CN113976058A - 一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法 - Google Patents

一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，该方法包括：对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子；在基片表面覆盖加有光致酸化合物的光刻胶，之后利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对基片表面的氨基酸进行脱保护；按照多肽序列在脱保护后的基片表面旋涂氨基端带有保护基团的氨基酸单体和活化偶联试剂，通过肽键固相合成反应在原位延伸一个氨基酸；根据多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体。该工艺结合了半导体制造中的光刻图形化技术与多肽的固相化学合成技术之优势，能实现高多肽探针密度、高序列准确性、高生产稳定性的生物芯片制造。

Description

一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法
技术领域
本发明涉及微阵列芯片制备技术领域，特别涉及一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法。
背景技术
健康是一种复杂的状态，其代表了几乎所有人类活动和互动的不断变化的结果。监测个体的健康是一个巨大的挑战。早期检测对疾病的治疗和归转结果具有显著影响；然而，往往不存在可在疾病发展到一定阶段，其主要症状出现前检测出疾病的单一测试。高密度多肽阵列芯片的探索发现平台(discovery)和生物信息学分析结合，进行人群健康大型队列研究，通过人工智能和机器学习等方法评估并建立健康人群和疾病人群的免疫及蛋白指证数据库，可用于健康监测、诊断、治疗和预防性保健。微阵列芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如基片、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子反应，通过特定的仪器，比如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影像机对反应信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。
在载人航天领域，太空环境对人体的影响和宇航员的健康状况将直接体现在免疫和蛋白指证的变化，针对航天领域对载荷的严苛要求和为宇航员提供适宜的免疫和蛋白指证检测方法，可以利用高密度多肽阵列芯片的探索发现平台积累的数据库，结合微流控和BioMEMS技术发展小型化和自动化的免疫指证检测系统。基于高密度多肽阵列芯片的免疫及蛋白表征平台，能够通过无偏差、高通量地解析抗体或蛋白结合，高灵敏的反映人体免疫细节图谱及蛋白相互作用靶点，从而推动新一代医疗诊断、疫苗和药物开发体系，带动生物医药产业的发展。由多肽筛选平台为引擎的数字生命生态系统将包括上游原料生产、中游仪器制造、下游医疗和健康应用，覆盖数字医疗健康的重要市场链条。
发明内容
本发明的主要目的在于提出一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，能够实现高多肽探针密度、高序列准确性、高生产稳定性的生物芯片规模化生产制造。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，该方法包括：
对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子；
在基片表面覆盖加有光致酸化合物的光刻胶，之后利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护；
按照多肽序列在脱保护后的所述基片表面旋涂氨基端带有保护基团的氨基酸单体和活化偶联试剂，通过肽键固相合成反应在原位延伸一个氨基酸；
根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体。进一步的，所述利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护的步骤之后，所述方法还包括：
洗去所述基片表面的光刻胶。
具体的，所述洗去所述基片表面的光刻胶：将脱保护后的基片放置到10％氢氧化钠溶液浸泡30s，之后利用去离子水中漂洗。
进一步的，所述根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体的步骤之后，所述方法：
对所述基片进行切割以形成预设尺寸的阵列芯片，并去除所述多肽序列的肽链上末端氨基酸及侧链氨基酸的保护基团。
进一步的，所述根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列包括：
在活化偶联合剂作用下，通过肽键固相合成反应将氨基酸单体依次延伸形成一线性多肽序列；或者在活化偶联合剂作用下，通过肽键固相合成反应在原位延伸的第一个氨基酸与最后一个氨基酸单体连接形成环形多肽序列。进一步的，所述方法还包括：
每一个所述氨基酸单体合成及所述多肽序列均通过MALDI-TOF-MS进行检测质控。
进一步的，所述对基片表面进行功能化修饰的步骤包括：
对所述基片表面依次进行羟基化处理、氨基化处理、羧基化处理、醛基化处理。
进一步的，所述在修饰后的基片表面连接手臂分子的步骤包括：
用交联试剂作为桥梁连接载体和探针，所述交联试剂是8％～10％的聚乙二醇溶液。
进一步的，所述对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子的步骤包括：
先将寡核苷酸的3′-端或5′-端引入oligo-T或者polyA,然后在其末端进行氨基化、醛基化、巯基化的功能修饰。
进一步的，所述光致酸化合物是叔丁基苯基碘鎓盐全氟辛烷磺酸(tert-butylphenyliodoniumperfluorooctanesulfonate，TBI-PFOS)、三苯基锍全氟丁烷磺酸(triphenylsulfoniumperfluorobutanesulfonate,TPS-PFBS)、三苯基锍全氟丁基(triphenylsulfonium nanoflate，TPS-Nf)或三苯基锍三氟磺酸(triphenylsulfoniumtrifluorosulfonate,TPS-TF)的其中一种或者多种。
进一步的，所述在基片表面覆盖加有光致酸化合物的光刻胶包括：
采用自转试涂敷法，速度为3000r/min，时间为10s；通过基片的中心与旋转盘的轴心重合；用大轴带动小转盘旋转，并采用真空吸附法把基片固定在小转盘的轴心上，然后在基片上滴2ml加有光致酸化合物的光刻胶，使小转盘与大轮接触，小转盘迅速地被加速到所需的转速，转速均匀。该法的优点是胶膜粘附良好、均匀、厚度适当，正好满足实验所需的涂胶要求。通过观察胶层在基片边缘呈现的不同彩色干涉条纹.如果彩色干涉条纹宽而且少，有规则，则胶均匀；反之，则胶层不均匀。
进一步的，所述利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护包括：
将预先涂好光刻胶的基片表面覆盖光学掩膜，用汞灯紫外光进行选择性照射，使受光部分的光刻胶发生化学反应，经显影，在胶膜上显现出与光学掩膜相应的图形。一般操作程序是：先预热紫光灯，使光源稳定。把光刻光学掩膜装在支架台上，使有图形的铬面朝下，在把涂有光刻胶的基片放在可微调的工作台上，胶面朝上，然后把光刻光学掩膜移到基片的上方，平行靠近而不接触。在显微镜下，仔细调节微动装置，使膜模版上的图形与基片的相应的位置准确套合，再将基片与光学掩膜紧紧相贴，然后用显微镜复查一下是否对准，定位好之后就可推至曝光灯下进行曝光。
进一步的，所述活化偶联试剂是HBTU(2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)。
本发明技术方案的有益效果：
本发明技术方案提供的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子；在基片表面覆盖加有光致酸化合物的光刻胶，之后利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护；按照多肽序列在脱保护后的所述基片表面旋涂氨基端带有保护基团的氨基酸单体和活化偶联试剂，通过肽键固相合成反应在原位延伸一个氨基酸；根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体。该多肽阵列芯片制造工艺结合了半导体制造中的光刻图形化技术与多肽的固相化学合成技术之优势，原位合成实现了高多肽探针密度、高序列准确性、高生产稳定性的生物芯片规模化智能制造。
附图说明
图1是本发明实施例提供的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法流程框图；
图2是本发明实施例提供的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法过程示意图；
图3是本发明实施例提供的基片NH3H20处理后表面基团；
图4是本发明实施例提供的基片氨基化处理后表面基团；
图5是本发明实施例提供的基片醛基化处理后表面基团；
图6是本发明实施例提供的光学掩膜版对称标记；
图7是本发明实施例提供的光学掩膜版局部图；
图8是本发明实施例提供的玻璃基片的多肽阵列芯片制作流程示意图；
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在后续的描述中，使用用于表示元器件的诸如“模块”、“部件”或“单元”的后缀仅为了有利于本发明的说明，其本身没有特定的意义。因此，“模块”、“部件”或“单元”可以混合地使用。
实施例1
如图1、2所示，本发明实施例提供了一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，该方法包括：
S101、对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子，用于后续多肽序列合成；
具体的，通过自下而上(bottom-up)自组装技术对基片表面进行功能化修饰，包括：对所述基片表面依次进行羟基化处理、氨基化处理(如图4所示)、羧基化处理(如图3所示)、醛基化处理(如图5所示)。
具体的，步骤1：将基片置于干净的羟化烧杯(羟化烧杯专用)中，将其正面朝上，用去离子水清洗3次，清洗时稍用力，使基片能够在烧杯中旋转起来，以减少基片之间的摩擦碰撞；将水倒净，立即用移液管(过氧化过氧化氢专用)往烧杯中加入5ml过氧化氢(H2O2)，然后用移液管(浓硫酸专用，在摇床上缓慢振荡或静置30分钟使之用)加入15ml浓硫酸(H2SO4)充分反应，此反应可使表面羟基化。倒掉上步反应的液体，用去离子水清洗3次。清洗时稍用力，使基片能够在烧杯中旋转起来，以减少基片之间的摩擦碰撞；然后将烧杯口向下倾斜，缓慢转动烧杯，使烧杯壁上的浓硫酸能被洗去。清洗结束后，用大量水保存基片，并需要使基片的正面保持朝上。
步骤2：取出氨化烧杯专用，氨化烧杯专用)先用无水乙醇清洗2次，(专用然后倒入20ml无水乙醇，氨化将步骤(1)反应后的获得的羟基化基片转移到氨化烧杯中，用无水乙醇，使基片处于乙醇环境中；清洗完成后倒清洗3次。清洗时同步骤(1)掉乙醇，迅速加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和无水乙醇的混合液(体积比为1：15)，或者先加15ml无水乙醇，然后用移液管加1mlAPTES，摇床上振摇反应2h。该反应结束后可以使基片表面氨基化。
步骤3：倒掉上步反应液体，用无水乙醇清洗3次，清洗过程同上。清洗完后把基片转移到羧基化烧杯专用)烧杯中含琥珀酸酐的无水乙醇饱和溶液，羧基化烧杯专用中，摇床振摇反应3h以上或者过夜，该反应结束后可使基片表面羧基化。将反应结束后的基片用无水乙醇清洗后，保存于大量无水乙醇中待用。注意：要保持各专用烧杯的清洁，处理过程中的硫酸要收集到废液瓶中，并做好标记。经过上述步骤处理后的基片表面已修饰有羧基官能团，再经过NHS/EDC(简称NE)活化后可与蛋白配基分子的氨基形成共价连接。
步骤4：基片的甲基化处理基片的甲基化处理甲基化上接步骤:(1)，接下来取出甲基化烧杯(专用)甲基化烧杯，用三氯乙烯清洗，以形成甲基化烧杯(专用)三氯乙烯环境，将羟基化后的基片用镊子小心夹持，放入疏水烧杯中，正面朝上；用三氯乙烯清洗3次，清洗过程同上。倒掉液体，将20ml三氯乙烯和3ml二氯二甲基硅烷在专用的烧杯中混合均匀，再倒入盛有基片的疏水烧杯中，反应5分钟；用无水乙醇清洗，再用三氯乙烯清洗；如此循环反复3次，将基片用镊子小心夹持取出，放在盛有大量无水乙醇溶液的容器中，用封口膜封存。注意：挥发性试剂的操作都必须在通风橱内进行。粘有硅烷的移液管和烧杯应立即用无水乙醇清洗。五、基片的醛基化处理基片的醛基化处理醛基化上接步骤(2)，倒掉反应液体，用无水乙醇清洗3次，以除去氨基硅烷；再用去离子水清洗3次，以除去无水乙醇，以避免其与醛基反应；然后用PBS溶液清洗2次，以形成PBS环境，倒掉PBS溶液，将基片亮面朝上，加入戊二醛和PBS的混合溶液(15mlPBS，1.5ml50％戊二醛，体积比为1:10)，摇床振摇反应1h。此反应结束后可使基片形成醛基化。倒掉反应液体，用大量PBS清洗3次，然后将醛基化的基片保存于PBS溶液中，以待下一步实验使用。
具体的，所述在修饰后的基片表面连接手臂分子的步骤包括：用交联试剂作为桥梁连接载体和探针，所述交联试剂是8％～10％的聚乙二醇溶液。
这些“手臂”分子的长度、所带电荷、疏水性、可溶性及立体空间构型等物理化学性质,会对杂交结果产生影响,其中“手臂”分子的长度是影响立体位阻对杂交效果的主要因素。在使用聚乙二醇作为“手臂”分子时,一般采用效果最好，当“手臂”分子的长度大约是40原子时,它可以将杂交效率提高至原来的150倍。
进一步的，所述对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子的步骤包括：
先将寡核苷酸的3′-端或5′-端引入oligo-T或者polyA,然后在其末端进行氨基化、醛基化、巯基化的功能修饰。
构建分子自组装单层:分子自组装就是分子与分子在一定条件下依赖非共价键分子间作用力(氢键、范德华力、离子键、疏水作用等)自发连接成结构稳定、高度有序的分子聚集体的过程。自组装单层的使用可以适度降低芯片片基上的活性官能团及探针的密度。氨基甲硅烷自组装单层,用于芯片表面处理,这种单层结构中含有活性的氨基甲硅烷和惰性的甲硅烷烃基,改变了芯片表面的氨基密度,使氨基与探针结合的位阻变小。采用蛋白质材料作为支架,为芯片的生物大分子提供足够的空间,同时用抗生物素蛋白链菌素和生物素酰化烷基乙硫醇自组装,以减小在金膜载体上固定的探针之间的空间位阻。此法的缺点是如果生物大分子中含有相同官能团或含有电性相反的基团时,它们在构成自组装层状结构时会发生聚集,形成聚合体。
基片材料可以是硅片、玻璃片以及其他材料等等。
如图8所示，在玻璃基片表面自组装修饰3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(3-aminopropyltrimethoxysilane，APTMS)，将玻璃浸泡在含1％APTMS质量分数的乙醇溶液中，在75℃密封加热2h，取出用氮气吹去余液，在75℃抽真空烘干(见(e))。然后，滴加50μL明胶蛋白质-R6G溶液(浓度为1mg/mL)，15min后用磷酸缓冲液(PBS)冲洗，氮气吹干(见(f))。接着，用保鲜膜保护玻璃基片蛋白质阵列以外的区域，在基片上以速率3 500r/s旋涂一层8％PVA溶液(见(g))，除去保鲜膜后在70℃加热15s坚膜。
S102、在基片表面覆盖加有光致酸化合物的光刻胶，之后利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护；
其中，所述利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护的步骤之后，所述方法还包括：洗去所述基片表面的光刻胶。
具体的，所述洗去所述基片表面的光刻胶：将脱保护后的基片放置到10％氢氧化钠溶液浸泡30s，之后利用去离子水中漂洗。
S103、按照多肽序列在脱保护后的所述基片表面旋涂氨基端带有保护基团的氨基酸单体和活化偶联试剂，通过肽键固相合成反应在原位延伸一个氨基酸；
S104、根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体。
具体的，如图2所示，所述根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列包括：在活化偶联合剂作用下，通过肽键固相合成反应将氨基酸单体依次延伸形成一线性多肽序列；或者在活化偶联合剂作用下，通过肽键固相合成反应在原位延伸的第一个氨基酸与最后一个氨基酸单体连接形成环形多肽序列。
可选的，所述根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体的步骤之后，所述方法：
对所述基片进行切割以形成预设尺寸的阵列芯片，并去除所述多肽序列的肽链上末端氨基酸及侧链氨基酸的保护基团。
具体的，根据所需大小，用玻璃刀进行基片的切割。操作时需要在洁净的环境中，并带一次性手套，以避免污染基片。先在桌面平铺一张干净的称量纸，用镊子小心夹持基片的边缘，将其正面朝上(光亮面)放于称量纸上；再取一张干净的称量纸覆盖于基片表面，留出基片上需要切割的部分；将切割专用的直尺放于覆盖基片的纸上，用手轻轻压住直尺；直尺应不超过待切割侧的纸面，以防止直尺污染基片；切割时玻璃刀沿直尺稍用力平行滑动，使用的力量以能在基片表面形成一清晰的划痕，但不至于将基片划开为度；如对大块基片进行横纵向多次切割，即可在基片表面形成网格；将基片包裹于称量纸内，(避免手套和基片表面直接接触)用手沿网格线轻轻掰动即可形成大小合适的小型基片；将切割好的基片用镊子小心夹持，放于干净的塑料平皿内，正面朝上，并用封口膜将平皿封好，放于干净处保存待用。注意：整块基片取出后严禁放回基片盒，应另行保存。注意：整块基片取出后严禁放回基片盒，应另行保存。
其中，所述方法还包括：
每一个所述氨基酸单体合成及所述多肽序列均通过MALDI-TOF-MS进行检测质控。
具体的，基于MALDI-TOF生物质谱的组织成像技术(MALDI-imaging massspectrometry，MALDI-IMS)是一门新兴的分子成像技术，对于发现疾病生物标志物和研究药物代谢等方面具有重要意义，并具有良好的临床应用前景。MALDI-TOF-MS近期的发展主要在改善灵敏度，提高分辨率，扩大应用范围以及标志物的鉴定等方面。灵敏度和分辨率主要受激光器频率和能量，样本切片质量，基质喷涂效果等因素影响。高频率(200Hz和1000Hz)的固体激光器已经普遍用于MALDI质谱中，可在较短时间内完成一个切片的成像质谱数据采集，但可调光束直径的激光器对于IMS更有利。切片质量和基质覆盖一直是IMS的一个技术瓶颈.近年来,一些研究者和质谱公司开发了新型基质喷涂设备和技术,改善了切片前处理方法,大大提高了质谱成像技术的灵敏度和分辨率。
其中，所述光致酸化合物是叔丁基苯基碘鎓盐全氟辛烷磺酸(tert-butylphenyliodoniumperfluorooctanesulfonate，TBI-PFOS)、三苯基锍全氟丁烷磺酸(triphenylsulfoniumperfluorobutanesulfonate,TPS-PFBS)、三苯基锍全氟丁基(triphenyl sulfoniumnanoflate，TPS-Nf)或三苯基锍三氟磺酸(triphenylsulfoniumtrifluorosulfonate,TPS-TF)的其中一种或者多种。
具体的，所述在基片表面覆盖加有光致酸化合物的光刻胶包括：
采用自转试涂敷法，速度为3000r/min，时间为10s；通过基片的中心与旋转盘的轴心重合；用大轴带动小转盘旋转，并采用真空吸附法把基片固定在小转盘的轴心上，然后在基片上滴2ml加有光致酸化合物的光刻胶，使小转盘与大轮接触，小转盘迅速地被加速到所需的转速，转速均匀。该法的优点是胶膜粘附良好、均匀、厚度适当，正好满足实验所需的涂胶要求。通过观察胶层在基片边缘呈现的不同彩色干涉条纹.如果彩色干涉条纹宽而且少，有规则，则胶均匀；反之，则胶层不均匀。
具体的，所述利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护包括：
将预先涂好光刻胶的基片表面覆盖光学掩膜，用汞灯紫外光进行选择性照射，使受光部分的光刻胶发生化学反应，经显影，在胶膜上显现出与光学掩膜相应的图形。一般操作程序是：先预热紫光灯，使光源稳定。把光刻光学掩膜装在支架台上，使有图形的铬面朝下，在把涂有光刻胶的基片放在可微调的工作台上，胶面朝上，然后把光刻光学掩膜移到基片的上方，平行靠近而不接触。在显微镜下，仔细调节微动装置，使膜模版上的图形与基片的相应的位置准确套合，再将基片与光学掩膜紧紧相贴，然后用显微镜复查一下是否对准，定位好之后就可推至曝光灯下进行曝光。
如图6、7所示，在制作原位合成高密度基因芯片过程中，采用半导体光刻工艺技术，在固相支持物基片表面原位合成寡核苷酸探针，利用汞灯发出的光束通过一个照相平版印刷的光刻光学掩膜(mask)，再落到固相表面特定合成区域，从而激活这些特定区域，使受光刻胶保护基团解离，57端产生自由羟基，继而脱氧核酸37端通过化学键结合到57端；换用另一块光刻光学掩膜，另一区域同样发生激活与反应，如此循环直到所需的寡核苷酸全部合成。而特定序列的寡核苷酸是由每次所用的光刻光学掩膜顺序而定，而这些又由设计者根据所需合成寡核苷酸链序列通过计算机控制。
要将版图的图形转移到基片片上，就需要经过一个重要的中间环节──制版，即制作一套相应的光刻光学掩膜。制版的目的就是产生一套分层的版图光刻光学掩膜，为将来进行图形转移(光刻和刻蚀)做准备。将设计工程师交付的标准制版数据传送给一个称作图形发生器的设备，图形发生器会根据该数据完成图形的缩小和重复，并将版图数据分层转移到各层光刻光学掩膜(为涂有感光材料的优质玻璃板)上，这就是制版。每层版图对应于不同的光刻光学掩膜，并对应于不同的工艺步骤。光刻光学掩膜质量的优劣直接影响光刻图形的质量。在芯片制造过程中需要经过十几乃至几十次的光刻，每次光刻都需要一块光刻光学掩膜，每块光刻光学掩膜的质量都会影响光刻的质量。因此要有高的成品率，就必须制作出高质的光刻光学掩膜。
其中，所述活化偶联试剂是HBTU(2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)。
HBTU(2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)是一种常用于固相多肽合成的偶联剂。由于该试剂具有温和的活化性能，所以广泛应用于化学和工业。此外，它也具有抗外消旋作用。外消旋作用的低趋势是多肽合成的关键需求。尤其对于固相多肽合成而言，为了使合成较长多肽具有可行性，较短反应时间内定量的产率至关重要。多肽合成主要依赖于高效和安全的偶联剂HBTU可高效实用地将羧酸转化成叠氮化合物。该过程可应用于广泛的羧酸中，包括N端保护的氨基酸。另外，HBTU在从酸中一锅合成二肽基脲酸酯、脲及氨基甲酸酯方面具有很大价值。HBTU的优点包括以下几点：1)属于非爆炸品类，因此更适用于溶液/固相多肽合成。2)在经典溶剂中具有高溶解性和稳定性。3)可用于显色反应检测。
可选的，所述通过肽键固相合成反应在原位延伸一个氨基酸的步骤参考固相合成多肽的方法步骤：
(1)投料：树脂加入固相合成设备，加入DCM二氯甲烷溶胀，抽干后加入DMF(N，N-二甲基甲酰胺)洗涤，洗涤结束抽干备用。
(2)缩合：将氨基酸用一定体积的DMF溶解，加入缩合剂活化后投入固相合成设备，补充DMF至反应浓度，搅拌反应。
(3)脱除保护基：以Kaiser试剂检测反应程度，反应结束后抽干溶剂，DMF洗涤，加入PIP/DMF溶液脱除保护基，以Kaiser试剂检测反应程度，反应完毕抽干溶剂，DMF洗涤，准备加入下一个氨基酸。
(4)缩合循环：按照树脂序列依次连接氨基酸，按照“脱保护——洗涤——活化氨基酸——投料缩合——洗涤”步骤进行缩合循环操作，按照氨基酸序列完成剩余n个氨基酸的缩合。
(5)出料：合成结束之后用IPA和DCM交叉洗涤树脂，完成树脂收缩收缩，出料至不锈钢托盘。
(6)树脂干燥：树脂在真空干燥箱中室温干燥，干燥完毕称重，计算收率。
(7)有机废液回收，集中处理。
(8)清场：操作结束后操作人员及时清场。
具体的，例如合成多肽序列：
H2N-Gly-Gly-Gly-Cys-Ser-Asp-Tyr-Asn-His-His-Trp-Cys-COOH
1、树脂的选择及活化处理
取二氯树脂1.5g加入到用DCM浸泡过的反应柱中,用DCM 15mL浸泡30min使树脂充分膨胀,以活化待用。
2、第一个氨基酸的连接
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH 0.31g(依据为:树脂量×取代度×氨基酸分子量×过量倍数)于DCM中溶解,再加入DIEA 0.5mL,混合加入反应容器中,吹N2反应2h,将反应液过滤除去加入MeOH 5mL封闭反应1h后用DCM、异丙醇、DMF各洗涤树脂3次。
3、脱除氨基保护基
加入约15mL 20％哌啶的DMF溶液反应5min,滤掉,再加入15mL反应20min后用异丙醇洗涤树脂2次、DMF洗涤树脂3次。
4、肽键的形成
称取0.55g Fmoc-Trp(boc)-OH,0.35g TBTU以DMF溶解,与0.6mL HOBt(2mol/L),0.2mL DIEA混合加入盛有树脂的反应容器中,吹N2反应2h后用异丙醇洗涤树脂2次、DMF洗涤树脂3次。重复上述步骤(脱保护和接肽),按还未成环前的直链肽的序列由羧基端→氨基端的顺序依次连接氨基酸。
5、侧链脱保护及环肽脱离树脂
洗涤、脱除最后一个氨基酸的Fmoc保护后用N2将肽-树脂复合物吹干,加入50mL小烧瓶中,按10mL/0.5mL/0.25mL/0.5mL/0.75g的比例加入TFA/苯甲硫醚/巯基乙醇/水/苯酚配成的切割试剂。室温磁力搅拌反应3h后,过滤入冰乙醚中,置冰箱2h,离心收集,沉淀用纯水溶解,再置冰箱冷冻,后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机,冻干至恒重即得粗肽。
本发明技术方案提供的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子；在基片表面覆盖加有光致酸化合物的光刻胶，之后利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护；按照多肽序列在脱保护后的所述基片表面旋涂氨基端带有保护基团的氨基酸单体和活化偶联试剂，通过肽键固相合成反应在原位延伸一个氨基酸；根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体。该多肽阵列芯片制造工艺结合了半导体制造中的光刻图形化技术与多肽的固相化学合成技术之优势，原位合成实现了高多肽探针密度、高序列准确性、高生产稳定性的生物芯片规模化智能制造。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
通过以上的实施方式的描述，本领域的技术人员可以清楚地了解到上述实施例方法可借助软件加必需的通用硬件平台的方式来实现，当然也可以通过硬件，但很多情况下前者是更佳的实施方式。基于这样的理解，本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质(如ROM/RAM、磁碟、光盘)中，包括若干指令用以使得一台终端设备(可以是手机，计算机，服务器，空调器，或者网络设备等)执行本发明各个实施例所述的方法。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述方法包括：
对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子；
在基片表面覆盖加有光致酸化合物的光刻胶，之后利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护；
按照多肽序列在脱保护后的所述基片表面旋涂氨基端带有保护基团的氨基酸单体和活化偶联试剂，通过肽键固相合成反应在原位延伸一个氨基酸；
根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体。
2.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述利用UV辐照和光学掩膜曝光特定反应区域以对所述基片表面的氨基酸进行脱保护的步骤之后，所述方法还包括：
洗去所述基片表面的光刻胶：将脱保护后的基片放置到10％氢氧化钠溶液浸泡30s，之后利用去离子水中漂洗。
3.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列，并在每次循环中设置对应的光学掩膜和对应的氨基酸单体的步骤之后，所述方法：
对所述基片进行切割以形成预设尺寸的阵列芯片，并去除所述多肽序列的肽链上末端氨基酸及侧链氨基酸的保护基团。
4.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述方法还包括：
每一个所述氨基酸单体合成及所述多肽序列均通过MALDI-TOF-MS进行检测质控。
5.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述对基片表面进行功能化修饰的步骤包括：
对所述基片表面依次进行羟基化处理、氨基化处理、羧基化处理、醛基化处理。
6.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述在修饰后的基片表面连接手臂分子的步骤包括：
用交联试剂作为桥梁连接载体和探针，所述交联试剂是8％～10％的聚乙二醇溶液。
7.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述对基片表面进行功能化修饰，并在修饰后的基片表面连接手臂分子的步骤包括：
先将寡核苷酸的3′-端或5′-端引入oligo-T或者polyA,然后在其末端进行氨基化、醛基化、巯基化的功能修饰。
8.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述光致酸化合物是叔丁基苯基碘鎓盐全氟辛烷磺酸TBI-PFOS、三苯基锍全氟丁烷磺酸TPS-PFBS、三苯基锍全氟丁基TPS-Nf或三苯基锍三氟磺酸TPS-TF的其中一种或者多种。
9.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述活化偶联试剂是HBTU 2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯。
10.根据权利要求1所述的高密度多肽阵列芯片光刻合成方法，其特征在于，所述根据所述多肽序列依次循环重复上述步骤直至合成所述多肽序列包括：在活化偶联合剂作用下，通过肽键固相合成反应将氨基酸单体依次延伸形成一线性多肽序列；或者在活化偶联合剂作用下，通过肽键固相合成反应在原位延伸的第一个氨基酸与最后一个氨基酸单体连接形成环形多肽序列。
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CN1645147A (zh) * 2005-01-18 2005-07-27 南开大学 用于免疫学分析的蛋白质芯片

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