CN114144059B

CN114144059B - 防止果实中形成种子的组合物

Info

Publication number: CN114144059B
Application number: CN201980098362.XA
Authority: CN
Inventors: H·B·梅尔·法里诺斯; A·加门迪亚·萨尔瓦多; F·J·加西亚·布雷乔; M·D·莱贡·希门尼斯
Original assignee: Plant Protection Varieties Association; Universidad Politecnica de Valencia
Current assignee: Plant Protection Varieties Association; Universidad Politecnica de Valencia
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: BR112022001097A2; ZA202110579B; EP3973770A1; PE20220702A1; AR119456A1; UY38799A; US20220346381A1; IL289988A; WO2021014028A1; CN114144059A

Abstract

本发明涉及农业食品工业和获得无籽果实。本发明包含活性产品，该活性产品的成分包含：八原子分子形式的硫(S₈)作为其活性成分，以及可选的表面活性剂和植物激素，优选赤霉酸或生长素，以及该活性产品在获得无籽果实的方法中的应用，所述方法包括将活性产品施用于作物、花卉、园艺植物和/或果树上。

Description

防止果实中形成种子的组合物

技术领域

本发明涉及农业食品工业，并且特别涉及一种新的组合物，该组合物在施用于园艺植物和/或果树作物的花时，可以有效的方式防止种子在果实中的形成，而不降低果实的产量和/或品质。

本发明的主题是新颖的组合物，含有硫(S)作为其活性剂，并且一旦按照本发明的方法施用，就能防止果实中种子的形成。

背景技术

新鲜产品市场对果实和蔬菜的内部和外部品质的要求越来越高_[1–3]。消费者最看重的品质特征之一是无籽_[4]。

因此，二十多年来，研究人员和农民都在寻求防止品种和栽培品种中形成种子的技术。用防蜂网覆盖作物或在温室中栽培是迄今为止最有效的一些技术_[5]，因为它们阻止了授粉者的存在，从而阻止了胚珠的授粉和受精。这些技术的最大缺点是劳动力和材料成本高，而且偶尔会减产，以柑橘为例，估计减产幅度约为30％_[1,2,5,6]。

其他使用的技术，如使用基于锌复合物或辣椒(Capiscum annuum)提取物的驱蜂剂，以及使用铜和赤霉酸的化学施用，都取得了非常低的效果，在10％-35％之间_[1,2,7,8]。在这些研究中，种子的有限减少被归因于铜及其对雄性部分的抑制作用，换句话说，对花粉管的萌发的抑制作用_[7,8]。这些减少不足以达到改善品质的目的，因此并不意味着经过处理的果实的价格会提高。目前，这些化学技术没有在田间使用，因为其有效性低，不能抵消处理的成本。

最后，可以通过植物育种、三倍体杂交、伽马射线诱导的突变或新的生物技术获得新的无籽品种_[9–13]。

因此，举例来说，无籽西瓜是通过杂交获得的，即用染色体组不相容的两株植物杂交。关键在于将一株植物放在另一株植物附近，使它们交叉授粉，但不受精，这样产生的果实就是无籽西瓜。在这个实例中，二倍体西瓜的雄性花粉与四倍体西瓜的花杂交，得到不育的杂交体(三倍体西瓜)，其不能产生种子。

无籽橙子和葡萄等果实是突变的实例，其通过选择和杂交育种过程，产生了新的品种。

在其他情况下，通过伽马射线照射，或最近通过基因编辑技术(CRISPR)，以生产无籽果实为目的故意引入突变，从而利用突变来产生无籽果实。这种技术正在番茄上进行测试。在这种情况下，突变会增加生长素激素水平，从而刺激果实发育，尽管种子尚未开始形成。

西班牙专利ES2323028描述了一种利用突变来获得无籽番茄的方法。该方法的基础是将拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的LFY基因转移到转基因番茄植株上并表达。带有LFY基因的转基因植物的果实保持了与原始作物相同的大小和重量，但不含种子，肉质更多，果肉更少，形状稍尖。

西班牙专利ES2580166描述了一种能产生无籽果实的辣椒植物，其中所述植物通过逆向育种在几代中稳定地产生，并且该植物通过杂交方法获得，该方法包括以下阶段a)选择能够产生无籽果实的第一子代植物，该植物具有雄性不育特征和第一子代植物群的单性果实特征，该植物通过雄性不育系的植物与单性果实系的植物杂交产生；b)将如此选择的第一子代植物与作为亲本授粉者的能够保留植物的单性果实系特征和雄性不育特征的固定单性果实系植物杂交，以便用它来形成具有单性果实系特征和雄性不育特征的后代植物；c)由此形成的后代植物用在阶段b)中作为亲本授粉者的固定单性果实系的植物作为亲本授粉者再次逆向培育，从而从后代中产生具有单性果实系特征和雄性不育特征的植物。

但获得无籽果实并不能保证这些果实在市场上会受到欢迎。无籽或有籽只是果实必须满足的特征集合中品质特征中的一个。因此，即使经过多年的努力，新的单性果实系品种也有可能没有被充分引入市场_[14,15]。因此，解决这一问题的不同方法是，一旦获得一个成功的品种，就要寻求一种有效的处理方法，防止其种子的形成，从而提高其价值。

本发明提供了一种组合物，该组合物在“开花”阶段期间施用于作为园艺作物和果实作物，即园艺植物和果树时，可以防止果实中种子的形成，而对植物和授粉者没有毒性，也不会对品质和产量的数量产生负面影响。

发明内容

本发明的主题是一种新的组合物，它在施用于农作物的花上时，能够防止经处理植物的果实形成种子。

施用必须在开花阶段(花期)期间进行，该组合物包含作为活性成分的硫(S)，其活性促使花的柱头乳突细胞萎陷，并且可选地促进活性有助于稳定作物的植物激素。此外，该组合物包含表面活性剂组成，它有助于通过喷洒方法将该组合物施用于作物。

本发明的作者发现，硫(S)一旦施用于园艺植物和/或果树的花，就会促使柱头乳突细胞的萎陷，从而阻止花粉管的生长，因此阻止了果实中种子的形成。

本发明的作者还观察到，由于上述效果，对果实形成的强度有减少作用。根据活性产品的施用浓度，这可以减少作物中的果实总数，这对获得更少但尺寸更大的果实，从而提高产出的商业价值是有益的。对于单性果实能力低下或没有单性果实能力的作物(例如蔷薇科的果树)而言，通过防止受精，也可以防止果实的部分形成。这种从主要效应(柱头乳突细胞的萎陷)衍生出来的次要效应对于调节这类作物的每棵树的果实数量很有用。

就本发明而言，术语“阻碍、防止和减少”果实中种子的形成和数量涵盖了对柱头内花粉管的95％至100％的生长抑制，从而使已及时用适当浓度的产品均匀处理过的花中的种子形成受到95％至100％的抑制。

在本发明中，术语“开花”与花期相对应，并且涵盖了从花开放和柱头暴露并接受花粉粒的时刻。

在本发明中，术语“授粉前的状态”涵盖花粉粒到达花的柱头之前的状态。

在本发明中，术语“授粉后的状态”涵盖花粉粒到达花的柱头之后的状态。

因此，本发明的主题是一种防止园艺植物和/或果树的果实中形成种子的组合物，所述组合物包含硫(S)，并且引起柱头乳突细胞的萎陷。

本发明的主题也是一种如上所述的组合物，其特征在于，所述硫(S)在所述组合物中的存在量与所述组合物的总重量相比为50-100％(m/m)。

本发明的主题也是一种符合上述段落的组合物，其特征在于，还包含表面活性剂，以生成稳定的水性溶液，从而方便其施用并改善其效果。

本发明的主题也是如上所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自由非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂以及它们的混合物组成的组。

本发明的主题也是上述的组合物，其特征在于，所述硫(S)和表面活性剂以100:1至1:10(硫：表面活性剂)的比例存在于所述组合物中。

本发明的主题也是一种如上所述的组合物，其还包含植物激素。

本发明的主题也是如上所述的组合物，其特征在于，所述植物激素以0mg.L^-1至500mg.L^-1的浓度存在于所述组合物中。

本发明的主题也是如上所述的组合物，其特征在于，植物激素选自包括赤霉酸、生长素和细胞分裂素以及它们的混合物组成的组。

本发明的主题也是一种如上所述的组合物，其特征在于，所述植物激素是赤霉酸。

本发明的主题也是上述各段所述的组合物，其特征在于，所述组合物中存在的硫(S)以八原子分子(S₈)的形式存在。

本发明的主题也是一种防止或减少园艺植物和/或果树的果实中形成种子的组合物，所述组合物包含作为八原子分子的硫(S₈)、聚山梨酯20和赤霉酸。

本发明的主题是一种组合物，其特征在于，其包含：

0.1g.L^-1至100g.L^-1表面活性剂：聚山梨酯20

0.1g.L^-1至100g.L^-1作为八原子分子(S₈)的硫(S)；和

1mg/L至300mg/L植物激素：赤霉酸。

此外，本发明的主题还包括上述任何段落中定义的组合物在防止或减少园艺植物和/或果树的果实中种子形成中的应用。

本发明的主题也是使用上述段落中详述的组合物在调节园艺植物和/或果树的形成强度(每株植物形成的果实数量)中的应用。

此外，本发明的主题也是一种防止园艺植物和/或果树的果实中形成种子的方法，所述方法包括施用有效量的前述段落中任何一项所述的组合物的阶段，其中所述施用在“开花”阶段期间对所述园艺植物和/或果树的花进行。

本发明的主题也是如上所述的防止园艺植物和/或果树的果实中形成种子的方法，所述方法包括施用如上所述的本发明组合物，其中所述施用在授粉后状态下的“开花”阶段期间对所述园艺植物和/或果树的花进行。

本发明的主题也是一种如上所述的减少园艺植物和/或果树的果实中形成种子的方法，所述方法由在授粉后状态下的“开花”阶段期间施用以上段落中任一项所述的本发明组合物组成。

本发明的主题也是一种如上所述的减少园艺植物和/或果树的果实中形成种子的方法，其中所述使用喷洒、浸泡或类似的方法进行所述施用。

本发明的主题也是一种如上所述的减少园艺植物和/或果树的果实中形成种子的方法，其中在作物开花期间以各种施用施加处理。

此外，本发明的主题也是一种无籽果实，其特征在于，尽管已经授粉，但其内部没有种子。

本发明的主题也是一种无籽果实，其特征在于，尽管已经授粉，但其内部没有种子，通过上述段落中定义的方法获得。

此外，本发明的主题是用上述段落中定义的本发明的组合物处理的园艺植物和/或果树，其特征在于，所述园艺植物和/或果树被该组合物包覆。

本发明的主题也是一种园艺植物和/或果树，其特征在于，存在无籽的果实。

本发明的主题也是上述定义的园艺植物和/或果树，其特征在于，存在萎陷的柱头乳突细胞。

最后，本发明的主题也是前述段落中定义的园艺植物和/或果树，其特征在于，一旦产生园艺植物和/或果树的授粉，就没有柱头上花粉管的生长。

附图说明

图1描述了“未经处理”的乳突细胞的健康上柱头乳突的不同部分的TEM(透射电子显微镜)视图，显示该细胞是健康的、完整的，并具有其特征形状。

图2描述了用本发明的活性产品处理过的乳突细胞的受损上乳突的不同部分的TEM视图，显示了乳突细胞如何失去了膨胀和其部分成分，并出现萎陷。

图3描述了未经处理的授粉柑橘花的柱头的荧光显微镜视图，显示了在柱头和花柱内生长的花粉管(存在“荧光纤维”)。

图4描述了仅用本发明的活性成分(S₈)处理过的授粉柑橘花的柱头的荧光显微镜视图，显示了在柱头区域没有花粉管(没有“荧光纤维”)。

图5描述了仅用赤霉酸处理过而不用活性成分(S₈)的授粉柑橘花的柱头的荧光显微镜视图。可以清楚地看到柱头内花粉管的存在。

图6描述了只用活性成分(硫)处理过的柑橘柱头的半薄切片的显微镜视图，其中可以看到受损柱头的乳突细胞，没有膨胀。

图7描述了只用赤霉酸处理过的柑橘柱头的半薄切片的显微镜视图，其中柱头的乳突细胞是良好的、功能性的和膨胀的。

图8描述了比较6种实验产品(T1-T6)有效性的实验结果。处理1(T1)是使用本发明所述的活性产品的处理，与阳性对照(C+)相比，它是唯一能显著减少种子数量的处理(从3.3减少到0.4)

图9描述了葡萄Vitis vinífera L.的荧光显微镜图像。图9A：未经处理的柱头(C+)存在PT。图9B：用AP处理的柱头没有PT。

图10描述了黄瓜果实Cucumis sativus L.的图像。图10A：未经处理的授粉花的果实(有种子)。图10B：经处理的授粉花的果实(无种子)。

图11描述了茄子Solanum melongena L.的荧光显微镜图像。图11A：未经处理的柱头(C+)存在PT。图11B：用AP处理的柱头没有PT。

图12描述了西瓜Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai的荧光显微镜图像。图12A：未经处理的柱头(C+)存在PT。图12B：用AP处理的柱头没有PT。

图13描述了克莱门氏柑橘(clemenules Citrus)Citrus clementina hort.ExTanaka.的荧光显微镜图像。图13A：未处理的柱头(C+)存在PT。图13B：用AP处理的柱头没有PT。

图14描述了克莱门氏小柑橘(clementina fina Citrus)Citrus clementinahort.Ex Tanaka.的荧光显微镜图像。图14A：未经处理的柱头(C+)存在PT。图14B：用AP处理的柱头没有PT。

图15描述了柑橘Murcott Citrus reticulata White的荧光显微镜图像。图15A：未经处理的柱头(C+)存在PT。图15B：用AP处理的柱头没有PT。

图16描述了Nova.C clementina x[C.paradisi x C.tangerina]的荧光显微镜图像。图16A：未经处理的柱头(C+)存在PT。图16B：用AP处理的柱头没有PT。

图17描述了柠檬Citrus limon L.Burm.f.的荧光显微镜图像。图17A：未经处理的柱头(C+)存在PT。图17B：用AP处理的柱头没有PT。

图18描述了橙子树的荧光显微镜图像。用AP处理的授粉花没有可见的PT。

图19描述了葡萄柚树(grapefruit tree)的荧光显微镜图像。用AP处理的授粉花没有可见的PT。

图20描述了墨西哥酸柠檬(Mexican lime)的荧光显微镜图像。用AP处理的授粉花没有可见的PT。

图21A和21B描述了随着时间的推移本发明的活性产品在果实中的作用结果，种子的数量x处理(图21A(授粉前处理)和图21B(授粉后处理)。

图22显示了关于在花粉粒萌发期间施用活性产品的效果的毒性曲线。

图23显示了施用本发明的活性产品后树的植物毒性。

图24显示了活性产品对授粉者的影响。图12A显示48小时后的死亡率。图12B描述了浓度的对数的逻辑模型。Log(LD50)＝11.84，因此，LD50＝139.017μg/熊蜂(bumblebee)。

图25显示了用活性产品处理后，活性产品对产物尺寸的影响。

图26(图26A-26C)显示了活性产品的作用对产物品质的影响。

具体实施方式

本发明应用于农业食品工业，特别是用于从园艺植物和/或被子植物组的果树中获得无籽果实。

被子植物作物具有开花和结果的能力，其果实内部有一颗或多颗种子。当受精发生时，子房成熟并转化为果实。它的生殖器官是雄蕊(花的雄性器官)，以及雌蕊(其是花的雌性器官)，其子房内发现雌性配子体。被子植物的种子位于果实内。

在被子植物的有性生殖过程中，特别是在授粉阶段，花粉通过风或昆虫授粉者从一朵花的花药转移到另一朵花或同一朵花的柱头。一旦花粉粒到达柱头，就会以管的形式生长，使雄性配子体通过花柱下降，到达雌性配子体所在的精原基(seminal primordium)，以便使其受精。从那一刻起，精原基转化为种子，雌蕊群的其余部分，主要是子房，转化为果实。

在成熟期，柱头可以有两种类型，湿的或干的，取决于它们是否分泌出特有的渗出物。它们的表面一般是乳突状的。术语“乳突”适用于那些单独的或分组的接受性柱头细胞，它们在柱头的一般表面以上，彼此之间明显自由地放置。一旦进入柱头，花粉就会萌发，发出花粉管(PT)，2个萌发核或精子核通过花粉管，然后其使雌配子体受精。花粉管必须穿透柱头组织和花柱，才能到达卵子。

本发明的作者发现了一种施用于花卉作物的活性产品，能够促使柱头乳突细胞萎陷，从而阻止花粉管的生长，并因此阻止果实中种子的形成，但不改变果实本身的形成。具体来说，已经验证了该活性产品影响花的柱头区。在这个区域，该产品有两个影响：(i)促使接受花粉的柱头乳突细胞萎陷；和(ii)减少渗出物(分泌物)的量(图1和2)。由于这种萎陷，乳突细胞失去其功能，并且即使花粉到达花朵，其也无法在里面生长(图3和4)。由于花粉不能进入花内，因此不能受精，所以没有形成种子。

这样，本发明的活性产品就可以用于在农业食品工业，特别是用于获得无籽果实。

在本发明的一个优选实施方式中，该活性产品适用于产生带有种子的果实的被子植物作物，并且在有或没有植物激素的帮助下具有一定的单性果实能力。在其他作物中，该产品适用于属于以下科的物种：芸香科(rutaceae)(柑桔(mandarin)、橘柚(tangelo)、柠檬、葡萄柚、酸柠檬(lime)、金柑(kumquat)、甜橙等)、葡萄科(食用葡萄(table grape)等)、葫芦科(curcubitaceae)(西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、西葫芦(courgette)等)和茄科(solanaceae)(茄子(aubergine)、辣椒(pepper)、番茄等)等其他栽培植物的科。该活性产品已经在不同的科和物种上进行了测试(见实施例1)，始终注意到相同的效果：柱头的乳突细胞的萎陷，阻止了花粉管的生长，因此它的作用是广泛的，可以用于防止各种作物的种子形成。

根据本发明，该产品用于以下柑橘物种和/或品种时特别有效：小叶(clemenules)、克莱门氏柑橘(fina clementine)、莫尔科特(murcott)、纳多克特柑橘(nadorcott)、诺瓦柑橘(nova)和其他桔柚和柑橘、柠檬、墨西哥酸柠檬、葡萄柚、甜橙和金柑(kumquat)，以及用于以下园艺物种和/或品种：黄瓜、茄子、甜瓜、西葫芦和西瓜等。

根据本发明的活性产品包括包含硫(S)作为组合物的活性成分的组合物。与组合物的总重量相比，硫(S)在组合物中的存在率为50-100％(m/m)。优选地，该组合物包含基本形式的化学元素硫(S)，换句话说，为八原子分子(S₈)，并且在这种情况下，与组合物的总重量相比，在组合物中的量在50-100％(m/m)之间变化。所述活性成分可以从天然矿床(矿山或地下矿床)中的原生元素形式获得。然而，有一些商业产品可以用于本发明的目的，例如农用硫等。

必须在组合物中存在的硫(S)浓度将取决于作物和所需的效果。一般来说，硫(S)，特别是作为八原子分子(S₈)的硫(S)以0.01-10％(m/v)的比率存在。也就是说，产品中硫的浓度可以在0.1g.L^-1-100g.L^-1之间变化。

在本发明的一个具体实施方式中，如果产品被指定用于柑橘类果树，如蜜柑，则一般的硫(S)和作为八原子分子(S₈)的硫(S)在组合物中的含量为0.5-4％(m/v)。如果该产品被指定用于园艺树种，在组合物中存在的一般的硫(S)和作为八原子分子(S₈)的硫(S)的含量在0.1-1.5％(m/v)之间。

在本发明的一个具体实施方式中，除了硫(S)之外，活性产品还包括如前述段落所述的表面活性剂，以实现活性成分即作为八原子分子(S₈)的硫(S)的稳定和均匀的水溶液。可构成活性产品制剂一部分的表面活性剂可选自以下组：(i)非离子型表面活性剂，如聚山梨酯20或聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯(20)(商品名20)，辛基苯酚乙氧基化物(商品名/>X-100)，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)，洋地黄皂苷，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯(20)(商品名/>80)、山梨醇酯、烷基聚葡萄糖苷(APG)、壬基苯氧基化物(壬氧醇)、丙氧基化脂肪醇(FAPO)和聚亚烷基二醇(乙氧基化脂肪醇(FAEO))；(ii)阴离子表面活性剂，例如苏打或钾皂(potash soap)、羧酸酯、烷基羧酸盐、羧酸衍生物和丙烯酸表面活性剂；以及它们的混合物。优选地，本发明的组合物由非离子表面活性剂：聚山梨酯20组成。

在本发明的一个具体实施方式中，根据待处理柱头的特性，表面活性剂和活性成分硫(S)以100:1至1:10(活性成分：表面活性剂)的比例出现在组合物中。对于湿的柱头，表面活性剂的量可以减少(10:1)，而对于干的柱头，可能需要更大的比例(1:5)。组合物中表面活性剂和硫(S)之间的优选比例是1:1。

在本发明的另一个具体实施方式中，本发明的活性产品由聚山梨酯20和作为八原子分子(S₈)的活性成分硫(S)组成。在这种情况下，根据待处理柱头的特性，表面活性剂和作为八原子分子(S₈)的活性成分硫(S)以100:1至1:10(活性成分：表面活性剂)的比例出现在组合物中。组合物中表面活性剂和作为八原子分子(S₈)的硫(S)之间的优选比例是1:1。

在本发明的另一个具体实施方式中，活性产品除了硫(S)和表面活性剂成分外，还包括植物激素或植物生长调节剂。可形成本发明活性产品制剂一部分的植物激素可选自包括赤霉酸(GA)、生长素和细胞因子以及其混合物的组。优选地，本发明的组合物由植物激素赤霉酸组成。

赤霉酸(或赤霉素A₃、GA、GA₃、GA_x)是一种存在于植物中的植物激素。其化学式为C₁₉H₂₂O₆。纯化后，它是白色至淡黄色的粉末，可溶于乙醇，稍溶于水。

GA作为一种与细胞生长和分裂有关的植物激素已被广泛研究，它是一种刺激生长的激素_[16–19]。

在开花阶段和果实的最初形成阶段，GA在子房内发挥着重要作用_[20,21]。种子的形成会产生GA，它作为一种激素信号，突出了子房的储集库样；这种信号使植物特别向该子房输送更多的糖，从而使它生长、形成并最终为果实_[22,23]。

为了通过本发明的活性成分的作用防止种子的形成，可以消除对果实的形成很重要的刺激(以GA的形式)，这可能意味着产量的减少。一些无籽品种和栽培品种或在防蜂网下栽培的品种出现产量问题_[1,2,5,6]。高产和单性生殖(无籽)品种往往具有较高的天然和内源性GA水平_[20,21]。

因此，该制剂可以受益于一定量的GA或另一种生长激素(如生长素)，它们可以抵消因种子没有形成而可能造成的刺激损失。需要的激素量取决于作物、品种和其他因素，并将与活性产品相结合。

氮化源、碳酸源和矿物盐的发酵是获得商业赤霉素的最自然方式。作为碳酸源，使用葡萄糖、蔗糖和天然面粉，并施用磷酸盐和镁矿物盐。

这个过程需要5到7天才能有效发酵。它需要不断地搅拌和通气，保持28℃至32℃的平均温度，以及3-3.5的pH水平。

回收赤霉素的过程是通过将生物质与发酵液分离来完成的。在这种情况下，无细胞上清液含有作为植物生长调节剂的要素。

在实验室里，赤霉素颗粒可以通过液-液柱提取过程来回收。对于这种技术，乙酸乙酯被用作有机溶剂。作为选择，将阴离子交换树脂用于上清液，从而通过梯度洗脱实现赤霉素的沉淀。最后，按照既定的纯度对颗粒进行干燥和结晶。

可用于本发明目的的商业产品为等。

存在于本发明的组合物/活性产品中的GA的浓度将取决于作物和其他因素，如开花强度。在本发明的一个具体实施方式中，组合物/活性产品中GA的浓度在0mg.L^-1-500mg.L^-1之间，优选在1mg.L^-1-300mg.L^-1之间。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明的活性产品包含非离子表面活性剂、作为八原子分子(S8)的活性成分硫(S)和赤霉酸。优选地，活性产品，换句话说，本发明的组合物包含聚山梨酯20，作为八原子分子(S₈)的活性成分硫(S)和赤霉酸。本发明的一个优选实施方式包含：

0.1g.L^-1-100g.L^-1的表面活性剂：聚山梨酯20；

0.1g.L^-1-100g.L^-1的硫(S)，作为八原子分子(S₈)；和

1mg/L-300mg.L^-1的植物激素：赤霉酸。

本发明的组合物/活性产品的制备方法是按照本领域专家的通常所知实践进行的，包括以下阶段：将表面活性剂与硫(S)混合和摇动，不加水，直到表面活性剂充分覆盖硫(S)分子，随后加水，直到获得所需浓度的溶液，最后将植物激素加入活性产品的浓缩溶液中。

将本发明的活性产品施用于农作物的花的方法是将化学合成产品施用于农作物的常用方法。特别是，可以预见活性产品/组合物通过用于农业处理的常规雾化机械施用于作物。具体来说，可以预见通过喷洒、浸泡和类似的系统进行施用。

为此，在施用前，根据上述段落获得的浓缩活性产品将被稀释在水中直到获得根据作物的推荐的浓度。

例如，对于拥有100L箱的常规喷洒机械，对于浓度为2％的活性产品1：1表面活性剂和40mg.L^-1GA，制备具有2L聚山梨酯20+2kg硫+0.25L GA溶液(16g.L^-1浓缩赤霉酸)+1.75L水的浓缩溶液，直到得到所有成分的均匀溶液。将此浓缩溶液放入箱中，使其达到100L(为此需要增加96L水)。在施用前，用箱的压力涡轮机搅拌混合物，以使混合物均匀。

另一方面，施用活性产品的最佳时间优选是：早上第一件事是避免日照和温度最高的时间，与其他植物调节剂的施用一样。此外，还可以在花朵最容易接受的时间到达。获得有效结果所需的活性产品的剂量是根据冠或叶的体积和开花的强度来决定的。

活性成分硫，优选八原子分子(S₈)的形式，负责通过改变柱头的乳突细胞来防止种子的形成，而GA负责重新建立果实形成所需的刺激，从而防止可能的减产。对GA的需求将取决于每种作物和它的单性果实能力。尽管最初认为GA自身可以减少种子的数量_[7]，但后来证实，在真实的田间条件下，施用GA对减少种子的数量没有效果，对照和处理之间没有明显的差异_[1,2]。从这个意义上说，赤霉酸不会改变乳突细胞，因此它不会干预防止种子出现的基本机制。这一机制主要是由于硫的作用。通过图4和图5显示了这一点，其中柑橘的柱头被授粉，随后被处理，一个只用活性成分(S₈)处理(图4)没有花粉管，另一个只用GA处理(图5)，可以清楚地看到发育的花粉管。图6和图7中可以通过半薄显微镜切片分别比较活性成分(硫)和赤霉酸(GA)对乳突细胞的影响。图8显示了专门用GA处理的柑橘花的柱头的半薄切片，其中可以看出柱头的乳突细胞是完整的、有功能和膨胀的；而在图6中，可以看出所述细胞被施用硫而损坏。换句话说，单独GA并不损害乳突细胞，因此不妨碍花粉管的生长。

消除种子和恢复对果实形成的刺激的双重效果必须在开花期(花期)进行，因此其联合和协同施用可以确保更好的效果。需要表面活性剂来实现活性成分在水中的均匀和稳定的溶液，使其能够与第三种成分(植物激素)混合，并通过常规的农业处理雾化机械在田间进行液体施用。

根据以下描述的实验工作，本发明的作者已经能够证实，按照本发明的活性产品的施用，在直接施用于花上时(达到了95-100％的效率)和在施用于整个树上时(对纳多克特品种(Nadorcott variety)的柑橘树所获得的结果中，效率约为85％)，都产生了非常令人满意的效果。该活性产品与另外5种可能的实验产品同时进行了测试，该活性产品是唯一能使柑橘种子数量明显减少的产品(图8)。在这个实验中，3种无机肥料(T1＝硫；T2＝硝酸铵和T3＝硝酸钾)和3种多糖(T4＝葡萄糖；T5＝纤维素；T6＝蔗糖)在纳多克特品种(柑橘)的整棵树上进行了测试。随后，收集每个处理的120个果实，并对每个果实中的种子数量计数。与阳性对照相比，活性产品硫是唯一能显著减少种子平均数量的产品。

表1：不同处理对果实中种子数量的影响。由于残留物的非正态性，使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal Wallis，KW)检验来比较平均值。不同的字母代表显著差异。

与用于相同目的的现有技术的其他方法和产品相比，根据本发明的活性产品也显示出重要的益处。具体来说，值得注意的益处是：

-比其他农艺处理更好的效果(超过加倍)。

-对经处理的作物的长期影响和永久作用：经处理的花对花粉管向子房内部的生长有永久的功能障碍，因此在其整个使用寿命中无法形成种子。

-终止已经开始的授粉的能力：即使花粉管已经向胚珠行进一半的路程，该活性产品也能阻止受精。

-其对植物是无毒的，换句话说，在每种作物的推荐浓度下(例如，对柑橘类果实低于4％)，它不会产生坏死、萎黄或落叶。

-其对授粉昆虫，特别是熊蜂来说是无毒的。

-其对产出物的尺寸没有显著影响。

-其对以下果实品质参数没有影响：果皮％、果汁％、果肉％、维生素C、Brix糖度、总酸度、成熟度指数、单个重量和果实的颜色。

实施例

实施例1：活性产品对不同作物的效果

该活性产品已在众多作物上进行了不同规模的测试。

花：对个体花朵进行处理，并用荧光显微镜进行观察。在这种情况下，评估柱头上是否有花粉管(PT)，以及与阳性对照相比，花粉管的减少百分比。

果实：对个体花进行处理，随后观察由处理过的花形成的果实。

树：个体树。

田间：用拖拉机对整行的成年树进行处理。

下面显示的结果证实了本报告中描述的产品的有效性，如按照以下参数从相应的图中的荧光显微镜图像可以看出：所有的花都是先授粉，然后进行处理或不处理。C+＝阳性对照＝已授粉但未用活性产品处理的花；PT＝花粉管(荧光纤维)；AP＝活性产品。

-.Vid花(S₈)＝100％Red.PT(图9A和9B)

-.Vid花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.黄瓜果实(S₈)＝100％Red.种子(图10A和10B)

-.黄瓜果实(S₈)+PS20+GA＝100％Red.种子

-.茄子果实(S₈)＝100％Red.种子(图11A和11B)

-.茄子果实(S₈)+PS20+GA＝100％Red.种子

-.西瓜果实(S₈)＝100％Red.PT(图12A和12B)

-.西瓜果实(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.纳多克特(柑橘)花(S₈)＝100％Red.PT

-.纳多克特(柑橘)花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.纳多克特(柑橘)树(S₈)＝85％Red.种子

-.纳多克特(柑橘)田间(S₈)+PS20＝81％Red.种子

-.克莱门特(柑橘)花(S₈)＝100％Red.PT(图13A和13B)

-.克莱门特(柑橘)花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.菲娜(柑橘)花(S₈)＝100％Red.PT(图14A和14B)

-.菲娜(柑橘)花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.摩卡特(柑橘)花(S₈)＝100％Red.PT(图15A和15B)

-.摩卡特(柑橘)花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.诺娃(橘柚)花(S₈)＝100％Red.PT(图16A和16B)

-.诺娃(橘柚)花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.柠檬花(S₈)＝100％Red.PT(图17A和17B)

-.柠檬花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.甜橙花(S₈)＝100％Red.PT(图18)

-.甜橙花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.柚子花(S₈)＝100％Red.PT(图19)

-.柚子花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

-.墨西哥酸柠檬花(S₈)＝100％Red.PT(图20)

-.墨西哥酸柠檬花(S₈)+PS20+GA＝100％Red.PT

PS20＝聚山梨酯20

GA＝赤霉酸。

Red.＝减少

PT＝花粉管

实施例2：本发明的活性产品的作用随时间变化的实验

为了研究该产品的作用随时间的变化，在纳多科特柑橘的花上进行了两个实验，一个是授粉前，另一个是授粉后。在授粉前的实验中，用本发明的产品(S₈)处理了300朵花，随后分批授粉。一批在同一天(D0)授粉，另一批在第二天(D1)授粉，以此类推，直到D9。

结果：在图21A中，阳性对照(C+)平均呈现4.67颗种子，而从D0到D9的其余处理中的果实没有呈现一颗种子。这表明该产品的作用是永久性的：一旦花以该产品处理过，即使它在随后的日子里(1-9)接受花粉，它也会被永久地阻止形成种子。

在授粉后的实验中，首先对360朵花进行授粉。在这种情况下，在第一次授粉后，一批花在当天(D0)被处理，另一批在第二天(D1)被处理，依次类推，直到第9天(D9)。

结果：图21B显示，阳性对照(C+)的果实平均含有4.7颗种子。活性产品能够在头4天(D0至D3)防止100％的种子(尽管花粉正在发育中)，在随后的6天(D4至D9)大约防止50％的种子。

实施例3：关于施用本发明的活性产品对花粉粒萌发的影响的实验。

研究了该产品对花粉粒萌发的作用。为此，在实验室条件下，将花粉粒播种在皮氏培养皿中，向皮氏培养皿中加入活性产品(S₈)浓度递增的培养基。72小时后对其进行评估，并计数每个皮氏培养皿中萌发的花粉粒的数量。

无毒的中性产品(样品)KNO₃被用来与活性产品(AP)的结果进行比较。

结果：如图22所示，该活性产品对花粉粒的萌发有抑制作用。毒性曲线在2、20、200时开始，在2000mg/l时，抑制作用是完全的。

实施例4：植物毒性实验

对纳多克特柑橘品种的成年树进行了植物毒性试验。树木被喷洒了不同浓度的活性产品(S₈)。对萎黄、坏死和落叶的影响程度进行评估，等级为1-6，其中1为非常低，6为非常高。

结果：如图23所示，初步测试表明，在推荐的浓度下(低于4％)，活性产品对柑橘没有植物毒性。在这些浓度下，没有出现萎黄、坏死或落叶的迹象。

实施例5：关于活性成分对授粉者影响的实验

研究该产品对授粉者的影响的实验是在实验室中按照官方方案对普通熊蜂(BombuSsp.)进行的。实验中使用的熊蜂总数为560只。

结果：图24A显示了取决于处理方法的48小时内死亡的频率。前4个处理与对照(H₂O)没有明显区别，显示死亡率在14-18％之间，远远低于致命剂量50(LD50)的50％特征。PAP_10代表1000μg/熊蜂。

国际尺度建立：-高等毒性(急性LD50<2μg/只蜂)-中等毒性(急性LD50 2-10.99μg/只蜂)-微毒(急性LD50 11-100μg/只蜂)-无毒(急性LD50>100μg/只蜂)。

换句话说，如果LD50超过100μg/熊蜂，则被归类为“无毒”。在这种情况下，1000μg/熊蜂的剂量仍然不能杀死群体中50％的个体。它是处理PAP_1000，其产生50％的熊蜂的死亡率，与MCP(甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)处理：用作阴性对照的杀虫剂)相当。因此，需要100,000μg/熊蜂的浓度才能产生50％的死亡率，因此该活性成分可以被归类为对熊蜂“无毒”。

图24B显示了逻辑模型的适应性。该模型提供的LD50＝139,017μg/熊蜂，与图24A的死亡率(PAP_1000)相吻合。

实施例6：关于活性产品对产量影响的实验

在田间实验中，用拖拉机对整行的纳多科特成年柑橘树进行了测量，并使用3种递增浓度的活性产品(S₈+聚山梨酯20 1:1)(D、E和F)，测量了每棵柑橘树产量的总量的影响。产量是对56棵整树进行测量的。

表2:每个处理后产量的Anova结果。

结果：表2和图25显示，各处理之间的总产量没有显著差异，因为所有处理的HSD检验显示相同的字母“a”。

产量的品质参数是在“树2017”实验中对年轻的纳多科特柑橘树的处理进行测量。每个处理的48个柑橘进行了测量。每一列代表一个不同的处理。

结果：如图26(A-C)所示，活性产品(AP)对品质参数没有影响：果皮％、果汁％、果肉％、维生素C、Brix、总酸度、成熟度指数、单个重量和果实的颜色。

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Claims

1.一种用于引起园艺植物的柱头乳突细胞的改变并由此防止在所述园艺植物的果实中形成种子的组合物，所述组合物包含八原子分子S₈形式的硫、表面活性剂和赤霉酸。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自包括非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂以及它们的混合物的组。

3.如权利要求1和2中任一项所述的组合物，其特征在于，存在于所述组合物中的所述硫和所述表面活性剂的比例，即硫：表面活性剂，为100:1至1:10。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，赤霉酸以1mg.L^-1至500mg.L^-1的浓度存在于所述组合物中。

5.如权利要求1和2中任一项所述的组合物，其包含作为八原子分子S₈的硫、聚山梨酯20和赤霉酸。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，其包含：

0.1g.L^-1至100g.L^-1表面活性剂：聚山梨酯20

0.1g.L^-1至100g.L^-1作为八原子分子S₈的硫；和

1mg/L至300mg/L植物激素：赤霉酸。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述园艺植物是果树。

8.一种用于引起园艺植物的柱头乳突细胞的改变并由此防止在所述园艺植物的果实中形成种子的方法，所述方法的特征在于，在“开花”阶段期间对园艺植物的花施用有效量的包含八原子分子S₈形式的硫的权利要求1至7中任一项所定义的组合物。

9.如权利要求8所述的用于引起园艺植物的柱头乳突细胞的改变并由此防止在所述园艺植物的果实中形成种子的方法，其中所述施用在授粉前状态下的“开花”阶段期间对所述园艺植物的花进行。

10.如权利要求8所述的用于引起园艺植物的柱头乳突细胞的改变并由此防止在所述园艺植物的果实中形成种子的方法，其中所述施用在授粉后状态下的“开花”阶段期间对所述园艺植物的花进行。

11.如权利要求8至10中任一项所述的用于引起园艺植物的柱头乳突细胞的改变并由此防止在所述园艺植物的果实中形成种子的方法，其中使用喷洒或浸泡进行所述施用。

12.如权利要求8至10中任一项所述的用于引起园艺植物的柱头乳突细胞的改变并由此防止在所述园艺植物的果实中形成种子的方法，其中在作物开花期间以各种施用施加处理。

13.如权利要求8至10中任一项所述的用于引起园艺植物的柱头乳突细胞的改变并由此防止在所述园艺植物的果实中形成种子的方法，其中所述园艺植物是果树。