CN114127271A - 用于生产不含基因组修饰的修饰的噬菌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，其中至少一种目的基因的表达受到特异性抑制其表达的分子的抑制。本发明还涉及用于生产修饰的噬菌体的组合物和试剂盒。此外，本发明涉及一种没有在基因组水平而是在蛋白质组水平上修饰的噬菌体及其在治疗、诊断和检测测定中的用途。

Description

用于生产不含基因组修饰的修饰的噬菌体的方法

技术领域

本发明涉及一种用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，其中至少一种目的基因的表达受到特异性抑制其表达的分子的抑制。本发明还涉及用于生产修饰的噬菌体的组合物和试剂盒。此外，本发明涉及一种没有在基因组水平而是在蛋白质组水平上修饰的噬菌体及其在治疗、诊断和检测测定中的用途。

背景技术

噬菌体是专门感染宿主细菌并利用细菌繁殖的病毒。噬菌体的生物技术应用非常广泛，从基于进化的选择方法，例如酶活性的进化改进(Esvelt等人2011)，到所谓的噬菌体展示，其可用于产生和优化生物药物，例如治疗性抗体(Bazan等人2012)，到噬菌体本身在噬菌体治疗中作为抗生素的替代品使用(Barbu等人2016)。后者基于噬菌体特异性攻击和破坏病原菌(裂解)的天然能力。然而，基于噬菌体的治疗剂和诊断剂的开发和生产仍然受到用于噬菌体的简单且安全的生产方法中困难的阻碍。到目前为止，噬菌体是通过与合适的细菌/病原体一起培养产生的(Pirnay等人,2018)。这需要遵守相应细菌的适当安全规定，以及培养它们的可能性。对于危险病原体，由于需要在特殊设施中经过专门培训的人员，因此处理非常困难且成本高昂。

相对于细胞表达，蛋白质的无细胞合成具有许多优势，尤其是在生产对于细菌有毒的蛋白质或将非天然氨基酸引入蛋白质时。蛋白质合成可以用裂解的细胞的转录和翻译装置进行。纯化后，细胞裂解物不含宿主DNA，并且能够通过外部添加DNA来表达期望的蛋白质。甚至可以同时合成多种蛋白质或代谢物(Garamella等人2016)。许多无细胞表达系统可用，其组成可能有很大差异。所谓的“PURE系统”(Shimizu等人2001)由纯化的蛋白质组成，而大肠杆菌的粗细胞提取物包含几乎所有的细胞内蛋白质，包括对于表达不需要的那些(Sun等人2013)。在这种粗细胞提取物中，已经表明可以表达感染性野生型噬菌体(Shin等人2012)以及蛋白质(Garamella等人2016)。

然而，基于噬菌体的治疗剂和诊断剂的开发和生产目前仍受到噬菌体修饰困难的阻碍。例如，遗传修饰可以增加噬菌体的宿主范围(Brown等人2017)，提高细菌生物膜的分辨率(Lu and Collins 2007)，或引入用于诊断目的的标记蛋白(Hagens and Loessner2014)。用于噬菌体修饰的经典方法是“基因组编辑”，其通常通过在宿主细菌中同源重组进行。为此，需要插入具有两个同源DNA序列的DNA片段，待插入的DNA序列位于它们之间。由于有时非常短的感染时间和其它限制，只有很小一部分噬菌体发生改变——重组率仅在10^-10和10^-4之间——这使得对噬菌体进行广泛筛选是必要的(Pires等人2016)。这种方法可以通过分子生物学方法进一步优化，例如攻击未修饰的噬菌体的I-E型CRISPR-Cas系统。然而，由于缺乏实验方法，将质粒或DNA片段引入宿主细菌中并不总是可能的(Kiro等人2014)。噬菌体修饰的复杂性主要是由于改变噬菌体基因组的难度。修饰噬菌体的另一种可能性是在噬菌体的基因缺失后添加相应的蛋白质。这仅适用于有限数量的衣壳蛋白，因为噬菌体仍然需要在细菌中组装。

发明内容

因此，需要一种快速且不太费力的通用方法来修饰噬菌体，而不修饰噬菌体的基因组。

为了解决这个问题，本发明人建立了一种体外表达系统，其中来自噬菌体的天然基因组的表达受到抑制。

因此，本发明的第一方面涉及用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，包括以下步骤：

-将微生物的细胞裂解物与噬菌体的基因组接触，

-通过添加特异性抑制至少一种目的基因的内源形式的表达的分子来抑制由所述噬菌体的基因组编码的所述至少一种目的基因的表达。

因此，对于所描述的方法，不需要修饰噬菌体的基因组。换句话说，本发明涉及用于产生在蛋白质组水平而非基因组水平包含修饰的噬菌体的方法、组合物和试剂盒。

由此产生的噬菌体并不代表遗传修饰生物体(GMO)，这是非常有利的，因为其可以避免这样的噬菌体用于治疗目的的批准过程中的障碍。此外，通过提供的方法获得的噬菌体可以安全地释放到环境中，因为它们的修饰不会传递给下一代噬菌体。此外，无细胞系统中的基因表达避免了对噬菌体基因组进行繁琐的遗传修饰。

如本文所用，产生“修饰的噬菌体”是指其中至少一种目的基因被抑制(也称为敲低)的噬菌体。因此，噬菌体的修饰包括至少蛋白质的敲低(没有修饰的蛋白质的额外表达)。在一个实施方案中，术语“修饰的噬菌体”是指其中至少一种目的基因被抑制的噬菌体。在一个实施方案中，术语“修饰的噬菌体”是指一种目的基因被抑制的噬菌体。

这样的修饰的噬菌体可用于确定被抑制的噬菌体蛋白质的功能。多种常用的酶来源于噬菌体，例如T4连接酶或多种RNA聚合酶。因此，本方法允许基于敲低和功能测定来表征噬菌体蛋白质。或者，可以以改变宿主特异性的方式修饰噬菌体。噬菌体可以包含不同的蛋白质，每种蛋白质都允许识别不同的宿主。当敲低这些蛋白质之一时，相应的宿主就不能再被感染。

在具体的实施方案中，修饰包括至少一种蛋白质的敲低和修饰的蛋白质的表达，特别是原始形式被抑制的至少一种蛋白质的修饰形式的表达。

因此，在一个具体实施方案中，该方法还包括通过添加编码目的基因的修饰形式的分子来表达至少一种目的基因的修饰形式的步骤。或者或此外，该方法可包括添加由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质的步骤。

因此，在一些实施方案中，产生了具有未修饰的基因组但包含修饰的噬菌体蛋白质的噬菌体。

通常，特异性抑制内源形式的表达的分子抑制目的基因的转录或翻译。编码目的基因的修饰形式的分子可以是核酸分子，例如DNA或RNA分子。在优选的实施方案中，DNA是质粒或PCR产物的形式。

在具体实施方案中，特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子是与目的基因的内源形式的序列互补的DNA分子。例如，特异性抑制内源形式的表达的分子与目的基因的核糖体结合位点结合。

在示例性实施方案中，目的基因编码高免疫原性外衣壳蛋白(HOC)。HOC蛋白可以具有在SEQ ID NO:1中示出的序列。还考虑了具有与SEQ ID NO:1至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％相同序列的序列。

氨基酸序列HOC(SEQ ID NO:1；*代表序列的终止密码子/末端)：

MTFTVDITPKTPTGVIDETKQFTATPSGQTGGGTITYAWSVDNVPQDGAEATFSYVLKGPAGQKTIKVVATNTLSEGGPETAEATTTITVKNKTQTTTLAVTPASPAAGVIGTPVQFTAALASQPDGASATYQWYVDDSQVGGETNSTFSYTPTTSGVKRIKCVAQVTATDYDALSVTSNEVSLTVNKKTMNPQVTLTPPSINVQQDASATFTANVTGAPEEAQITYSWKKDSSPVEGSTNVYTVDTSSVGSQTIEVTATVTAADYNPVTVTKTGNVTVTAKVAPEPEGELPYVHPLPHRSSAYIWCGWWVMDEIQKMTEEGKDWKTDDPDSKYYLHRYTLQKMMKDYPEVDVQESRNGYIIHKTALETGIIYTYP*

修饰的噬菌体蛋白质可以包含选自由以下组成的组的修饰：亲和标签、检测标记、用于改进噬菌体或突变的蛋白质或其组合。例如，修饰的噬菌体蛋白质可以表达黄色荧光蛋白和聚组氨酸标签。这样的标签可以允许噬菌体的纯化和/或检测。

用于改进噬菌体的蛋白质可以是生物膜降解酶。在一个实施方案中，生物膜降解酶是糖苷水解酶，例如DspB。这种生物膜降解酶增加了对生物膜形成细菌的接近。

在另一个实施方案中，修饰的噬菌体蛋白质包含酶，例如萤光素酶。相应修饰的噬菌体可用于检测食品中细菌(例如李斯特菌)的方法。有利地，这种方法将允许通过简单的萤光素酶测定容易且快速地检测活细菌。

修饰的噬菌体蛋白质例如尾蛋白、刺突蛋白、纤维蛋白或底板蛋白也可允许感染与噬菌体原始宿主不同的宿主。

本发明的另外方面涉及用于生产噬菌体的组合物和试剂盒，包含：

-微生物的细胞裂解物，

-所述噬菌体的基因组，

-特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子。在优选的实施方案中，噬菌体的基因组未被修饰。

组合物和试剂盒还可包含：

-编码目的基因的修饰形式的分子，和/或

-由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

本发明的另一方面涉及通过本发明的方法获得的噬菌体。本发明的另一方面涉及一种噬菌体，包含

-未修饰的基因组，

-修饰的噬菌体蛋白质。

其它方面涉及所述的噬菌体用作药物使用，例如用于治疗受试者的细菌感染。

本发明还考虑了所述的噬菌体用于避免食品或饮料的细菌生长、农业和用于检测用于检测特定微生物的用途。

附图说明

图1：用于生产不含基因组修饰的修饰的噬菌体的方法的图形概述，包括编码噬菌体的DNA(DNA)、应并入的成分(额外成分)和调节所选蛋白质的转录/翻译的成分(调节成分)。

图2：噬菌体T4的结构模型(左上)，其具有与Hoc融合的修饰(YFP)(右上)。通过His标签和尺寸排阻色谱法纯化的His-YFP-Hoc蛋白的多种级分的12％SDS凝胶(底部)。

图3：无细胞反应中报告蛋白荧光的终末水平的开/关比例，依赖于与编码报告蛋白的mRNA的核糖体结合位点互补的单链DNA链的添加浓度。单链DNA链的序列是AGACATCTAGTtttctcctctttCTCATGATTAAACAAAATTATTTGTAGAGGCGCTTTC(SEQ ID NO:2)。

图4：依赖于与编码主要衣壳蛋白的mRNA的核糖体结合位点互补的添加的单链DNA链的噬菌体表达后无细胞反应中的噬菌体滴度。单链DNA链的序列是AGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGAAACCGTTG(SEQ ID NO:3)。

图5：斑点测定的结果：点1：来自无细胞反应的未纯化的T7噬菌体，点2：His-Tag柱的第一流通，点3：第一洗涤步骤的流通，点4：第二洗涤步骤的流通，点5：第三洗涤步骤的流通，点6：第四洗涤步骤的流通，点7：第五洗涤步骤的流通，点8：第六洗涤步骤的流通，点9：洗脱的流通，点10：来自T7噬菌体原液的阳性对照和点11：阴性对照(洗脱缓冲液)。

具体实施方式

在关于本发明的一些优选实施方案详细描述本发明之前，提供以下一般定义。

以下示例性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。

将关于特定实施方案并参考某些图来描述本发明，但本发明不限于此，而仅由权利要求限制。

在本说明书和权利要求中使用术语“包括/包含”时，不排除其它要素。出于本发明的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包含至少一定数量的实施方案，则这也应理解为公开了优选地仅由这些实施方案组成的组。

当指代单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“a”、“an”或“the”，除非另有说明，否则包括该名词的复数形式。本发明上下文中的术语“约”或“大约”表示本领域技术人员将理解的仍能确保所讨论特征的技术效果的准确度的区间。该术语通常表示与指示数值±10％、优选±5％的偏差。

技术术语按其常识使用。如果向某些术语传达特定含义，则在下文中将在使用这些术语的上下文中给出术语的定义。

本发明的第一方面涉及用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，包括以下步骤：

-将微生物的细胞裂解物与噬菌体的基因组接触，

-通过添加特异性抑制至少一种目的基因的内源形式的表达的分子来抑制由所述噬菌体的基因组编码的所述至少一种目的基因的表达。

因此，通过该方法生产的噬菌体的基因组在生产方法过程中没有被修饰。因此，目的基因的修饰形式将不会传递到在本发明的方法之后(例如在宿主生物中)可能发生的复制循环。因此，通过本发明的方法产生的噬菌体不同于通过噬菌体基因组的经典修饰产生的噬菌体，后者随着所有随后的复制循环将修饰传递。因此，通过其基因组修饰产生的噬菌体受到高安全标准的限制。相反，通过本发明的方法得到的噬菌体不受高安全标准的限制。

在一个实施方案中，目的基因是非必需基因。非必需基因是对噬菌体复制和/或噬菌体组装不是必需的基因。噬菌体基因组得到了很好的表征，并且有多种方法可以进行这样的表征(Studier 1972,Studier 1973,McNair等人2019)。

噬菌体是感染细菌或古细菌的病毒。其由封装DNA或RNA基因组的衣壳蛋白构成。在它们的基因组感染到细胞质中后，噬菌体利用细菌的转录和翻译装置在微生物中复制。国际病毒分类委员会(international Committee on Taxonomy of Viruses)根据形态学和核酸对噬菌体进行分类，包括Ackermannviridae、肌病毒科(Myoviridae)、长尾病毒科(Siphoviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、瓶形噬菌体科(Ampullaviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、卡氏噬菌体科(Clavaviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、轻小噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、多态形病毒科(Pleolipoviridae)、带球病毒科(Portogloboviridae)、Spharolipoviridae、Spiraviridae、复层噬菌体科(Tectiviridae)、Tristromaviridae、Turriviridae。

如本文所用，术语“细胞裂解物”是指包含裂解后的微生物、特别是细菌的细胞组分的组合物。因此细胞裂解物不含完整细胞，即无细胞。通常，细胞裂解物不含宿主DNA。优选地，细胞裂解物不含宿主DNA和细胞膜。此外，细胞裂解物可以不含小代谢物。细胞裂解物包含不同于噬菌体宿主的生物体的转录和翻译机器。在一些实施方案中，术语“不含”还包括“基本上不含”。

优选地，细胞裂解物是大肠杆菌(E.coli)裂解物。更优选地，细胞裂解物是大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)细胞裂解物。

术语“微生物”是指细菌或古细菌。优选地，微生物是细菌。

在优选的实施方案中，该方法还包括通过添加编码目的基因的修饰形式的分子来表达至少一种目的基因的修饰形式的步骤。编码目的基因的修饰形式的分子可以是核苷酸序列，特别是DNA或RNA序列。优选地，编码目的基因的修饰形式的分子可以是DNA序列，例如质粒DNA。

或者或此外，该方法还包括添加由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质的步骤。修饰的噬菌体蛋白质可以在噬菌体组装期间存在。

在一个实施方案中，目的基因是非必需基因。在另一个实施方案中，目的基因是必需基因，例如负责衣壳或一种尾纤维蛋白的基因中的一种，并且方法还包括添加必需基因的修饰形式的步骤。在又一个实施方案中，目的基因是必需基因，并且该方法还包括添加对应于必需基因的蛋白质的修饰形式的步骤。

优选地，与细胞裂解物接触的噬菌体的基因组未被修饰。换言之，噬菌体的基因组是天然基因组，即从自然栖息地分离的基因组。这意味着在生产修饰的细菌的方法之前和过程中，噬菌体的基因组没有被修饰，即没有基因组修饰的主动步骤，例如基因缺失、核苷酸的添加、核苷酸的缺失或核苷酸的交换。技术人员理解可以发生噬菌体基因组的自发修饰。

在优选的实施方案中，目的基因编码噬菌体的衣壳蛋白或尾纤维蛋白。

特异性抑制内源形式的表达的分子(即表达抑制剂)可以抑制目的基因的转录或翻译。例如，表达抑制剂可以与目的基因的核糖体结合位点结合，从而抑制目的基因的翻译。如果抑制目的基因的转录或翻译，表达抑制剂可以是与位点特异性结合的核苷酸序列、其合成类似物、肽或小分子。

通常，编码目的基因的修饰形式的分子是核酸分子，例如DNA或RNA分子。

优选地，特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子是核苷酸分子，更优选地是与目的基因的内源形式的序列互补的DNA分子。DNA可以例如以质粒或PCR产物的形式提供。

在示例性实施方案中，目的基因编码高免疫原性外衣壳蛋白(HOC)。

修饰的表达产物可包含亲和标签、检测标记、用于改进噬菌体或突变的蛋白质或其组合。检测标记可以是荧光蛋白，例如黄色荧光蛋白(YFP)。例如，修饰的噬菌体蛋白质表达黄色荧光蛋白和聚组氨酸标签。

该方法可用于产生广泛的噬菌体。噬菌体可选自由以下组成的组的科：Ackermannviridae、肌病毒科(Myoviridae)、长尾病毒科(Siphoviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、瓶形噬菌体科(Ampullaviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、卡氏噬菌体科(Clavaviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、轻小噬菌体科(Leviviridae)、微小噬茵体科(Microviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、多态形病毒科(Pleolipoviridae)、带球病毒科(Portogloboviridae)、Spharolipoviridae、Spiraviridae、复层噬菌体科(Tectiviridae)、Tristromaviridae和Turriviridae。在一个优选的实施方案中，噬菌体来自肌病毒科，更优选来自Tevenvirinae亚科，甚至更优选T4病毒，也称为T偶数噬菌体(包括肠杆菌噬菌体T2、肠杆菌噬菌体T4、肠杆菌噬菌体T6)，最优选地噬菌体是埃希氏菌病毒T4。

噬菌体的基因组可以以分离的天然DNA、合成的DNA、噬菌体基因组的PCR产物或酵母人工染色体的形式提供。

该方法还可包括添加小代谢物和/或缓冲液。

本发明的另一方面涉及用于生产噬菌体的组合物，其包含：

-微生物的细胞裂解物，

-所述噬菌体的基因组，

-特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子。

该组合物可以任选地包含：

-编码目的基因的修饰形式的分子，和/或

-由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

在这种无细胞提取物中，噬菌体可以通过使用为提取物来源的微生物的转录和翻译机器来产生。

通常提取物来源于细菌宿主或相应地被修饰。

本发明的另一方面涉及如本文所述的组合物，其中噬菌体的基因组未被修饰。

本发明的另一方面涉及用于生产噬菌体的试剂盒，其包含：

-微生物的细胞裂解物，

-所述噬菌体的基因组，

-特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子。

任选地，该试剂盒还包含

-编码目的基因的修饰形式的分子，和/或

-由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

本发明的另一方面涉及一种噬菌体，其包含

-未修饰的基因组，

-修饰的噬菌体蛋白质。

换言之，本发明涉及在蛋白质组水平被修饰但在基因组水平没有修饰的噬菌体。修饰的噬菌体蛋白质质包括，噬菌体不含通常存在于噬菌体的未修饰形式中的目的蛋白质，并且任选地噬菌体表达目的蛋白质的修饰形式。

本发明的另一方面涉及通过如本文所述的方法获得的噬菌体。本发明的另一方面涉及如本文所述的噬菌体用作药物使用，例如用于在治疗受试者的细菌感染中使用。

本发明的其他方面涉及如本文所述的噬菌体用于避免食物或饮料中的细菌生长和/或用于检测特定微生物的用途。

实验

实施例：

质粒制备：

表3：用于克隆和Sanger测序的引物的列表

克隆

所有列出的寡核苷酸都是用Benchling(USA)设计的。二级结构预测使用Mfold(USA)进行。所有PCR均使用Q5 High-Fidelity 2x Master Mix kit(NEB,USA)根据表4和5利用来自表3的引物制备。PCR设置使用NEB Tm calculator(NEB,USA)进行计算。HOC编码序列在编码YFP的表达载体(psbic3)中从T4噬菌体(表2)中克隆。YFP HOC的融合通过突出端PCR用Histag延伸。对于转化、质粒扩增、蛋白质表达和T4增殖，使用表1中的大肠杆菌细胞。

DNA制备：

从先前制备的滴度高于10⁸PFU/ml的噬菌体原液形式中通过苯酚-氯仿提取，然后乙醇沉淀纯化噬菌体DNA。将浓度调节至约5nM，其通过在260nm处的吸附确定。

细胞提取物制备：

为了产生粗S30细胞提取物，如Sun等人(doi:10.3791/50762)所述，在Minilys匀浆器(Peqlab,德国)中用0.1mm玻璃珠对BL21-Rosetta 2(DE3)对数中期培养物进行珠磨。将提取物在37℃下孵育80分钟以消化基因组DNA，然后在4℃下以10kDa的截止值进行透析(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes,Thermo Fisher Scientific)。以Bradford测定法估计蛋白质浓度为30mg/mL。复合缓冲液含有50mM Hepes(pH 8)、5.5mM ATP和GTP、0.9mMCTP和UTP、0.5mM dNTP、0.2mg/mL tRNA、26mM辅酶A、0.33mM NAD、0.75mM cAMP、68mM亚叶酸、1mM亚精胺、30mM PEP、1mM DTT和4.5％PEG-8000。使用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)代替3-磷酸甘油酸(3-PGA)作为该缓冲液中的能源。所有组分在使用前都储存在-80℃。单个无细胞反应由42％(v/v)复合缓冲液、25％(v/v)DNA加添加剂和33％(v/v)S30细胞提取物组成。对于ATP再生，将13.3mM麦芽糖，针对DNA降解添加，3.75nM GamS和1U T7 RNA聚合酶(NEB,M0251S)添加到反应混合物中。

噬菌体表达：

对于噬菌体表达，添加1nM噬菌体基因组和在T7启动子调节下编码目标蛋白质的1nM质粒。将样品在29℃下孵育。

结果

为了生产表达修饰的高免疫原性外衣壳蛋白(HOC蛋白)而不进行基因组修饰的修饰的T4噬菌体，需要修饰的蛋白质，例如在质粒上或纯化的。高免疫原性外衣壳蛋白(HOC蛋白)与质粒上的多组氨酸标记的黄色荧光蛋白融合。除了噬菌体DNA，还可以进一步共表达质粒或将期望蛋白质直接添加到源自大肠杆菌的无细胞表达系统中(额外成分)。为了减少来自噬菌体基因组的天然蛋白质的翻译，添加了调节成分DNAi(图1)。在这种情况下，修饰的HOC用镍色谱法接着用尺寸排阻色谱法纯化(图2)。DNAi的影响通过根据DNAi浓度的T7启动子下荧光团YPet的翻译的减少来显示(图3)。还测量了依赖于DNAi浓度的噬菌体体外表达的减少。此处主要衣壳蛋白的翻译被与核糖体结合位点互补的单链DNA抑制(图4)。

使用DNAi的瞬时修饰

对于瞬时修饰，通过添加0.2nM的编码T7噬菌体G10B的主要衣壳蛋白以及3xGS接头、HiBiT-Tag和6xHis-Tag的质粒(MLGVASTVAASPEEASVTSTEETLTPAQEAARTRAANKARKEAELAAATAEQGSGSGSVSGWRLFKKISHHHHHH)如前组装T7噬菌体。为了减少来自噬菌体基因组的天然G10B蛋白的翻译，添加了调节性成分DNAi。

HisTag纯化：

组装后，将噬菌体以1x PBS和20mM咪唑稀释至10⁶PFU/mL。然后将噬菌体悬浮液施加到Ni-NTA琼脂糖珠上，该珠已经用含有1x PBS和20mM咪唑的洗涤缓冲液预平衡。随后用6个柱体积的1x PBS和20mM咪唑洗涤柱。在用斑点测定法检测滴度之前，用一个柱体积的1xPBS和250mM咪唑洗脱噬菌体。

斑点测定：

对于斑点测定，将0.5％琼脂糖NZCYM培养基熔化并储存在48℃的水浴中。将100μL相应宿主细菌的过夜培养物用4ml琼脂铺板。悬浮液在室温下固化后，加入样品并将板在37℃下孵育，直到噬斑变得可见(图5)。

本申请还包含以下条目：

条目1.用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，包括以下步骤：

-将微生物的细胞裂解物与噬菌体的基因组接触，

-通过添加特异性抑制至少一种目的基因的内源形式的表达的分子来抑制由所述噬菌体的基因组编码的所述至少一种目的基因的表达。

条目2.根据条目1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤

-通过添加编码所述目的基因的修饰形式的分子来表达所述至少一种目的基因的修饰形式。

条目3.根据条目1或2所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤

-添加由所述至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

条目4.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述噬菌体的基因组未被修饰。

条目5.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述目的基因编码所述噬菌体的衣壳蛋白或尾纤维蛋白。

条目6.根据前述条目中任一项所述的方法，其中特异性抑制所述内源形式的表达的分子抑制所述目的基因的转录或翻译。

条目7.根据前述条目中任一项所述的方法，其中特异性抑制所述内源形式的表达的分子与所述目的基因的核糖体结合位点结合。

条目8.根据前述条目中任一项所述的方法，其中编码所述目的基因的修饰形式的分子是核酸分子。

条目9.根据前述条目中任一项所述的方法，其中编码所述目的基因的修饰形式的分子是DNA或RNA分子。

条目10.根据前述条目中任一项所述的方法，其中特异性抑制所述目的基因的内源形式的表达的分子是与所述目的基因的内源形式的序列互补的核酸分子。

条目11.根据条目10所述的方法，其中所述核酸分子是DNA，优选为质粒或PCR产物的形式。

条目12.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述目的基因编码高免疫原性外衣壳蛋白(HOC)。

条目13.根据前述条目中任一项所述的方法，其中修饰的噬菌体蛋白质包含选自由以下组成的组的修饰：亲和标签、检测标记、用于改进所述噬菌体或突变的蛋白质或其组合。

条目14.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述修饰的噬菌体蛋白质表达黄色荧光蛋白和聚组氨酸标签。

条目15.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述噬菌体是肌尾噬菌体(Myoviridae)科、优选Tevenvirinae亚科的噬菌体，甚至更优选T4病毒，最优选地所述噬菌体是埃希氏菌病毒T4。

条目16.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述噬菌体的基因组以分离的天然DNA、合成的DNA、噬菌体基因组的PCR产物或酵母人工染色体的形式提供。

条目17.根据前述条目中任一项所述的方法，其中所述方法还包括添加小代谢物。

条目18.用于生产噬菌体的组合物，包含：

-微生物的细胞裂解物，

-所述噬菌体的基因组，

-特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子。

条目19.根据条目18所述的组合物，其中所述噬菌体的基因组未被修饰。

条目20.根据条目18或19所述的组合物，其中所述组合物还包含

-编码目的基因的修饰形式的分子，和/或

-由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

条目21.用于生产噬菌体的试剂盒，包含：

-微生物的细胞裂解物，

-所述噬菌体的基因组，和/或

-特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子。

条目22.根据条目22所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含

-编码目的基因的修饰形式的分子，和/或

-由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

条目23.噬菌体，包含

-未修饰的基因组，

-修饰的噬菌体蛋白质。

条目24.通过根据条目1和17所述的方法获得的噬菌体。

条目25.条目23和24所述的噬菌体用作药物使用。

条目26.条目23和24所述的噬菌体用于在治疗受试者的细菌感染中使用。

条目27.条目23和24所述的噬菌体用于避免食物或饮料中细菌生长的用途。

条目28.条目23和24所述的噬菌体用于检测特定微生物的用途。

条目29.在无细胞表达系统中生产修饰噬菌体的方法，包括以下步骤：

-将微生物的细胞裂解物与噬菌体的基因组接触，

-通过添加特异性抑制至少一种目的基因的内源形式的表达的分子来抑制由所述噬菌体的基因组编码的所述至少一种目的基因的表达，其中所述目的基因是非必需基因。

条目30.在无细胞表达系统中生产修饰噬菌体的方法，包括以下步骤：

-将微生物的细胞裂解物与噬菌体的基因组接触，

-通过添加特异性抑制至少一种目的基因的内源形式的表达的分子来抑制由所述噬菌体的基因组编码的所述至少一种目的基因的表达，其中所述目的基因是必需基因。

条目31.根据条目30所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤

-通过添加编码所述目的基因的修饰形式的分子来表达所述至少一种目的基因的修饰形式。

条目32.根据条目30所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤

-添加由所述至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

参考文献

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Rustad Cell-free TXTL synthesis of infectious bacteriophage T4 in asingle test tube reaction Synthetic Biology,Volume 3,Issue 1.

序列表

<110> 慕尼黑科技大学

<120> 用于生产不含基因组修饰的修饰的噬菌体的方法

<130> T08387WO

<150> 19187079.4

<151> 20190718

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 376

<212> PRT

<213> 噬菌体T4

<400> 1

Met Thr Phe Thr Val Asp Ile Thr Pro Lys Thr Pro Thr Gly Val Ile

1 5 10 15

Asp Glu Thr Lys Gln Phe Thr Ala Thr Pro Ser Gly Gln Thr Gly Gly

20 25 30

Gly Thr Ile Thr Tyr Ala Trp Ser Val Asp Asn Val Pro Gln Asp Gly

35 40 45

Ala Glu Ala Thr Phe Ser Tyr Val Leu Lys Gly Pro Ala Gly Gln Lys

50 55 60

Thr Ile Lys Val Val Ala Thr Asn Thr Leu Ser Glu Gly Gly Pro Glu

65 70 75 80

Thr Ala Glu Ala Thr Thr Thr Ile Thr Val Lys Asn Lys Thr Gln Thr

85 90 95

Thr Thr Leu Ala Val Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ala Gly Val Ile Gly

100 105 110

Thr Pro Val Gln Phe Thr Ala Ala Leu Ala Ser Gln Pro Asp Gly Ala

115 120 125

Ser Ala Thr Tyr Gln Trp Tyr Val Asp Asp Ser Gln Val Gly Gly Glu

130 135 140

Thr Asn Ser Thr Phe Ser Tyr Thr Pro Thr Thr Ser Gly Val Lys Arg

145 150 155 160

Ile Lys Cys Val Ala Gln Val Thr Ala Thr Asp Tyr Asp Ala Leu Ser

165 170 175

Val Thr Ser Asn Glu Val Ser Leu Thr Val Asn Lys Lys Thr Met Asn

180 185 190

Pro Gln Val Thr Leu Thr Pro Pro Ser Ile Asn Val Gln Gln Asp Ala

195 200 205

Ser Ala Thr Phe Thr Ala Asn Val Thr Gly Ala Pro Glu Glu Ala Gln

210 215 220

Ile Thr Tyr Ser Trp Lys Lys Asp Ser Ser Pro Val Glu Gly Ser Thr

225 230 235 240

Asn Val Tyr Thr Val Asp Thr Ser Ser Val Gly Ser Gln Thr Ile Glu

245 250 255

Val Thr Ala Thr Val Thr Ala Ala Asp Tyr Asn Pro Val Thr Val Thr

260 265 270

Lys Thr Gly Asn Val Thr Val Thr Ala Lys Val Ala Pro Glu Pro Glu

275 280 285

Gly Glu Leu Pro Tyr Val His Pro Leu Pro His Arg Ser Ser Ala Tyr

290 295 300

Ile Trp Cys Gly Trp Trp Val Met Asp Glu Ile Gln Lys Met Thr Glu

305 310 315 320

Glu Gly Lys Asp Trp Lys Thr Asp Asp Pro Asp Ser Lys Tyr Tyr Leu

325 330 335

His Arg Tyr Thr Leu Gln Lys Met Met Lys Asp Tyr Pro Glu Val Asp

340 345 350

Val Gln Glu Ser Arg Asn Gly Tyr Ile Ile His Lys Thr Ala Leu Glu

355 360 365

Thr Gly Ile Ile Tyr Thr Tyr Pro

370 375

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与编码报告蛋白的mRNA的核糖体结合位点互补

<400> 2

agacatctag ttttctcctc tttctcatga ttaaacaaaa ttatttgtag aggcgctttc 60

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与编码主要衣壳蛋白的mRNA的核糖体结合位点互补

<400> 3

agccatatgt atatctcctt cttaaagtta aacaaaatta tttctagagg gaaaccgttg 60

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T4_f_左

<400> 4

aattttcctt attaggccgc aagggccttc atagttttag cg 42

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T4_r_右

<400> 5

atgtacaata ttaaatgcct gaccaaaaac gaacaagctg 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSB1C3_T7_YPET_FWD

<400> 6

atatcaactg taaaagtcat acgacccagc ggcaccaggt 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pSB1C3_T7_YPET_REV

<400> 7

tcatctatac ctatccataa agcatgccgg aggaaacaca 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HOC_YPET_FWD

<400> 8

acctggtgcc gctgggtcgt atgactttta cagttgatat 40

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HOC_YPED_REV

<400> 9

gtttcctccg gcatgcttta tggataggta tagatg 36

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> His_前_YFP_R3

<400> 10

gaaagaggag aaaactagat gcatcatcac 30

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> His_前_YFP_F2

<400> 11

catcaccact ctaaaggtga agaactgttt acg 33

Claims (16)

1.用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，包括以下步骤：

-将微生物的细胞裂解物与噬菌体的基因组接触，

-通过添加特异性抑制至少一种目的基因的内源形式的表达的分子来抑制由所述噬菌体的所述基因组编码的所述至少一种目的基因的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤

-通过添加编码所述目的基因的修饰形式的分子来表达所述至少一种目的基因的修饰形式。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤

-添加由所述至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目的基因是必需基因或非必需基因。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述噬菌体的所述基因组未被修饰。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目的基因编码所述噬菌体的衣壳蛋白或尾纤维蛋白，优选地其中所述目的基因编码高免疫原性外衣壳蛋白(HOC)。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中修饰的噬菌体蛋白质包含选自由以下组成的组的修饰：亲和标签、检测标记、用于改进所述噬菌体或突变的蛋白质或其组合。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述噬菌体是肌尾噬菌体(Myoviridae)科、优选Tevenvirinae亚科的噬菌体，甚至更优选T4病毒，最优选地所述噬菌体是埃希氏菌病毒T4。

9.用于生产噬菌体的组合物，包含：

-微生物的细胞裂解物，

-所述噬菌体的基因组，

-特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子，

-任选的编码所述目的基因的修饰形式的分子，和

-任选的由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

10.用于生产噬菌体的试剂盒，包含：

-微生物的细胞裂解物，

-所述噬菌体的基因组，

-特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子，

-任选的编码所述目的基因的修饰形式的分子，和/或

-任选的由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。

11.噬菌体，包含

-未修饰的基因组，

-修饰的噬菌体蛋白质。

12.通过根据权利要求1至8所述的方法获得的噬菌体。

13.权利要求11和12所述的噬菌体用作药物使用。

14.权利要求11和12所述的噬菌体用于在治疗受试者的细菌感染中使用。

15.权利要求11和12所述的噬菌体用于避免食物或饮料中细菌生长的用途。

16.权利要求11和12所述的噬菌体用于检测特定微生物的用途。

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