CN113973812A - 一种甘蔗花粉保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：（1）移栽；（2）采集；（3）干燥；（4）前处理；（5）冷冻；（6）冷藏。采集甘蔗花粉之后立马将甘蔗花粉的含水率降至10%以下，提高甘蔗花粉存活率；依次对甘蔗花粉进行8～10℃冷藏、‑25～‑30℃的冷冻，最后超低温保存，可增大甘蔗花粉的耐受性，减少冻伤率，同时能避免温差过大导致的性能变化，可极大减弱甘蔗花粉的呼吸作用，延长保存时间的同时使其遗传性能保持稳定，储藏效果好；放入‑65～‑70℃的冷冻库中超低温保存时在冻存管中加入干燥剂，加之花粉外包裹着白纸及油纸，甘蔗花粉解除休眠或是超低温保存过程中短暂停电时，可以降低花粉不适，从而提高甘蔗花粉的存活率及结实率。
Description
技术领域
本发明涉及花粉保存技术领域，具体涉及一种甘蔗花粉保存方法。
背景技术
甘蔗，甘蔗属，多年生高大实心草本。根状茎粗壮发达。秆高3-5(-6)米。中国台湾、福建、广东、海南、广西、四川、云南等南方热带地区广泛种植。甘蔗适合栽种于土壤肥沃、阳光充足、冬夏温差大的地方。甘蔗是温带和热带农作物，是制造蔗糖的原料，且可提炼乙醇作为能源替代品。甘蔗中含有丰富的糖分、水分，还含有对人体新陈代谢非常有益的各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质，主要用于制糖，表皮一般为紫色和绿色两种常见颜色，也有红色和褐色，但比较少见。
花粉是种子植物的微小孢子堆，成熟的花粉粒实为其小配子体，能产生雄性配子。花粉由雄蕊中的花药产生，由各种方法到达雌蕊，使胚珠授粉。各类植物的花粉各不相同。根据花粉形状大小，对称性和极性，萌发孔的数目、结构和位置，壁的结构以及表面雕纹等，往往可以鉴定到科和属，甚至可以鉴定到植物的种。花粉形态的研究可为分类鉴定和花粉分析中鉴定化石花粉提供依据，同时也为植物系统发育的研究提供有价值的资料。大多数花粉成熟时分散，成为单粒花粉。但也有两粒以上花粉粘合在一起的，称为复合花粉粒。许多花粉结合在一起，在一个药室中至少有两块以上的，称为花粉小块。在一个或几个药室中全部花粉粒粘合在一起的，称为花粉块种质资源是亲代通过生殖细胞或体细胞直接传递给子代决定其性状的遗传物质，是生物遗传变异和生物多样性的物质基础，是新品种选育和改良的遗传物质基础。
甘蔗花粉的细胞壁比较薄，对外界气候变化较为明显，甘蔗花粉散粉一小时之后会丧失活力，甘蔗花粉的保存也较为困难。目前甘蔗花粉多采用低温保存的方法进行保存，但直接低温保存存在花粉存活率低、花粉活力下降等问题；且对甘蔗花粉解除休眠时，会导致花粉不适，从而降低花粉存活率及结实率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种保存时间长、存活率高、遗传性稳定、结实率高的甘蔗花粉保存方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，移栽至室内，得到待采甘蔗植株；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，花药开裂时，立马利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在10%以下，得到干燥的花粉；
（4）前处理：用白纸包住干燥的花粉，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层油纸，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为8～10℃的冷藏室中冷藏40～60min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-25～-30℃的冷冻库中冷冻20～30min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-65～-70℃的冷冻库中超低温保存。
进一步地，所述步骤（1）中选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入营养液中并倾斜放置，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由硫酸镁40～45份、硫酸铵15～20份、硝酸钠8～10份、过磷酸钙12～15份、过磷酸钙12～15份、无菌水100～130份组成。
进一步地，所述步骤（1）中的营养液中还包括0.01～0.02重量份的0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂。
进一步地，所述步骤（2）中观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.5～0.7米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉。
进一步地，所述步骤（3）中采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在7～10%，得到干燥的花粉。
进一步地，所述步骤（4）中先在白纸的两面均匀地喷上一层茶多酚含量为0.2克/升的茶多酚无菌水溶液，干燥，得到含茶多酚的白纸；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为8～10℃的冷藏室中冷藏45～60min，取出，得到冷藏花粉冻存管。
进一步地，所述步骤（5）中将冷藏花粉冻存管放入温度为-26～-30℃的冷冻库中冷冻22～30min，取出，得到冷冻花粉冻存管。
进一步地，所述步骤（6）中在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-65～-70℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙55～60份、胶淀粉40～45份组成。
进一步地，所述步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉的解除休眠方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为30～35℃、振荡转速为30～40r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为20～25℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
进一步地，所述步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉的解除休眠方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32～35℃、振荡转速为35～40r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22～25℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，采集甘蔗花粉之后立马干燥花粉，将甘蔗花粉的含水率降至10%以下，大大提高甘蔗花粉存活率；依次对甘蔗花粉进行8～10℃冷藏、-25～-30℃的冷冻，最后才放入-65～-70℃的冷冻库中超低温保存，一步步降温，可增大甘蔗花粉的耐受性，减少冻伤率，同时能避免温差过大导致的性能变化，可极大减弱甘蔗花粉的呼吸作用，延长保存时间的同时使其遗传性能保持稳定，储藏效果好；放入-65～-70℃的冷冻库中超低温保存时在冻存管中加入干燥剂，加之花粉外包裹着白纸及油纸，甘蔗花粉解除休眠或是超低温保存过程中短暂停电时，可以降低花粉不适，从而提高甘蔗花粉的存活率及结实率。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，可以极大延长甘蔗花粉保存时间，甘蔗花粉保存时间长达600天以上；在营养液中加入适量的芸苔素内酯，调节甘蔗植株营养分配，可有效提高采集得到的甘蔗花粉的活性；采集甘蔗花粉时开启白炽灯，花粉干燥时完全遮光，调节花粉各阶段的光照，发挥光照的有益影响，消除光照的不利影响，可有效提高采集得到的甘蔗花粉的活性；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，茶多酚具有较强的抗氧化作用，同时对葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等有抑制作用，可有效提高甘蔗花粉的活性。
具体实施方式
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在30-60度，倾斜放置的好处是便于采集花粉；倾斜角度不宜过大，倾斜角度过大容易导致放置不稳。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，营养液按重量份计由硫酸镁40～45份、硫酸铵15～20份、硝酸钠8～10份、过磷酸钙12～15份、过磷酸钙12～15份、无菌水100～130份组成；营养液也可采用市面上购买得到的甘蔗杆茎用营养液稀释而成，能保证甘蔗杆茎的正常养分所需即可。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，营养液中还添加了适量的芸苔素内酯；芸苔素内酯是一种广谱高效的植物生长调节剂，具有生长素、细胞分裂素的生理功能，还具有提高光合作用、调节营养分配，促进茎叶碳水化合物向子粒转运、提高作物对外界不利因素的抗逆能力、促进植物弱势部位的生长能力；实验发现，在营养液中加入适量的芸苔素内酯，可以提高采集得到的甘蔗花粉的活性。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，干燥时需要遮光，且是百分百遮光，干燥室不能透光，以免光线对花粉产生不利影响；干燥的方法：可以利用变色硅胶或氯化钙等干燥剂吸水干燥，也可以用花粉干燥设备直接干燥。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂前，需要对油纸包进行密封，密封的方法是：用防水胶水胶封；为避免花粉直接与干燥剂接触造成不利影响，可以在油纸包外包裹防水薄膜层，同时对防水薄膜层进行热封。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，甘蔗花粉散粉一小时之后会丧失活力，甘蔗花粉的保存也较为困难，很难用茶多酚等抗氧化组分对花粉进行处理，因此本申请特地用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，达到提高甘蔗花粉活性的目的。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，下述实施例中花粉离体培养的方法为：采用固体培养法，培养基的pH值为6.0，将解除休眠的甘蔗花粉抖落在培养基表面，用光学显微镜观察花粉萌发情况，重复3次；花粉萌发率=萌发花粉数/观察花粉总数x100%。
本发明一种甘蔗花粉保存方法，以南宁武宁区种植的第一年生的桂糖42号甘蔗作为研究对象。
实施例1
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在30度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂0.01份、硫酸镁40份、硫酸铵15份、硝酸钠8份、过磷酸钙12份、过磷酸钙12份、无菌水100份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.5米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在7%，得到干燥的花粉；
（4）前处理：先在白纸的两面均匀地喷上一层茶多酚含量为0.2克/升的茶多酚无菌水溶液，干燥，得到含茶多酚的白纸；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层或多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为8℃的冷藏室中冷藏40min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-25℃的冷冻库中冷冻20min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-65℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙55份、胶淀粉40份组成。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为30℃、振荡转速为30r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为20℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表1所示：
表1
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 83.5 | 73.5 | 55.5 | 30.5 |
实施例2
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在60度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂0.02份、硫酸镁45份、硫酸铵20份、硝酸钠10份、过磷酸钙15份、过磷酸钙15份、无菌水130份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.7米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在10%，得到干燥的花粉；
（4）前处理：用先在白纸的两面均匀地喷上一层茶多酚含量为0.2克/升的茶多酚无菌水溶液，干燥，得到含茶多酚的白纸；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层或多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为10℃的冷藏室中冷藏60min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-30℃的冷冻库中冷冻30min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-70℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙60份、胶淀粉45份组成。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为35℃、振荡转速为40r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为25℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表2所示：
表2
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 80.5 | 71.5 | 52.5 | 28.5 |
实施例3
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在45度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂0.015份、硫酸镁42份、硫酸铵17份、硝酸钠9份、过磷酸钙13份、过磷酸钙14份、无菌水120份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.6米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在9%，得到干燥的花粉；
（4）前处理：先在白纸的两面均匀地喷上一层茶多酚含量为0.2克/升的茶多酚无菌水溶液，干燥，得到含茶多酚的白纸；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层或多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为9℃的冷藏室中冷藏45min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-26℃的冷冻库中冷冻22min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-68℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙58份、胶淀粉43份组成。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32℃、振荡转速为35r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表3所示：
表3
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 85.5 | 78.5 | 57.5 | 38.5 |
实施例4
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在45度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由硫酸镁42份、硫酸铵17份、硝酸钠9份、过磷酸钙13份、过磷酸钙14份、无菌水120份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.6米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在9%，得到干燥的花粉；
（4）前处理：先在白纸的两面均匀地喷上一层茶多酚含量为0.2克/升的茶多酚无菌水溶液，干燥，得到含茶多酚的白纸；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层或多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为9℃的冷藏室中冷藏45min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-26℃的冷冻库中冷冻22min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-68℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙58份、胶淀粉43份组成。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32℃、振荡转速为35r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表4所示：
表4
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 75.5 | 62.5 | 43.5 | 19.5 |
实施例5
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在45度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂0.015份、硫酸镁42份、硫酸铵17份、硝酸钠9份、过磷酸钙13份、过磷酸钙14份、无菌水120份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在9%，得到干燥的花粉；
（4）前处理：先在白纸的两面均匀地喷上一层茶多酚含量为0.2克/升的茶多酚无菌水溶液，干燥，得到含茶多酚的白纸；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层或多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为9℃的冷藏室中冷藏45min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-26℃的冷冻库中冷冻22min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-68℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙58份、胶淀粉43份组成。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32℃、振荡转速为35r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表5所示：
表5
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 77.5 | 61.5 | 42.5 | 18.5 |
实施例6
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在45度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂0.015份、硫酸镁42份、硫酸铵17份、硝酸钠9份、过磷酸钙13份、过磷酸钙14份、无菌水120份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.6米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在9%，得到干燥的花粉；
（4）前处理：用白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层或多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为9℃的冷藏室中冷藏45min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-26℃的冷冻库中冷冻22min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-68℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙58份、胶淀粉43份组成。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32℃、振荡转速为35r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表6所示：
表6
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 70.5 | 58.5 | 40.5 | 15.5 |
对比例1
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在45度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂0.015份、硫酸镁42份、硫酸铵17份、硝酸钠9份、过磷酸钙13份、过磷酸钙14份、无菌水120份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.6米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在9%，得到干燥的花粉；
（4）冷藏：在冻存管内加入干燥的花粉，封口，并将冻存管放入温度为-68℃的冷冻库中超低温保存。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32℃、振荡转速为35r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表7所示：
表7
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 60.5 | 25.5 | -- | -- |
对比例2
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在45度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂0.015份、硫酸镁42份、硫酸铵17份、硝酸钠9份、过磷酸钙13份、过磷酸钙14份、无菌水120份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.6米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在9%，得到干燥的花粉；
（4）前处理：在冻存管中加入干燥的花粉，封口，并置于温度为9℃的冷藏室中冷藏45min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-26℃的冷冻库中冷冻22min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-68℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙58份、胶淀粉43份组成。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32℃、振荡转速为35r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表8所示：
表8
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 63.5 | 46.5 | 25.5 | -- |
对比例3
一种甘蔗花粉保存方法，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入深度为35厘米左右的营养液中并倾斜放置，倾斜放置的角度在45度，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂0.015份、硫酸镁42份、硫酸铵17份、硝酸钠9份、过磷酸钙13份、过磷酸钙14份、无菌水120份组成；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.6米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在9%，得到干燥的花粉；
（4）前处理：先在白纸的两面均匀地喷上一层茶多酚含量为0.2克/升的茶多酚无菌水溶液，干燥，得到含茶多酚的白纸；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层或多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为9℃的冷藏室中冷藏45min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-26℃的冷冻库中冷冻22min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：将冷冻花粉冻存管放入温度为-68℃的冷冻库中超低温保存。
解除休眠：步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉解除休眠的方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32℃、振荡转速为35r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
统计本实施例甘蔗花粉不同超低温保存时间下甘蔗花粉的离体萌发率，统计结果如下表9所示：
表9
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 离体萌发率（%） | 65.5 | 40.5 | 22.0 | -- |
采用实施例3中不同超低温保存时间下的甘蔗花粉进行授粉杂交实验，花粉授粉结实结果统计如下表10所示：
表10
| 超低温保存时间（天） | 10 | 100 | 300 | 600 |
| 自交萌发数量（株） | 535 | 341 | 147 | 78 |
| 与桂糖92-66杂交萌发数量（株） | 867 | 562 | 389 | 178 |
| 与粤糖83-257杂交萌发数量（株） | 1036 | 857 | 676 | 452 |
| 与台糖146杂交萌发数量（株） | 754 | 513 | 336 | 190 |
由上述实施例1-6及对比例1-3的甘蔗花粉离体萌发率结果及花粉授粉结实结果可知，本发明一种甘蔗花粉保存方法，采集甘蔗花粉之后立马干燥花粉，将甘蔗花粉的含水率降至10%以下，大大提高甘蔗花粉存活率；依次对甘蔗花粉进行8～10℃冷藏、-25～-30℃的冷冻，最后才放入-65～-70℃的冷冻库中超低温保存，一步步降温，可增大甘蔗花粉的耐受性，减少冻伤率，同时能避免温差过大导致的性能变化，可极大减弱甘蔗花粉的呼吸作用，延长保存时间的同时使其遗传性能保持稳定，储藏效果好；放入-65～-70℃的冷冻库中超低温保存时在冻存管中加入干燥剂，加之花粉外包裹着白纸及油纸，甘蔗花粉解除休眠或是超低温保存过程中短暂停电时，可以降低花粉不适，从而提高甘蔗花粉的存活率及结实率；本发明甘蔗花粉保存方法，可以极大延长甘蔗花粉保存时间，甘蔗花粉保存时间长达600天以上；在营养液中加入适量的芸苔素内酯，调节甘蔗植株营养分配，可有效提高采集得到的甘蔗花粉的活性；采集甘蔗花粉时开启白炽灯，花粉干燥时完全遮光，调节花粉各阶段的光照，发挥光照的有益影响，消除光照的不利影响，可有效提高采集得到的甘蔗花粉的活性；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，茶多酚具有较强的抗氧化作用，同时对葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等有抑制作用，可有效提高甘蔗花粉的活性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）移栽：选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，移栽至室内，得到待采甘蔗植株；
（2）采集：观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，花药开裂时，立马利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉；
（3）干燥：清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在10%以下，得到干燥的花粉；
（4）前处理：用白纸包住干燥的花粉，得到花粉包；在花粉包的外表面包上一层油纸，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为8～10℃的冷藏室中冷藏40～60min，取出，得到冷藏花粉冻存管；
（5）冷冻：将冷藏花粉冻存管放入温度为-25～-30℃的冷冻库中冷冻20～30min，取出，得到冷冻花粉冻存管；
（6）冷藏：在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-65～-70℃的冷冻库中超低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（1）中选择基本完成抽穗且即将开花的甘蔗植株，沿甘蔗杆茎的中下部砍下，带回室内，将甘蔗杆茎插入营养液中并倾斜放置，得到待采甘蔗植株；所述营养液按重量份计由硫酸镁40～45份、硫酸铵15～20份、硝酸钠8～10份、过磷酸钙12～15份、过磷酸钙12～15份、无菌水100～130份组成。
3.根据权利要求2所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（1）中的营养液中还包括0.01～0.02重量份的0.01%的芸苔素内酯水溶性粉剂。
4.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（2）中观察待采甘蔗植株花药的开裂情况，并在花穗顶部上方0.5～0.7米位置处设置瓦数为100瓦的白炽灯；花药开裂时，立马打开白炽灯，同时利用干净的白纸置于花穗下，晃动花穗，使花粉掉落至白纸上，采集得到甘蔗花粉。
5.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（3）中采集得到甘蔗花粉后，立即将甘蔗花粉过50目筛网，清除干净甘蔗花粉中的杂质，得到干净的甘蔗花粉；立即将干净的甘蔗花粉送入遮光干燥室，干燥至含水量在7～10%，得到干燥的花粉。
6.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（4）中先在白纸的两面均匀地喷上一层茶多酚含量为0.2克/升的茶多酚无菌水溶液，干燥，得到含茶多酚的白纸；用含茶多酚的白纸包住干燥的花粉，包成条状，得到花粉包；在花粉包的外表面包上多层油纸，包成条状，捆绑好，得到油纸包；在冻存管内塞入油纸包，封口，并置于温度为8～10℃的冷藏室中冷藏45～60min，取出，得到冷藏花粉冻存管。
7.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（5）中将冷藏花粉冻存管放入温度为-26～-30℃的冷冻库中冷冻22～30min，取出，得到冷冻花粉冻存管。
8.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（6）中在冷冻花粉冻存管中加入干燥剂，封口，并将冷冻花粉冻存管放入温度为-65～-70℃的冷冻库中超低温保存；所述干燥剂按重量份计由无水氯化钙55～60份、胶淀粉40～45份组成。
9.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉的解除休眠方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为30～35℃、振荡转速为30～40r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为20～25℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
10.根据权利要求9所述的一种甘蔗花粉保存方法，其特征在于，所述步骤（6）中超低温保存甘蔗花粉的解除休眠方法为：1）将冷冻花粉冻存管放入水浴温度为32～35℃、振荡转速为35～40r/min的恒温水浴设备中化冻；2）化冻结束之后取出冻存管，将冻存管内的干燥剂倒出，取出油纸包，并用温度为22～25℃的无菌水冲洗干净油纸包；3）干燥油纸包，取出油纸包内的甘蔗花粉即可。
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| US20100251435A1 (en) * | 2007-06-22 | 2010-09-30 | Syngenta Crop Protection, Inc. | Method for growing sugarcane |
| CN107494522A (zh) * | 2017-08-29 | 2017-12-22 | 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） | 甘蔗花粉低温储存方法 |
-
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| 李富生等: "不同无性系蔗茅抽穗开花特性的观察和花粉贮藏条件的研究", 《植物生理学通讯》 * |
| 杨弘远等编著: "《植物有性生殖实验研究四十年》", 31 December 2013 * |
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