CN114097703A - 一种提高动物精子活力和繁殖能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高动物精子活力和繁殖能力的方法。本发明公开的提高动物精子活力和繁殖能力的方法，均包括对雄性哺乳动物饲喂牛磺酸以实现其精子活力的提高和繁殖能力的提高。本发明发现了一种牛磺酸的新用途，其能调节精子获能、提高精子活力，对雄性小鼠和公猪精子质量和繁殖能力的提高有重要作用。通过在动物的饲料或饮用水中添加牛磺酸，动物精子的活力以及繁殖能力得到提高。牛磺酸成本低、安全有效、无毒副作用，具有良好的市场前景。本发明为提高畜牧生产效益提供新思路。

Description

一种提高动物精子活力和繁殖能力的方法

技术领域

本发明涉及农业畜牧领域中，一种提高动物精子活力和繁殖能力的方法。

背景技术

精液品质(包括精液体积、精液密度、精子活力及精子形态)对雌性动物的产仔率、产仔数和繁殖力有直接影响。雄性动物的精液品质受品种、环境、饲养管理和营养等多方面因素的影响。

牛磺酸，一种含硫氨基酸，化学名称为2-氨基乙磺酸(Taurine，简写Tau)，俗称牛胆酸、牛胆碱等，因首次从牛胆汁中分离而得名。牛磺酸在动物界有着广泛的分布，尤其是在海洋类动物中牛磺酸浓度很高；在哺乳动物中，牛磺酸是很多组织含量最多的游离氨基酸，包括心脏、脑、骨骼肌、肝脏和肾脏，此外，体液及分泌性组织中牛磺酸含量也很丰富。在细胞水平，牛磺酸具有抵抗氧化应激、调节渗透压、调节Ca²⁺平衡、调节基因表达、减少内质网应激、维持质膜稳定性、调节线粒体功能等作用。牛磺酸对细胞的保护作用使其在很多生理过程中发挥重要功能，包括对细胞体积的调节、神经系统功能的调节、蛋白质稳定性的维持以及应激反应和免疫反应的调节。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高哺乳动物精子活力及生殖能力。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述X1或X2的方法：

X1、一种提高哺乳动物精子活力的方法，包括：对雄性哺乳动物饲喂牛磺酸实现其精子活力的提高；

X2、一种提高哺乳动物生殖能力的方法，包括：对雄性哺乳动物饲喂牛磺酸实现所述哺乳动物生殖能力的提高。

上述方法中，所述对雄性哺乳动物饲喂牛磺酸可通过在所述哺乳动物的饮用水或饲料中添加牛磺酸实现。

上述方法中，所述哺乳动物的饮用水中牛磺酸的含量可为3g/L；饲料中牛磺酸的含量可为3g/kg。

所述生殖能力可体现在见栓率、怀孕率、窝产仔数和/或雄性动物睾酮含量上。

所述精子活力可体现在精子受精能力、直线运动精子所占比例、精子的平均运动速度、直线运动速度、曲线运动速度和/或尾部鞭毛摆动振幅上。

本发明还提供了一种哺乳动物的饲养方法，所述方法包括：利用添加牛磺酸的饲料或饮用水饲喂哺乳动物，实现所述哺乳动物的饲养。

所述哺乳动物为雄性哺乳动物。

牛磺酸在制备哺乳动物饲料或饮用水中的应用，也属于本发明的保护范围。

牛磺酸在制备哺乳动物精子获能液中的应用，也属于本发明的保护范围。

上文中，所述哺乳动物可为家畜或啮齿类动物。具体的，所述家畜可为猪(如长白猪)，所述啮齿类动物可为小鼠。

所述雄性小鼠可为低生殖能力和/或具有低精子活力的小鼠。在本发明的一个实施例中，所述雄性小鼠为CSAD敲除小鼠。

本发明发现了一种牛磺酸的新用途，牛磺酸能调节精子获能、提高精子活力，对雄性小鼠和公猪精子质量和繁殖能力的提高有重要作用。通过在动物的饲料或饮用水中添加牛磺酸，动物精子的活力以及繁殖能力得到提高。牛磺酸成本低、安全有效、无毒副作用，具有良好的市场前景。本发明为提高畜牧生产效益提供新思路。

附图说明

图1为小鼠体内受精率的检测结果。左上图为一组野生型雄性小鼠与野生型雌性小鼠交配36h后胚胎发育情况，右上图为一组CSAD KO雄性小鼠与野生型雌性小鼠交配36h后胚胎发育，左下图为一组饮用水中补充3g/L牛磺酸的CSAD KO雄性小鼠与野生型雌性小鼠交配36h后胚胎发育情况，右下图为三组小鼠体内受精率的统计结果。

图2为蛋白酪氨酸磷酸化检测结果。

图3为小鼠精子运动能力分析。同一指标下，标有不同大写字母的组别间有极显著差异(P＜0.01)，标有相同大写字母的组别间差异不显著，标有不同小写字母的组别间有显著差异(P＜0.05)，标有相同小写字母的组别间差异不显著。

图4为牛磺酸对种公猪精子运动能力影响的检测。左图为种公猪血清中牛磺酸浓度检测结果，中间图为能动精子所占比例结果，右图为直线运动精子所占比例的结果。*表示有显著差异，P＜0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、饮水添加牛磺酸用于提高雄性小鼠的精子活力

1)敲除小鼠体内牛磺酸含量降低

野生组，野生型129品系雄鼠饲喂不含牛磺酸饲料且饮水中添加3g/L牛磺酸；

敲除组，CSAD敲除雄鼠(CSAD KO雄鼠)饲喂不含牛磺酸饲料与不含牛磺酸饮用水，CSAD敲除雄鼠记载在“CSAD和TauT基因敲除小鼠模型的建立以及牛磺酸对雄性小鼠生殖功能的影响，赵建军，中国农业大学毕业论文，2015”一文中第二章节2.5.4—2.5.9部分，为将129品系小鼠中CSAD基因敲除得到的雄性小鼠；

敲除补充牛磺酸组，CSAD KO雄鼠饲喂不含牛磺酸饲料同时饮用水中补充3g/L牛磺酸。

各组保证至少6只雄鼠，初始小鼠均约3-4周龄，连续处理2个月后，采集血清、睾丸和附睾按牛磺酸检测的标准方法进行牛磺酸含量检测。各组处理2个月后牛磺酸含量检测结果如表1所示。

表1.敲除小鼠牛磺酸含量检测

表1中数值表示为平均值±标准误，同列不同字母表示有显著性差异。

表1结果表明，按上述饲喂标准连续处理2个月后，CSAD KO雄鼠体内牛磺酸含量相对于正常野生组有显著降低，补充牛磺酸的CSAD KO雄鼠体内牛磺酸含量与正常野生组相比没有差异，并显著高于敲除组小鼠。说明，饲喂牛磺酸可以增加雄鼠体内牛磺酸含量。

2)牛磺酸对雄鼠生殖能力的影响

按照步骤1)中三组小鼠的分组(每组10只)与饲养方式处理2个月后分别与野生型ICR品系雌鼠合笼，次日检查阴道栓。配种成功的雄鼠(以雌鼠检查到阴道栓为鉴定标准)间隔2日后再次与雌鼠进行合笼。见栓的雌鼠单独饲养，记录见栓情况及雌鼠的怀孕、产仔情况。实验连续进行2个月。配种实验统计结果如表2。

表2中，见栓率：见栓的雌鼠总数/雄鼠配种次数×100％。

怀孕率：产仔的雌鼠数/见栓的雌鼠数×100％。

平均窝产仔数：产仔的总数/产仔的总窝数。

表2.雄性小鼠配种实验

表2中数值表示为平均值±标准误，同列不同字母表示有显著性差异，有相同字母表示无显著性差异。

由表2中的配种实验结果可以看出，缺乏牛磺酸的CSAD KO雄鼠见栓率和怀孕率相对于野生组分别有45％和47.41％的下降，前者平均窝产仔数与野生组相比也有23.30％的降低；饮水中补充牛磺酸的CSAD KO雄鼠见栓率、怀孕率和平均窝产仔数分别高于敲除组46.00％(P＜0.05)、65.38％和15.88％，与野生组相比均不存在显著性差异。说明，饲喂牛磺酸可以增加见栓率、怀孕率和平均窝产仔数。

3)牛磺酸对雄性小鼠睾酮合成和分泌的影响

按照步骤1)中三组小鼠的分组(每组6只)与饲养方式处理2个月。对雄鼠进行眼眶采血，收集血清，检测睾酮浓度。牛磺酸对睾酮合成和分泌的影响如图表3所示。

小鼠血清中睾酮浓度的检测由北方生物技术研究所利用其所生产的放射免疫试剂盒完成。

表3.雄性小鼠血清睾酮含量检测

表3中数值表示为平均值±标准误，同列不同字母表示有显著性差异，有相同字母表示无显著性差异。

表3睾酮含量检测结果表明，牛磺酸缺乏的敲除组雄鼠血清睾酮含量较野生组有显著降低，饮水中补充3g/L牛磺酸的敲除雄鼠血清睾酮含量相对于敲除组有2.95倍(P＜0.05)的显著升高，与对照组相比没有差异。说明，饲喂牛磺酸可以增加睾酮含量。

4)牛磺酸对小鼠精子受精能力的影响

按照步骤1)中三组小鼠的分组(每组10只)与饲养方式处理2个月。各雄鼠分别与野生型ICR成年雌鼠合笼,第二天上午检查阴道栓。见栓雌鼠单独饲养，见栓第二天下午15:00-16:00断颈处死,采集输卵管冲出胚胎。统计体内受精率。

体内受精率：冲出胚胎的二细胞率。体内受精率＝二细胞数目/细胞总数×100％。

图1中柱形图为体内受精的统计结果，柱状图上方不同字母表示有显著性差异。野生组、敲除组和敲除补充牛磺酸组的体内受精率分别为98.33±1.67％、26.51±13.44％、77.93±9.28％。图1的结果表明，敲除组体内受精率与野生组相比有73.04％(P＜0.05)的显著降低；饮水中补充3g/L牛磺酸的敲除小鼠，体内受精率相对于敲除组有1.94倍(P＜0.05)的显著升高，与野生组相比不存在显著差异。说明，饲喂牛磺酸可以增加体内受精率。

5)牛磺酸对小鼠精子活力的影响

按照步骤1)中三组小鼠的分组(每组10只)与饲养方式处理2个月。雄鼠在配种成功(与之交配的雌鼠检查到阴道栓)后的3-7天内进行脏器系数(脏器重量/体重)、附睾尾精子计数检测、精子获能检测及精子运动能力分析。

表4.睾丸、附睾脏器系数及精子计数

表4中数值表示为平均值±标准误。

表4结果表明，敲除组小鼠睾丸和附睾重量与野生组和敲除补充牛磺酸组小鼠相比没有显著性差异。敲除组小鼠附睾尾中精子数目相对野生组虽有31.0％的降低，但差异不显著；敲除组与补充牛磺酸组相比，附睾尾精子数目也无显著差异。说明，牛磺酸不影响睾丸和附睾重量以及附睾尾精子数量。

为了检测野生组和敲除组雄鼠精子获能是否有差异，体外分离野生组和敲除组雄鼠附睾尾，在台式获能液(0.666g NaCl，0.0238g KCl，0.209g NaHCO₃,0.0047g MgCl₂,0.1gGlucose,0.0294g CaCl₂·2H₂O，0.0055g丙酮酸钠，0.0048g NaH₂PO₄，0.24g Hepes，0.35mL60％乳酸钠，3mg BSA，加超纯水定容至100mL)中挤出精子。分别在不同的获能时间(0/30/60/90/120min)收集精子(约10⁶个)提取蛋白，用蛋白免疫印迹方法检测获能标记分子——蛋白酪氨酸磷酸化的变化。检测结果如图2所示，从蛋白免疫印迹结果可以看出敲除组雄鼠精子在获能过程中发生酪氨酸磷酸化的蛋白种类和数量均有减少。

获能时间是指成熟精子需要在通过生殖道的过程中经历一系列生理生化变化，才能获得受精能力，这一过程称为精子获能，一般为1-1.5h。本发明中不同的获能时间是指小鼠精子在台式获能液中孵育的时间。

蛋白免疫印迹方法中所用抗体为Phospho-Tyrosine抗体(Abcam,Ab9411)。

检测三组小鼠精子的运动能力，分析结果如图3。

敲除组小鼠精子能动性相对于野生组和敲除补充牛磺酸组小鼠分别有41.70％和37.44％的显著降低(P＜0.05)，敲除补充牛磺酸组与野生组之间无显著差异。能动性是指活动精子所占比例。

敲除组小鼠直线运动精子所占比例相对于野生组和敲除补充牛磺酸组小鼠分别有59.62％(P＜0.05)和37.71％的降低，后两者之间没有显著差异。直线运动精子所占比例是指呈现直线向前运动精子所占的比例。

敲除组小鼠精子的平均运动速度、直线运动速度、曲线运动速度和尾部鞭毛摆动振幅与野生组相比分别有49.55％、53.98％、48.88％和43.47％的显著降低(P＜0.05)，敲除补充牛磺酸组小鼠精子的运动速度相对于敲除组均有显著提高，与野生对照组相比不存在差异性。精子尾部鞭毛摆动频率在三组间无显著差异。

平均运动速度是指精子头沿其空间轨迹的平均运动速度，由计算机将精子运动的实际轨迹平均后计算出来。直线运动速度是指精子头部直线移动距离的速度。曲线运动速度是指精子头部沿实际行走曲线的运动速度。尾部鞭毛摆动振幅是指精子尾部的侧摆幅度。

以上结果说明雄性小鼠牛磺酸的缺乏会严重影响雄鼠的繁殖能力，导致雄性小鼠配种能力下降、雄鼠配种的雌鼠怀孕率降低。在雄性生殖系统中，牛磺酸的缺乏除了会影响睾丸间质细胞睾酮的合成及分泌外，还会影响精子的功能，导致精子获能发生障碍、精子的运动能力降低、体内受精率下降，补充牛磺酸后精子的功能恢复到野生对照组的水平。

实施例2、饲料添加牛磺酸能提高公猪的精子活力

1、实验地点

河北裕丰京安养殖有限公司

2、牛磺酸饲料的配制方法

牛磺酸饲料：按重量比在正常饲料中加入3g/kg的食品级牛磺酸(1公斤饲料中加入3克牛磺酸)，充分搅拌均匀。

3、实验动物与方法

对照组：长白种公猪20头，饲喂正常饲料；

牛磺酸补充组(即实验组)：长白种公猪20头，饲喂牛磺酸饲料；

饲喂85天后，采集各公猪血液按照实施例1的方法进行牛磺酸含量测定。人工采精，收集到的精子进行精子运动能力分析。

分析结果如图4所示，结果显示，饲料中补充3g/kg牛磺酸的实验组种公猪血清中牛磺酸含量相比对照组有18.34％(P＜0.05)的显著增加。实验组种公猪能动精子所占比例与对照组相比没有显著差异，但其直线运动精子所占比例相比于对照组种公猪有13.21％(P＜0.05)的显著升高。

以上结果表明饲料中补充3g/kg的牛磺酸对种公猪的精子质量有显著提高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.下述X1或X2的方法：

X1、一种提高哺乳动物精子活力的方法，包括：对雄性哺乳动物饲喂牛磺酸实现其精子活力的提高；

X2、一种提高哺乳动物生殖能力的方法，包括：对雄性哺乳动物饲喂牛磺酸实现所述哺乳动物生殖能力的提高。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对雄性哺乳动物饲喂牛磺酸通过在所述哺乳动物的饮用水或饲料中添加牛磺酸实现。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述哺乳动物的饮用水中牛磺酸的含量为3g/L；饲料中牛磺酸的含量为3g/kg。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述哺乳动物为家畜或啮齿类动物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述家畜为猪，所述啮齿类动物为小鼠。

6.哺乳动物的饲养方法，包括：将牛磺酸添加至饲料或水中获得的含牛磺酸饲料或饮用水饲喂哺乳动物，实现所述哺乳动物的饲养。

7.牛磺酸在制备哺乳动物饲料或饮用水中的应用。

8.牛磺酸在制备哺乳动物精子获能液中的应用。

9.根据权利要求6所述的方法或权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述哺乳动物为家畜或啮齿类动物。

10.根据权利要求8所述的方法或应用，其特征在于：所述家畜为猪，所述啮齿类动物为小鼠。

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