管道上；所述第二管路过滤器设置于所述第二可控单向阀和软骨下骨培养基之间的双通无菌管道上；
还包括二氧化碳供给系统；所述二氧化碳供给系统分别与所述软骨培养基和软骨下骨培养基相连。
2.根据权利要求1所述的多功能动态生物反应器，其特征在于，所述多相骨软骨复合支架包括多相支架或含细胞多相骨软骨复合支架；所述多相支架的制备原料包括生物材料；所述含细胞多相骨软骨复合支架的制备原料包括细胞和生物材料，所述细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、人脐静脉内表皮细胞、骨细胞、成骨细胞或软骨细胞；所述生物材料包括I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸、糖蛋白、丝素蛋白、海藻酸盐、羟基磷灰石、磷酸三钙、双相磷酸钙、硫酸钙、PLGA、PCL和PLA中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的多功能动态生物反应器，其特征在于，所述二氧化碳供给系统的出口处设置有空气滤清器。
4.根据权利要求3所述的多功能动态生物反应器，其特征在于，还包括集成控制系统；所述集成控制系统分别与所述弧形活塞、双通道蠕动泵和二氧化碳供给系统相连。
5.根据权利要求4所述的多功能动态生物反应器，其特征在于，所述集成控制系统还包括分别设置于所述软骨培养基和软骨下骨培养基中的液体压力传感器以及分别设置于所述软骨下骨培养基和软骨培养基中的单悬臂梁式流体剪切应力传感器。
6.根据权利要求1所述的多功能动态生物反应器，其特征在于，所述弧形活塞的驱动方式包括机械驱动、流体驱动或电磁控制驱动。
7.根据权利要求1所述的多功能动态生物反应器，其特征在于，所述软骨培养基包括以下含量的成分：占所述软骨培养基的体积分数为10～15％的胎牛血清、100～120nmol/L地塞米松、35～37.5ug/ml维生素C、1～2mmol/L丙酮酸钠、100～120mg/L青霉素、100～120mg/L链霉素和第一活性分子；
所述第一活性分子包括在软骨培养基中含量分别为10～15mg/L的TGF-β、1～2ng/mL的β-FGF、6～6.25pg/mL的牛胰岛素、6～6.25ug/mL的转铁蛋白和10～15mg/L的BMP-7中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的多功能动态生物反应器，其特征在于，所述软骨下骨培养基包括以下含量的成分：占所述软骨下骨培养基的体积分数为10～15％的胎牛血清、100～120nmol/L地塞米松、10～15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0.2～0.3mmol/L抗坏血酸、100～120mg/L青霉素、100～120mg/L链霉素和第二活性分子；
所述第二活性分子包括在软骨下骨培养基中含量为10～15mg/L的TGF-β和/或含量为10～15mg/L的BMP-2。
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