CN114058519A - 一种有机污染物和秸秆降解促进剂及其应用 - Google Patents

一种有机污染物和秸秆降解促进剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种有机污染物和秸秆降解促进剂及其应用，所述促进剂按如下方法制备：将彩绒革盖菌、里氏木霉和黑曲霉分别接种至固体发酵培养基中，在25‑32℃、空气相对湿度75‑95％条件下通风培养7‑12d，获得所述有机污染物和秸秆降解促进剂；本发明促进剂既可用于秸秆快速还田，还可促进土壤有机污染物的高效降解，可大大降低使用成本，避免人工合成介体的二次污染问题。利用SSD促进剂处理含土霉素、2,4,5‑三氯酚以及毒死蜱的污染土壤，无需外加介体，三种污染物的降解率即可达94.74％、78.35％以及73.56％。发酵第10天对秸秆的降解率高达53.09％。

Description

一种有机污染物和秸秆降解促进剂及其应用
(一)技术领域
本发明涉及微生物发酵工程及环境治理技术领域，特别涉及一种土壤污染修复的方法。
(二)背景技术
我国土壤污染情况十分严峻，由于工业三废的大量排放、农药、化肥及抗生素的大规模使用，大量有机污染物排放到环境中并在土壤里不断累积。土壤中的有机污染物会进入植物组织，并通过食物链富集到动物和人体内，从而危害人体健康，甚至引发癌症和其他疾病。据报道，全国受污染的农田耕地占比22.1％,其中农药、抗生素等是土壤中常见的有机污染物。解决土壤污染问题、保护土地资源的可持续利用以及农产品的食用安全已刻不容缓。
以漆酶为核心的土壤生物修复研究，近年来已受到国内外的高度关注。漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)是一类多酚氧化酶，作为一种多功能环保型催化剂，除参与木质素降解之外，还可催化多种酚类和芳香类有机污染物及其衍生物的氧化。但目前将漆酶应用于土壤修复还存在着许多困难，首先是酶制剂的价格太高，难以规模化应用。其次是由于漆酶的氧化还原电势较低，对于大部分有机污染物需要小分子介体参与介导氧化。介体是一类起电子传递中间体作用的低分子量化合物，在催化过程中，先于底物迅速与漆酶反应，产生自由基后再与底物发生氧化作用，同时自身被还原。目前常用的合成介体稳定性较差、价格过高、还可能会对土壤造成二次污染。
农作物秸秆是廉价的可再生木质纤维素资源，我国每年的秸秆产量高达7亿多吨，这些资源长期以来未得到合理利用。在自然条件下秸秆的腐熟分解速度缓慢，秸秆的大量堆积会影响土壤的物理性状和后续耕作。而焚烧秸秆不但浪费资源，还会造成严重的环境污染。现有的秸秆腐熟菌剂对秸秆的腐解周期较长(通常要25d左右)，研制绿色、高效的秸秆还田技术对于增加土壤肥力，减少化肥用量，改善农业生态环境具有重要作用。
秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，它们分别可被特定的微生物高效降解。里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)的优良菌株能分泌高活力的纤维素酶和木聚糖酶，对秸秆纤维素和半纤维素实现快速降解；彩绒革盖菌(Trametes versicolor)能分泌高活力的漆酶，漆酶在催化秸秆木质素降解的过程中，会释放大量木质素降解中间产物，它们可作为天然介体回补给漆酶，从而增强漆酶的催化能力，拓展其底物谱，并实现对土壤有机污染物的广谱、高效降解。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种有机污染物和秸秆降解促进剂及其应用，该促进剂既可快速降解秸秆还田，又可实现土壤有机污染物的高效降解，对于增加土壤肥力，减少化肥用量，改善农业生态环境以及污染土壤的生物修复具有重要作用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种有机污染物和秸秆降解促进剂，所述促进剂按如下方法制备：将彩绒革盖菌、里氏木霉和黑曲霉分别接种至固体发酵培养基中，在25-32℃、空气相对湿度75-95％条件下通风培养7-12d，发酵产物即为所述有机污染物和秸秆降解促进剂；
所述固体发酵培养基是由发酵基质和水组成，所述水的质量含量为60-80％；所述发酵基质的质量组成为：秸秆60-80％、麸皮20-40％、(NH4)2SO4 1.0-3.0％、尿素0.2-0.8％、KH2PO40.2-0.8％、CaCl20.2-0.8％、MgSO4·7H2O 0.1-0.4％、CoCl2 0.02-0.08％、CuSO4 0.01-0.05％，总量为100％；所述秸秆包括稻草秸秆、麦草秸秆或玉米秸秆。
进一步，所述彩绒革盖菌优选彩绒革盖菌(Trametes versicolor)ATCC20869，所述里氏木霉优选里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC56764，所述黑曲霉优选黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC52172。
进一步，优选所述发酵基质的质量配方如下：80％水稻秸秆(10-20目)、16％麸皮、2.0％(NH4)2SO4、0.6％尿素、0.5％KH2PO4、0.53％CaCl2、0.3％MgSO4·7H2O、0.05％CoCl2、0.02％CuSO4。
进一步，优选所述固体发酵培养基中水的质量含量为70％。
进一步，所述彩绒革盖菌、里氏木霉和黑曲霉分别以种子液形式接种，其中彩绒革盖菌种子液，里氏木霉种子液和黑曲霉种子液接种体积比为1：0.5-1.5：0.3-1.0，总体积接种量以固体发酵培养基重量计为0.1-1mL/g，优选体积比为1：1：0.5，总接种量优选0.1mL/g。
进一步，所述里氏木霉种子液按如下步骤制备：
将里氏木霉(优选里氏木霉ATCC56764)试管斜面移入摇瓶中的二级种子培养基，30-32℃、180rpm摇床培养48h，获得二级液体菌种；按照10％(V/V)接种量，将二级液体菌种接入三级种子培养基中，28-32℃、180rpm培养6d，获得里氏木霉种子液；所述二级种子培养基配方为：葡萄糖15g/L，玉米浆10g/L，酵母粉10g/L，(NH4)2SO42.5g/L，KH2PO4 6g/L，CaCl21g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，CaCO3 0.4g/L，微量元素0.2ml/L，溶剂为水，pH4.8；微量元素：ZnSO4·7H2O 1.4g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L，CoC12·6H2O 3.7g/L，H3BO3 0.4g/L，(NH4)6Mo7O241.6g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，溶剂为水；
所述三级种子培养基由种子基质与水以质量比1:2.2组成，所述种子基质质量组成为：59％稻草，37％麸皮、2.0％(NH4)2SO4、0.6％尿素、0.58％KH2PO4、0.5％CaCl2、0.25％MgSO4·7H2O、0.05％CoCl2、0.02％CuSO4，总量100％。
进一步，所述黑曲霉种子液按如下步骤制备：
将黑曲霉(优选黑曲霉ATCC52172)移入摇瓶中的二级种子培养基，30-32℃、180rpm摇床培养48h，获得二级液体菌种；按照10％(V/V)接种量，将二级液体菌种接入三级种子培养基中，28-32℃、180rpm培养5d，获得黑曲霉种子液；所述二级种子培养基与三级种子培养基同彩里氏木霉种子液的制备。
进一步，所述彩绒革盖菌种子液按如下步骤制备：
将彩绒革盖菌(优选彩绒革盖菌ATCC20869)试管斜面移入摇瓶中的二级种子培养基，30-32℃、180rpm摇床培养48h，获得二级液体菌种；按照10％(V/V)接种量，将二级液体菌种接入三级种子培养基中，28-32℃、180rpm培养7d，获得彩绒革盖菌种子液；所述二级种子培养基与三级种子培养基同彩里氏木霉种子液的制备。
进一步，所述促进剂按如下方法制备：首先将彩绒革盖菌接种至固体发酵培养基中，在25-32℃、空气相对湿度75-95％条件下通风培养12-48h后，接种里氏木霉(即彩绒革盖菌接种后12-48h)，培养24-60h后接种黑曲霉(即彩绒革盖菌接种后24-60h)，继续通风培养至总培养时间为7-12d，获得所述有机污染物和秸秆降解促进剂。
本发明还提供一种所述有机污染物和秸秆降解促进剂在修复污染土壤中的应用，所述污染土壤中含有50-100mg/kg有机污染物，所述有机污染物为土霉素、2,4,5-三氯酚或毒死蜱，具体所述的应用为：将所述有机污染物和秸秆降解促进剂加入含水量30-80％的污染土壤中，调节pH 3.0-6.5，在温度20-55℃下进行修复；所述促进剂加入量以污染土壤质量计为3-12％。优选当土霉素含量为73.7mg/kg时，促进剂用量为8％；当2,4,5-三氯酚含量为59.7mg/kg时，促进剂用量为10％；当毒死蜱含量为52.4mg/kg，促进剂用量为8％。
进一步，所述pH为4.5，修复温度为30-33℃。
本发明还提供一种所述有机污染物和秸秆降解促进剂在降解秸秆中的应用，所述的应用方法为：将有机污染物和秸秆降解促进剂加入质量含水量60-85％的秸秆基质中，喷水维持秸秆基质质量含水量60-85％，在25-32℃下保持6-12d；所述有机污染物和秸秆降解促进剂质量添加量以秸秆基质重量计为3-12％(优选10％)；所述秸秆基质是将风干的秸秆中，加入(NH4)2SO4和尿素，获得秸秆基质；再向秸秆基质中加入水，使得含水量60-85％，优选75％；所述风干的秸秆与(NH4)2SO4质量比为1：0.01-0.1(优选1:0.02)，所述风干的秸秆与尿素质量比为1：0.001-0.1(优选1:0.005)；所述秸秆厚度为3-10cm。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明方法以秸秆为主要原料，利用三种性能互补的真菌进行固态发酵，其中里氏木霉和黑曲霉可分别利用所生产的纤维素酶和木聚糖酶，对秸秆纤维素、半纤维素进行降解；彩绒革盖菌可以利用其产生的漆酶，对秸秆木质素进行逐步降解。木质素屏障的解除，不仅有利于纤维素酶和木聚糖酶更好地与底物结合，加速秸秆的降解过程。而且在木质素降解过程中，会释放出大量木质素降解中间产物，如香草醛、丁香醛、丁香酸等可作为漆酶催化反应的天然介体，无需外加人工合成介体，进一步增强漆酶的催化能力，促进漆酶对土壤中有机污染物的催化降解，实现土壤有机污染物的低成本、高效率降解。以里氏木霉(高产纤维素酶)为核心，黑曲霉(分泌木聚糖酶)和彩绒革盖菌(分泌漆酶)作为辅助菌种，三菌协同发酵，由该复合菌系所产纤维素酶、木聚糖酶、漆酶活力分别可达为230.63IU/g、6250.34IU/g和30.35IU/g，秸秆纤维素、半纤维素、木质素降解率高达67.63％、46.68％和65.56％。
本发明方法制备的土壤有机污染物及秸秆降解双向促进剂(简称SSD促进剂)含有活性菌丝、分生孢子、高活力复合酶(漆酶、纤维素酶、木聚糖酶等)以及复合天然介体等组分，既可用于秸秆快速还田，还可促进土壤有机污染物的高效降解。利用SSD促进剂中的漆酶/复合天然介体自动回补系统，使漆酶摆脱了对外加介体的依赖，不仅可大大降低使用成本，还可避免人工合成介体的二次污染问题。本发明方法制备的土壤有机污染物及秸秆降解双向促进剂(简称SSD促进剂)可有效实现对土壤有机污染物的高效降解，利用SSD促进剂处理含土霉素、2,4,5-三氯酚以及毒死蜱的污染土壤，无需外加介体，三种污染物的降解率即可达94.74％、78.35％以及73.56％。
发酵第10天本发明SSD促进剂对秸秆的降解率高达53.09％，明显高于单独使用里氏木霉的36.76％，单独使用黑曲霉的34.94％，单独使用彩绒革盖菌的28.43％以及枯草芽孢杆菌(目前用于秸秆腐熟的常用菌种)的12.63％。
(四)附图说明
图1：实施例2固体发酵过程的产酶进程。
图2：实施例3中SSD促进剂作用下的秸秆降解曲线。
图3：实施例4中SSD促进剂对土霉素的降解曲线。
图4：实施例5中SSD促进剂对2,4,5-三氯酚的降解曲线。
图5：实施例6中SSD促进剂对毒死蜱的降解曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例使用的培养基：
二级种子培养基配方为：葡萄糖15g/L，玉米浆10g/L，酵母粉10g/L，(NH4)2SO42.5g/L，KH2PO4 6g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，CaCO3 0.4g/L，微量元素0.2ml/L，溶剂为水，pH4.8；微量元素：ZnSO4·7H2O 1.4g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L，CoC12·6H2O 3.7g/L，H3BO3 0.4g/L，(NH4)6Mo7O24 1.6g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，溶剂为水。
三级种子培养基由种子基质和水组成，每100g种子基质加水220g，pH自然，所述种子基质的质量组成为：59％稻草(10-20目)，37％麸皮、2.0％(NH4)2SO4、0.6％尿素、0.58％KH2PO4、0.5％CaCl2、0.25％MgSO4·7H2O、0.05％CoCl2、0.02％CuSO4。
菌种来源：所述的菌种均来自美国菌种保藏中心，菌种保藏号分别为：里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC56764、黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC52172、彩绒革盖菌(Trametes versicolor)ATCC20869。
实施例1、菌种培养：
1、里氏木霉ATCC56764三级种子液：
将里氏木霉ATCC56764试管斜面移入摇瓶中的二级种子培养基，30-32℃、180rpm摇床培养48h，获得二级液体菌种。按照10％(V/V)接种量，将二级液体菌种接入三级种子培养基中，28-32℃、180rpm培养6d，获得里氏木霉ATCC56764三级种子液，菌丝干重约20g/L。
2、黑曲霉ATCC52172三级种子液：
将黑曲霉ATCC52172移入摇瓶中的二级种子培养基，30-32℃、180rpm，摇床培养48h，获得二级液体菌种。按照10％(V/V)接种量，将二级液体菌种接入三级种子培养基中，28-32℃、180rpm培养5d，获得黑曲霉ATCC52172三级种子液，菌丝干重约8g/L。
3、彩绒革盖菌ATCC20869三级种子液：
将彩绒革盖菌ATCC20869试管斜面移入摇瓶中的二级种子培养基，30-32℃、180rpm，摇床培养48h，获得二级液体菌种。按照10％(V/V)接种量，将二级液体菌种接入三级种子培养基中，28-32℃、180rpm培养7d，获得彩绒革盖菌ATCC20869三级种子液，菌丝干重约4g/L。
实施例2：SSD促进剂的制备
采用浅盘发酵工艺，将250g固体发酵培养基加入浅盘(50cm×35cm×5cm)，厚度约5cm，于121℃灭菌60min，冷却后先接入10mL实施例1制备的彩绒革盖菌ATCC20869三级种子液，在空气相对湿度92％，温度30℃条件下通风培养24h后接种10mL里氏木霉ATCC56764三级种子液(延后一天接种)，继续培养到48h后接种5mL黑曲霉ATCC52172三级种子液(延后两天接入)，彩绒革盖菌、里氏木霉、黑曲霉的接种体积比例为1:1:0.5，总接种量以固体发酵培养基质量计为0.1ml/g。继续在空气相对湿度92％，温度30℃条件下通风培养，总计培养10d，发酵产物即为SSD促进剂。
固体发酵培养基由发酵基质和水以质量比3:7组成，其中水的质量含量为70％，所述发酵基质的质量配方如下：80％水稻秸秆(10-20目)、16％麸皮、2.0％(NH4)2SO4、0.6％尿素、0.5％KH2PO4、0.53％CaCl2、0.3％MgSO4·7H2O、0.05％CoCl2、0.02％CuSO4。
固体发酵过程中，每隔24h，取发酵产物(即酶曲)检测纤维素酶(滤纸酶)、木聚糖酶和漆酶活力，菌种的产酶进程如图1。
固态发酵第10天，发酵基质中纤维素酶(滤纸酶)、木聚糖酶和漆酶活力分别达230.63IU/g、6250.34IU/g和30.35IU/g；固态发酵形成的酶曲中菌丝密布、分生孢子众多、由于富含复合酶制剂及木质素降解中间产物(漆酶的天然介体)，这种发酵产物既可用于秸秆快速降解还田，也可促进土壤有机污染物的高效降解，是一种新型的双向促进剂。
粗酶液：称取5g酶曲，加入250ml柠檬酸缓冲溶液(pH 4.8)室温下浸泡24h，于8000r/min，4℃条件下离心2min，取上清液得到粗酶液。分别对粗酶液进行纤维素酶(滤纸酶)、木聚糖酶和漆酶活力的检测。
滤纸酶活力测定方法：滤纸酶活测定采用国际纯化学与应用化学联合会推荐的方法测定(Ghose T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure and AppliedChemistry,1987,59(2):257-268)。一个滤纸酶活力(FPA)国际单位定义为：在标准反应条件下，每分钟生成1μmol葡萄糖(以还原糖计)所需的酶量，以IU/ml或IU/g表示。
木聚糖酶活力测定方法：采用DNS法(Bocchini D A,Alves-Prado H F,Baida LC,et al.Optimization of xylanase production by Bacillus circulans D1 insubmerged fermentation using response surface methodology[J].ProcessBiochemistry,2002,38(5):727-731)，具体为：粗酶液用0.05M柠檬酸缓冲溶液(pH 4.8)稀释500倍，取0.5ml稀释的粗酶液，加入1ml 0.05M柠檬酸缓冲溶液(pH 4.8)及l ml质量浓度1.2％木聚糖溶液(溶剂为0.05M柠檬酸缓冲溶液(pH 4.8))，在50℃水浴反应30分钟后，立即加入2mL DNS，沸水浴5min，冷却定容至10mL，于540nm处测吸光值，计算还原糖含量。空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变。定义每分钟分解底物释放出1μmol木糖(以还原糖计)所需的木聚糖酶量为一个活力单位，以IU/ml或IU/g表示。
漆酶活力测定方法：漆酶活力测定采用ABTS法(Bourbonnais R,Paice M G,Freiermuth B,et al.Reactivities of various mediators and laccases with kraftpulp and lignin model compounds[J].Applied and environmental microbiology,1997,63(12):4627-4632)，以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物。取50μl粗酶液，加入950μl柠檬酸缓冲溶液(pH 4.0)，再加1ml ABTS溶液(2mM)，30℃反应2min，测定420nm下吸光值随时间的变化。一个漆酶活力国际单位(IU)定义为：每分钟消耗1μmol ABTS的酶量(ε＝36000L/molcm-1)。
实施例3：SSD促进剂对秸秆的降解
将1kg风干的水稻秸秆(质量含水量10-12％，纤维素、半纤维素和木质素含量分别为47.5％、22.6％和13.2％)切成8cm左右的段，加入20g(NH4)2SO4和5g尿素，获得秸秆基质。向秸秆基质中加入650mL水使得质量含水量为75％。
将50g实施例2方法制备的SSD促进剂按质量浓度10％比例掺入含水量75％的秸秆基质中，置于200cm×100cm敞开的降解槽，厚度为5cm，间息喷淋水使秸秆基质维持75％的湿度，在常温(25-32℃)下保持12d，间隔24h，取样，采用实施例2方法检测纤维素、半纤维素和木质素含量，计算各自降解率。
秸秆的降解进程如图2所示，接入SSD促进剂后第4天，秸秆纤维素的降解率就达到37.94％，第10天秸秆纤维素的降解率为64.19％。秸秆半纤维素的降解率在接入SSD促进剂后第4天达到22.46％，到第10天秸秆半纤维素的降解率为61.47％。
秸秆木质素在前期降解率较低，但到接入SSD促进剂后的第6天，秸秆木质素的降解速率也出现了明显提高(37.33％)。到第10天，秸秆木质素降解率达到45.16％，秸秆总失重率为53.09％。秸秆木质素的降解不但有利于促进秸秆纤维素、半纤维素的降解，还可为漆酶的催化反应提供天然介体(木质素降解中间产物)，有利于漆酶对土壤中有机污染物的催化降解。
纤维素含量测定：将1g样品(W1)和25mL体积浓度20％硝酸乙醇溶液加入到250mL磨口锥形瓶中，于沸水浴中回流冷凝加热1h，抽滤，重复上述步骤至纤维变为无色。之后滤渣先用体积浓度20％硝酸乙醇溶液洗涤，再用热水洗涤，洗液不显酸性后用无水乙醇洗涤三次即可。最后将滤渣置于105℃条件下烘干至恒重(W2)。纤维素含量由式(1)计算得，
Figure BDA0003371529290000081
半纤维素含量测定：将0.5g样品(W)、10g氯化钠和100mL体积浓度12％的盐酸水溶液加入到250mL三颈烧瓶中。将三颈烧瓶与冷凝器、50mL分液漏斗和温度计相连，160℃油浴加热蒸馏，速度为3mL/min，不断补加体积浓度12％的盐酸水溶液直至馏出液达350mL，用湿醋酸苯胺试纸检验馏出液中糠醛含量。之后将馏出液用体积浓度12％的盐酸水溶液定容至500mL，取100mL于500mL磨口锥形瓶中，利用冰块降温降至0℃后加入25mL溴化钾-溴酸钾溶液(准确称取2.0g溴化钾和0.6g溴酸钾于烧杯中，加入适量水溶解后定容至500mL，保存备用)，于避光处静置5min，加入10mL体积浓度10％KI水溶液摇匀，再放置5min。最后用0.1mol/L硫代硫酸钠标准水溶液滴定。临近滴定终点时加入2mL质量浓度0.5％淀粉水溶液，待蓝色褪去后记录滴定体积V1(mL)。另取100mL体积浓度12％的盐酸水溶液(代替馏出液用体积浓度12％的盐酸水溶液定容后的溶液)，重复操作，记录滴定体积V2(mL)。半纤维素含量根据式(2)计算得，
Figure BDA0003371529290000082
木质素含量测定：将1g样品(W3)和250mL乙醇－苯混合液(体积比1:2)加入到索氏抽提器中，沸水浴中加热抽提3h。样品风干后转移至烧杯中，加入15mL质量浓度72％硫酸水溶液混合均匀，于20℃水浴中静置2.5h。之后用300mL蒸馏水分多次洗涤至500mL锥形瓶中，于沸水浴中回流冷凝加热2h。反应结束后进行真空抽滤，用热水洗涤滤渣至质量浓度10％CaCl2水溶液不浑浊，105℃烘干至恒重(W4)。木质素含量根据式(3)计算得，
Figure BDA0003371529290000091
实施例4：SSD对土霉素的降解
采用实施例2方法制备的SSD促进剂对含土霉素(73.7mg/kg)的污染土壤(土壤含水量47％)进行修复试验。
将500g污染土壤(土壤含水量47％)加入50cm×50cm浅盘中，试验土层厚度5cm，pH4.5，再按质量浓度8％的用量加入40g SSD促进剂，在30-33℃进行修复反应，每隔24h，取样，高效液相色谱法检测土霉素含量，结果见图3。反应第10d，土霉素的降解率为91.52％。
高效液相色谱法检测土霉素：
准确称取土样2.0g加入10mL甲醇，30℃水浴下于20kHz超声浸提5min，重复三次后于4000r/min条件下离心5min，随后吸取1mL上清液过0.45μm水膜，滤液利用高效液相色谱仪(Agilent 1200,USA)进行检测，流动相为0.01mol/L草酸水溶液：乙腈：甲醇＝7:2:1(v/v/v)，Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm×5μm)色谱柱，流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长355nm，进样体积20μL，外标法定量。
土霉素降解率计算如下：
降解率(％)＝(C0-C1)/C0×100％。其中C0为反应前土霉素的浓度，C1为降解反应后土霉素的浓度。
实施例5：SSD对2,4,5-三氯酚的降解
采用实施例2方法制备的SSD促进剂对含2,4,5-三氯酚(59.7mg/kg)的污染土壤(土壤含水量52％)进行修复试验。
将500g含2,4,5-三氯酚(59.7mg/kg)的污染土壤(土壤含水量52％)加入50cm×50cm浅盘中，试验土层厚度5cm，pH4.5，按质量浓度10％的用量掺入50g实施例2方法制备的SSD促进剂，30-33℃下保持11d，每隔24h，取样，采用高效液相色谱法检测2,4,5-三氯酚含量，2,4,5-三氯酚的降解率为75.48％(图4)。
高效液相色谱法检测2,4,5-三氯酚：
准确称取土样1.0g加入2mL体积浓度50％甲醇水溶液，30℃水浴下于20kHz超声浸提5min，重复三次后于4000r/min条件下离心3min，随后吸取1mL上清液过0.45μm水膜，滤液利用高效液相色谱仪(Agilent 1200,USA)进行测定，以甲醇/水(体积比为85/15)为流动相，采用Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm×5μm)色谱柱，流速1.0mL/min，柱温30℃；检测波长220nm，进样量20μL。以2,4,5-TCP标准品绘制标准曲线，采用外标法定量。
Figure BDA0003371529290000101
其中C0为降解反应前2,4,5-三氯酚的浓度，C为降解反应后2,4,5-三氯酚的浓度。
实施例6：SSD对毒死蜱的降解
采用实施例2方法制备的SSD促进剂对含毒死蜱(52.4mg/kg)的污染土壤进行修复试验。
将500g含毒死蜱(52.4mg/kg)的污染土壤(土壤含水量60％)加入50cm×50cm浅盘中，试验土层厚度5cm，pH4.5，按质量浓度8％的用量掺入40g实施例2方法制备的SSD促进剂，30-33℃下保持12d，每隔24h取样，采用高效液相色谱法检测毒死蜱含量，毒死蜱降解率为73.56％(图5)。
高效液相色谱法检测毒死蜱：
准确称取土样2.0g加入10mL甲醇，30℃水浴下于20kHz超声浸提5min，重复三次后于4000r/min条件下离心3min，随后吸取1mL上清液过0.45μm水膜，滤液利用高效液相色谱仪(Agilent 1200,USA)进行检测，流动相为甲醇：水＝85:15(v/v)，Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm×5μm)色谱柱，流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长293nm，进样体积20μL，外标法定量。
降解率(％)＝(C0-C1)/C0×100％。其中C0为反应前毒死蜱的浓度，C1为降解反应后毒死蜱的浓度。
本发明方法利用SSD促进剂将秸秆的高效降解过程与土壤污染修复过程耦合在一起协同进行，明显具有绿色、经济、高效的优势。

Claims (10)

1.一种有机污染物和秸秆降解促进剂，其特征在于所述促进剂按如下方法制备：将彩绒革盖菌、里氏木霉和黑曲霉分别接种至固体发酵培养基中，在25-32℃、空气相对湿度75-95％条件下通风培养7-12d，发酵产物即为所述有机污染物和秸秆降解促进剂；
所述固体发酵培养基是由发酵基质和水组成，所述水的质量含量为60-80％；所述发酵基质的质量组成为：秸秆60-80％、麸皮20-40％、(NH4)2SO4 1.0-3.0％、尿素0.2-0.8％、KH2PO4 0.2-0.8％、CaCl2 0.2-0.8％、MgSO4·7H2O 0.1-0.4％、CoCl2 0.02-0.08％、CuSO40.01-0.05％，总量为100％；所述秸秆包括稻草秸秆、麦草秸秆或玉米秸秆。
2.如权利要求1所述有机污染物和秸秆降解促进剂，其特征在于所述彩绒革盖菌为彩绒革盖菌(Trametes versicolor)ATCC20869，所述里氏木霉为里氏木霉(Trichodermareesei)ATCC56764，所述黑曲霉为黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC52172。
3.如权利要求1所述有机污染物和秸秆降解促进剂，其特征在于所述彩绒革盖菌、里氏木霉和黑曲霉分别以种子液形式接种，其中彩绒革盖菌种子液，里氏木霉种子液和黑曲霉种子液接种体积比为1：0.5-1.5：0.3-1.0，总体积接种量以固体发酵培养基重量计为0.1-1mL/g。
4.如权利要求3所述有机污染物和秸秆降解促进剂，其特征在于所述种子液按如下步骤制备：
分别将里氏木霉、彩绒革盖菌或黑曲霉试管斜面移入摇瓶中的二级种子培养基，30-32℃、180rpm摇床培养48h，获得二级液体菌种；按照体积浓度10％接种量，将二级液体菌种接入三级种子培养基中，28-32℃、180rpm培养5-7d，获得各自的种子液；所述二级种子培养基配方为：葡萄糖15g/L，玉米浆10g/L，酵母粉10g/L，(NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO4 6g/L，CaCl21g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，CaCO3 0.4g/L，微量元素0.2ml/L，溶剂为水，pH4.8；微量元素：ZnSO4·7H2O 1.4g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L，CoC12·6H2O 3.7g/L，H3BO3 0.4g/L，(NH4)6Mo7O241.6g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，溶剂为水；
所述三级种子培养基由种子基质与水以质量比1:2.2组成，所述种子基质质量组成为：59％稻草，37％麸皮、2.0％(NH4)2SO4、0.6％尿素、0.58％KH2PO4、0.5％CaCl2、0.25％MgSO4·7H2O、0.05％CoCl2、0.02％CuSO4，总量100％。
5.如权利要求1所述有机污染物和秸秆降解促进剂，其特征在于所述促进剂按如下方法制备：首先将彩绒革盖菌接种至固体发酵培养基中，在25-32℃、空气相对湿度75-95％条件下通风培养12-48h后，接种里氏木霉，培养24-60h后接种黑曲霉，继续通风培养至总培养时间为7-12d，获得所述有机污染物和秸秆降解促进剂。
6.一种权利要求1所述有机污染物和秸秆降解促进剂在修复污染土壤中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述污染土壤中含有50-100mg/kg有机污染物，所述有机污染物为土霉素、2,4,5-三氯酚或毒死蜱。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：将所述有机污染物和秸秆降解促进剂加入含水量30-80％的污染土壤中，调节pH 3.0-6.5，在温度20-55℃下进行修复；所述促进剂加入量以污染土壤质量计为3-12％。
9.一种权利要求1所述有机污染物和秸秆降解促进剂在降解秸秆中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用为：将有机污染物和秸秆降解促进剂加入质量含水量60-85％的秸秆基质中，喷水维持秸秆基质质量含水量60-85％，在25-32℃下保持6-12d；所述有机污染物和秸秆降解促进剂质量添加量以秸秆基质重量计为3-12％；所述秸秆基质是将风干的秸秆中，加入(NH4)2SO4和尿素，获得秸秆基质；所述风干的秸秆与(NH4)2SO4质量比为1：0.01-0.1，所述风干的秸秆与尿素质量比为1：0.001-0.1。
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汤星阳: "秸秆快速降解菌系的构建及其在有机污染物治理中的应用", CNKI硕士电子期刊, no. 2, pages 1 *

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