CN114040785A - 具有延长抗微生物活性的透明质酸水凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水凝胶以及用于制备所述负载的水凝胶的方法，该水凝胶包含透明质酸(HA)或其衍生物，该水凝胶负载有至少一种带正电荷的抗微生物肽，其中所述HA或其衍生物在其羟基部分的水平上与交联剂交联，而HA或其衍生物的羧基部分保持游离并且所述HA或其衍生物保持带负电荷。

Description

具有延长抗微生物活性的透明质酸水凝胶

本发明涉及具有抗微生物活性的水凝胶。

生物医学设备的植入通常伴随着对植入体的过度免疫反应，以及细菌、酵母和真菌感染。炎症和感染可能会严重影响植入体的功能，并且甚至导致植入体的失败。

因此，在生物医学设备的植入之后，非常需要用于避免这种感染的解决方案。

水凝胶具有几个独特的特点性能，包括水凝胶与组织细胞外基质的相似性，对细胞增殖和迁移的支持，药物或生长因子的受控释放，使对周围组织的机械性刺激最小化，以及支持细胞的生存能力和增殖的营养扩散。因此，水凝胶是在组织工程领域很有前途的材料。

透明质酸被广泛用以制备用于组织工程的生物材料，因为透明质酸提供高度再生产性且可负担的生物材料。

然而，HA水凝胶本身对可能的感染不具有任何活性。此外，HA在组织工程中的应用已经与许多缺点相关，包括半衰期短、周转快，这影响了HA在组织工程中的兴趣。

因此，非常需要用于生物医学设备植入体或组织工程植入体的新材料，这种新材料可以由医生方便地操作，在对待治疗的患者保持安全的情况下不会表现出过快的周转并且具有抗微生物活性。

本发明满足了这种需要。

本发明起因于发明人的意外发现，即可能开发负载有聚精氨酸的HA水凝胶，该HA水凝胶提供了持久的抗微生物作用，并且可以容易地沉积在伤口敷料(wound dressing)和网状假体(mesh prosthesis)上、以防止感染，因此改善了组织再生和/或植入体融合。

因此，本发明涉及一种水凝胶，该水凝胶包含透明质酸(HA)或其衍生物，该水凝胶负载有至少一种带正电荷的抗微生物肽(antimicrobial peptide)，其中在所述HA或其衍生物的羟基部分的水平上与交联剂交联，而HA或其衍生物的羧基部分保持游离并且所述HA或其衍生物保持带负电荷。

本发明的另一目的涉及一种用于制备根据本发明的水凝胶的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)在碱性条件下，将透明质酸(HA)或其衍生物与交联剂混合，该交联剂在透明质酸(HA)或其衍生物的羟基部分的水平上交联HA，而HA或其衍生物的羧基部分保持游离，并且所述HA或其衍生物保持带负电荷，

(b)将混合物沉积在支承体上并且在室温下温育48小时至72小时以获得水凝胶，

(c)回收在步骤(b)形成的水凝胶

(d)在能够去除交联剂残留物的条件下，在水性缓冲液中培育所述水凝胶且水凝胶溶胀，

(e)用至少一种带正电荷的抗微生物肽负载在步骤(d)获得的水凝胶，和

(f)回收在步骤(e)获得的所负载的水凝胶。

本发明的另一目的涉及一种可能通过本发明的制备方法获得的根据本发明的水凝胶。

本发明进一步涉及一种医疗设备，该医疗设备包含根据本发明的水凝胶。

具体实施方式

透明质酸水凝胶

如本文中所使用的，术语“水凝胶”指的是保水的、化学交联的水凝胶。

本发明的水凝胶包含透明质酸(HA)或其衍生物。

如本文中所使用的，术语“透明质酸(HA)”(也称为玻尿酸(Hyaluronan))是一种线性(无支链)多糖或非硫酸化的粘多糖，由重复的N-乙酰基葡萄糖胺和葡萄糖醛酸盐(酯)(由β1-3糖苷键和β1-4糖苷键联接)双糖单元构成。

HA通常具有以下式(3)：

其中，p是包含2与25,000之间的整数。

因此，透明质酸(HA)是一种带负电荷的聚合物(也称为聚阴离子)。因此，所述带负电荷的聚合物以盐的形式与抗衡离子一起存在。透明质酸钠的抗衡离子是钠。透明质酸可以被透明质酸酶(Hyaluronidase)降解。透明质酸的分子量(Mw)代表群体中所有分子的平均值，因此代表了分子质量平均值(平均分子量，Molecular Weight Average)。透明质酸(HA)的分子量范围很广。

因此，“一类透明质酸”指的是具有特定分子量的特定透明质酸。

在一特定的实施方案中，所述透明质酸是具有分子量在150kDa与3000kDa之间、特别是在160kDa与2900kDa之间、在170kDa与2800kDa之间、在180kDa与2700kDa之间、在190kDa与2670kDa之间、在200kDa与2600kDa之间、在300kDa与2500kDa之间、在400kDa与2400kDa之间、在500kDa与2300kDa之间、在600kDa与2200kDa之间、在700kDa与d2100 kDa之间、在750kDa与2000kDa之间、在760kDa与1900kDa之间、在770kDa与1800kDa之间、在780kDa与1700kDa之间、在790kDa与1600kDa之间、在800kDa与1500kDa之间、在805kDa与1400kDa之间、在810kDa与1300kDa之间、在815kDa与1200kDa之间、在820kDa与1100kDa之间、在821kDa与1000kDa之间、在822kDa与900kDa之间、在823kDa与850kDa之间的透明质酸。

在一实施例中，透明质酸具有150kDa的分子量，并且以来自美国Lifecore Biomed的透明质酸钠的形式提供。

在一优选的实施方案中，所述透明质酸是具有在800kDa与850kDa之间的分子量的透明质酸。

在一优选的实施例中，透明质酸具有823kDa的分子量(称为HA⁸⁰⁰)。

在另一实施例中，透明质酸具有2670kDa的分子量(称为HA²⁷⁰⁰)。

在特定的实施方案中，所述水凝胶包含一类以上的透明质酸。因此，在一些实施方案中，透明质酸包含至少两类透明质酸、并且至少两类透明质酸中的一种具有在800kDa与850kDa之间的分子量、并且至少两类透明质酸中的另一种具有在100kDa与2000kDa之间的分子量，特别是150kDa的分子量。

如本文中所使用的，本文中术语“透明质酸的衍生物”指的是化学修饰的透明质酸。更具体地，透明质酸的衍生物可以指的是已经被化学修饰以引入化学基团或以将HA与化学化合物缀合的透明质酸；该透明质酸的衍生物优选能够使HA与另一种化合物交联、或使HA与另一种HA化合物或其衍生物交联，特别是带有胺基的化合物。

在一些实施方案中，透明质酸的衍生物包括但不限于：具有醛基修饰的HA(称为HA-CHO或HA-Ald)、胺修饰的透明质酸(称为HA-NH2)、包含光反应性乙烯苄基基团(photoreactive vinylbenzyl group)的HA(称为HA-VB)、用甲基丙烯酸酯基修饰的HA(称为甲基丙烯酸酯化HA)、与酪胺缀合的HA(称为HA-酪胺)和与儿茶酚缀合的HA(称为HA-儿茶酚)。

在本发明的水凝胶中，在HA或其衍生物羟基部分的水平上将所述HA或其衍生物与交联剂交联，而HA或其衍生物的羧基部分保持游离且所述HA或其衍生物保持带负电荷。

“交联剂”在本文中指的是能够在两种聚合物(即，两个HA分子)之间形成共价键或离子键的试剂。

在本发明的上下文中，交联剂在HA的羟基部分的水平上交联HA，而HA的羧基部分保持游离且HA保持带负电荷。

“羧基部分保持游离”在本文中指的是交联剂不会在HA的羧基部分的水平上引起键的形成，因此与HA的羧基部分交联前的状态相比保持未修饰。

靶向羟基的交联剂的实施例是技术人员公知的、且包括丁二醇二缩水甘油醚(butanediol diglycidyl ether，BDDE)、二乙烯基砜(divinyl sulfone，DVS)和溴化氰、辛烯基琥珀酸酐。

正如技术人员将理解的那样，交联剂是否会引起在特定部分的形成可以取决于反应条件，尤其取决于在酸性条件或碱性条件下的反应。

“HA保持带负电荷”在本文中指的是交联后的HA的整体电荷为负电的。在一特定实施方案中，所有HA分子在交联后保持带负电。

在一个具体实施方式中，所述交联剂是丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。

与BDDE交联的HA通常具有下式(4)

本发明的水凝胶通常具有高交联水平。

带正电荷的抗微生物肽

本发明的HA水凝胶负载有至少一种带正电荷的抗微生物肽。

“负载”在本文中指的是HA水凝胶被浸渍、包含和/或带有至少一种带正电荷的抗微生物肽，而所述肽不与水凝胶共价地连接。因此，随着时间的推移，所述肽可以从水凝胶中自然释放。

“抗微生物肽”在本文中指的是表现出防腐、抗生物质、抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗原生动物和/或抗寄生活性(antiparasitic activity)的肽。

优选地，该抗微生物胎是抗细菌的肽。

如本文中所用的，术语“抗细菌活性”涵盖抑菌活性和/或杀菌活性。

在一实施方案中，抗细菌活性和/或抑菌活性是针对至少一种细菌。

如本文中所用的，“杀菌活性”指的是杀死细菌，尤其是杀死至少一类细菌。

如本文中所用的，本文中的“抑菌活性”指的是停止细菌繁殖，而不需要杀死细菌，换而言之，本文中的抑菌活性指的是抑制细菌的生长。因此，抑菌活性可以例如以至少一种细菌的生长抑制的百分比来表示。

在本发明的上下文中，“至少一种细菌的生长抑制”可以是超过70％，例如超过75％、超过80％，通常超过82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％。

因此，在一实施方案中，本发明上下文中使用的抗微生物肽对至少一种细菌的生长抑制超过70％，更特别地，对至少一种细菌的生长抑制超过75％、超过80％、通常超过82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％。

本文中的“至少一种细菌”指的是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种细菌的细菌。

在一实施方案中，至少一种细菌是ESKAPE病原体。

“ESKAPE病原体”是遍及世界的医院感染的主要原因，并例如在Biomed ResInt.2016；2016：2475067中描述的。在一实施方案中，术语“ESKAPE病原体”指的是选自由屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌(Enterobacter species)构成的组的细菌。

在一实施方案中，至少一种细菌是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，优选革兰氏阳性细菌。

在一实施方案中，革兰氏阴性菌是铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌或军团杆菌(Legionella)细菌，优选大肠杆菌或铜绿假单胞菌。

在一实施方案中，革兰氏阳性细菌是葡萄球菌、微球菌或肠球菌细菌。

“葡萄球菌”属的细菌是稳定的、无芽胞形成的、过氧化氢酶阳性的、氧化酶阴性的、以葡萄状簇聚集在一起的革兰氏阳性球菌。巴斯德(Pasteur)于1879年在疖疮脓液中观察到葡萄球菌，葡萄球菌(staphylococci)的名字来源于在急性慢性脓肿中将它们分离出来的Ogsten(1881)。诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、头状葡萄球菌(S.capitis)、山羊葡萄球菌(S.caprae)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、模仿葡萄球菌(S.simulans)和华纳葡萄球菌(S.Warneri)的“葡萄球菌”属的细菌是异物感染(例如，假体关节感染)的主要病原体。

因此，在一实施方案中，葡萄球菌选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、路邓葡萄球菌、施氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌和华纳葡萄球菌，优选为金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，更优选为金黄色葡萄球菌。

“微球菌”属的细菌通常被认为是一种腐生或共生生物，尽管它可能是一种机会致病菌，尤其是在免疫系统受损的宿主(诸如HIV患者)中。微球菌通常存在于皮肤微生物群落中，并且该属很少与疾病有关。然而，在极少数情况下，免疫功能低下的患者会发生由微球菌引起的肺部感染而死亡。微球菌可能与其他感染有关，包括复发性菌血症、脓毒性休克、脓毒性关节炎、心内膜炎、脑膜炎和空洞性肺炎，尤其是在免疫抑制患者中。

在一实施方案中，微球菌是藤黄微球菌(M.Luteus)细菌。

“肠球菌”属的细菌是诸如尿路感染、菌血症、细菌性心内膜炎、憩室炎和脑膜炎的重要临床感染的病因。

在一实施方案中，肠球菌是万古霉素耐药肠球菌(vancomycin-resistantEnterococcus)，例如粪肠球菌(E.faecalis)或屎肠球菌(E.faecium)。

抑菌活性或生长抑制的百分比可以在例如本文下面的“方法”章节描述的抗细菌测定中证明。可以在这种抗细菌测定中使用的菌株可以是，例如，藤黄葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。

本发明上下文中使用的抗微生物肽是带正电荷的肽。

“带正电荷”在本文中指的是整体肽电荷是正电的。

带正电荷的氨基酸是技术人员公知的，并且包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸和鸟氨酸。

在本发明的上下文中可以使用任何带正电荷的抗微生物肽。

在一具体实施方案中，所述带正电荷的抗微生物肽是下式(2)的肽：

其中

-n是包括在2与250之间的整数，尤其是在2与200之间的整数，并且

-R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂。

式(2)的肽由n个重复单元组成，所述重复单元是相同的或不同的。根据本发明，式(2)肽的重复单元具有式-NH-CH(CH₂-CH₂CH₂-R)-C(＝O)-。对于给定的重复单元，R如上所定义并且因此对于每个单元可以是不同的。

根据一优选的实施方案，式(2)的肽由n个重复单元够成，其中所有的R基团是相同的。

根据另一实施方案，式(2)的肽由n个重复单元组成，其中R基团可以是不同的。

在n个单元中，肽可以包含i个式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-NH₂)-C(＝O)-单元，j个式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂)-C(＝O)-单元，和k个式-NH-CH(CH₂-CH₂-CH₂-NH-C(NH)-NH₂)-C(＝O)-单元，其中每个i、j和k包括在0与n之间，并且其中i+j+k＝n，具有单元的随机分布或具有作为块的分布。

在一实施方案中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时，具有式(2)的n个重复单元的“n”是在11与200之间的整数。

在另一实施方案中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时、优选当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂、更优选当R是-NH-C(NH)-NH₂时，n是包括在11与99之间的整数，例如，n包含在11与95之间、在15与95之间、在15与90之间、在15与85之间、在15与80之间、在15与75之间、在20与95之间、在20与90之间、在20与85之间、在20与80之间、在20与75之间、在25与95之间、在25与90之间、在25与85之间、在25与80之间、在25与75之间、在28与74之间、在28与72之间、在30与70之间的整数，例如30、50和70。

在另一实施方案中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时、优选当R是选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂、更优选当R是-NH-C(NH)-NH₂时，n是在11与49之间的整数，例如，n是在11与45之间、在15与45之间、在20与40之间、在21与39之间、在22与38之间、在23与37之间、在24与36之间、在25与35之间、在26与34之间、在27与33之间、在28与32之间、在29与31之间的整数。

在一特定实施方案中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时、优选当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时、更优选当R是-NH-C(NH)-NH₂时，n是选自以下组成的组的整数：11、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、47、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98，优选地，n为30、50或70。

在一特定实施方案中，当R选自-NH₂、-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时、优选当R选自-CH₂-NH₂和-NH-C(NH)-NH₂时、更优选当R是-NH-C(NH)-NH₂时，n是选自以下组成的组的整数：11、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45和49，优选地，n为30。

式(2)的“重复单元”也可以被称为“结构单元”，并且在本文中指的是氨基酸或氨基酸残基，其中当R是-NH₂时、所述氨基酸为鸟氨酸，当R是-CH₂-NH₂时、所述氨基酸为赖氨酸，或者当R是-H-C(NH)-NH₂时、所述氨基酸为精氨酸。因此，“式(2)的n个重复单元”也可以被称为“式(2)的n个氨基酸残基”，更准确地说，当R是-NH₂时、“式(2)的n个重复单元”为n个鸟氨酸残基，当R是-CH₂-NH₂时、“式(2)的n个重复单元”为n个赖氨酸残基，或者当R是-H-C(NH)-NH₂时、“式(2)的n个重复单元”为n个精氨酸残基。

根据上文，在一些实施方案中，“具有式(2)的n个重复单元”在当R是-NH₂时可以被称为“具有n个鸟氨酸残基的聚鸟氨酸”、当R是-CH₂-NH₂时可以被称为“具有n个赖氨酸残基的聚赖氨酸”、或者当R是-H-C(NH)-NH₂时可以被称为“具有n个精氨酸残基的聚精氨酸”。

“鸟氨酸”是一种在尿素循环中发挥作用的非蛋白氨基酸。聚鸟氨酸指的是结构单元鸟氨酸的聚合物。聚鸟氨酸指的是聚-L-鸟氨酸、聚-D-鸟氨酸或聚-LD-鸟氨酸。在本发明的上下文中，聚鸟氨酸特别指的是聚-L-鸟氨酸(poly-L-ornithine，PLO)。

“精氨酸”和“赖氨酸”是在蛋白质生物合成中使用的α-氨基酸。聚精氨酸和聚赖氨酸分别指的是结构单元精氨酸的聚合物或结构单元赖氨酸的聚合物。聚精氨酸或聚赖氨酸是指聚-L-精氨酸、聚-D-精氨酸或聚-LD-精氨酸或聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-LD-赖氨酸。在本发明的上下文中，聚精氨酸或聚赖氨酸尤其分别指的是聚-L-精氨酸(poly-L-arginine，PAR)和聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)。

在一特定实施方案中，所述带正电荷的抗微生物肽选自由聚精氨酸、聚鸟氨酸和聚赖氨酸构成的组。

“聚-L-鸟氨酸”、“聚-L-赖氨酸”和“聚-L-精氨酸”是带正电荷的合成聚合物，并且以具有抗衡离子的盐的形式生产。抗衡离子可以选自但不限于盐酸盐、氢溴酸盐或三氟乙酸盐。

在一实施例中，聚精氨酸是具有CAS#26982-20-7的聚-L-精氨酸盐酸盐。

在一实施例中，聚鸟氨酸是具有CAS#27378-49-0的聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐或具有CAS#26982-21-8的聚-L-鸟氨酸盐酸盐。

在一实施例中，聚赖氨酸是聚-L-赖氨酸三氟乙酸盐、具有CAS#25988-63-0的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、或具有CAS#26124-78-7的聚-L-赖氨酸盐酸盐。

具有确定数目氨基酸残基的聚-L-鸟氨酸、聚-L-赖氨酸和聚-L-精氨酸可以例如通过美国Alamanda Polymers商购获得。

在一实施例中，自美国Alamanda Polymers购买聚-L-精氨酸(PAR)，例如PAR10(10精氨酸(R)，Mw＝2.1kDa，PDI＝1)、PAR30(30R，Mw＝6.4kDa，PDI＝1.01)、PAR50(50精氨酸(R)，Mw＝9.6kDa，PDI＝1.03)、PAR70(70精氨酸(R)，Mw＝13.4kDa,PDI＝1.01)、PAR100(100R，Mw＝20.6kDa，PDI＝1.05)以及PAR200(200R，Mw＝40.8kDa，PDI＝1)。

在另一实施例中，自美国Alamanda Polymers购买聚-L-鸟氨酸(PLO)，例如PLO30(30R，Mw＝5.9kDa，PDI＝1.03)、PLO100(100R，Mw＝18.5kDa，PDI＝1.03)以及PLO250(250R，Mw＝44.7kDa，PDI＝1.02)。

在另一实施例中，自美国Alamanda Polymers购买聚-L-赖氨酸(PLL)，例如PLL10(10R，Mw＝1.6kDa)、PLL30(30R，Mw＝5.4kDa，PDI＝1.02)、PLL100(100R，Mw＝17.3kDa，PDI＝1.07)、PLL250(250R，Mw＝39.5kDa，PDI＝1.08)。

获得具有n个重复单元(诸如，例如具有n＝30的聚精氨酸、聚赖氨酸或聚鸟氨酸)的多肽的方法是本领域技术人员已知的、并且包括α-氨基酸N-羧基酸酐(alpha-aminoacid N-carboxyanhydrides，NCA)的开环聚合，然后纯化。通常，多肽在聚合后通过在水中或例如在有机非溶剂中沉淀、以及在氨基酸侧链脱保护后通过透析进行纯化。最后，所有水溶性聚合物最后都被冻干。

在一特别优选的实施方案中，所述带正电荷的抗微生物肽是聚精氨酸。

在更特别优选的实施方案中，所述聚精氨酸具有下式(1)

其中n是包括在2与100之间的整数。

在另一实施方案中，式(1)中的n是包括在11与99之间的整数，例如，n是包括在11与95之间、在15与95之间、在15与90之间、在15与85之间、在15与80之间、在15与75之间、在20与95之间、在20与90之间、在20与85之间、在20与80之间、在20与75之间、在25与95之间、在25与90之间、在25与85之间、在25与80之间、在25与75之间、在28与74之间、在28与72之间、在30与70之间的整数，例如30、50和70。

在另一实施方案中，式(1)中的n是包括在11与49之间的整数，例如，n是在11与45之间、在15与45之间、在20与40之间、在21与39之间、在22与38之间、在23与37之间、在24与36之间、在25与35之间、在26与34之间、在27与33之间、在28与32之间、在29与31之间的整数。

在一特定实施方案中，式(1)中的n是选自由11、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、47、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98构成的组的整数，优选地，n为30、50或70。

在一特定实施方案中，式(1)中的n是选自由11、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45和49构成的组的整数，优选地，n为30。

在一特别优选的实施方案中，所述聚精氨酸具有下式(1)

其中n为30。

在一特定实施方案中，所述水凝胶负载有如上定义的式(2)的带正电荷的抗微生物肽，其中n是n₁，n₁为包括在2与100之间的整数，并且至少负载有如上定义的式(2)的带正电荷的抗微生物肽，其中n是n₂，n₂为在2与100之间但不同于n₁的整数。

换而言之，在特定实施方案中，所述水凝胶负载有至少两种式(2)的、带正电荷的抗微生物肽，所述肽具有不同大小。

在一特定实施方案中，所述水凝胶负载有下式(1)的聚精氨酸

其中n是n₁，n₁为包括在2与250之间，特别是在2与200之间的整数，

以及负载有下式(1)的聚精氨酸

其中n是n₂，n₂为包括在2与250之间，特别是在2与200之间的整数，其中n₂不同于n₁。

在更特定实施方案中，所述水凝胶负载有不同尺寸的式(1)的聚精氨酸。

在另一实施方案中，抗微生物肽选自儿茶酚抑素(catestatin)、cateslytin、聚鸟氨酸、聚赖氨酸和它们的D-异构体或L-异构体、乳链菌肽(nisin)、防御素(defensing)、蜂毒肽(mellitin)和蛙皮素(magainin)。

在一特定的实施方案中，本发明的水凝胶负载有如上定义的、不同的带正电荷的抗微生物肽，例如负载有PAR10和PAR200的混合物或负载有PAR30和PAR200的混合物。

附加化合物

本发明的水凝胶还可以包含附加化合物。特别地，本发明的水凝胶可以进一步包含药物活性药品。

在本发明的上下文中，术语“药物活性药品”指的是改变、抑制、激活或以其他方式影响生物事件的化合物或实体。例如，药品包括但不限于抗癌物质；抗炎剂；免疫抑制剂；细胞-细胞外基质相互作用的调节剂，包括细胞生长抑制剂、抗凝剂、抗血栓形成剂、酶抑制剂、镇痛剂、抗增殖剂、抗真菌物质、细胞生长抑制物质、生长因子、激素、类固醇、非类固醇物质和抗组胺剂。适应症组的实施例包括但不限于镇痛剂、抗增殖剂、抗血栓剂、抗炎剂、抗真菌剂、抗生素、细胞生长抑制剂、免疫抑制物质以及生长因子、激素、糖皮质激素、类固醇、非类固醇物质、用于沉默和转染的遗传或代谢活性物质、抗体、肽、受体、配体及其任何药物可接受的衍生物。上述组的具体实施例是紫杉醇、雌二醇、西罗莫司、红霉素、克拉霉素、阿霉素、伊立替康、庆大霉素、双氯西林、奎宁、吗啡、肝素、萘普生、泼尼松、地塞米松、细胞因子、IL-4、IL-10、VEGF、两性霉素B、儿茶酚抑素或cateslytin。

制备方法

本发明还涉及一种用于制备如上定义的水凝胶的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)在碱性条件下将透明质酸(HA)或其衍生物(如上文“透明质酸水凝胶”章节中定义的)与交联剂混合，该交联剂在HA或其衍生物的羟基部分的水平上交联HA，而HA或其衍生物的羧基部分保持游离并且所述HA或其衍生物保持带负电荷，如上文“透明质酸水凝胶”章节中定义的，

(b)将混合物沉积在支承体上并在室温下温育48小时至72小时以获得水凝胶，

(c)回收在步骤(b)形成的水凝胶，

(d)在能够去除交联剂残留物的条件下，在水性缓冲液中温育所述水凝胶且水凝胶溶胀，

(e)用至少一种带正电荷的抗微生物肽负载在步骤(d)获得的水凝胶，如上文“带正电荷的抗微生物肽”章节中定义的，以及

(f)回收在步骤(e)获得的负载水凝胶。

混合步骤(a)

本发明方法的混合步骤(a)包括在碱性条件下将透明质酸(HA)或其衍生物(如上文“透明质酸水凝胶”部分定义的)与交联剂混合，该交联剂在HA或其衍生物的羟基部分的水平上交联HA，而HA或其衍生物的羧基部分保持游离并且该HA或其衍生物保持带负电荷，如上文“透明质酸水凝胶”章节中定义的。

在一特定实施方案中，HA是具有在800kDa与850kDa之间的分子量，特别是具有823kDa的分子量的透明质酸。

在一特定实施方案中，步骤(a)的混合物包含1至10％(w/v)的如上定义的HA或其衍生物，更优选地包含2至3％(w/v)的如上定义的HA或其衍生物，最优选包含2.5％(w/v)的如上定义的HA或其衍生物。

在一特定实施方案中，交联剂是丁二醇二缩水甘油醚(butanediol diglycidylether，BDDE)。

在一特定实施方案中，步骤(a)的混合物包含至少10％(v/v)的如上定义的交联剂(特别是BDDE)，更优选至少20％(v/v)的交联剂(特别是BDDE)。在一特定实施方案中，步骤(a)的混合物包含10％至30％(v/v)的如上定义的交联剂，特别是BDDE。

在一特定实施方案中，步骤(a)的混合物包含2至3％(w/v)的HA或其衍生物；以及，至少10％(v/v)的交联剂(特别是BDDE)，尤其是至少20％(v/v)的交联剂(特别是BDDE)。

“碱性条件”在本文中指的是pH高于7的反应条件。一般情况下，HA和交联剂在NaOH溶液中，特别是在0.1M至0.3M的NaOH溶液中、更特别是在0.25M的NaOH溶液中混合。

沉积步骤(b)

本发明方法的沉积步骤(b)包括将在步骤(a)获得的混合物沉积在支承体上、并且将混合物在室温下温育48小时至72小时以获得如上定义的水凝胶。

可以使用任何合适的支承体，例如培养皿、载玻片、孔板、封口膜、医用敷布、网状体或医用假体(聚合物、金属)。

所述支承体可以是任何合适的材料，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯、丙烯腈丁二烯苯乙烯(acrylonitrile butadiene styrene，ABS)、玻璃、特氟隆或金属。在一特定的实施方案中，所述支承体是能够支承高pH值的材料。

所述支承体可以在沉积混合物之前进行预处理。例如，可以清洗所述支承体，例如在

(阴离子洗涤剂)溶液和/或HCl溶液和/或70％酒精溶液和/或丙酮中清洗，和/或所述支承体被处理来改善粘附性，例如通过沉积聚乙烯亚胺(PEI)。

混合物可以通过技术人员公知的任何技术沉积在支承体上，例如逐滴沉积、倾倒、移液、挤出、旋涂、浸渍或3D打印。

混合物一旦沉积在支承体上，在室温下温育48小时至72小时、优选72小时以获得如上定义的水凝胶。

回收步骤(c)

然后回收在步骤(b)形成的水凝胶。

回收步骤(c)可以通过技术人员公知的任何技术来实施，例如通过通常使用圆形切割机、解剖刀、精密切割仪器(基于物理或激光的)和根据尺寸需要的特定压力切割机来切割水凝胶的片。

温育步骤(d)

本发明方法的温育步骤(d)包括在能够去除交联剂残留物的条件下、在水性缓冲液中温育所述水凝胶且使水凝胶溶胀。

“水性缓冲液”在本文中指的是由弱酸及其共轭碱(反之亦然)的混合物组成的水溶液。水性缓冲液的实施例包括Tris/NaCl缓冲液(例如，Tris 10mM，NaCl 0.15M，pH 7.4的缓冲液)、PBS或HEPES。

如本文中使用的，水性缓冲液还涵盖了由水(例如，蒸馏水)组成的溶液。

“去除交联剂残留物”在本文中指的是不参与键合的交联剂分子从水凝胶中除去，使得优选地在温育步骤后的水凝胶中存在不超过0.01％的游离交联剂分子。

“水凝胶的溶胀”在本文中指的是水凝胶从温育该水凝胶的水性缓冲液中捕获水，优选直到水凝胶将其尺寸增加至少1.5倍的水平。

温育步骤通常进行1-5分钟至1小时。温育步骤可以特别包括在不同或相同缓冲液中的多次温育，通常在1-5分钟期间进行第一次温育，在1小时期间进行第二次温育。

水凝胶通常可以在温育步骤后、实行负载步骤之前在4℃下储存。

负载步骤(e)

本发明方法的负载步骤(e)包括用至少一种带正电荷的抗微生物肽负载步骤(d)获得的水凝胶，该带正电荷的抗微生物肽如在上文“带正电荷的抗微生物肽”章节中定义的。

在一特定实施方案中，带正电荷的抗微生物肽是如在上文“带正电荷的抗微生物肽”章节中定义的聚精氨酸，特别是PAR30。

在一特定实施方案中，所述带正电荷的抗微生物肽在步骤(e)中以0.05mg/ml至5mg/ml、更特别地0.05mg/ml至1mg/ml的浓度负载。

所述负载优选在室温下进行。

带正电荷的抗微生物肽的负载可以进行2小时至48小时、特别是3小时至24小时、优选24小时。

负载步骤(e)之后可以进行清洗步骤(e’)，其中负载的水凝胶在如上定义的水性缓冲液、特别是在Tris Nacl缓冲液中清洗。

通过本发明的方法制备的负载的水凝胶可以进一步包含如上文“附加化合物”章节中定义的附加化合物。这些附加化合物可以在水凝胶的形成过程中或在水凝胶的负载过程中加入。具体地，所述附加化合物可以在加入交联剂之前与HA混合，可以与HA和交联剂的混合物混合，或者可以在用抗微生物肽负载之前或之后、在交联反应之后负载。

本发明进一步涉及可能通过如上定义的制备方法获得的水凝胶。

如本领域技术人员从上面描述的制备方法将可以清楚地看出，通过如上定义的制备方法获得的水凝胶可能具有高交联水平。

医疗设备

本发明还涉及包含如上定义的水凝胶的医疗设备。

“医疗设备”在本文中指的是诸如导管、支架、气管内插管、皮下注射管(hypotubes)、过滤器(例如用于栓塞保护的那些)、手术器械等的物品。在医学领域中通常被涂覆的任何装置均可用于本发明。进一步地，本发明的范围内，其中该术语指的是插入哺乳动物的任何天然或人工材料。特别适合应用本发明的水凝胶的特定医疗设备包括，但不限于，可外周插入的中心静脉导管、透析导管、长期隧道式中心静脉导管、长期非隧道式中心静脉导管、外周静脉导管、短期中心静脉导管、动脉导管、肺动脉Swan-Ganz导管、导尿管、人造尿道括约肌、长期泌尿装置、尿扩张器、泌尿支架、其他泌尿装置、组织粘合泌尿装置、阴茎假体、血管移植物、血管导管端口、血管扩张器、血管外扩张器、血管支架、血管外支架、伤口引流管、脑积水分流器、心室导管、腹膜导管、起搏器系统、小型或临时关节替换件、心脏瓣膜、心脏辅助装置等和骨假体、关节假体和假牙。

如本文使用的，术语“医疗设备”还涵盖伤口敷料和网状假体。

术语“伤口敷料”在下文中指的是任何药学上可接受的伤口覆盖物，例如：

a)膜，包括那些半渗透或半闭合性质的膜，例如聚氨酯共聚物、丙烯酰胺、丙烯酸酯、石蜡、多糖、赛璐玢和羊毛脂；

b)水胶体，包括羧甲基纤维素、明胶蛋白质成分、果胶、以及包括阿拉伯胶、瓜尔胶和梧桐树胶的复合多糖，该水胶体可以以软泡沫的形式利用，替代地，在配制聚氨酯中，或进一步替代地，配制为粘合剂物质(例如，聚异丁烯)；

c)浸渍剂，包括松木网状纱布、石蜡和羊毛脂涂覆的纱布、聚乙二醇涂覆的纱布、针织粘胶纤维、人造丝和聚酯；以及

d)纤维素样多糖，例如包括海藻酸钙的海藻酸盐，该纤维素样多糖可以配制成纤维的非织造复合材料或纺成织造复合材料。

在一特定的实施方案中，所述伤口敷料包括作为载体材料的非织造织物或针织织物、在天然纤维或合成纤维上制成的针织或编织织物。

“网状假体”在本文中指的是松散编织的片材，该薄片在手术期间用作器官和其他组织的永久或临时支承体。网状假体通常可以是聚丙烯网、聚对苯二甲酸乙二醇酯网、聚四氟乙烯网或聚偏二氟乙烯网。

在特定实施方案中，所述医疗设备是伤口敷料或网状假体。

在一特定的实施方案中，医疗设备用本发明的水凝胶涂覆和/或浸渍。

特别地，当医疗设备是伤口敷料时，伤口敷料的载体材料优选在一侧或多侧用水凝胶涂覆或浸渍。

可以通过技术人员公知的任何方法将水凝胶施加到和/或包括在医疗装置中。

通常，通过将未交联的HA-交联剂混合物逐滴沉积到材料上或通过将吸收材料浸渍至未交联的HA-交联剂混合物中，或通过用专用仪器或挤出印刷涂覆水凝胶，可以将水凝胶施加到和/或包含在医疗设备中。

在本发明的一特定实施方案中，还提供了将根据本发明的水凝胶布置在包装中。特别规定了水凝胶是无菌包装的。在这些情况下，可以使用例如为具有螺旋盖的容器、可重新封闭的管子或一次性容器(例如，具有安全盖的管子)的包装。然而，也可以规定，将水凝胶布置在用作原始包装的注射器中。特别规定注射器中的水凝胶是无菌的。在一特别优选的实施方案中，作为即用型试剂盒的、包含在无菌原始包装中的这种水凝胶可以与药品载体或敷料材料一起使用，并且还可能与其他医疗辅助工具一起使用。还可以规定，原始包装中的水凝胶和药品载体或敷料材料都在试剂盒包装中的无菌原始包装中是可获得的。

上述实施方案的任何组合构成本发明的一部分。

在本申请中，术语“包括”被解释为涵盖所有具体提到的特征以及可选的、附加的、未指定的特征。如本文中使用的，术语“包括”的使用还公开了除具体提到的特征之外其中不存在的特征(即“由……构成”)的实施方案。此外，不定冠词“a”或“an”不排除复数。在相互不同的从属权利要求中记载的某些措施这一事实并不表示这些措施的组合不能有利地使用。

现在将参考以下实施例更详细地描述本发明。本文中引用的所有文献和专利文件均通过引用并入本文。虽然在前面的描述中已经详细说明和描述了本发明，但是这些实施例被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的。

附图说明

图1：水凝胶制备工艺的示意图。

图2：石蜡膜与载玻片之间的结构。

图3：PAR预负载和后负载的HA膜上的细菌生长。24小时后，通过620nm处的光密度(OD)测量评估细菌生长。PAR0对应于没有PAR的HA膜。HA 2.5％+BDDE 20％膜在交联后(＝后负载膜)加入1mg/mL的PAR。

图4：独立式(free-standing)HA水凝胶的生产。用于水凝胶盘制备(A)以获得不同尺寸(B)的HA水凝胶盘的示意性方案。

图5：将PAR负载到HA水凝胶盘中。(A)PAR-FITC负载的示意图展示。(B)所得的水凝胶盘(负载有0.5g/mL PAR30-FITC)的CLSM图像：3D重建(左)和Z型横切(右)。

图6：将PAR30-FITC以不同浓度负载到HA水凝胶盘中3小时和24小时。(A)CLSM图像，(B)盘中心PAR浓度的定量。

图7：将PARs-FITC负载到HA水凝胶盘中。负载有0.5mg/mL的、用FITC标记的三种PAR的HA水凝胶盘的CSLM图像(左侧)以及所得盘的荧光分布(右侧)。

图8：HA水凝胶内的PAR迁移率。HA盘用0.5mg/mL的三种不同的FITC-缀合的PAR负载24小时并冲洗。然后，进行了FRAP实验。(A)比较三种PARs的荧光恢复。(B)三种PAR的扩散系数D和迁移分子p的百分比的确定。

图9：负载有PAR10、PAR30、PAR200的HA水凝胶的抗菌活性：重复培养。重复培养：细菌培养24h后，冲洗样品并接种新鲜细菌。

图10至图12：负载有PAR10、PAR30、PAR200的HA水凝胶的抗菌活性：重复培养。细菌培养24小时后，冲洗样品并接种新鲜细菌。该图示出了在负载有不同浓度PAR10(图10)、PAR30(图11)和PAR200(图12)的水凝胶盘存在下的细菌生长。

图13：PAR10和PAR30负载的HA水凝胶的细胞毒性测定。(A)24小时后，Balb/3T3细胞在HA+PAR10和HA+PAR30盘(以0.05mg/mL负载)下示出了分离/变形，而在盘周围保持良好的健康状态。(B)MTT试验证实了良好的细胞生存力。(C)根据ISO 10993，这种反应性(2级)被认为是没有细胞毒性作用的温和反应。

图14：通过MTT试验评估细胞生存力。Balb/3T3细胞接种在24-孔板中，并与负载或未负载PAR的HA水凝胶盘接触24小时。HA盘对应于不含PAR的BDDE-交联的HA水凝胶盘，并且HA+PAR对应于负载了不同PAR浓度(mg/mL)的HA水凝胶。(A)直接体外细胞毒性试验24小时后的细胞图像。(B)通过MTT试验测定的细胞生存力。虚线对应于70％的生存力(细胞毒性极限)。

图15：负载有PAR10、PAR30、PAR200的HA水凝胶的抗菌活性：重复培养。每24小时一次细菌培养，样品接种新鲜细菌。该图示出了在负载有PAR10、PAR30和PAR200(指示负载浓度)的水凝胶盘存在下的细菌生长。

图16：HA水凝胶盘和负载有PAR的水凝胶涂覆的网状体的抗菌活性。该图示出了在负载有0.05mg/mLPAR10或PAR30(指示负载浓度，mg/mL)的水凝胶盘或水凝胶涂覆的网状体存在下的细菌生长。将细菌与材料在37℃下温育6天，然后测量光密度以评估细菌生长。

图17：高压灭菌后HA水凝胶的抗菌活性。该图示出了与未高压灭菌的样品相比，在负载有0.05mg/mL和0.1mg/mL的PAR30并通过高压灭菌杀菌的水凝胶涂覆的聚丙烯(PP)网状体存在下的细菌生长。将细菌与材料在37℃下温育24小时，然后测量光密度以评估细菌的生长。

图18：与不同百分比的BDDE交联的HA水凝胶的抗菌活性。该图示出了与未高压灭菌的样品相比，在负载有0.05mg/mL和0.1mg/mL的PAR30并通过高压灭菌杀菌的HA水凝胶盘存在下的细菌生长。将细菌与材料在37℃下温育24小时，然后测量光密度以评估细菌的生长。

图19：负载有带正电荷的抗菌多肽的HA水凝胶的抗菌活性。该图示出了在负载有0.05mg/mL和0.1mg/mL的聚精氨酸PAR30、聚鸟氨酸PLO30和聚赖氨酸PLL30的HA水凝胶盘存在下的细菌生长。将细菌与材料在37℃下温育24小时，然后测量光密度以评估细菌的生长。

图20至图24：NaCl中和培养基中PAR的释放。HA盘用0.5mg·mL^-1的、三种不同的FITC-缀合的PAR温育24小时。冲洗盘，然后在NaCl 1M、MH或DMEM中温育72小时。

图20：共聚焦显微镜观察，指示了72小时后剩余的PAR的百分比。

图21：通过荧光光谱法对在1M NaCl中72小时后PAR释放进行定量。图表代表来自3个独立实验的平均值，误差线代表标准偏差。

图22：用MH和DMEM温育前后的盘的共聚焦显微镜图像。

图23：MH中释放的PAR的百分比，其中100％代表在Tris/NaCl中盘的荧光强度。

图24：DMEM中释放的PAR的百分比，其中100％代表在Tris/NaCl中盘的荧光强度。

实施例

实施例1：HA交联和水凝胶沉积

作为HA水凝胶研发的第一步，发明人评估了几种基板和沉积技术。目标是获得10–100μm厚且均匀的HA层。

为了交联膜，发明人选择了用于大多数市场领先的HA水凝胶的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。

HA与BDDE交联

初步实验是通过将823kDa、2.5％的HA(m/v)(通过搅拌过夜溶解在0.1MNaOH中)与5％和10％(v/v)的BDDE在玻璃罐中混合而交联来进行。反应进行48小时直到观察到溶液粘度不再增加。在交联之前和之后观察HA溶液。

在交联之前，所有三种溶液都是液体。24小时后，观察到含10％BDDE的HA溶液凝胶化，48小时后，含5％BDDE和10％BDDE的溶液均发生交联，而不含BDDE的HA仍为液体。

通过逐滴沉积生产HA水凝胶，HA与BDDE预混合

发明人选择了823kDa的HA，它似乎比其他HA吸收更多的PAR30-罗丹明。

他们测试的方法包括将5％HA823kDa溶解在0.25M的NaOH中并将其与10％BDDE或20％BDDE预混合。

在12mm直径的载玻片上测试沉积。

载玻片首先在2％的Hellmanex溶液中清洗，然后在1M的HCl中清洗(两个步骤后用软化水冲洗)，然后在70％的乙醇中冲洗并干燥。为了改善HA粘附力，通过将载玻片浸渍至0.5mg/ml的PEI水溶液中30分钟来沉积聚乙烯亚胺(PEI)层。

将混合物沉积在准备好的载玻片上，并将含有载玻片的板密封以避免膜干燥(图1)。进行交联反应48小时。

溶解在NaOH中的HA允许将HA的浓度增加到5％，而不会使溶液太粘稠。将BDDE与HA的预混合允许使用更少量的交联剂。

通过25μL的5％HA、10％BDDE的沉积获得的层约800μm厚并且是均匀的。当10μL的5％HA-10％BDDE沉积并铺展在载玻片上时，膜厚度降低至约250μm。最后，当5μL的5％HA+20％BDDE沉积在两个载玻片之间时，获得了50μm的膜厚度。

因此，用BDDE预混合的HA的沉积允许获得不同厚度的膜，这取决于沉积的体积和沉积方法。

最后，发明人选择了10μL的2.5％HA+20％BDDE(预混合)在石蜡膜与载玻片之间进行沉积(图2)，得到了约100μm均匀的膜。

PAR预负载与后负载

接下来，发明人测试了PAR-带电的HA水凝胶的抗菌活性。他们评估了PAR后负载(在交联的HA膜上加入1mg/mL的PAR溶液)。PAR负载有4种不同的长度：10、30、150和200个残基，进一步称为PAR10、PAR30、PAR150和PAR200。我们还跟踪了24小时后、后负载膜的PAR释放。

抗菌活性使用金黄色葡萄球菌培养物(400μL细菌悬浮液，初始光密度OD＝0.001，24孔板的每孔包含或不包含HA涂覆的、PAR带电的或不带电的载玻片)进行测试。24小时后，在620nm处测定OD，并使用BacLight Redox Sensor CTC Vitality试剂盒(分子探针(Molecular Probes))作为荧光标记来评估表面上的细菌生存力。

结果示出了后负载有PAR(所有长度)的膜上的细菌生长受到抑制。

发明人认为PAR后负载方法是最有效的。

实施例2：独立式HA水凝胶的制备和表征

在第一次中，发明人设定了方案，通过在0.25M的NaOH中将823kDa的2.5％(w/v)HA与20％(v/v)1.4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)混合、并且在石蜡膜与12-mm直径的载玻片之间沉积溶液来产生薄的水凝胶膜。

这种方法产生了大约100μm的薄膜，但需要使用对温度敏感并且会影响水凝胶形成的石蜡膜。为了避免缺乏可重复性，本发明人研发了一种新方法，该方法允许生产不同尺寸、抗性和易于操作的独立式水凝胶。

独立式HA水凝胶的构建

为了制备这种水凝胶，将1.5mL的2.5％HA和20％BDDE在0.25M的NaOH中充分混合的溶液倒入35-mm直径的培养皿中，并且允许在室温下交联72小时。

使用圆形切割机(例如，对于24孔板的实验使用4mm直径的盘)将水凝胶进一步切割成所需尺寸的盘。

水凝胶盘在10mMTris/0.15MNaCl缓冲液(pH＝7.4)中进一步冲洗，并且可以在4℃下保存数周。

图4示出了水凝胶盘制备的示意图方案和得到的不同尺寸的盘。得到的水凝胶可以很容易地用钳子或抹刀操作。

实施例3：PAR负载和释放表征

PAR负载至HA水凝胶盘中

为了将PAR负载至水凝胶中，将盘浸渍至PAR溶液中并且在室温下温育。对于24孔板中的4mm盘，使用0.5mL的PAR溶液。然后用Tris/NaCl缓冲液冲洗盘两次：一次短时间冲洗和一次长时间(至少1小时)冲洗。

该过程以及得到的PAR30-FITC(PAR具有30个精氨酸残基并且缀合至FITC)负载的盘的实施例在图5中示出。

本发明人比较了PAR30负载3小时和24小时。结果示出了24h后，PAR30更多地扩散到盘中心(图6)。因此，选择24小时负载用于进一步的实验。

他们接下来研究了三种不同PAR的负载：PAR10，对应于具有10个精氨酸残基的链；PAR30，对应于具有30个精氨酸残基的链；以及PAR200，对应于具有200个精氨酸残基的链。

为了可视化水凝胶内的PAR负载和扩散，他们再次使用了荧光标记的PAR(PAR10-FITC、PAR30-FITC、PAR200-FITC)。

荧光曲线示出了PAR10和PAR30的更均匀分布(图7)。

接下来，发明人使用FRAP(光漂白后荧光恢复)技术研究了水凝胶内的PAR的迁移率(图8)。定性地说，PAR10为迁移最强，PAR200为迁移最小(图8A)。还确定了例如扩散系数的定量参数(图8B)。

Tris/NaCl缓冲液中PAR负载的水凝胶稳定性

负载有三种不同PAR(PAR10，对应于具有10个精氨酸残基的链；PAR30，对应于具有30个精氨酸残基的链；以及PAR200，对应于具有200个精氨酸残基的链)的HA盘在室温或37℃下温育48小时。结果示出了在任何条件下都没有PAR-FITC释放，这表明抗菌HA-PAR盘即使在较高温度下在Tris/NaCl缓冲液中仍保持稳定，这有利于盘的操作和运输。

更具体地说，水凝胶中包含的PAR的总量是通过在浓缩NaCl中温育负载有荧光标记PAR的水凝胶以促进PAR释放来估计的。根据共聚焦显微镜图像(图20)，在1M的NaCl中、在37℃下72小时之后，根据公交显微镜图像，PAR10几乎完全释放，PAR30和PAR200接近80％释放。利用图像处理测定温育72小时后水凝胶盘中剩余PAR的百分比；100％对应于释放前的荧光强度。然后，确定1M的NaCl温育后剩余PAR的百分比以获得释放的PAR的值：PAR10、PAR30和PAR200分别约为97％、78％和78％。PAR30和PAR200的不完全释放与由FRAP实验证明的较低迁移率相关。然后，通过荧光分光光度法测定上清液的荧光强度并且参考校准曲线来量化释放的PAR-FITC的量。

结果示出了，在0.5mg·mL^-1的PAR溶液中温育的盘在1M的NaCl中72小时后释放约212μg的PAR10-FITC、157μg的PAR30-FITC以及91μg的PAR200-FITC(图21)。当将释放量校正为100％时，给出了分别负载PAR10-FITC、PAR30-FITC和PAR200-FITC的释放量为218μg、201μg和117μg。盘体积约为30μL，因此盘分别包含约7.3mg·mL^-1的PAR10、6.7mg·mL^-1的PAR30和3.9mg·mL^-1的PAR200。

在细菌和细胞培养基中PAR释放

使用FITC标记的10个单位、30个单位和200个单位的PAR，发明人评估了它们在37℃下在两种不同介质中从HA水凝胶中的释放。

他们在MH(Mueller Hinton肉汤，细菌培养基)和DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基+10％的FBS+抗生素，细胞培养基)中在37℃下温育24小时后执行了盘成像。结果示出了，MH和DMEM/FBS的PAR释放模式略有不同。在DMEM/FBS中，PAR30和PAR200的释放高于在MH中。

更具体地说，在微生物生长培养基(MH)或细胞培养基(DMEM)中，在72小时内跟踪了自水凝胶中PAR释放。将PAR-FITC负载的水凝胶放入这些培养基中并在37℃下温育，并且通过共聚焦显微镜观察PAR释放(图22)。与释放更缓慢的PAR30和PAR200相比，MH中PAR10的释放更快(图23)。在DMEM中，所有三种PAR或多或少地具有相似的释放曲线，并且在48小时后完全释放(图24)。

实施例4：抗菌作用与体外细胞毒性

在初步实验中，发明人证明了以1mg/mL负载到HA水凝胶的PAR10、PAR30和PAR200的抗菌活性。

为了更详细地研究PAR负载的水凝胶的抗菌特性，他们用负载有不同浓度PAR10、PAR30和PAR200的水凝胶盘执行了细菌的重复培养(图9)。

PAR30具有最长的抗菌效果，在重复培养8天后、在0.5mg/mL和1mg/mL(负载)仍保持有效。PAR10在1mg/mL时保持有效8天，PAR200在1mg/mL时保持有效7天(图10至图12)。

细胞毒性试验

直接体外细胞毒性试验包括将材料与细胞接触24小时并且执行MTT试验以评估细胞生存力。根据ISO 10993，测试材料应覆盖大约1/10的细胞层表面，这对应于24孔板每孔约5mm的水凝胶盘。

发明人使用了直径为4mm的盘，当它们被放置在Tris-NaCl缓冲液中时，这些盘会溶胀并变成～6mm的直径。

在37℃下24小时后，取出水凝胶盘并执行MTT测试以测定通常用于估计细胞生存力的细胞代谢活动。黄色水溶性MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid))在存活细胞中代谢还原为蓝紫色不溶性甲臜(formazan)。将甲臜溶于酒精后(来自ISO 10993)，存活细胞的数量与通过光度测量确定的着色强度相关。

因此，将负载或未负载有PAR的盘进行杀菌，然后将盘放置在大约80％的Balb/3T3细胞的汇合层(confluent layer)上。对于MTT测定，将细胞在含有0.2mg/mL的MTT的细胞培养基中温育2小时。然后除去培养基并将甲臜溶解在DMSO中。使用分光光度计在570nm处测量所得溶液的吸光度，并在盘周围和下方拍摄图像以评估细胞形态。

在第一个实验中，根据定量MTT测试结果(良好的生存力)和定性反应性等级(反应性限制在样品下方区域)(图13)，按照ISO 10993标准负载有0.05mg/mL的PAR10和PAR30(示出了抗菌效果的最低负载浓度)的水凝胶显示为无细胞毒性的。

发明人证实了这些结果，此外，还对PAR10和PAR30 0.1mg/mL负载的水凝胶执行了细胞毒性测定，这些水凝胶显示为没有细胞毒性(图14)。如前所述，反应性区域仅限于盘下方的区域(数据未示出)并且细胞生存力良好(图20B)。然而，PAR200负载的水凝胶被归类为细胞毒性的。

值得注意的是，PAR10和PAR30 0.1mg/mL的负载水凝胶在重复培养(＝每天加入新鲜细菌)中示出了2天和4天的抗菌效果。在附加测试中(图15)，这些数字甚至更高(3天和5天)。

实施例5：HA水凝胶在网状材料上的沉积

除了设定独立式水凝胶盘生产方案外，发明人还尝试将水凝胶沉积到两种用于临床应用的材料上：具有高吸收能力的、用于伤口消毒的非纺织织物

和用于疝修补的聚丙烯网状体。

HA-BDDE溶液(50μL或100μL)沉积在直径为12mm的织物或网状片上，并允许其交联。

吸收并保留100μL的水凝胶溶液，而50μL的量更适合无吸收性的聚丙烯网状体。然而，这两种材料都能够在交联后保留水凝胶，并且易于操作。

获得了沉积在

织物和聚丙烯网状体上的PAR30-罗丹明负载的HA水凝胶的共聚焦图像。在这些图像中，织物或网状纤维被PAR30-罗丹明标记的水凝胶包围。一些PAR30-罗丹明也吸附在纤维上。

在抗菌活性方面，将水凝胶涂覆的网状材料与水凝胶盘进行比较，并且在低浓度下示出了类似的细菌生长抑制持续了6天(图16)。

实施例6：储存和灭菌

水凝胶(独立式，以及沉积在网状材料上)可以在4℃下保存数天，干燥、冷冻和高压灭菌(图17)而不会失去抗菌活性。

实施例7：交联百分比

与20％BDDE相比，负载有PAR30的、具有较低或较高交联度(10％BDDE和30％BDDEv/v)的水凝胶在24小时后示出了相似的抗菌活性(图18)。但是，它们更难处理：10％BDDE的水凝胶非常柔软且富有弹性，而30％BDDE的水凝胶易碎且容易破裂。

实施例8：其他带正电荷的抗菌多肽的用途

24小时后，与PAR30负载的水凝胶相比，负载有0.05mg/mL和0.1mg/mL的聚鸟氨酸PLO30和聚赖氨酸PLL30的HA水凝胶示出了相似的抗菌活性(图19)。

实施例9：体内生物相容性

本研究使用了由认证繁殖中心(法国，查尔斯河)提供的10只8周龄雄性Wistar大鼠(体重300-400g)。

在CREFRE(US 006/CREFRE-Inserm/UPS/ENVT)动物供应商处接收动物(编号A31555010，2015年12月17日发布)。根据欧洲指示(DE 86/609/CEE；修改后的DE 2003/65/Ce)，将方案提交至CREFRE伦理委员会并获得批准以用于进行动物实验。遵守一周的适应环境。将动物圈养在双层通风笼中(根据欧洲标准，每笼两只动物)。仔细监测动物(行为和食物摄入)并且在整个实验过程中每周称重动物。10只大鼠各接受2个圆形植入体(直径1cm)，左侧一个植入体，右侧一个植入体。对于以下每种条件，总共在网状材料上沉积5个干燥和高压灭菌的水凝胶：i)仅含HA的水凝胶；ii)负载有0.1mg·mL^-1PAR10的HA水凝胶；iii)负载有0.05mg·mL^-1PAR30的HA水凝胶；iv)负载有0.1mg·mL^-1的PAR30的HA水凝胶。

大鼠用4％的异氟烷诱导，2％的异氟烷维持。每只大鼠在加热垫上以俯卧放置。用必妥碘剃毛和擦洗后，在胸腰椎区域做两个20mm的背侧切口，一个在右侧，一个在左侧。一个支架在两侧插入皮下袋(subcutaneous pocket)。所有切口均用

封闭。所有大鼠接收每天两次皮下注射丁丙诺啡(0.6mg/kg)，持续5天。所有动物在研究期间都存活下来，没有副作用。14天后进行安乐死。首先用异氟烷装置和面罩麻醉动物，然后以腹腔途径缓慢注射过量的戊巴比妥(150mg/kg)。动物死亡期满后，取出并收集带有周围组织的植入体执行组织学检查。

对于组织学分析，将样品固定在4％的福尔马林中。宏观切片被包埋在石蜡中。5-μm厚的切片用苏木精-伊红-藏红花(hematoxylin-eosin-saffron,HES)染色。对于每个样品，在载玻片扫描(NanoZoomer，Hamamatsu)后使用软件NDP.版本2(view2)(Hamamatsu，马西，法国)实现显微光学分析，标准如下：急性炎症、慢性炎症、成纤维细胞反应、水肿、纤维化、血管生成和假体周围组织细胞反应的半定量评估。

结果

对大鼠(10只动物)进行了初步的体内实验。每只大鼠接受2个水凝胶涂覆的网状植入体(d＝1cm)，左侧一个植入体，右侧一个植入体。所有动物在研究期间存活下来，没有不良反应，并且所有动物都以正常方式增加体重。

14天后，取出并收集具有周围组织的植入体执行组织学分析。分析结果显示植入体周围组织存在炎症。然而，仅含HA的水凝胶和HA-PAR水凝胶之间没有差异，这表明添加PAR不会促进或增加炎症反应。

结论

总之，本发明人研发了透明质酸(HA)水凝胶，该透明质酸(HA)水凝胶可以负载有聚精氨酸(PAR)并提供持久的抗菌效果。这种效果取决于负载的PAR的浓度和长度。PAR30被认为是在提供延长抗菌效果中最有效的，随着PAR浓度的增加而效果增加。

抗菌水凝胶可以沉积在伤口敷料和网状假体上并且有助于预防感染，因此改善了组织再生和/或植入体集成。

Claims (15)

1.一种水凝胶，所述水凝胶包含透明质酸(HA)或其衍生物，所述水凝胶负载有至少一种带正电荷的抗微生物肽，其中所述HA或其衍生物在其羟基部分的水平上与交联剂交联，而在所述HA或其衍生物的羧基部分保持游离、并且所述HA或其衍生物保持带负电荷。

2.根据权利要求1所述的水凝胶，其中，所述带正电荷的抗微生物肽选自由聚精氨酸、聚鸟氨酸和聚赖氨酸构成的组。

3.根据权利要求1或2所述的水凝胶，其中，所述带正电荷抗微生物肽为聚精氨酸。

4.根据权利要求3所述的水凝胶，其中，所述聚精氨酸具有下式(1)

其中，n为包括2与250之间的整数。

5.根据权利要求4所述的水凝胶，其中，所述聚精氨酸具有下式(1)

其中，n为30。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的水凝胶，其中，所述透明质酸是具有在800kDa与850kDa之间的分子量的透明质酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的水凝胶，其中，所述交联剂为丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。

8.一种用于制备根据权利要求1至7中任一项所述的水凝胶的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(a)在碱性条件下，将透明质酸(HA)或其衍生物与交联剂混合，所述交联剂在所述透明质酸(HA)或其衍生物的羟基部分的水平上交联HA，而所述HA或其衍生物的羧基部分保持游离、并且所述HA或其衍生物保持带负电荷，

(b)将混合物沉积在支承体上并且在室温下温育48小时至72小时以获得水凝胶，

(c)回收在步骤(b)形成的所述水凝胶，

(d)在能够去除交联剂残留物的条件下，在水性缓冲液中温育所述水凝胶且所述水凝胶溶胀，

(e)用至少一种带正电荷的抗微生物肽负载在步骤(d)获得的所述水凝胶，以及

(f)回收在步骤(e)获得的所负载的水凝胶。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(a)的所述混合物包含2％至3％(w/v)的HA或其衍生物，以及至少10％(v/v)的交联剂，特别是至少20％(v/v)的交联剂。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述交联剂是丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，所述带正电荷的抗微生物肽为聚精氨酸。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中，在步骤(e)中以0.05mg/ml至1mg/ml的浓度负载所述带正电荷的抗微生物肽。

13.根据权利要求1所述的水凝胶，所述水凝胶能够通过根据权利要求8至12中任一项所述的方法制备获得。

14.一种医疗设备，所述医疗设备包括根据权利要求1至7、或13中的任一项所述的水凝胶。

15.根据权利要求14所述的医疗设备，其中，所述医疗设备是伤口敷料或网状假体。

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