CN114127055A - 针对mcr菌株的新抗生素和抗生素佐剂的分子设计 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含疏水部分、接头和含N部分的化合物。本发明还涉及合成该化合物的方法和该化合物作为抗生素或抗生素佐剂的用途。

Description

针对MCR菌株的新抗生素和抗生素佐剂的分子设计
技术领域
本发明涉及包含疏水部分、接头和含N部分的化合物。本发明还涉及合成该化合物的方法和该化合物作为抗生素或抗生素佐剂的用途。
背景技术
由于产生碳青霉烯酶的肠杆菌科(Enterobacteriacae)细菌的不断出现，特别是具有赋予青霉烯类抗生素抗性的KPC-2和NDM1基因的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株的不断出现，进一步恶化了越来越多的关于病原体对现有抗生素抗性水平升高的报告加剧的卫生保健危机。这些患者的治疗选项是有限的，黏菌素已成为最后手段的重要抗生素。黏菌素是关键的“最后手段”抗生素，因为它破坏了外膜的分子组织，使其向内膜扩散，在那里它破坏了结构，通过使水进入细菌并失去跨膜电位(trans-membrane potential)来杀灭细菌。由于这种作用方式，黏菌素避免了由基因突变引起的大多数类型的抗性。如图1所示，革兰氏阴性细菌的外膜被脂多糖(LPS)覆盖，LPS锚定在形成LPS结构基座的脂质A中，这对于稳定外膜至关重要。黏菌素是一种肽，也称为多黏菌素E，是包括多黏菌素B在内的阳离子多黏菌素家族的成员。该家族的分子通过破坏外膜的脂质A部分随后破坏内膜，然后水进入细菌，从而裂解该生物体，来杀灭革兰氏阴性细菌。
黏菌素对革兰氏阴性细菌具有广泛的活性，但由于严重的副作用、肾毒性和神经毒性而很少使用。由于这些副作用，2μg/ml通常视为出现抗性的断点。相比之下，在美国和中国，它广泛用于鸡和肉牛农业。然而，黏菌素抗性最近以与E.coli相关的运动或移动质粒的形式出现，该质粒2015年在中国西北部的猪中发现。已记录的携带mcr-1的E.coli的传播移动黏菌素抗性(mobile colistin resistance,MCR)表明，截止到2015年，mcr-1出现在包括美国在内的10个国家/地区。现在已经在许多革兰氏阴性病原体中发现了MCR-1抗性，包括E.coli、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌和鲍曼不动杆菌，这对这些感染的治疗提出了巨大挑战，特别是因为该性状赋予对当前抗微生物剂、尤其是对碳青霉烯类的高抗生素抗性倾向。此外，目前已有30多个国家/地区记录了MCR-1抗性。
此外，由于MCR基因经由质粒介导的机制转移，不同细菌菌株之间容易发生横向传播，预计情况会进一步恶化。最近，还鉴别了其他三种突变，即MCR-2、MCR-3和MCR-4。然而，迄今为止，作用机制一直是将磷酸乙醇胺连接到脂质A上的脂质A修饰(图2)。因此，迫切需要解决MCR基因赋予的抗性的策略。特别受影响的是对其他抗生素不敏感的具有碳青霉烯酶抗性细菌的患者。
因此，需要至少部分改善上述缺点的解决mcr-1抗性的新方法。
发明概述
已经开发了用于设计针对MCR菌株(包括MCR-1、MCR-2、MCR-3和MCR-4)的新抗生素或抗生素佐剂的新方法。设计了扰乱MCR修饰的外膜氢键合网络的分子文库。该方法结合了一种可大大加快开发时间，同时降低新抗微生物治疗剂成本的新的计算机建模方法。该方法将计算机设计与治疗MCR感染效果的实验室验证和体内测试进行了比较。
该设计方法基于片段基药物策略，包括四个步骤：(i)用于靶标鉴别的计算机建模，(ii)配体设计，(iii)合成和(iv)生物学验证。通过一轮或多轮优化，揭示了一种或多种先导化合物。对于革兰氏阴性细菌的MCR阳性菌株，确定了两个靶标：MCR-1蛋白的活性部位和外膜的氢键合网络。基于详细的原子分析，设计了使具有mcr-1质粒的E.coli的外膜不稳定的化合物文库，这克服耐药性并杀灭细菌。从文库中选择了几种化合物，并测试了它们的MIC以及它们与黏菌素的协同活性。其中一种化合物即GLA-DPA对一组临床分离的黏菌素抗性细菌显示出有限的抗微生物活性。然而，据证明，GLA-DPA当与黏菌素组合时可以恢复具有mcr-1的E.coli对黏菌素的敏感性。因此，当与所公开的化合物组合时，黏菌素的有效剂量可以降低至避免毒性的水平。
一方面，提供了具有下式(I)的化合物：
Z1-L1-A-L2-Z2 式(I)
其中A是疏水部分；
L1和L2独立地是接头；且
Z1和Z2独立地是含N部分。
有利的是，该化合物可以具有与细菌膜相互作用并破坏细菌膜的合适结构。换而言之，该化合物可以具有两个与细菌膜相互作用的头基区域和与细菌膜脂质成分相互作用的疏水部分。该化合物可以具有使其能够跨越细菌膜脂双层合适的尺寸。有利的是，头基可以包含N-原子，从而具有高pKa值。更有利的是，疏水部分可以很大。更有利的是，疏水部分可以是平面的。总之，该化合物的成分可以赋予该化合物高膜相互作用和抗微生物特性。
有利的是，含氮部分、胍、锌螯合络合物都具有相同特征，即与细菌膜中的磷酸基团具有高亲和力。式(I)化合物的端基(Z1或Z2)与膜的磷酸基团之间的强相互作用导致大的膜扰乱。
有利的是，含N部分可以破坏稳定细菌膜的静电相互作用(例如，氢键合网络)。有利的是，这可以导致细菌细胞杀灭。或者，氢键合网络的破坏可以促进诸如黏菌素等其他抗生素有效发挥作用，从而杀灭细菌细胞。即使细菌对黏菌素具有抗性，黏菌素也可与脂质A相互作用，并且外膜的微小扰动可使式(I)化合物与黏菌素一起进入脂质A朝向内膜的结构，导致内膜的致命破坏和细菌杀灭。
式(I)的化合物单独或与黏菌素共施用时可有效杀灭革兰氏阳性细菌。式(I)的化合物单独或与黏菌素共施用时可以有效杀灭为MCR阳性的革兰氏阴性细菌。在这种情况下，含N部分可以与锌螯合，锌因此可以与锌依赖性MCR结合并破坏其活性。当与黏菌素共施用时，式(I)的化合物还可以有效杀灭为MCR阴性但仍对黏菌素具有抗性的革兰氏阴性细菌。此外，当与黏菌素共施用时，式(I)的化合物可以有效杀灭多种革兰氏阴性细菌，包括对碳青霉烯类具有抗性的细菌。因此，式(I)的化合物可以克服细菌对黏菌素的抗性，恢复黏菌素的作用，并且实际上将黏菌素的作用扩展到对单独的碳青霉烯类或黏菌素具有抗性的革兰氏阴性细菌。有利的是，式(I)的化合物还可以有效杀灭大量细菌而不必根据细菌种类来改变药物浓度。唯一能够达到此目的的其他已知抗菌素是酒精，但众所周知，酒精是有毒的。
另一方面，提供了包含上文定义的化合物、或其药学上可接受的盐或水合物，以及药学上可接受的载体的药物组合物。
另一方面，提供了制备上文定义的化合物的方法，包括在反应条件下使疏水部分与含N部分接触的步骤。
有利的是，制备该化合物的方法是容易做到的，使用温和的反应条件，有利于该化合物的低成本和大规模合成。
另一方面，提供了上文定义的化合物或上文定义的药物组合物作为抗生素的用途。
另一方面，提供了上文定义的化合物或上文定义的药物组合物在体外杀灭或抑制微生物生长的用途。
另一方面，提供了用于治疗的上文定义的化合物。
另一方面，提供了治疗细菌感染的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的上文定义的化合物的步骤。
另一方面，提供了用于治疗细菌感染的上文定义的化合物。
另一方面，提供了上文定义的化合物在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途。
有利的是，该化合物可以通过促进破坏MCR突变细菌以及其他没有MCR突变的革兰氏阴性细菌的外膜，本身作为抗生素或作为其他抗生素例如黏菌素的佐剂，并恢复这些菌株对黏菌素的敏感性。有利的是，该化合物可以将黏菌素的MIC降低至少两倍。
定义
除非另有说明，否则“烷基”作为基团或基团的一部分是指直链或支链脂族烃基，优选C1–C20烷基、C1–C12烷基，更优选C1-C10烷基，最优选C1-C6。合适的直链和支链C1-C6烷基取代基的实例包括甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、己基等。该基团可以是端基或桥基。
“烯基”作为基团或基团的一部分表示含有至少一个碳-碳双键并且可以是直链或支链的脂族烃基，优选在正链中具有2-20个碳原子，优选具有2-12个碳原子，更优选2-10个碳原子，最优选2-6个碳原子。该基团可以在正链中含有多个双键，并且每个双键的取向独立地为E或Z。示例性烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基和壬烯基。该基团可以是端基或桥基。
“炔基”作为基团或基团的一部分是指含有碳-碳三键并且可以是直链或支链的脂族烃基，优选在正链中具有2-20个碳原子，优选具有2-12个碳原子，更优选2-10个碳原子，更优选2-6个碳原子。示例性结构包括但不限于乙炔基和丙炔基。该基团可以是端基或桥基。
“氨基”是指–NRaRb形式的基团，其中Ra和Rb单独选自包括但不限于氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基和任选取代的芳基。
“氨基烷基”是指NH2-烷基-基团，其中烷基如本文所定义。该基团可以是端基或桥基。如果该基团是端基，则它通过烷基键合于分子的其余部分。
“芳基”作为基团或基团的一部分表示(i)任选取代的单环或稠合多环芳族碳环(环原子全部为碳的环结构)，优选每个环具有5-12个原子。芳基的实例包括苯基、萘基等；(ii)任选取代的部分饱和双环芳族碳环部分，其中苯基和C5-7环烷基或C5-7环烯基稠合在一起形成环状结构，例如四氢萘基、茚基或茚满基。该基团可以是端基或桥基。通常芳基是C6-C18芳基。
“胍基烷基”是指烷基-NC(NH2)2-基团，其中烷基如本文所定义。该基团可以是端基或桥基。如果该基团是端基，则它通过烷基键合于分子的其余部分。
“杂芳基”单独或作为基团的一部分是指含有这样的芳族环(优选5或6元芳族环)的基团，该芳族环具有一个或多个杂原子作为芳族环中的环原子，其余环原子为碳原子。合适的杂原子包括氮、氧和硫。杂芳基的实例包括噻吩、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、萘并[2,3-b]噻吩、呋喃、异吲哚嗪、xantholene、phenoxatine、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、四唑、吲哚、异吲哚、1H-吲唑、嘌呤、喹啉、异喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、噌啉、咔唑、菲啶、吖啶、吩嗪、噻唑、异噻唑、吩噻嗪、噁唑、异噁唑、呋呫(furazane)、吩噁嗪、2-、3-或4-吡啶基、2-、3-、4-、5-或8-喹啉基、1-、3-、4-或5-异喹啉基、1-、2-或3-吲哚基和2-或3-噻吩。杂芳基通常是C1-C18杂芳基。杂芳基可包含3-8个环原子。杂芳基可以包含1-3个独立地选自N、O和S的杂原子。该基团可以为端基或桥基。
“杂芳基烷基”是指杂芳基和烷基部分如本文所定义的杂芳基-烷基。优选的杂芳基烷基含有低级烷基部分。示例性的杂芳基烷基包括吡啶基甲基。该基团可以是端基或桥基。如果该基团是端基，则它通过烷基键合于分子的其余部分。
“杂环”是指含有至少一个选自氮、硫和氧的杂原子作为环原子的饱和、部分不饱和或完全不饱和的单环、双环或多环环系。杂环部分的实例包括杂环烷基、杂环烯基和杂芳基。
“卤素”代表氯、氟、溴或碘。
本文所用术语“取代的”是指该术语所指的基团可以被一个或多个独立地选自以下的基团取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基、环烯基、环烷基烯基、杂环烷基、环烷基杂烷基、环烷氧基、环烯氧基、环氨基、卤代、羧基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、炔氧基、杂烷基、杂烷氧基、羟基、羟基烷基、烷氧基、烯氧基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、氨基烷基、炔基氨基、酰基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基芳基、烷氧基羰基、烷氧基环烷基、烷氧基杂芳基、烷氧基杂环烷基、酰氨基、烷基磺酰氧基、杂环、杂环烯基、杂环烷基、杂环烷基烷基、杂环烷基烯基、杂环烷基杂烷基、杂环烷氧基、杂环烯氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、亚磺酰基、亚磺酰基氨基、磺酰基、磺酰基氨基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基杂烷基、杂芳基氨基、杂芳氧基、芳基烯基、芳基烷基、芳氧基、芳基磺酰基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-C(O)NH(烷基)和-C(O)N(烷基)2。
术语“药学上可接受的盐”是指保留了上述化合物的所需生物活性的盐，包括药学上可接受的酸加成盐和碱加成盐。式(I)化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐可由无机酸或有机酸制备。这种无机酸的例子是盐酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可选自脂族、环脂族、芳族、杂环羧酸和磺酸类有机酸，其实例是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、烷基磺酸、芳基磺酸。在药剂为固体的情况下，本领域技术人员应当理解，本发明的化合物、药剂和盐可以以不同的结晶或多晶型形式存在，所有这些都旨在在本公开和指定公式的范围内。
术语“药学上可接受的载体”旨在包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或药剂与化合物不相容，否则考虑其在治疗组合物以及治疗和预防方法中的用途。也可以将补充性活性化合物掺入本发明的组合物中。出于容易施用和剂量均匀性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的。本文所用“剂量单位形式”是指适合作为用于待治疗个体的单位剂量的物理离散单位；计算含有预定量的化合物的每个单位与所需的药物载体，以产生所需的治疗效果。为了方便和有效地施用，可以将有效量的化合物与合适的药学上可接受的载体一起配制在可接受的剂量单位中。在组合物含有补充性活性成分的情况下，参考所述成分的常用剂量和给药方式确定剂量。
应当理解，所公开的化合物家族中包括“E”或“Z”构型异构体或E和Z异构体的混合物形式的异构体形式，包括非对映异构体、对映异构体、互变异构体和几何异构体。还应理解，本领域技术人员可以通过物理和/或化学方法分离一些异构体形式，例如非对映异构体、对映异构体和几何异构体。
所公开实施方案的一些化合物可以作为单一立体异构体、外消旋体和/或对映异构体和/或非对映异构体的混合物存在。所有这些单一的立体异构体、外消旋体及其混合物都旨在落入所描述和要求保护的主题范围内。
此外，在适用的情况下，所公开的化合物旨在涵盖化合物的溶剂化和非溶剂化形式。因此，每个式都包括具有所示结构的化合物，包括水合形式和非水合形式。
“基本上”一词不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，本发明的定义中可以省略“基本上”一词。
除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”和“包含(comprise)”及其语法变体旨在表示“开放”或“包容性”语言，使得它们包括所列举的要素但也允许包括额外的、未列举的要素。
在制剂成分浓度的上下文中，本文所用术语“约”通常是指所述值的+/-5％，更通常是所述值的+/-4％，更通常是+/-所述值的3％，更通常是所述值的+/-2％，甚至更通常是所述值的+/-1％，甚至更通常是所述值的+/-0.5％。
在整个本公开中，可以以范围格式公开某些实施方案。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应理解为对所公开范围的范围的不灵活限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及各个数值。例如，对范围例如从1至6的描述应视为已具体公开了子范围，例如1-3、1-4、1-5、、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
可选实施方案的详细描述
缩写
ArgOMe：精氨酸甲酯
ArgOEt：精氨酸乙酯
BPD：联吡啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DIC：N,N′-二异丙基碳二亚胺
DPA：二吡啶甲基胺(Dipicolylamine)
EDTA：乙二胺四乙酸
EtBr：溴乙锭
EtOH：乙醇
HOBt：羟基苯并三唑
HPLC：高效液相色谱
LMMD：配体定位分子动力学
LPS：脂多糖
MCR：移动黏菌素抗性
MCR菌株：具有移动黏菌素抗性的细菌。
MCR蛋白：在MCR-1、MCR-2、MCR-3和MCR-4菌株中催化PE基团修饰脂质A的酶。这四种蛋白质的结构高度保守，并具有相似的活性部位。
MD模拟：分子动力学模拟
MeOH：甲醇
MIC：最低抑菌浓度。
NDM1：新德里金属-β-内酰胺酶1(New Delhi metallo-beta-lactamase 1)
PE基团：磷酸乙醇胺基团
TEA：三乙胺
THF：四氢呋喃
TPD：三联吡啶
MCR抑制剂设计的总体策略
本公开内容旨在设计对具体靶标(在这种情况下为mcr-1蛋白)有活性或对细菌有活性的抗生素分子，或恢复黏菌素对具有MCR质粒的细菌的敏感性，如图3所示。
具有mcr-1的E.coli可能对黏菌素和其他抗生素具有抗性，无mcr-1的E.coli可能对黏菌素和其他抗生素具有抗性，抗性铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)可能对碳青霉烯类、氨基糖苷和其他抗生素具有抗性，抗性鲍曼不动杆菌可能对碳青霉烯类、黏菌素和其他抗生素具有抗性，抗性肺炎克雷伯菌可能对碳青霉烯类、黏菌素和其他抗生素具有抗性。
基于片段基策略，公开了多学科的方法，包括：(1)计算机分析和靶标鉴别(2)配体设计；(3)合成和(4)生物学验证。如图3所示，该方法开始于对MCR蛋白的构象以及外膜结构的计算机分析，以鉴别MCR修饰的脂质A中的可能靶标。基于片段基药物设计策略(FBDD)，选择了一系列对鉴别的靶标具有高亲和力的化学片段。将这些化学片段组装在一起或掺入其他设计的片段，形成多个抗微生物支架，以获得新的抗生素或抗生素佐剂。
为了有效破坏细菌膜，所提出的模型含有三种类型的片段：两个与细菌膜的两个头基区相互作用的阳离子片段，一个与细菌膜脂质尾部相互作用的疏水片段，以及两个连接阳离子基团和疏水片段的接头基团。设计一系列化学片段，并将其组装在一起，以获得新的抗生素或抗生素佐剂。选择片段结构的基本原理基于下述标准(图4)：
●含N基团的pKa：使用模型化合物，发现末端极性基团的pKa值很重要。pKa值越高，膜活性越高。优选，pKa应当大于8、大于8.5、大于9、大于11或大于13。优选，pKa应当小于20、小于17或小于15。
●含氮基团的金属螯合特性：当与二价阳离子如锌或钙螯合时，带正电荷的络合物对外膜中的磷酸基团和MCR-1蛋白都有亲和力，MCR-1蛋白在其催化部位含有锌(图6)。
●疏水支架的尺寸：由于中心疏水支架需要有一定的尺寸，所以测试了由两个或多个具有一个或多个烃基(例如异戊二烯基)的芳族环组成的化合物。这是为了确保疏水片段具有允许所得分子跨越细菌膜的一定大小。发现通常支架越大活性越好。
●疏水支架的形状：平面疏水支架是优选的，因为它们很容易切入膜。
●支架的整体疏水性：根据药效团模型，疏水性支架与脂质尾部相互作用，因此疏水性或有利的转移能越高，膜活性越高。优选，化合物的logP应大于4、大于6或大于8。优选，化合物的logP应小于10或小于9。优选，自由能垒应为负。自由能垒越负，则片段对膜的亲和力就越高。
●异戊二烯基的作用：异戊二烯基具有较高的膜亲和力，可用作膜探针；当用一个或多个异戊二烯基修饰疏水支架时，膜活性变得更高。
接下来，合成设计的分子并测试它们对携带移动质粒mcr-1的细菌的抗微生物活性。计算机和生物学见解可能会在下一轮片段设计中迭代使用。这些轮次的结构优化可能会导致开发出一种或多种先导化合物。
计算机分析和靶标鉴别
当模拟黏菌素与正常革兰氏阴性细菌外膜的脂质A成分相互作用时，脂质A中的阴离子磷酸基团与阳离子黏菌素发生初级静电相互作用，这最终导致外膜破裂。
Mcr-1基因编码类似于磷酸乙醇胺转移酶的酶，它可以通过添加磷酸乙醇胺(PE)基团来修饰外膜的脂质A部分，导致脂质分子之间形成氢键等静电相互作用并减少这些化合物渗透到细菌的外膜中。通过晶体学，MCR-1被表征为锌依赖性金属蛋白，这使其成为设计抑制其活性的配体的良好靶标。
如图5所示，转移的基团允许会交联并稳定外膜的脂质A部分的额外的氢键合。虽然每个氢键本身可能很弱，但当数量很大时，它们会导致可以保持脂质A完整性的非常强大的超分子支架。为了使黏菌素或多黏菌素能够杀灭细菌，必须破坏脂质A的这种超分子组织结构。
此外，在MCR-1菌株中，PE修饰的脂质A形成大量将脂质A交联在一起，从而稳定外膜的氢键。然而，修饰的脂质分子之间的氢键网络也可以作为额外的靶标。破坏氢键合网络的分子会使MCR菌株的外膜不稳定，并可能恢复这些菌株对黏菌素的敏感性。
MCR阳性细菌菌株中的黏菌素抗性源于MCR蛋白对脂质A的修饰以及随后外膜特性的变化。因此，可以确定MCR菌株中的两个靶标：(1)MCR蛋白；(2)修饰的外膜。对于第一个靶标，MCR-1胞外域与全长PE转移酶胞外域的结构比对揭示了高度的结构相似性。使用MCR-1蛋白和PE转移酶胞外域的晶体结构为模板，根据该数据，使用同源建模构建了整个MCR-1蛋白的结构(图7)。与PE转移酶类似，MCR酶是在催化结构域中具有锌原子的金属蛋白，它有利于POPE脂质的带负电荷部分的结合并催化随后的脂质A修饰。修饰的脂质A表现出与黏菌素的相互作用减少，导致黏菌素抗性。因此，与MCR-1蛋白活性部位结合的分子会抑制其活性并恢复MCR菌株对黏菌素的敏感性。
对于第二个靶标，PE基团与脂质A的连接减少了其与黏菌素的静电相互作用，导致黏菌素与外膜的亲和力降低。此外，PE修饰的脂质A膜的分子动力学模拟首次揭示了脂质A分子头基之间形成大量氢键(图7)。氢键网络将LPS分子交联在一起并稳定MCR菌株的外膜，从而产生对黏菌素的抗性。因此，MCR阳性菌株外膜中的氢键合网络可以作为设计抗MCR治疗剂的另一靶标。破坏/扰乱外膜氢键合网络的片段可以直接杀灭细菌或恢复细菌对黏菌素的敏感性。总之，已经将外膜的MCR蛋白和氢键合网络确定为两个靶标，并用配体定位模拟(ligand mapping simulation)来寻找设计MCR抑制剂的更隐藏的结合口袋。
配体设计
根据已识别的靶标的原子细节，设计了一系列片段，这些片段可以与MCR蛋白结合，或可以扰乱外膜的氢键合网络。就作用方式而言，可以将这些片段分为三类：
(1)与MCR-1蛋白活性部位结合的片段；
(2)与MCR-1蛋白隐藏的口袋结合的片段；
(3)扰乱/破坏外膜的氢键合网络的片段。
前两类片段直接抑制MCR-1活性，恢复MCR-1菌株对黏菌素的敏感性，而第三类片段破坏/扰乱PE修饰的外膜，这可以独立地杀灭MCR细菌或与黏菌素协同作用。基于这三种作用模式，提出了6种类型的片段，图8显示了每种类型的代表性实例的结构。
i.PE基团。PE基团及其类似物与MCR-1蛋白的活性部位结合。
ii.锌螯合基团，如DPA基团、三联吡啶基团、2,2'-联吡啶基团、1,10-菲咯啉基团、卟啉基团、8-羟基喹啉基团和羧基。锌螯合基团可以通过与MCR-1蛋白活性部位的锌原子结合来抑制MCR-1蛋白的活性。此外，当与锌或其他二价阳离子螯合时，络合物呈阳性，并可以与磷酸基团形成盐桥，从而扰乱mcr-1外膜中的氢键合网络，导致PE修饰的外膜不稳定。
iii.环状多胺。环状多胺具有双重功能：(a)与PE修饰的脂质的头基形成氢键，导致外膜中氢键合网络的扰乱；(b)螯合锌原子从而抑制MCR-1蛋白并扰乱mcr-1外膜。
iv.胺和直链或支链多胺。多胺可以与脂质的磷酸基团形成氢键，并可以扰乱外膜的氢键合网络。
v.胍和聚胍基团。聚胍基团可以与磷酸基团形成双齿氢键，并可以扰乱外膜的氢键合网络。
vi.碱性氨基酸基团，例如精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、聚ε-赖氨酸、精氨酸衍生物、赖氨酸衍生物。含有碱性氨基酸的基团可以与脂质分子的磷酸基团形成氢键，并可以扰乱外膜的氢键合网络。
所有上述片段都具有相同的特征，即它们与细菌膜中的磷酸基团具有高亲和力。上述片段与细菌膜中磷酸基团之间的强相互作用导致大的膜扰乱。
使用上述片段，设计了化合物文库，作为与黏菌素协同作用的抗MCR细菌的可能抗生素或抗生素佐剂。通过将两个或多个片段组装在一起或将片段与其他支架偶联来设计分子。下文描述了文库分子的结构及其作用模式。
X-Cn-Y-Cn-X，其中X是含N部分，Y是疏水性支架，Cn是具有n个碳原子的烷基链。含N部分X可以是图8中的片段，而Y可以是图9中的任何疏水支架。该分子可以充当(i)MCR-1蛋白抑制剂；(ii)氢键合网络破坏者。
提供了具有下式(I)的化合物：
Z1-L1-A-L2-Z2 式(I)
其中A是疏水部分；
L1和L2独立地是接头；且
Z1和Z2独立地是含N部分。
A可以包含至少一个取代或未取代的芳基。
A还可以包含至少一个烯基。
A可以是平面的或基本上平面的。即，A可以位于平面内或基本上位于平面内。
A还可包含至少一个异戊二烯基。
A可以选自：
Figure BDA0003470188490000151
Figure BDA0003470188490000152
及其任何混合物。
其中断键表示该结构连接到式(I)的其余部分的位置。
A可以选自：
Figure BDA0003470188490000161
及其任何混合物。
Z1和Z2的pKa值可以独立地大于8。pKa值可以大于8.5，大于9，大于11或大于13。pKa值可以小于20。
Z1和Z2可以独立地具有下述结构：
Figure BDA0003470188490000162
其中断键表示该结构连接到式(I)的其余部分的位置；
R1和R2可以独立地是氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的氨基烷基、胍、取代或未取代的胍基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、氨基酸或肽，或R1和R2一起形成饱和或不饱和、取代或未取代的杂环；且
R3可以不存在，或可以为氢或取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的氨基烷基、胍、取代或未取代的胍基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、氨基酸或肽，
其中当R3存在时，氮原子可以是阳离子四价氮。
Z1和Z2可以独立地包含选自胺、胍、吡咯烷、吡咯、咪唑烷、吡唑烷、咪唑、吡唑、三唑、哌啶、吡啶、哌嗪、二嗪、异羟肟酸、肼、N-羟基脲、方酸、氨基甲酰基膦酸盐(carbamolyphosphonate)、噁唑啉、嘧啶三酮、1-羟基-2(1H)-吡啶酮(1,2-HOPO)及其任何组合。
R1、R2和R3可以独立地选自甲基、乙基、丙基、丁基、-(CH2)xNR’R”、-(CH2)xOH、-(CH2)xPO3、-(CH2)xCR’R”R”’、-(C(NH2)NHC(NH2))x-NH2、胍、2-甲基吡啶、1-甲基咪唑、吡啶、联吡啶、三联吡啶、菲咯啉、3-甲基吡咯、轮环藤宁(cyclen)(1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、环拉胺(1,4,8,11-四氮杂环十四烷)、1,8-二甲基-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,4,7-三氮杂环壬烷、精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、聚ε赖氨酸及其任何混合物，其中x可为1-10的任何整数，且R’、R”和R”’可以独立地为氢或取代或未取代的烷基。
Z1和Z2可以独立地选自：
Figure BDA0003470188490000171
Figure BDA0003470188490000181
Figure BDA0003470188490000182
及其任何组合。
L1和L2可以独立地是取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、酯、酰胺、醚、-(O-CH2-CH2-O)n-、L3或其任何组合，其中L3具有以下结构：
Figure BDA0003470188490000183
其中n可以为1-10的整数且R4可以为氨基或杂烷基且断键表示该结构连接至式(I)的其余部分的位置。
L1和L2可以独立地选自-(CH2)4-、酰胺、
Figure BDA0003470188490000191
及其任何组合，或
Figure BDA0003470188490000192
式(I)化合物的logP值可以大于4。该logP值可以大于6或大于8。
式(I)的化合物可以具有以下结构：
Figure BDA0003470188490000201
Figure BDA0003470188490000211
Figure BDA0003470188490000221
Figure BDA0003470188490000231
Figure BDA0003470188490000241
Figure BDA0003470188490000251
Figure BDA0003470188490000261
每个含N部分都可以独立地与锌螯合。
每个含N部分都可以独立地具有正电荷。
提供了药物组合物，包含上文定义的化合物、或其药学上可接受的盐或水合物，以及药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体可以是盐水。
提供了制备上文定义的化合物的方法，包括在反应条件下使疏水部分与含N部分接触的步骤。
上文定义的方法还可以包括在与含N部分接触之前使疏水部分与接头接触的步骤。
可以在疏水部分与含N部分之间或疏水部分与接头之间或接头与含N部分之间形成共价键。
疏水部分可以选自：
Figure BDA0003470188490000271
Figure BDA0003470188490000272
及其任何混合物。
接头可选自1,4-二溴丁烷、1,3-二碘丁烷、碘乙酸乙酯、羟基苯并三唑、1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷、碘乙酸甲酯、溴乙酸甲酯、1,4-二碘丁烷及其任何组合。
含N部分可以选自二吡啶甲基胺、轮环藤宁、1,8-二甲基-l,1,4,8,11-四氮杂环十四烷、二乙胺、-NH[(CH2)3N(CH3)]2、-NH2(CH2)3N(CH3)2、5-溴戊基三甲基溴化铵、3-溴戊基三甲基溴化铵、4-溴丁基三乙基溴化铵、3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴盐、1-(4-溴丁基)溴化吡啶、1-(4-溴丁基)溴化吡啶及其任何组合。
上文定义的方法可以包括在含N部分共价键合于接头或疏水部分之后添加锌的步骤。
可以在选自丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷、吡啶、水及其任何混合物的溶剂中进行接触。
可以在约21℃至约160℃、约21℃至约60℃、约21℃至约100℃、约60℃至约100℃、约60℃至约160℃或约100℃至约160℃的温度进行接触步骤。
接触步骤可进行约2小时至约36小时、约2小时至约8小时、约2小时至约12小时、约2小时至约24小时、约8小时至约12小时、约8小时至约24小时、约8小时至约36小时、约12小时至约24小时、约12小时至约36小时或约24小时至约36小时。
提供了上文定义的化合物或上文定义的药物组合物作为抗生素的用途。
提供了上文定义的化合物或上文定义的药物组合物体外杀灭或抑制微生物生长的用途。
上文定义的化合物或上文定义的药物组合物可用于杀灭或抑制微生物在表面上的生长，包括但不限于局部应用，在膏药、滴眼液、鼻喷雾剂、漱口水和洗手液中。上文定义的化合物或上文定义的药物组合物还可用于食品防腐剂、消毒剂、表面清洁剂或医疗器械。
微生物可以是细菌、古细菌、真菌、原生生物或其任何混合物。
微生物可以是革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
细菌可以是MCR阳性或MCR阴性。
细菌可以是对碳青霉烯类具有抗性的。
细菌可以选自E.coli、阴沟大肠杆菌(E.cloacae)、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌和鲍曼不动杆菌。
上文定义的化合物可以与黏菌素结合使用。
提供了用于治疗的上文定义的化合物。
还提供了治疗细菌感染的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的上文定义的化合物的步骤。
上文定义的方法还可以包括施用治疗量的黏菌素和上文定义的化合物的步骤。
提供了用于治疗细菌感染的上文定义的化合物。
上文定义的化合物可以与黏菌素结合施用。
提供了上文定义的化合物在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途。
根据本发明，当用于治疗或预防微生物感染时，本发明的化合物可单独施用。或者，该化合物可以作为药物、兽医、农业或工业制剂施用，其包含至少一种本发明的化合物。该化合物也可以作为合适的盐存在，包括药学上可接受的盐。
上文定义的用途还可包括与黏菌素结合施用的上文定义的化合物。
提供了上文定义的方法、上文定义的化合物或上文定义的用途，其中上文定义的化合物可以以下述量存在：约2μg/mL至约75μg/mL、约2μg/mL至约12μg/mL、约2μg/mL至约25μg/mL、约2μg/mL至约50μg/mL、约12μg/mL至约25μg/mL、约12μg/mL至约50μg/mL、约12μg/mL至约75μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约75μg/mL或约50μg/mL至约75μg/mL。
上文定义的方法、上文定义的化合物或上文定义的用途，其中上文定义的化合物和黏菌素可以以相同重量的量存在，或者按重量计，上文定义的化合物可以为黏菌素的约1.5至约6倍、约1.5至约3倍、约1.5至约4.5倍、约3倍至约4.5倍、约3倍至约6倍或约4.5倍至约6倍过量。
上文所定义的方法、化合物或用途，其中黏菌素可以以下述范围存在：约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg或约5mg/kg至约10mg/kg，并且上文定义的化合物可以以约10mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg或20mg/kg至约50mg/kg的范围存在。
上文定义的方法、上文定义的化合物或上文定义的用途，其中上文定义的化合物可以以肌肉内、腹膜内、局部、皮下或静脉内施用。
在一个实施方案中，该化合物可以通过注射施用。在可注射溶液的情况下，载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物的溶剂或分散介质，以及植物油。可以例如通过使用诸如卵磷脂的涂层、在分散体的情况下通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过包括各种抗细菌剂和/或抗真菌剂来防止微生物的作用。合适的药剂是本领域技术人员众所周知的，并且包括例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、苯甲醇、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠，可能是优选的。可通过在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来延长可注射组合物的吸收。
根据需要，可以通过将所需量的类似物和上述一种成分或多种成分的组合掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将类似物掺入含有基本分散介质和来自上面列举的那些成分中所需其他成分的无菌媒介中来制备分散体。
优选，药物组合物还可以包括合适的缓冲剂以使酸水解最小化。合适的缓冲剂是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐及其混合物。
也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备本发明化合物的分散体。在通常的储存和使用条件下，药物制剂可以含有防腐剂以防止微生物生长。
适合注射的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。理想的是，组合物在制造和储存条件下是稳定的，并且可以包括防腐剂以稳定组合物来抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。
延迟释放制剂也包括在本发明的范围内。
本发明的化合物也可以以“前药”的形式施用。前药是在体内转化为活性形式的化合物的无活性形式。合适的前药包括活性形式化合物的酯、膦酸酯等。
可以进行本发明药物组合物的单次或多次施用。本领域技术人员应当能够通过常规实验确定本发明的化合物和/或组合物的有效、无毒剂量水平以及适合治疗其适用的疾病和/或感染的施用方式。
此外，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，可以使用常规疗程确定测试来确定最佳疗程，例如在限定天数内每天给予的本发明化合物或组合物的剂量数。
附图简要说明
[图1]是显示通往革兰氏阴性细菌细胞质膜的途径和每个步骤中分子相互作用类型的示意图。
[图2]是革兰氏阴性细菌外膜和LPS分子的脂质A部分化学结构的卡通图。
[图3]涉及所提出的用于设计可以恢复MCR菌株对黏菌素敏感性的分子的方法的示意流程图。
[图4]涉及的示意图显示了本发明抗生素的成分如何与细菌膜的脂双层相互作用。含N基团(4001)通过接头(4002)连接于疏水支架(4003)。含N基团(4001)与脂质的头基(4004)相互作用，而疏水支架(4003)与脂质尾(4005)相互作用。
[图5]涉及的示意图显示了MCR菌株中脂质A的化学修饰。脂质A被MCR-1通过磷酸乙醇胺(PPEA)基团的转移修饰，导致脂质A的相邻节段之间形成氢键，从而导致PPEA-4'-脂质A或PPEA-1'-脂质A的形成。
[图6]显示了由同源建模构建的MCR-1蛋白结构的图像。细胞外结构域的结构高度保守，并且在活性部位含有锌原子。
[图7]涉及的图像和坐标图显示了经MCR修饰的膜的外膜的分子动力学模拟。(a)正常脂质A膜的快照；(b)PE修饰的脂质A膜的快照。PE基团与相邻的脂质A分子形成氢键(显示为虚线)，从而形成稳定外膜的网络。(c)坐标图显示了64个脂质A分子的膜片中的氢键数量。(d)坐标图显示不同基团之间的径向分布函数(RDF)，显示了磷酸-磷酸(701)、胺-胺(702)和磷酸-胺(703)。
[图8]涉及1-16型片段的代表性结构。
[图9]涉及疏水支架的结构。
[图10]涉及在DPA-Zn系列中合成的分子的结构。
[图11]涉及在胺系列中合成的分子的结构。
[图12]涉及在胍系列中合成的分子的结构。
[图13]涉及的坐标图显示了，针对黏菌素抗性mcr-1(+)菌株6083655967，对(a)黏菌素和(b)LC100与黏菌素的组合的时间杀灭研究。
[图14]涉及的坐标图显示了，针对黏菌素抗性mcr-1(+)菌株6075066346，对(a)黏菌素和(b)LC100与黏菌素的组合的时间杀灭研究。
[图15]涉及的坐标图显示了，针对抗黏菌素抗性mcr-1(-)菌株7023446108，对(a)黏菌素和(b)LC100与黏菌素的组合的时间杀灭研究。
[图16]涉及的坐标图显示了B2088和LC100组合的时间杀灭作用。
[图17]涉及的坐标图显示了使用荧光探针溴化乙锭的(a)LC100、(b)黏菌素和(c)LC100组合黏菌素对mcr-1细菌膜的作用。
[图18]是显示LC100与MCR1蛋白使用荧光猝灭的相互作用的坐标图。
[图19]涉及的坐标图显示了在存在和不存在多黏菌素B的情况下细菌膜中的疏水表面积。
[图20]涉及的坐标图显示了LC100和LC101使用100nm大单层囊泡的钙黄绿素渗漏。囊泡的脂质组成为DOPE/DOPG＝3/1，从而模拟细菌内膜。随着LC100或LC101浓度的增加，检测到显著的荧光，表明囊泡受到破坏，染料分子被释放。由于荧光猝灭效应，LC100或LC101的进一步增加导致荧光减少。
[图21]涉及的坐标图显示了LC100和黏菌素的组合在感染MCR阳性E.Coli临床分离株6083655967的中性白细胞减少症小鼠大腿感染模型中的功效测试。起始接种物为1.87x106，N＝3。“组合”是指黏菌素10mg/kg+LC100 50mg/kg。每次治疗均在感染后1小时腹膜内进行。治疗后6小时，将小鼠大腿组织匀质化以获得活CFU。在LC100组和组合组的小鼠中发现腹胀。与LC100组相比，组合组的小鼠在被处死前似乎更弱、身体较冷，活动量较小。
附图详细说明
[图1]是显示了革兰氏阴性细菌通往细胞质膜的途径和每个步骤中分子相互作用类型的示意图。1001是指步骤1，其中t～ns，且LPS表面上的吸附通过静电相互作用而发生。1002是指步骤2，其中外膜被透化，静电相互作用、与PO43-的氢键以及与脂质尾的疏水相互作用破坏了PO4 3-与Ca2+/Mg2+之间的盐桥。1003是指步骤3，其中t～ns，细胞质膜上的吸附通过与阴离子脂质的静电相互作用、与头基的氢键以及与脂质尾的疏水相互作用而发生。1004是指步骤4，其中t>μs，其中细胞质膜受到破坏。
[图3]涉及所提出的用于设计可以恢复MCR菌株对黏菌素敏感性的分子的方法的示意流程图。进行外膜的MD模拟和MCR酶的结构分析(3001)，确定靶标(3002)，生成片段(3003)，掺入片段(3004)，合成新抗生素(3005)，验证抗生素(3006)，然后破译作用机制(3007)，并将此信息反馈(3008)到片段生成(3003)。
实验和方法
实施例1：材料
名称中带有“ATCC”的菌株购自美国弗吉尼亚州的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。所有其他细菌菌株均购自新加坡陈笃生医院(Tan Tock Seng Hospital,Singapore)。
疏水支架LC003、LC007、LC008、AM000购自Chengdu Biopurify Phytochemicals(中国成都)。阳离子部分N,N,N-三甲基-1,3-丙二胺和3,3'-3,3'-亚胺基双(Iminobis)(N,N-二甲基丙胺)购自Bio-etc(新加坡，新加坡)。MCR-1蛋白购自A*STAR生物处理技术研究所(新加坡，新加坡)。轮环藤宁和1,8-二甲基-1,4,8,11-四环十四烷购自TCI(日本东京)。溶剂乙酸乙酯、己烷、丙酮、丁醇、甲醇、DMF购自Aik Moh(新加坡，新加坡)。所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。
实施例2：MIC研究
根据临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南，使用96孔培养板，通过改良的肉汤微量稀释方法确定抗微生物剂的MIC实验。简而言之，以不同浓度(μg)制备所有平板的系列稀释液。通过将TSA平板上18-20小时的分离菌落添加到磷酸盐缓冲液(0.31mM，pH 7.2)或注射用水(BBraun)中并将悬浮液调节至相当于0.5McFarland标准的浊度来制备接种物悬浮液。每孔含有的最终细菌浓度为约5×105个菌落形成单位(CFU)/mL。将板覆盖并在35℃孵育24小时。MIC是用肉眼检测到的完全抑制微生物在试管或微量稀释孔中生长的最低抗微生物剂浓度。对于微量稀释板，可以使用TECANinfinite M200Pro在OD600下测量孔中的浊度。MIC被确定为产生99％抑制的最高浓度。
实施例3：协同作用研究
使用CLSI推荐的肉汤微量稀释技术确定单个药物和与LC化合物的组合的MIC，据此，将两种抗微生物剂以等量加入。(例如：50μL黏菌素：50μL LC化合物)。含有化合物和抗生素的稀释培养基会被连续稀释2倍，会在固定的协同作用浓度下检测单独或组合的LC化合物和抗生素。在所有情况下，将未发生可见生长的最低浓度记录为单个和组合抗菌剂的MIC值。孵育24小时后获得结果。
实施例4：时间杀灭研究
时间杀灭测定用于确定抗微生物剂在何种浓度下杀灭细菌分离物的速率。用不同浓度的LC化合物和抗生素将细菌悬浮液调节至106至107CFU/mL，以便在于35℃孵育的单独试管中进行比较。对于协同作用时间杀灭：以等量添加为抗生素/LC化合物的两种不同的抗微生物菌剂，以使最终体积为1mL(例如：500μL抗生素：500μL LC化合物)，随后将1mL制备的细菌悬浮液添加到同一管中。在不同的时间间隔(0、1、2、4、8、24小时)取出100μL样品的等分试样，并在系列稀释后铺板于穆勒欣顿琼脂(Mueller Hinton Agar,MHA)上。随后，在24和48小时后，检查所有平板的细菌生长，并计算菌落的菌落形成单位(CFU/mL)计数，并用活计数对时间的对数绘制时间杀灭曲线。绘制了各种浓度的抗生素和对照的结果。
实施例5：体内小鼠大腿感染模型
在中性白细胞减少症小鼠大腿感染模型中，针对E.coli临床分离株MCR阳性菌株6083655967测试了黏菌素和抗微生物肽(LC100)的组合。通过环磷酰胺使C57BL/6小鼠中性白细胞减少，在感染前的第-4天和-1天以递送的150mg kg-1和100mg kg-1进行剂量给药。将细菌悬浮在无菌盐水中，并调整至每个感染部位(100μL)约1.876×106CFU的浓度，并肌肉注射到每个治疗组5只小鼠的右大腿中。在感染后1小时，小鼠接受黏菌素(15mg kg-1，i.p.n＝5)、LC100(50mg kg-1，i.p.n＝5)、未治疗(n＝5)或组合(n＝5)。感染后6小时对小鼠实施安乐死；在无菌条件下收集大腿组织，匀质化，在PBS中连续稀释，并铺板于补充了TSA的固体平板上。将平板在37℃孵育过夜，并量化菌落以确定细菌负荷。
实施例6：分子动力学研究结果
进行分子动力学模拟，以了解黏菌素抗性的分子起源。研究了mcr-1(+)和完整脂质A膜的结构和动力学。对于每个膜，首先通过在xy维度的网格上放置所需数量的脂质A分子(来自mcr-1(+)或mcr-1(-)菌株)来组装预组装的脂质A双层。接下来，用水分子使预组装的双层溶剂化。钙离子用于中和系统。进行300ns的MD模拟以平衡每个脂质A双层。在MD模拟结束时，发现所有钙离子都被吸附在双层表面上。在mcr-1(-)菌株中，发现钙离子在磷酸基团之间形成盐桥，这抵消了带负电荷的脂质A分子之间的排斥并稳定脂质A膜。用抗微生物肽例如黏菌素破坏盐桥会使外膜不稳定。然而，在mcr-1(+)菌株的情况下，MD模拟揭示)与mcr-1膜的磷酸基团之间存在大量分子间氢键(图7)。由于磷酸基团和胺基团携带相反的电荷，它们与进一步稳定脂质A膜的强静电吸引力相互作用。结果，短程脂质间氢键和长程静电相互作用将mcr-1(+)菌株的脂质A分子交联在一起，导致对黏菌素作用的抵抗。结果表明，氢键的扰乱或脂质A膜的静电相互作用可以使mcr-1(+)菌株的外膜不稳定。
实施例7：化学合成
选定的合成方案如图10、图11和图12所示。
LC004的合成：将1,4-二溴丁烷(313.8μL，2.65mmol)和K2CO3(111.7mg，0.808mmol)添加到溶解在3mL丙酮中的异补骨脂查尔酮(Isobavachalcone)LC003(57.2mg，0.176mmol)中。将反应保持在回流条件下并搅拌过夜。真空除去丙酮溶剂。粗产物用乙酸乙酯稀释并用饱和氯化钠溶液提取。通过硅胶柱色谱，使用洗脱梯度(己烷:EtOAc(v/v)，26:1)，获得纯LC004，77.3mg。产率：73.8％。
LC003-I的合成：将1,4-二碘丁烷(601μL，4.557mmol)和K2CO3(198mg，1.43mmol)添加到溶解在丙酮中的LC003(98.6mg，0.304mmol)中。反应的处理类似于LC004的合成。粗产物的硅胶柱色谱使用溶剂比己烷:EtOAc(v/v)40:1，获得到113.5mg黄色粉末状LC003-I。产率：54％。
LC003-DPA的合成：向LC003-I(25.5mg，0.037mmol)的2.5mL丙酮溶液中添加K2CO3(26.2mg，0.190mmol)和二吡啶甲基胺(99μL，0.550mmol)。将反应混合物在55℃搅拌过夜。真空除去丙酮。粗产物用EtOAc稀释并用饱和NaCl溶液提取3次。用制备型HPLC进行纯化，得到17.8mg亮黄色凝胶状LC003-DPA。产率：58％。
LC003-DPA-Zn的合成：将5.44mg ZnCl2的1mL甲醇溶液与8.3mg LC003-DPA混合并搅拌3小时。真空除去溶剂，得到LC003-DPA-Zn络合物(LC003-DPA:Zn＝1:4)。
LC008-I的合成：将1,4-二碘丁烷(478μL,1.86mmol)和K2CO3(180mg,1.302mmol)添加到溶解在丙酮中的LC008(61.8mg，0.241mmol)中。反应的处理类似于LC004的合成。粗产物的硅胶柱色谱使用溶剂比己烷:EtOAc(v/v)25:1，获得49.6mg黄色粉末状LC008-I。产率：33％。
LC008-DPA的合成：向LC008-I(32.1mg,0.052mmol)的2mL丙酮溶液添加K2CO3(42.0mg,0.304mmol)和二吡啶甲基胺(140μL,0.778mmol)。将反应混合物在55℃搅拌过夜。真空除去丙酮。粗产物用EtOAc稀释并用饱和NaCl溶液提取3次。用制备型HPLC进行纯化，获得16.7mg亮黄色凝胶状LC008-DPA。产率：42％。
LC008-DPA-Zn的合成：将5.44mg ZnCl2的1mL甲醇溶液与7.62mg LC003-DPA混合并搅拌3小时。真空除去溶剂，得到LC008-DPA-Zn络合物(LC008-DPA:Zn＝1:4)。
AM005的合成：将1,4-二溴丁烷(434μL，3.66mmol)和K2CO3(168mg，1.22mmol)添加到溶解在3mL丙酮中的AM000(100mg，0.244mmol)中。反应的处理类似于LC004的合成。粗产物的硅胶柱色谱使用溶剂比己烷:EtOAc(v/v)20:1，获得98mg黄色粉末状AM005。收率：59％。
AM000-DPA的合成：向AM005(68mg,0.1mmol)的3mL丙酮溶液添加K2CO3(84.0mg,0.6mmol)和二吡啶甲基胺(269μL,1.5mmol)。将反应混合物在55℃搅拌过夜。真空除去丙酮。粗产物用EtOAc稀释并用饱和NaCl溶液提取3次。用制备型HPLC进行纯化，获得38.4mg亮黄色凝胶状AM000-DPA。产率：47％。
LC104(AM000-DPA-Zn)的合成：将5.44mg ZnCl2的1mL甲醇溶液与9.16mg AM000-DPA混合并搅拌3小时。真空除去溶剂得到LC104络合物(AM000-DPA:Zn＝1:4)。
Orc-I的合成：将1,4-二碘丁烷(1mL,7.58mmol)和K2CO3(546mg,3.95mmol)添加到溶解在丙酮中的苔黑素(Orcinol)(62.9mg,0.506mmol)中。反应的处理类似于LC004的合成。粗产物的硅胶柱色谱使用溶剂比己烷:EtOAc(v/v)100:1，获得164.7mg黄色粉末状LC008-I。产率：67％。
Orc-DPA的合成：向Orc-I(66mg,2.83mmol)的2mL丙酮溶液添加K2CO3(122mg,0.883mmol)和二吡啶甲基胺(364μL,2.022mmol)。将反应混合物在55℃搅拌过夜。真空除去丙酮。粗产物用EtOAc稀释并用饱和NaCl溶液提取3次。用制备型HPLC进行纯化，获得66.4mg亮黄色凝胶状LC008-DPA。产率：85％。
Orc-DPA-Zn的合成：将5.44mg ZnCl2的1mL甲醇溶液与6.3mg Orc-DPA混合并搅拌3小时。真空除去溶剂，得到Orc-DPA-Zn络合物(Orc-DPA:Zn＝1:4)。
LC007-I的合成：将1,4-二碘丁烷(373μL,2.83mmol)和K2CO3(147.3mg,1.07mmol)添加到溶解在丙酮中的光甘草定(62.2mg,0.192mmol)中。反应的处理类似于LC004的合成。粗产物的硅胶柱色谱使用溶剂比己烷:EtOAc(v/v)30:1，获得66.6mg黄色粉末状LC007-I。产率：50.0％。
GLA-DPA的合成：向GLA-I(31.5mg,0.0456mmol)的2mL丙酮溶液添加K2CO3(37.5mg,0.271mmol)和二吡啶甲基胺(123μL，0.683mmol)。将反应混合物在55℃搅拌过夜。真空除去丙酮。粗产物用EtOAc稀释并用饱和NaCl溶液提取3次。用制备型HPLC进行纯化，获得24.4mg黄色凝胶状GLA-DPA。产率：65％。
GLA-DPA-Zn(LC007-DPA-Zn)的合成：将5.44mg ZnCl2的1mL甲醇溶液与8.3mgGLA-DPA混合并搅拌3小时。真空除去溶剂得到GLA-DPA-Zn络合物(GLA-DPA:Zn＝1:4)。
LC300的合成：向LC010(34.85mg,0.05mmol)的3mL DMF溶液添加轮环藤宁(68.8mg,0.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将粗产物溶解在丁醇中，随后用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤3次并真空干燥。然后将粗品重新溶解在1mmol ZnCl2/MeOH溶液中。用制备型HPLC进行纯化，获得20.2mg黄色凝胶状LC300(GLA-轮环藤宁-Zn)。产率：40.5％。
LC301的合成：向LC003-I(34.85mg，0.05mmol)的3mL DMF溶液添加轮环藤宁(68.8mg，0.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将粗产物溶解在丁醇中，随后用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤3次并真空干燥。然后将粗产物重新溶解在1mmol ZnCl2/MeOH溶液中。用制备型HPLC进行纯化，获得18.4mg黄色凝胶状LC301(LC003-轮环藤宁-Zn)。产率：37％。
LC302的合成：向AM005(34.0mg,0.05mmol)的3mL DMF溶液添加轮环藤宁(68.8mg，0.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将粗产物溶解在丁醇中，随后用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤3次并真空干燥。然后将粗品重新溶解在1mmol ZnCl2/MeOH溶液中。用制备型HPLC进行纯化，获得24.6mg黄色凝胶状LC302(AM000-轮环藤宁-Zn)。产率：45％。
LC304的合成：向LC008-I(34.0mg，0.05mmol)的3mL DMF溶液添加轮环藤宁(68.8mg，0.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将粗产物溶解在丁醇中，随后用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤3次并真空干燥。将粗品重新溶解在1mmol ZnCl2/MeOH溶液中。用制备型HPLC进行纯化，得到25.3mg黄色凝胶状LC302(LC008-轮环藤宁-Zn)。产率：54％。
LC014的合成：将LC004(62.1mg,0.104mmol)和1,8-二甲基-1,4,8,11-四环十四烷(61.9μL，0.376mmol)溶解在4mL DMF中，并在室温下搅拌过夜。将粗产物用丁醇稀释，用饱和NaCl溶液提取3次，并真空干燥。然后将粗品重新溶解在1mmol ZnCl2/MeOH溶液中。用制备型HPLC进行纯化，得到10.9mg黄色凝胶状LC014。产率：12％。
LC100的合成：将LC004(89mg，0.150mmol)添加到3mL二乙胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌3小时。将粗产物用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤。将粗样品用硅胶色谱(EtOAc/MeOH/TEA(v/v/v),150/1/1)纯化。获得63.8mg产物。产率：73.6％。
LC097的合成：将LC004(59.4mg,0.10mmol)添加到1mL 3,3'-亚胺基双(N,N-二甲基丙胺)和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌4小时。将粗产物用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤。用制备型HPLC进行纯化，获得41.8mg产物。产率：52％。
LC098的合成：将LC004(59.4mg,0.10mmol)添加到1mL N,N,N-三甲基-1,3-丙二胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌4小时。将粗产物用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤。用制备型HPLC进行纯化，获得43.2mg产物。产率：65％。
LC095的合成：将LC010(29.7mg,0.05mmol)添加到1mL 3,3'-亚胺基双(N,N-二甲基丙胺)和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌4小时。将粗产物用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤。用制备型HPLC进行纯化，获得36mg产物。产率：44.8％。
LC096的合成：将LC010(29.7mg,0.05mmol)添加到0.6mL N,N,N-三甲基-1,3-丙二胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌4小时。将粗产物用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤。用制备型HPLC进行纯化，获得46.5mg产物。产率：70％。
LC149的合成：将1,2-二溴乙烷(259μL,3mmol)和K2CO3(138mg,0.1mmol)添加到溶解在3mL丙酮中的异补骨脂查尔酮LC003(64.8mg,0.2mmol)中。将反应保持在回流条件下并搅拌两天。真空除去丙酮溶剂。将粗产物用乙酸乙酯稀释并用饱和氯化钠溶液提取。通过硅胶柱色谱，使用洗脱梯度(己烷:EtOAc(v/v),15:1)，获得纯LC149，63.4mg产物。产率：59.1％。
LC143的合成：将LC149(26.9mg,0.05mmol)添加到1mL乙二胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌5小时。将粗产物用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤。用制备型HPLC进行纯化，获得7.3mg LC143。产率：29.4％。
LC150的合成：将LC149(53.8mg,0.1mmol)添加到2mL二乙胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌5小时。将粗产物用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤。用制备型HPLC进行纯化，获得35.5mg LC150。产率：68％。
LC011的合成：将1,4-二溴丁烷(99.0μL,0.829mmol)和K2CO3(83.3mg,0.603mmol)添加到溶解在4mL丙酮中的异甘草素LC008(30.8mg,0.120mmol)中。将反应在62℃加热并搅拌过夜。真空除去丙酮溶剂。将粗产物用乙酸乙酯稀释并用饱和氯化钠溶液提取。通过硅胶柱色谱，使用洗脱梯度(PE:EtOAc(v/v),50:1)，获得纯LC011，37.7mg。产率：45.1％。
LC107的合成：将LC011(23.1mg,0.044mmol)添加到2mL二乙胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌3小时。用饱和NaCl溶液洗涤粗产物。用硅胶色谱(EtOAc/MeOH/TEA(v/v/v),100/1/1)纯化粗样品。获得20.3mg LC107。产率：90.6％。
LC010的合成：将1,4-二溴丁烷(548.5μL,4.62mmol)和K2CO3(213mg,1.54mmol)添加到溶解在4mL丙酮中的光甘草定LC007(101.6mg,0.313mmol)中。将反应在60℃加热并搅拌过夜。真空除去丙酮溶剂。粗产物用乙酸乙酯稀释并用饱和氯化钠溶液提取。通过硅胶柱色谱，使用洗脱梯度(PE:EtOAc(v/v),30:1)，获得纯LC010，145mg。产率：79.5％。
LC105的合成：将LC010(69.2mg,0.116mmol)添加到2mL二乙胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌3小时。将粗产物用饱和NaCl溶液洗涤。用硅胶色谱(EtOAc/MeOH/TEA(v/v/v),200/1/1)纯化粗样品。获得35.5mg LC105。产率：52.7％。
LC310的合成：将苔黑素(62mg,0.5mmol)、5-溴戊基三甲基溴化铵(418mg,2mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在3.5mL DMF中。将混合物在80℃搅拌24小时。反应后，将混合物溶解在丁醇中并用饱和NaCl溶液洗涤3次。真空除去丁醇。用制备型HPLC进行纯化，获得32mg LC310。产率：16.8％。
LC311的合成：将LC003(97mg,0.3mmol)、5-溴戊基三甲基溴化铵(289mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在60℃搅拌6小时。反应后，将混合物溶解在丁醇中并用饱和NaCl溶液洗涤3次。真空除去丁醇。用制备型HPLC进行纯化，获得44.2mgLC311。产率：28％。
LC312的合成：将LC003(97mg,0.3mmol)、3-溴丙基三甲基溴化铵(265mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在60℃搅拌6小时。反应后，将混合物溶解在丁醇中并用饱和NaCl溶液洗涤3次。真空除去丁醇。用制备型HPLC进行纯化，获得48.5mgLC312。产率：31％。
LC315的合成：将LC003(97mg,0.3mmol)、4-溴丁基三乙基溴化铵(317mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在60℃搅拌6小时。反应后，添加乙醚，将沉淀溶解在甲醇中，并用制备型HPLC纯化，获得59.1mg LC315。产率：31％。
LC316的合成：将LC007(97mg,0.3mmol)、5-溴戊基三甲基溴化铵(289mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在60℃搅拌6小时。反应后，将混合物溶解在丁醇中并用饱和NaCl溶液洗涤3次。真空除去丁醇。用制备型HPLC进行纯化，获得55.7mgLC316。产率：35％。
LC317的合成：将LC007(97mg,0.3mmol)、4-溴丁基三乙基溴化铵(317mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在60℃搅拌6小时。反应后，添加乙醚，将沉淀溶解在甲醇中，并用制备型HPLC纯化，获得63mg LC317。产率：33％。
LC350的合成：将LC003(97mg,0.3mmol)、3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴盐(298mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在50℃搅拌5小时。反应后，添加乙醚，将沉淀溶解在甲醇中，并用制备型HPLC纯化，获得46.5mg LC350。产率：25％。
LC365的合成：将LC003(97mg,0.3mmol)、1-(4-溴丁基)溴化吡啶(295mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在50℃搅拌5小时。反应后，添加乙醚，将沉淀溶解在甲醇中，并用制备型HPLC纯化，获得49.7mg LC365。产率：28％。
LC370的合成：将LC003(97mg,0.3mmol)、3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴盐(298mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在50℃搅拌5小时。反应后，添加乙醚，将沉淀溶解在甲醇中，并用制备型HPLC纯化，获得56.1mg LC370。产率：30％。
LC375的合成：将LC003(97mg,0.3mmol)、1-(4-溴丁基)溴化吡啶(295mg,1mmol)和K2CO3(272mg,2mmol)溶解在4mL DMF中。将混合物在50℃搅拌5小时。反应后，添加乙醚，将沉淀溶解在甲醇中，并用制备型HPLC纯化，获得65.1mg LC375。产率：37％。
LC005的合成：将碘乙酸乙酯(25.3μL,0.213mmol)和K2CO3(82.9mg,0.60mmol)添加到3mL丙酮中的LC003(31.6mg,0.097mmol)中。反应的处理类似于LC004的合成。通过硅胶色谱，使用洗脱梯度(己烷:EtOAc(v/v),12.5:1)，获得纯乙酸盐类似物，42.8mg。产率：88.5％。
LC101的合成：将2mL THF中的LC005(69.1mg,0.139mmol)添加到溶解在1mL水中的LiOH(31.6mg,1.32mmol)中。将溶液在室温下搅拌2小时，然后冷却至室温。将乙酸添加到混合物中并搅拌5分钟。用丁醇稀释后，将溶液用饱和NaCl溶液洗涤并用Na2SO4干燥过夜。真空除去溶剂，产物无需进一步纯化即可用于后续反应。将HOBt(55.0mg,0.360mmol)和ArgOMe(94.4mg,0.361mmol)引入溶解在DMF中的先前干燥的产物中。随后添加DIC(106μL,0.696mmol)。将混合物在室温下混合过夜。使用二乙醚沉淀进行进样前样品制备。用制备型HPLC进行纯化，获得18.3mg LC101。产率：16.8％。
LC127的合成：将2mL THF中的LC012(24.8mg,0.05mmol)添加到溶解在1mL水中的LiOH(31.6mg,1.32mmol)中。将溶液在室温下搅拌2小时，然后冷却至室温。真空除去溶剂，产物无需进一步纯化即可用于后续反应。将HOBt(35.0mg,0.23mmol)和精氨酰胺二盐酸盐(61.5mg,0.25mmol)引入溶解在DMF中的先前干燥的产物中。随后添加DIC(130μL,0.85mmol)和N,N-二异丙基乙胺(71.8μL,0.51mmol)。将混合物在室温下混合过夜。使用二乙醚沉淀进行进样前样品制备。用制备型HPLC进行纯化，获得17.4mg LC127。产率：42％。
LC131的合成：将2mL THF中的LC005(24.8mg,0.05mmol)添加到溶解在1mL水中的LiOH(31.6mg,1.32mmol)中。将溶液在室温下搅拌2小时，然后冷却至室温。真空除去溶剂，产物无需进一步纯化即可用于后续反应。将HOBt(35.0mg,0.23mmol)和精氨酰胺二盐酸盐(61.5mg,0.25mmol)引入溶解在DMF中的先前干燥的产物中。随后添加DIC(130μL,0.85mmol)和N,N-二异丙基乙胺(71.8μL,0.51mmol)。将混合物在室温下混合过夜。使用二乙醚沉淀进行进样前样品制备。用制备型HPLC进行纯化，获得13.3mg LC131。产率：32％。
LC137的合成：将2mL THF中的LC005(42.6mg,0.086mmol)添加溶解在1mL水中的LiOH(31.6mg,1.32mmol)中。将溶液在室温下搅拌2小时，然后冷却至室温。真空除去溶剂，产物无需进一步纯化即可用于后续反应。将HOBt(63.0mg,0.410mmol)和ArgOEt(118mg,0.43mmol)引入溶解在DMF中的先前干燥的产物中。随后添加DIC(130μL,0.85mmol)和N,N-二异丙基乙胺(156.8μL,0.9mmol)。将混合物在室温下混合过夜。使用二乙醚沉淀进行进样前样品制备。用制备型HPLC进行纯化，获得46.3mg LC137。产率：60.8％。
LC106的合成：将2ml THF中的LC012(107.7mg,0.217mmol)添加到溶解在1mL水中的LiOH(43.6mg,1.820mmol)中。将溶液在室温下搅拌2小时，然后冷却至室温。将乙酸添加到混合物中并搅拌5分钟。用丁醇稀释后，用饱和NaCl溶液洗涤溶液并用Na2SO4干燥过夜。真空除去溶剂，产物无需进一步纯化即可用于后续反应。
将HOBt(85.4mg,0.558mmol)和ArgOMe(153.8mg,0.589mmol)引入溶解在DMF中的先前干燥的产物中。随后添加DIC(164μL,1.089mmol)。将混合物在室温下混合过夜。使用二乙醚沉淀进行进样前样品制备。用制备型HPLC进行纯化，获得34.9mg LC106。产率：20.6％。
LC012的合成：将碘乙酸乙酯(175μL,1.48mmol)和K2CO3(208.9mg,1.51mmol)添加到LC007(95.8mg,0.295mmol)的4mL丙酮溶液中。反应的处理类似于LC010的合成。通过硅胶色谱法，使用洗脱梯度(己烷:EtOAc(v/v),20:1)，获得纯乙酸盐类似物LC012，107.7mg。产率：73.5％。
LC140的合成：将LC149(53.8mg,0.1mmol)添加到2mL N,N,N-三甲基-1,3-丙二胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌3小时。将粗产物用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤。用制备型HPLC进行纯化，获得22.5mg LC140。产率：37％。
LC148的合成：将1,3-二溴丙烷(305μL,3mmol)和K2CO3(138mg,0.1mmol)添加到溶解在3mL丙酮中的异补骨脂查尔酮LC003(64.8mg,0.2mmol)中。将反应保持在回流条件下并搅拌两天。真空除去丙酮溶剂。将粗产物用乙酸乙酯稀释并用饱和氯化钠溶液提取。通过硅胶柱色谱，施用洗脱梯度(己烷:EtOAc(v/v),20:1)，获得纯LC148，58.1mg产物。产率：52％。
LC204的合成：将LC148(56.6mg,0.1mmol)添加到2mL二乙胺和3mL DMSO的混合物中，并在室温下搅拌5小时。用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤粗产物。用制备型HPLC进行纯化，获得34.6mg LC204。产率：63.1％。
LC206的合成：向LC148(56.6mg,0.1mmol)的3mL DMF溶液添加轮环藤宁(86mg,0.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。将将粗产物溶解在丁醇中，随后用K2CO3水溶液和饱和NaCl溶液洗涤3次并真空干燥。用制备型HPLC进行纯化，获得26.2mg黄色凝胶状LC2O6。产率：35％。
LC013的合成：将碘乙酸乙酯(341.4μL,2.88mmol)和K2CO3(252.3mg,1.83mmol)添加到LC008(92.4mg,0.361mmol)的4ml丙酮溶液中。反应的处理类似于LC011的合成。通过硅胶色谱，用洗脱梯度(Hex:EtOAc(v/v),10:1)，获得纯乙酸盐类似物LC013，112.7mg。产率：73.1％。
LC108的合成：将2mL THF中的LC013(27mg,0.063mmol)添加到溶解在1mL水中的LiOH(14.5mg,0.605mmol)中。将溶液在室温下搅拌2小时，然后冷却至室温。将乙酸添加到混合物中并搅拌5分钟。用丁醇稀释后，将溶液用饱和NaCl溶液洗涤并用Na2SO4干燥过夜。真空除去溶剂，产物无需进一步纯化即可用于后续反应。将HOBt(24.2mg,0.158mmol)和ArgOMe(42.7mg,0.164mmol)引入溶解在DMF中的先前干燥的产物中。随后添加(48μL,0.315mmol)。将混合物在室温下混合过夜。使用二乙醚沉淀进行进样前样品制备。用制备型HPLC进行纯化，获得8.4mg LC108。产率：18.7％。
实施例8：生物学研究
体外
在革兰氏阴性细菌中，外膜和内膜都是脂质双层。每个双层都由脂质尾的一个疏水区和两个面向水溶液的头基区组成，形成夹心结构。为了扰乱细菌外膜和内膜，合成了许多由两个阳离子端基和一个疏水支架组成的bola型两亲化合物，阳离子端基和疏水支架可以分别与两个阴离子头基区和脂质尾区相互作用(图4)。疏水支架选自一系列天然产物(图9)。选择了许多阳离子基团，例如DPA-Zn、多胺、叔胺、季胺、胍和碱性胺酸(图8)。结果，通过组装疏水核心和阳离子基团合成了化合物文库。
针对一组黏菌素抗性菌株，包括7个mcr-1(+)菌株和4个mcr-1(-)菌株，测试了多种化合物的抗微生物活性和协同作用。表1a-1e显示了合成化合物的最小抑制浓度(MIC)。黏菌素显示了MIC 6.25μg/ml；然而，由于其毒性，黏菌素的断点为2-4μg/ml，这表明携带mcr-1的E.coli菌株对黏菌素具有抗性。它还表明，mcr-1阴性的E.coli菌株也具有抗性。
表1a.DPA-Zn化合物对一组黏菌素抗性菌株的MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000461
*E.Coli
**阴沟大肠杆菌
表1b.胺化合物对一组黏菌素抗性菌株的MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000471
*E.Coli
**阴沟大肠杆菌
表1c.胺化合物对一组黏菌素抗性菌株的MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000472
*E.Coli
**阴沟大肠杆菌
表1d.胺化合物对一组黏菌素抗性菌株的MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000481
*E.Coli
**阴沟大肠杆菌
表1e.LC137、LC140、LC143、LC150、LC204和LC206对一组黏菌素抗性菌株的MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000482
此外，由于其他一些对黏菌素组合敏感的机制，其他E.coli也对黏菌素具有抗性，但没有mcr-1突变，称为mcr-1(-)。大多数本发明的化合物对这些mcr(-)抗性菌株显示出抗微生物活性或与黏菌素组合协同作用(表2a-2e)。这表明本发明的组合对mcr-1(-)和mcr-1(+)细菌的相似工作机制。
表2a.存在DPA-Zn化合物时对一组黏菌素抗性菌株的黏菌素MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000491
*E.Coli
**阴沟大肠杆菌
表2b.在存在胺类似物时对一组黏菌素抗性菌株的黏菌素MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000501
表2c.在存在胺类似物时对一组黏菌素抗性菌株的黏菌素MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000511
*E.Coli
**阴沟大肠杆菌
表2d.在存在胺类似物时对一组黏菌素抗性菌株的黏菌素MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000521
*E.Coli
**阴沟大肠杆菌
表2e.在存在LC137、LC140、LC143、LC150、LC204、LC206时对一组黏菌素抗性菌株的黏菌素MIC(μg/ml)。
Figure BDA0003470188490000531
开发了四类化合物。第一类化合物是DPA衍生物，其中两个DPA-Zn部分通过两个接头基团连接于选定的疏水支架。MIC和协同活性如表1a和表2a所示。第一个概念验证化合物是Orc-DPA，其在50μg/ml时针对mcr-1细菌显示出与黏菌素的协同作用。相比之下，EDTA仅在浓度高于250μg/ml时起作用。然后优化疏水支架并合成了许多DPA衍生物。一种化合物GLA-DPA与5μg/ml的黏菌素协同作用。
第二类化合物是胺和多胺衍生物。使用不同的胺或多胺基团，开发了一系列类似物，例如LC100、LC098、LC097、LC096、LC095、LC300、LC301、LC302、LC304、LC140、LC204、LC206、LC100、LC107、LC143、LC014、LC105。针对mcr-1细菌，大多数这些化合物显示出与黏菌素的协同作用，结果总结在表1b-1e和2b-2e中。其中一种化合物LC100在单独使用时没有表现出任何活性，但表现出与2μg/ml黏菌素的极好协同作用。LC100已被选为体内和生物物理研究中的先导化合物，下面将进一步详细讨论。
第三类化合物是季胺类似物，包括LC311、LC312、LC315、LC316、LC317、LC350、LC365、LC370和LC375。相应的MIC和协同作用数据如表1b-1d和表2b-2d所示。与胺和多胺类似物相比，季胺类似物不仅与黏菌素协同作用，而且在单独使用时也显示出抗微生物活性。
第四类化合物是胍类似物，包括LC101、LC137、LC131、LC106、LC127、LC108。使用异补骨脂查尔酮(LC003)作为疏水核心开发的两种化合物LC101、LC137显示出与黏菌素的优异协同作用。此外，LC101和LC137在单独使用时也显示出中等抗微生物活性(MIC范围为12.5-25μg/ml)。
实施例9：LC100
为了进一步测试本发明化合物与黏菌素的抗微生物活性和协同活性，选择LC100作为模型化合物来进一步测试抗菌谱以及了解作用机制，这是因为LC100单独没有活性，但显示出与黏菌素的优异协同活性。首先使用不同浓度的L100测试协同作用。表3表明，随着LC100浓度的增加，协同作用变得更强。大于5μg/ml的LC100可使黏菌素MIC降至低至0.0975μg/ml，在此浓度，黏菌素的毒性要小得多。接下来，检查了LC100是否与多黏菌素B(PMB)协同作用，多黏菌素B(PMB)是以类似于黏菌素的方式发挥功能，但与黏菌素有一个残基差异的肽。表4中的数据表明，对多黏菌素B而言，该组合效果同样好。表5将这种组合的作用扩展到三种多重耐药形式的革兰氏阴性细菌：鲍曼不动杆菌(ACBA)、肺炎克雷伯菌(KLPN)和阴沟大肠杆菌。应当指出的是，KLPN菌株经遗传分析为碳青霉烯类抗性肠杆菌科(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)。结果表明该组合对这些碳青霉烯类抗性和多重耐药菌株有效。
还应当指出的是，该组合可有效杀灭大量细菌，而无需根据细菌种类改变药物浓度。实现这一点的唯一其他方法是使用消毒剂，例如酒精，但已知消毒剂是有毒的。
表3.在存在不同浓度的LC100时对一组黏菌素抗性菌株的黏菌素MIC(μg/ml)
Figure BDA0003470188490000551
*E.Coli
**阴沟大肠杆菌
表4.LC100和黏菌素对黏菌素敏感菌株的协同作用。
Figure BDA0003470188490000552
表5.LC100与黏菌素对多重耐药菌株的协同作用
Figure BDA0003470188490000561
发现，LC100与黏菌素的组合能够杀灭细菌，例如，对黏菌素和其他抗生素具有抗性的含有mcr-1的E.coli，对黏菌素和其他抗生素具有抗性的不含mcr-1的E.coli，对碳青霉烯类、氨基糖苷和其他抗生素具有抗性的抗性铜绿假单胞菌，对碳青霉烯类、黏菌素和其他抗生素具有抗性的的抗性鲍曼不动杆菌，和对碳青霉烯类、黏菌素和其他抗生素具有抗性的抗性肺炎克雷伯菌。表3显示，在不同浓度的LC100，杀灭细菌所需的黏菌素量发生了变化，证实了LC100实际上充当佐剂。在具有mcr-1的E.coli和其他细菌(如阴沟肠杆菌)中也发现了这种情况，从而支持了这种现象在广泛的细菌中都是真实的。
为了理解LC100与黏菌素组合的作用，在包括两种mcr-1(+)和一种mcr-1(-)菌株的三种黏菌素抗性菌株中，使用本发明的组合进行了时间杀灭实验。图13、图14和图15显示浓度等于或高于MIC的黏菌素在2小时内导致3log的减少。而在10μg/ml LC100存在时，1/8MIC的黏菌素在2小时内实现了相同的杀灭效果(就3log的减少而言)。快速的杀灭动力学表明，LC100和黏菌素的组合作用于细菌膜。
LC100和LC101不仅可以协同加强黏菌素或多黏菌素B的活性，而且还可以与其他阳离子肽协同作用。这是通过用另一种化合物B2088替换黏菌素进行测试的，B2088具有完全不同的化学性质，是带正电荷的肽，也与外膜具有物理化学相互作用。在协同研究中发现，在杀灭具有mcr-1突变的E.coli时，LC100或LC101在1μg/ml水平上与B2088具有协同作用，从而将活性提高10倍以上，如图16和表6所示。使用LC100和黏菌素的组合，进一步测试了范围广泛的菌株的活性(表7)。表7涵盖了范围广泛的细菌，其中许多对抗生素具有很强的抗性。似乎1μg/ml的黏菌素和5μg/ml的LC100的组合对除肺炎克雷伯菌(KLPN)之外的所有病原体都有效。这种组合似乎也可以安全使用。
还针对革兰氏阳性细菌，包括多重耐药菌株，例如MRSA，测试了本发明组合的抗微生物活性。表8显示单独的LC100或LC101对革兰氏阳性细菌株表现出良好的活性，表明单独的LC100或LC101对细菌内膜有很强的作用，因为革兰氏阳性细菌没有外膜。这意味着LC100/LC101与黏菌素的组合具有广泛的抗微生物谱，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有活性。
表6.LC100或LC101与B2088的协同研究结果
Figure BDA0003470188490000571
表7.本发明化合物作为黏菌素佐剂在各种病原体中的病原体敏感性
Figure BDA0003470188490000581
表7.续
Figure BDA0003470188490000591
表7.续
Figure BDA0003470188490000601
表8.LC100和LC101对革兰氏阳性细菌的抗微生物作用。
MCR1菌株 LC 100 IC 101
SA ATCC 29213 3.125 3.125
SA ATCC 6538 3.125 3.125
SA DM 4400R 3.125 3.125
MRSAATCC 43300 3.125 6.25
MRSAATCC 700699 3.125 6.25
MRSA DM 21455 3.125 3.125
实施例10：LC100和LC101的作用机制(具有mcr-1)
本发明的化合物被认为是促进黏菌素对革兰氏阴性细菌尤其是具有mcr-1突变的E.coli作用的佐剂化合物，这是因为这些化合物以协同方式起作用，从而将黏菌素的有效剂量降低10倍或更多。当与LC100或LC101结合使用时，黏菌素的MIC从超过6μg/ml变为低于0.5μg/ml。在6μg/ml时，由于浓度依赖性副作用，黏菌素被认为是使用不安全的。在其他形式的抗性革兰氏阴性细菌上，例如E.coli、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌，也观察到了与这两种化合物的协同作用。
尽管mcr-1细菌对黏菌素具有抗性，但有报道称黏菌素仍然可以扰乱mcr-1细菌的外膜。需要注意的是，仅破坏外膜不会直接导致细胞死亡，内膜必须受到影响，从而使跨膜电位丧失，水进入细菌。因此，假设在LC100与黏菌素组合的情况下，黏菌素和LC100共同作用以扰乱外膜，从而使LC100到达内膜。由于LC100对内膜具有很强的作用，因此细菌细胞因内膜破裂而死亡。
为了验证该假设，我们使用染料分子EtBr进行了荧光实验，当与DNA结合时EtBr会发出强烈的荧光。然而，EtBr是膜不透性的，这意味着它只能进入细菌细胞并与DNA结合，并且只有在细菌外膜和内膜都受到扰乱时才能发出荧光。图17显示，LC100和黏菌素当单独使用时仅诱导轻微的荧光，这表明这两种化合物都不能破坏细菌外膜。然而，在LC100和黏菌素组合存在时，有很强的荧光，表明mcr-1细菌的外膜和内膜都受到破坏了，证实了LC100和黏菌素的组合作用于细菌膜这一假设。LC100也有可能具有其他靶标。一种可能的靶标是MCR-1蛋白。为了了解LC100和MCR-1蛋白的相互作用，测量了在不同浓度的LC100存在时MCR-1蛋白的荧光。MCR-1蛋白含有几个色氨酸残基，在323nm处发出自发荧光。图18表明，随着LC100浓度的增加，荧光减弱。荧光猝灭效应表明，MCR-1蛋白与LC100之间存在强相互作用。
黏菌素和多黏菌素B可以与磷酸基团相互作用并扰乱头基，从而产生使膜的脂质尾暴露于水相的空腔。例如，在作为黏菌素类似物的阳离子多黏菌素B存在时，细菌膜的疏水表面积增加(图19)，从而允许多黏菌素B的脂质尾与细菌外膜的脂质尾之间的疏水缔合，导致对黏菌素的抗性。
假设LC100与黏菌素组合的功效来自于黏菌素的阳离子基团瞬时扰乱膜内氢键合网络的能力，从而暴露细菌膜中的疏水脂质基团。这种瞬时暴露似乎足以让LC100分子“钻入”并穿过外膜，到达内膜并杀灭细菌。微生物学数据表明，与黏菌素自身发挥作用所需的量相比，这种协同作用所需的黏菌素浓度可以降低4-100倍。LC100破坏了模拟内膜的脂质体这一观察结果加强了这一假设(图20)。推测的另一种作用模式是黏菌素分子在膜上形成通道样低聚物，这可能形成有助于LC100扩散到内膜中的空腔。
实施例11：LC100和LC101的作用机制(无mcr-1)
E.coli是mcr-1最喜欢的宿主，并且还经常在没有mcr-1突变的情况下对黏菌素具有抗性。有人提出这可能是由于阿拉伯糖的存在所致。糖分子有几个羟基，这些羟基也可以参与氢键合网络以稳定细菌膜，从而导致对黏菌素的抗性。如上所述，当测试LC100与黏菌素的组合对几种没有mcr-1的抗性细菌的影响时，发现在LC100存在下，E.coli对低浓度的黏菌素非常敏感，浓度低至<0.5μg/ml的水平。作用机制可能类似于上面针对具有mcr-1的细菌提出的机制，其中阳离子黏菌素可能会暂时扰乱膜内氢键网络，使膜中疏水腔的瞬时出现，进而促进具有很强的疏水核心的LC100进入脂质A的脂肪酸层，然后向下破坏细菌的内膜。
还发现碳青霉烯类抗性细菌对LC100和黏菌素的组合敏感。碳青霉烯类抗性是由细菌细胞质的生物合成酶由于这些蛋白质的突变引起的。这些细菌对黏菌素具有可变的敏感性。很可能在存在LC100和黏菌素的组合时，黏菌素与外膜的相互作用促进了LC100进入内膜，从而导致LC100能够杀灭细菌。
实施例12：LC100的体内研究
为了评估LC100和黏菌素组合的体内功效，使用了中性白细胞减少症小鼠大腿感染模型。将30只小鼠分为5组：对照、10mg/kg黏菌素、50mg/kg LC100、100mg/kg美洛培南以及50mg/kg LC100和10mg/kg黏菌素的组合。在感染后1小时腹膜内施用每次治疗。起始接种物为1.87x106，治疗后6小时，将小鼠大腿组织匀质化以获得活CFU。图21显示单独的LC100或黏菌素不能减少细菌负荷，而组合在6小时内导致了1.2log的减少。由于研究中使用了中性白细胞减少症小鼠，细菌负荷减少1.2log是由于LC100和黏菌素的组合而不是小鼠的免疫系统所致。作为对照，美洛培南显示出更显著的活性(减少2log)，因为浓度高且细菌菌株对青霉烯敏感。
工业实用性
所公开的化合物可以用于与细菌膜相互作用并破坏细菌膜。所公开的化合物单独或与黏菌素共施用时可以有效杀灭革兰氏阳性细菌。所公开的化合物单独或与黏菌素共施用时可以有效杀灭mcr阳性革兰氏阴性细菌。所公开的化合物当与黏菌素共施用时还可以有效杀灭MCR阴性但仍对黏菌素具有抗性的革兰氏阴性细菌。此外，所公开的化合物当与黏菌素共施用时可以有效杀灭范围宽泛的革兰氏阴性细菌，包括对碳青霉烯类具有抗性的细菌。
所公开的化合物可以用作抗生素，以在治疗中杀灭或抑制微生物的生长，和/或用于治疗细菌感染。
所公开的化合物可以用于杀灭或抑制表面微生物的生长，包括但不限于局部应用、在膏药、滴眼液、鼻喷雾剂、漱口水和洗手液中。所公开的化合物还可用于食品防腐剂、消毒剂、表面清洁剂或医疗器械。
所公开的制备所公开化合物的方法可以是简便的，使用温和的反应条件，有利于化合物的低成本和大规模合成。
显然，在阅读了上述公开后，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，对本发明的各种其他修改和适应性变化，对本领域技术人员而言会是显而易见的，因此规定所有这些修改和适应性变化都在所附权利要求的范围内。

Claims (47)

1.具有下式(I)的化合物：
Z1-L1-A-L2-Z2 式(I)
其中A是疏水部分；
L1和L2独立地是接头；且
Z1和Z2独立地是含N部分。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中A包含至少一个取代或未取代的芳基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中A还包含至少一个烯基。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中A是平面的或基本上平面的。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中A还包含至少一个异戊二烯基。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中A选自：
Figure FDA0003470188480000011
Figure FDA0003470188480000021
Figure FDA0003470188480000022
及其任何混合物，
其中所述断键表示所述结构连接到式(I)的其余部分的位置。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中A选自：
Figure FDA0003470188480000031
及其任何混合物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z1和Z2的pKa值独立地大于9。
9.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z1和Z2独立地具有以下结构：
Figure FDA0003470188480000032
其中所述断键表示所述结构连接到式(I)的其余部分的位置；
R1和R2独立地是氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的氨基烷基、胍、取代或未取代的胍基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、氨基酸或肽，或R1和R2一起形成饱和或不饱和、取代或未取代的杂环；且
R3不存在或为氢或取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的氨基烷基、胍、取代或未取代的胍基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、氨基酸或肽，
其中当R3存在时，氮原子是阳离子四价氮。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中R1、R2和R3独立地包含选自以下的官能团：胺、胍、吡咯烷、吡咯、咪唑烷、吡唑烷、咪唑、吡唑、三唑、哌啶、吡啶、哌嗪、二嗪、异羟肟酸、肼、N-羟基脲、方酸、氨基甲酰基膦酸盐、噁唑啉、嘧啶三酮、1-羟基-2(1H)-吡啶酮(1,2-HOPO)及其任何组合。
11.根据权利要求9或10所述的化合物，其中R1、R2和R3独立地选自甲基、乙基、丙基、丁基、-(CH2)xNR’R”、-(CH2)xOH、-(CH2)xPO3、-(CH2)xCR’R”R”’、-(C(NH2)NHC(NH2))x-NH2、胍、2-甲基吡啶、1-甲基咪唑、吡啶、联吡啶、三联吡啶、菲咯啉、3-甲基吡咯、轮环藤宁(1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、环拉胺(1,4,8,11-四氮杂环十四烷)、1,8-二甲基-1,4,8,11-四氮杂环十四烷、1,4,7-三氮杂环壬烷、精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、聚ε赖氨酸及其任何混合物，其中x可以为1-10的任何整数，且R’、R”和R”’独立地为氢或取代或未取代的烷基。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的化合物，其中Z1和Z2独立地选自：
Figure FDA0003470188480000041
Figure FDA0003470188480000051
Figure FDA0003470188480000052
及其任何组合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中L1和L2独立地为取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、酯、酰胺、醚、-(O-CH2-CH2-O)n-、L3或其任何组合，其中L3具有以下结构：
Figure FDA0003470188480000061
其中n是1-10的整数，R4是氨基或杂烷基，且所述断键表示所述结构连接到式(I)的其余部分的位置。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中L1和L2独立地选自-(CH2)4-、酰胺、
Figure FDA0003470188480000062
及其任何组合或
Figure FDA0003470188480000063
Figure FDA0003470188480000064
15.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述式(I)化合物的logP值大于4。
16.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述式(I)的化合物具有以下结构：
Figure FDA0003470188480000071
Figure FDA0003470188480000081
Figure FDA0003470188480000091
Figure FDA0003470188480000101
Figure FDA0003470188480000111
Figure FDA0003470188480000121
Figure FDA0003470188480000131
Figure FDA0003470188480000141
17.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中每个含N部分都独立地与锌螯合。
18.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中每个含N部分都独立地具有正电荷。
19.药物组合物，包含前述权利要求中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，以及药学上可接受的载体。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是盐水。
21.一种制备根据权利要求1-18中任一项所述的化合物的方法，包括在反应条件下使疏水部分与含N部分接触的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，还包括在与所述含N部分接触之前使所述疏水部分与接头接触的步骤。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中在所述疏水部分与所述含N部分之间、或所述疏水部分与所述接头之间、或所述接头与所述含N部分之间形成共价键。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述疏水部分选自：
Figure FDA0003470188480000151
Figure FDA0003470188480000161
及其任何混合物。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述接头选自1,4-二溴丁烷、1,3-二碘丁烷、碘乙酸乙酯、羟基苯并三唑、1,2-二溴乙烷、1,3-二溴丙烷、碘乙酸甲酯、溴乙酸甲酯、1,4-二碘丁烷及其任何组合。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述含N部分选自二吡啶甲基胺、轮环藤宁、1,8-二甲基1,4,8,11-四环十四烷、二乙胺、-NH[(CH2)3N(CH3)]2、-NH2(CH2)3N(CH3)2、5-溴戊基三甲基溴化铵、3-溴戊基三甲基溴化铵、4-溴丁基三乙基溴化铵、3-(4-溴丁基)-1-甲基咪唑溴盐、1-(4-溴丁基)溴化吡啶、1-(4-溴丁基)吡啶溴化物及其任何组合。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，包括在所述含N部分与所述接头或疏水部分共价键合之后添加锌的步骤。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的方法，其中在选自丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷、吡啶、水及其任何混合物的溶剂中进行所述接触。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的方法，其中在约21℃至约160℃的温度进行所述接触步骤。
30.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述接触步骤进行约2小时至约36小时的持续时间。
31.根据权利要求1-16中任一项所述的化合物或权利要求19或20所述的药物组合物在体外杀灭微生物或抑制微生物生长的用途。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述微生物是细菌、古细菌、真菌、原生生物或其任何混合物。
33.根据权利要求32所述的用途，其中所述微生物是革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
34.根据权利要求32或33所述的用途，其中所述细菌是MCR阳性或MCR阴性的。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的用途，其中所述细菌是碳青霉烯类抗性的。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的用途，其中根据权利要求1-16中任一项所述的化合物与黏菌素结合使用。
37.一种根据权利要求1-16中任一项所述的化合物，用于治疗。
38.一种治疗细菌感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-16中任一项所述的化合物的步骤。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法还包括结合施用治疗量的黏菌素和根据权利要求1-16中任一项所述的化合物的步骤。
40.一种根据权利要求1-16中任一项所述的化合物，用于治疗细菌感染。
41.根据权利要求40所述的化合物，其中权利要求1-16中任一项所述的化合物与黏菌素结合施用。
42.根据权利要求1-16中任一项所述的化合物在制备用于治疗细菌感染的药物中的用途。
43.根据权利要求42所述的用途，其中根据权利要求1-16中任一项所述的化合物与黏菌素结合施用。
44.根据权利要求38和39所述的方法、根据权利要求40和41所述的化合物、或根据权利要求42和43所述的用途，其中根据权利要求1-16中任一项所述的化合物以约2μg/mL至约75μg/mL的量存在。
45.根据权利要求39所述的方法、根据权利要求41所述的化合物、或根据权利要求43所述的用途，其中根据权利要求1-16中任一项所述的化合物和黏菌素以按重量计相等的量存在，或根据权利要求1-16所述的化合物按重量计以黏菌素的约1.5至约6倍过量存在。
46.根据权利要求45所述的方法、化合物或用途，其中黏菌素以约1mg/kg至约10mg/kg的范围存在，且根据权利要求1-16中任一项所述的化合物以10mg/kg至约50mg/kg的范围存在。
47.根据权利要求38-39所述的方法、根据权利要求42和42所述的化合物、或根据权利要求43所述的用途、根据权利要求40或41、或根据权利要求42和43所述的用途，其中根据权利要求1-16所述的化合物被或将被肌肉内、腹膜内、局部、皮下或静脉内施用。
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