CN114057896A - 一种靶向ror1和cd7的双特异性嵌合抗原受体（car）及其应用 - Google Patents

一种靶向ror1和cd7的双特异性嵌合抗原受体（car）及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体(CAR)及其应用，具有如下结构：ROR1 scFv‑CD7 scFv‑H‑TM‑C‑CD3ζ，其中“‑”为连接肽或肽键；H为铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为胞内信号传导序列。该嵌合抗原受体能够在体内、体外抑制肿瘤生长，延长生存周期，促进细胞因子分泌，发挥协同抗肿瘤作用。

Description

一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体(CAR)及其应用
技术领域：
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体(CAR)及其制备抗肿瘤药物的应用。
背景技术：
目前，癌症已成为全球范围内致死率最高的疾病之一，但是现有的手术切除和放化疗等手段对早期肿瘤的治疗效果较好，却难以治疗中晚期患者，而且还会引起患者严重的不良反应，影响患者生活质量，增加患者及其家庭负担。近年来，随着肿瘤免疫治疗的发展，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T Cells，CART)疗法在抗癌方面取得了巨大的成功。这一疗法最初由Gross和他的同事于1989年提出，他们将抗体的抗原结合区scFv与CD3-ζ链或FcεRIγ的胞内部分融合形成嵌合抗原受体。CAR的基本结构包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区(Hinge area)，一个跨膜区(Transmembrane region)和一个胞内免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)。随后，研究人员为了提高CART的抗肿瘤能力，在Gross等人的研究基础上添加了共刺激信号分子，使得CART对肿瘤细胞的杀伤能力大幅度加强，并在血液肿瘤治疗方面取得了成功，2017年诺华公司的Kymiriah(CLT-019和Kite制药(已被吉利德公司收购)的Yescarta(KTE-C10)先后被美国FDA批准上市，2019年中国首款CAR-T疗法阿基仑赛注射液(复星凯特)也被批准上市，掀起了针对嵌合抗原受体相关抗肿瘤药物的研究热潮。
早期的CART细胞多以CD19为治疗靶点，但是后续发现CD19不仅在肿瘤细胞中表达，在正常细胞中也有相对高的表达量，造成了CART细胞的“误判”而攻击正常细胞，诱发毒性反应。为此，研究人员开始尝试寻找新的治疗靶点，并且试图通过构建双特异性CART细胞降低脱靶现象的出现，及同时靶向两个抗肿瘤位点，提高识别特异性。
在这种理论指导下，大量新型抗肿瘤靶点被开发出来，其中受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1，ROR1)是最受瞩目的新型靶点之一。ROR1)是一种跨膜蛋白，属于受体酪氨酸激酶receptor tyrosine kinase，RTK)家族，酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)作为一组肿瘤特异性抗原。ROR1最初是在神经母细胞瘤株中发现并被命名为神经营养酪氨酸激酶受体相关蛋白，因为未发现其自然配体，所以被定义为孤儿受体。ROR 1参与细胞间信号交流，胞内信号传导等过程，调节细胞增殖、分化、转移和存活，ROR1在多种肿瘤中高表达，如白血病、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、肾上腺癌、乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌等，但在正常产后组织中微量表达(Hojjat-Farsangi M,Jeddi-Tehrani M,Daneshmanesh AH,et al.Spontaneous ImmunityAgainst the Receptor Tyrosine Kinase ROR1 in Patients with ChronicLymphocytic Leukemia.PloS one.2015,10(11):e0142310.)。正是由于这种特性，ROR1成为了理想的抗肿瘤靶点和肿瘤诊断标志物。目前研究人员已经针对ROR1开发出来多种抗体或核酸抑制剂，用于治疗恶性肿瘤，但是有关ROR1的CART细胞却报道较少，如CA2973964A1、WO2020160050A1、US20180265593A1、CN107557337A、WO2017127664A1等分别公开了ROR1抗体或嵌合抗原受体。涉及靶向ROR1的双特异性CART研究更加稀少，如CN109503716A公开了一种双特异性嵌合抗原受体，由信号肽，两个特异性抗原结合片段，膜外间隔区，跨膜区，胞内共刺激信号区组成，说明书中提及了第一个抗原可以选择ROR1，第一个抗原为CD38，但其实际提供的是BCMA&CD38嵌合抗原受体，并未研究包括ROR1靶点的双特异性CART。
可见，目前依然缺乏基于ROR1靶点可充分发挥抗肿瘤活性的CART细胞，尤其是如何开发包括ROR1靶点双特异CART细胞，如何选择能够产生协同效益的第二抗原，以便可提高肿瘤治疗靶向性、有效性和安全性，上述问题成为CART领域的研究难点和热点之一，本发明为解决上述技术问题，提供了一种新型的双特异性CART，为进一步开发相关抗肿瘤药物和疗法奠定了技术基础。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明中提供了一种双特异性嵌合抗原受体，包括第一抗原结合域和第二抗原结合域，所述第一抗原结合域靶向ROR1、BCMA、c-Met、B7-H6等目标抗原的是scFv，优选靶向ROR1 scFv；第一抗原结合域靶向CD19、CD20、CD33、CD7、CD3等目标抗原的是scFv，优选靶向CD7 scFv。
现有技术中已经报道了多种可作为嵌合抗原受体的目标靶点，包括但不限于ROR1、BCMA、c-Met、B7-H6、D19、CD20、CD33、CD7、CD3、CD123、PD-1等，而如何选择双特异抗性的嵌合抗原受体目标靶点，却没有统一的标准和做法，甚至存在完全相反的教导和实验结果。为此，发明人经过大量实验筛选出了ROR1与CD7的组合，相对于其他双特异抗原组合，更能够有效识别和杀死白血病细胞。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括如下结构：ROR1 scFv-CD7scFv-H-TM-C-CD3ζ其中“-”为连接肽或肽键；H为铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为胞内信号传导序列；ROR1 scFv包括如SEQ ID NO:1-3所示重链CDR区和SEQ ID NO:4-6所示轻链CDR区；CD7
scFv包括如SEQ ID NO:7-9所示重链CDR区和SEQ ID NO:10-12所示轻链CDR区。
在某些实施方式中，所述ROR1 scFv包括如SEQ ID NO:13所示的或与其具有85％以上同源性的重链可变区和SEQ ID NO:14的或与其具有85％以上同源性的所示轻链可变区。
在某些实施方式中，所述CD7 scFv包括如SEQ ID NO:15所示的或与其具有85％以上同源性的重链可变区和SEQ ID NO:16所示的或与其具有85％以上同源性的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述共刺激信号分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40或CD3，优选CD28和4-1BB，更优选4-1BB。在嵌合抗原受体结构中，共刺激因子的存在被认为是必不可少的，第一代CART中由于缺少共刺激因子，而使得CART细胞难以被有效激活；而且共刺激因子选择不当也可能导致严重的不良反应，致使患者死亡的恶性不良反应也已被报告。正因如此，本发明中选择了相对成熟且活性温和的4-1BB作为共刺激因子，构建了相关嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示或与其具有85％以上同源性。
进一步的，提供了一种核酸分子，其编码所述的双特异性嵌合抗原受体，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示或与其具有85％以上同源性。
进一步的，提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞表达有所述的双特异性嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述免疫细胞为T细胞或NK细胞，二者均为机体内的可发挥抗肿瘤作用的免疫效益细胞，导入本发明所提供的嵌合抗原受体结构后，均能够发挥显著的抗肿瘤活性。
进一步的，提供了一种所述的双特异性嵌合抗原受体或所述的核酸分子或所述的免疫细胞在制备肿瘤药物中的应用。所述肿瘤包括但不限于：尤文肉瘤、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、胰腺癌、肺癌、胆管癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌等等。
有益效果
本发明中提供了一种新型靶向ROR1和CD7双特异性嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体可同时高特异性结合ROR1和CD7两个肿瘤靶点，显著提高肿瘤靶向性，防止脱靶效应的发生；实验表明ROR1和CD7的靶点组合，相对于与其他抗肿瘤靶点，能够显著提供针对白血病细胞和淋巴瘤细胞的杀伤作用；本发明靶向ROR1和CD7双特异性CART细胞，能够促进细胞因子分泌，IFN-γ和TNF-α表达水平显著提高，说明这种疗法除激活T细胞免疫功能外，还能够介导细胞因子发挥协同肿瘤抑制效能；本发明靶向ROR1和CD7双特异性CART细胞可在体内显著抑制肿瘤生长，提高实验动物生存周期，发挥体内抗肿瘤作用。
附图说明
图1：K562细胞存活率
图2：Raji细胞存活率；
图3：IFN-γ表达水平；
图4：TNF-α表达水平；
图5：小鼠K562肿瘤模型生存周期。
具体实施方式
实施例1：CART细胞制备
1.1嵌合抗原受体设计
本发明中所提供的双特异性嵌合抗原受体，具有如下结构：ROR1 scFv-X scFv-H-TM-C-CD3ζ其中“-”为连接肽或肽键；H为铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为胞内信号传导序列；X scFv选自靶向CD19、CD20、CD33、CD7或CD3的scFv。所述各个scFv的氨基酸序列和核苷酸序列，由发明人在早期实验中制备并保存。
1.2病毒载体转染T细胞
本发明中构建了多个具有双特异性的嵌合抗原受体结构，以便验证ROR1靶点分别与CD19、CD20、CD33、CD7或CD3等其他抗肿瘤靶点的组合效果，为方便区分和后续检测，分别记为ROR1-CD19、ROR1-CD20、ROR1-CD33、ROR1-CD7和ROR1-CD3。将上述嵌合抗原受体基因片段导入psb1576载体中，在将该载体导入感受态细胞中，采用质粒提取试剂盒(购自Axygen公司)提取质粒，测序鉴定目标基因序列是否正确，选择测序正确的阳性克隆用于后续实验。将阳性克隆质粒交由上海吉凯公司(GeneChem Biotechnology)合成慢病毒载体。
从健康志愿者中采集外周血200mL，并签定知情同意书。用Ficoll梯度离心法收集外周血单个核细胞(PBMC)，在含有CD3mAb、IL-2(100U/mL)和10％FBS的1640培养液中培养。待T细胞调整至对数生长期后，进行慢病毒感染，所述慢病毒滴度达2×108TU/mL以上。用1640培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×106cells/mL，按MOI＝10加入慢病毒于24孔培养板中，混匀后放置于37℃、5％CO2培养箱培养。培养48h后更换新鲜1640培养基，之后隔天进行半量换液，共培养约96h，培养期间维持IL-2 100U/mL。使用流式细胞仪检测CAR修饰T细胞的转染率，阳性率达95％以上。
实施例2CART细胞体外肿瘤细胞杀伤效果
为验证CART细胞的肿瘤杀伤效果，本发明中选用K562(慢性髓系白血病细胞系)、Raji(淋巴瘤细胞系)作为研究对象。
2.1肿瘤细胞培养
从液氮中取出并复苏K562细胞和Raji细胞，以1×106个/mL接种于RPMI 1640完全培养基(含10％FBS)，37℃、5％CO2细胞培养箱中无菌培养。每隔48h计数传代1次，观察细胞状态，当细胞存活率达到80％以上时，进行后续实验。
2.2CART细胞共培养
分别收获CART细胞与上述肿瘤细胞，使用无菌PBS洗涤3次，然后按2:1比例混合CART细胞与肿瘤细胞，调整细胞密度至1×106个/mL，接种于96孔板中，进行CART细胞与肿瘤细胞共培养，置于37℃，5％CO2培养箱中共培养48h。以无菌PBS溶液作为阴性对照。
2.3MTT法检测细胞杀伤效率
CART细胞与肿瘤细胞共培养2天后，离心取上清，每孔加入20μL MTT处理4h，之后弃掉MTT后加入150μL DMSO，摇床震荡10min；同时设空白对照：即除了不加细胞外，其他处理步骤与试验一样。490nm波长处，以空白孔调零，在酶标仪上测定各孔的光吸收值，记录好酶标仪检测的OD值。计算细胞的相对存活率(cell viability)：cell viability(％)＝(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100％。
如图1所示，本发明中所提供的双特异性CART细胞能够强烈杀伤肿瘤细胞，具体来看，在K562细胞中，ROR1靶点似乎与CD7或CD33靶点的组合更加有效，靶向ROR1和CD7的双特异性CART细胞，以及靶向ROR1和CD33的双特异性CART细胞均能够达到约30％细胞存活率，但是报道较多的CD19和CD20靶点，在与ROR1构成组合的双特异性CART细胞却并未达到令人满意的肿瘤细胞杀伤效果，其肿瘤细胞存活率明显高于CD33和CD7组合。
如图2所示，在Raji细胞中，CART细胞也展示出了强大的肿瘤杀伤能力，当与CART细胞共培养后，Raji细胞的存活率显著降低。与K562细胞不同的，靶向ROR1和CD19的双特异性CART细胞表现了强烈的杀伤能力，与之相似活性的CART细胞仍然包括靶向ROR1和CD7的双特异性CART细胞和靶向ROR1和CD33的双特异性CART细胞，均可使得肿瘤细胞的存活率将至40％以下。相比之下，ROR1靶点与CD20和CD3的组合，肿瘤杀伤能力相对较弱。
实施例3CART促进细胞因子释放
将本发明中提供的CART细胞与K562细胞共培养，具体方法同2.2节。共培养48h后，收集细胞上清，使用ELISA试剂盒(购自solarbio公司)检测上清液中的IFN-γ和TNF-α含量。
如图3所示，CART细胞与K562细胞共培养后，可大幅度提高IFN-γ表达水平，其中靶向ROR1和CD7双特异性CART促进IFN-γ分泌能力最强，而靶向ROR1和CD7双特异性CART次之，靶向ROR1和CD19双特异性CART以及靶向ROR1和CD3双特异性CART诱导IFN-γ分泌能力相对较弱。
如图4所示，CART也能够提高细胞上清中的TNF-α表达水平，与IFN-γ不同的是，ROR1与CD19、CD33和CD7靶点组合后的双特异性CART促进TNF-α分泌能力较强，其中靶向ROR1和CD33双特异性CART活性最高，靶向ROR1和CD7双特异性CART以及靶向ROR1和CD19双特异性CART的活性类似，靶向ROR1和CD20双特异性CART在诱导TNF-α表达方面效果最差。
实施例4目标CART筛选与鉴定
在上述实验的基础上，本发明中选择肿瘤细胞杀伤能力和促进细胞因子分泌能力均较强的靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体作为研究对象，进行后续研究。该嵌合抗原受体，具有如下结构：ROR1 scFv-CD7 scFv-H-TM-C-CD3ζ，其中“-”为连接肽或肽键；H为铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为胞内信号传导序列。所述ROR1 scFv和CD7 scFv为发明人在早期研究中筛选并获得的目标抗原特应性结合抗体片段，其中ROR1scFv包括如SEQ ID NO:1-3所示重链CDR区和SEQ ID NO:4-6所示轻链CDR区；CD7 scFv包括如SEQ ID NO:7-9所示重链CDR区和SEQ ID NO:10-12所示轻链CDR区。
经过进一步鉴定，所述ROR1 scFv包括如SEQ ID NO:13所示重链可变区和SEQ IDNO:14所示轻链可变区；所述CD7 scFv包括如SEQ ID NO:15所示重链可变区和SEQ ID NO:16所示轻链可变区。
在嵌合抗原受体结构中，共刺激因子为必不可少的部分，这一结构域可有效传递胞内、胞外信号，介导和维持T细胞活化状态，本发明中选用现有研究中使用较多的4-1BB作为共刺激因子。此外，还选择已见报道的CD8铰链区、CD28跨膜区以及CD3ζ胞内信号域等嵌合抗原受体常规元件，共同组合了本发明中所述的嵌合抗原受体结构，其氨基酸序列如SEQID NO:17所示。随后，经过基因序列分析和密码子优化处理，优选出了本发明中所述嵌合抗原受体的核苷酸序列，如SEQ ID NO:18所示。
实施例5CART抑制体内肿瘤生长
复苏并培养K562细胞，方法同2.1节。准备40只6-8周龄的B-NDG裸鼠，正常饲养3天，适应实验环境。检疫合格后，每只裸鼠尾静脉注射1×106个K562细胞。成瘤3天后，根据肿瘤体积随机分为两组，每组20只，分别为ROR1-CD7组和对照组，其中ROR1-CD7组在成瘤3天后尾静脉注射1×106个靶向ROR1和CD7的双特异性CART细胞，对照组注射等体积的生理盐水。每日检测和记录裸鼠生存情况。
如图5所示，使用本发明所提供的靶向ROR1和CD7的双特异性CART细胞可在体内抑制肿瘤的生长，显著提高实验动物的生存周期，说明该CART不仅能够在体外细胞水平杀死肿瘤细胞，在体内环境中也可发挥强烈的肿瘤抑制作用，延长动物生存周期，抑制肿瘤的发生和发展，为进一步开发新型抗肿瘤药物提供了基础。
虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。
序列表
<110> 北京创世客生物技术有限公司
<120> 一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体（CAR）及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Gln Ala Asp Lys Glu Ile Thr Ser
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Leu Ser Gly
1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Ser Ser Thr Tyr Trp Gln Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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Gly Thr Ser Arg Glu Leu Ile Tyr Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Gly Ala Glu Gly Glu Cys Ile Thr Cys
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Glu Val Thr Cys Val Trp Met
1 5
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Gly Pro Ser Tyr Asp Tyr Val Phe Leu Gly Asp
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Pro Arg Glu Trp Pro Met Gln Leu Pro Pro Ser Gln Thr
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Lys Pro Thr Gly Ser Ser Gln Val Val Lys
1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Thr Glu Ser Gly Pro Gly Leu Asp Val Ala Pro Ser
1 5 10 15
Gln Ser Pro Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Thr Gln Ala Asp Lys Glu
20 25 30
Ile Thr Ser Val His Trp Cys Pro Gln Pro Pro Gly Lys Trp Leu Met
35 40 45
Trp Leu Gly Val Leu Ser Gly Asn Tyr Pro Ser Ala Leu Leu Ser Ile
50 55 60
Ser Lys Asp Asn His Gln Gly Ser Lys Ser Gln Asp Phe Leu Lys Met
65 70 75 80
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85 90 95
Gln Lys Arg Val Pro Glu Asn Leu Pro Lys Thr Val Leu Phe Asn His
100 105 110
Gln Asp Trp Tyr Leu Asn
115
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Ile Val Leu Phe Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Gly Gln Arg
1 5 10 15
Pro Thr Ile Ser Arg Arg Ala Ser Pro Ser Ser Thr Tyr Trp Gln Tyr
20 25 30
Met His Pro Pro Thr Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Lys Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Arg Glu Leu Ile Tyr Tyr Asn Leu Glu Ser
50 55 60
Gly Val Pro Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Thr Glu Phe
65 70 75 80
Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Gly Ala Glu Gly Glu Cys Ile Thr Cys Val Thr Lys Thr Phe
100 105 110
Asn Arg Ser Leu Glu Cys
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Ile Gln Leu Gly Pro Thr Glu Leu Lys Gln Pro Gly Glu Thr Cys
1 5 10 15
Lys Ile Ser Cys Lys Pro Ser Pro Glu Val Thr Cys Val Trp Met Met
20 25 30
Asn Trp Val Thr Ile Ser Lys Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Lys Trp
35 40 45
Cys Gly Trp Gly Pro Ser Tyr Asp Tyr Val Phe Leu Gly Asp Thr Tyr
50 55 60
Ala Asp Asp Phe Lys Thr Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Val
65 70 75 80
Glu Trp Thr Ser Ala Ser Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Pro Asn Leu Lys
85 90 95
Asn Gln Gln Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ile Ser Ser Leu Trp
100 105 110
Ile Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Cys Thr Val Ser Lys
115 120 125
<210> 16
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Ser Val Val Leu Ser Leu Pro Val Thr
1 5 10 15
Leu Pro Gly Gln Ala Ser Ile Ser Cys Leu Pro Pro Ser Phe Thr Gln
20 25 30
Met Val Glu Tyr Trp Tyr Leu Gln Thr Pro Met Asn Ser Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Pro Arg Glu Trp Pro Met Gln Leu Pro Pro Ser Gln Thr
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Gly Val Pro Val Leu Thr Phe Ser Gly Ser Gly Ala Tyr Thr Asp Phe
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Thr Ser Lys Ile Ser Arg Glu Asp Leu Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Lys
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Pro Thr Gly Ser Ser Gln Val Val Lys Phe Gly Gly Gly Phe Gly Tyr
100 105 110
Trp Leu Asp Ile Lys
115
<210> 17
<211> 788
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Val Leu Phe Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Gly Gln Arg
1 5 10 15
Pro Thr Ile Ser Arg Arg Ala Ser Pro Ser Ser Thr Tyr Trp Gln Tyr
20 25 30
Met His Pro Pro Thr Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Lys Pro Arg Leu
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Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Arg Glu Leu Ile Tyr Tyr Asn Leu Glu Ser
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Gly Val Pro Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Thr Glu Phe
65 70 75 80
Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Gly Ala Glu Gly Glu Cys Ile Thr Cys Val Thr Lys Thr Phe
100 105 110
Asn Arg Ser Leu Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Thr Glu Ser Gly Pro Gly Leu Asp Val Ala Pro Ser
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Gln Ser Pro Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Thr Gln Ala Asp Lys Glu
145 150 155 160
Ile Thr Ser Val His Trp Cys Pro Gln Pro Pro Gly Lys Trp Leu Met
165 170 175
Trp Leu Gly Val Leu Ser Gly Asn Tyr Pro Ser Ala Leu Leu Ser Ile
180 185 190
Ser Lys Asp Asn His Gln Gly Ser Lys Ser Gln Asp Phe Leu Lys Met
195 200 205
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Gln Lys Arg Val Pro Glu Asn Leu Pro Lys Thr Val Leu Phe Asn His
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Gln Asp Trp Tyr Leu Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gln
260 265 270
Ser Ser Val Val Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Pro Gly Gln Ala Ser
275 280 285
Ile Ser Cys Leu Pro Pro Ser Phe Thr Gln Met Val Glu Tyr Trp Tyr
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Trp Pro Met Gln Leu Pro Pro Ser Gln Thr Gly Val Pro Val Leu Thr
325 330 335
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Tyr Thr Asp Phe Thr Ser Lys Ile Ser Arg
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Glu Asp Leu Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Lys Pro Thr Gly Ser Ser Gln
355 360 365
Val Val Lys Phe Gly Gly Gly Phe Gly Tyr Trp Leu Asp Ile Lys Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Gly Pro Thr
385 390 395 400
Glu Leu Lys Gln Pro Gly Glu Thr Cys Lys Ile Ser Cys Lys Pro Ser
405 410 415
Pro Glu Val Thr Cys Val Trp Met Met Asn Trp Val Thr Ile Ser Lys
420 425 430
Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Lys Trp Cys Gly Trp Gly Pro Ser Tyr
435 440 445
Asp Tyr Val Phe Leu Gly Asp Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Thr Gly
450 455 460
Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Val Glu Trp Thr Ser Ala Ser Ala
465 470 475 480
Ala Tyr Leu Gln Ile Pro Asn Leu Lys Asn Gln Gln Glu Asp Thr Ala
485 490 495
Thr Tyr Phe Cys Ile Ser Ser Leu Trp Ile Leu Glu Tyr Trp Gly Gln
500 505 510
Gly Thr Ser Cys Thr Val Ser Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
515 520 525
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
530 535 540
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
545 550 555 560
Asp Phe Ala Cys Asp Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
565 570 575
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
580 585 590
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
595 600 605
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
610 615 620
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
625 630 635 640
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
645 650 655
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
660 665 670
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
675 680 685
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
690 695 700
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
705 710 715 720
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
725 730 735
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
740 745 750
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
755 760 765
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
770 775 780
Leu Pro Pro Arg
785
<210> 18
<211> 2364
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gatattgtgc tgtttcagag cccgaccagc ctggcggtgg gccagcgccc gaccattagc 60
cgccgcgcga gcccgagcag cacctattgg cagtatatgc atccgccgac caaccagcag 120
aaaccgggcc agaaaccgcg cctgctgatt tatggcacca gccgcgaact gatttattat 180
aacctggaaa gcggcgtgcc gctgaccatt agcagcctgc agccgagcgg caccgaattt 240
accctgaaca ttcatccggt ggaagaagat gatgcggcga cctattattg cagcggcgcg 300
gaaggcgaat gcattacctg cgtgaccaaa acctttaacc gcagcctgga atgcggcggc 360
ggcggcagcg gcggcggcgg cagccaggtg cagctgaccg aaagcggccc gggcctggat 420
gtggcgccga gccagagccc gagcattacc tgcaccgtga gcacccaggc ggataaagaa 480
attaccagcg tgcattggtg cccgcagccg ccgggcaaat ggctgatgtg gctgggcgtg 540
ctgagcggca actatccgag cgcgctgctg agcattagca aagataacca tcagggcagc 600
aaaagccagg attttctgaa aatgaccagc ctgcagctga ccgatgatac cgcgatgtat 660
tattgcaacg gccagaaacg cgtgccggaa aacctgccga aaaccgtgct gtttaaccat 720
caggattggt atctgaacgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 780
agcggcggcg gcggcagcga tgtgctgatg acccagagca gcgtggtgct gagcctgccg 840
gtgaccctgc cgggccaggc gagcattagc tgcctgccgc cgagctttac ccagatggtg 900
gaatattggt atctgcagac cccgatgaac agcccgaaac tgctgattta tccgcgcgaa 960
tggccgatgc agctgccgcc gagccagacc ggcgtgccgg tgctgacctt tagcggcagc 1020
ggcgcgtata ccgattttac cagcaaaatt agccgcgaag atctgctggg cgtgtattat 1080
tgcaaaccga ccggcagcag ccaggtggtg aaatttggcg gcggctttgg ctattggctg 1140
gatattaaag gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcc agattcagct gggcccgacc 1200
gaactgaaac agccgggcga aacctgcaaa attagctgca aaccgagccc ggaagtgacc 1260
tgcgtgtgga tgatgaactg ggtgaccatt agcaaacagg cgccgggcaa agtgctgaaa 1320
tggtgcggct ggggcccgag ctatgattat gtgtttctgg gcgataccta tgcggatgat 1380
tttaaaaccg gccgctttgc gtttagcctg gaagcggtgg aatggaccag cgcgagcgcg 1440
gcgtatctgc agattccgaa cctgaaaaac cagcaggaag ataccgcgac ctatttttgc 1500
attagcagcc tgtggattct ggaatattgg ggccagggca ccagctgcac cgtgagcaaa 1560
accaccaccc cggcgccgcg cccgccgacc ccggcgccga ccattgcgag ccagccgctg 1620
agcctgcgcc cggaagcgtg ccgcccggcg gcgggcggcg cggtgcatac ccgcggcctg 1680
gattttgcgt gcgataccac caccccggcg ccgcgcccgc cgaccccggc gccgaccatt 1740
gcgagccagc cgctgagcct gcgcccggaa gcgtgccgcc cggcggcggg cggcgcggtg 1800
catacccgcg gcctggattt tgcgtgcgat atttatattt gggcgccgct ggcgggcacc 1860
tgcggcgtgc tgctgctgag cctggtgatt accctgtatt gcaaacgcgg ccgcaaaaaa 1920
ctgctgtata tttttaaaca gccgtttatg cgcccggtgc agaccaccca ggaagaagat 1980
ggctgcagct gccgctttcc ggaagaagaa gaaggcggct gcgaactgcg cgtgaaattt 2040
agccgcagcg cggatgcgcc ggcgtataaa cagggccaga accagctgta taacgaactg 2100
aacctgggcc gccgcgaaga atatgatgtg ctggataaac gccgcggccg cgatccggaa 2160
atgggcggca aaccgcgccg caaaaacccg caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa 2220
gataaaatgg cggaagcgta tagcgaaatt ggcatgaaag gcgaacgccg ccgcggcaaa 2280
ggccatgatg gcctgtatca gggcctgagc accgcgacca aagataccta tgatgcgctg 2340
catatgcagg cgctgccgcc gcgc 2364

Claims (10)

1.一种靶向ROR1和CD7的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括如下结构：ROR1 scFv-CD7 scFv-H-TM-C-CD3ζ其中“-”为连接肽或肽键；H为铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为胞内信号传导序列；ROR1 scFv包括如SEQ ID NO:1-3所示重链CDR区和SEQ ID NO:4-6所示轻链CDR区；CD7 scFv包括如SEQ ID NO:7-9所示重链CDR区和SEQ ID NO:10-12所示轻链CDR区。
2.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述ROR1scFv包括如SEQ ID NO:13所示重链可变区和SEQ ID NO:14所示轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD7 scFv包括如SEQ ID NO:15所示重链可变区和SEQ ID NO:16所示轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号分子选自CD28或4-1BB。
5.根据权利要求1所述的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4任一项所述的双特异性嵌合抗原受体。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:18所示。
8.一种免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达有权利要求1-4任一项所述的双特异性嵌合抗原受体。
9.根据权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞。
10.权利要求1-4所述的双特异性嵌合抗原受体或权利要求6-7所述的核酸分子或权利要求8-9所述的免疫细胞在制备肿瘤药物中的应用。
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