CN113943430A - 一种原位矿化水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种原位矿化水凝胶，通过含有羧酸根的可降解高分子化合物和含磷酸根小分子在碱性条件下，于溶剂中共混后制备前体水凝胶，然后由金属离子交联制备得到。本发明以可降解高分子化合物作为骨架材料，含磷酸根小分子自身结晶同时充当晶核引起金属离子沉积矿化，同时可降解高分子化合物的负电性可加速金属离子沉积，最终羧酸根、磷酸根和金属离子的共配位和体系的结晶作用形成以矿化晶体交联的水凝胶。实验结果表明，本发明制备的水凝胶，随着时间的延长机械性能从高韧转变为高强，具有较高的黏附，降解后SEM结构恢复为小孔径形成无机矿化水凝胶，具有低溶血率和细胞毒性，具有优异的生物相容性，可有效的促进骨髓间充质干细胞增殖。

Description

一种原位矿化水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用高分子材料技术领域，尤其涉及一种原位矿化水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
骨骼的再生能力有限，大于一定大小的缺陷无法自行治愈。近年来，治疗与骨相关的创伤，感染和肿瘤的医疗费用不断增加。根据相关统计数据，2010年欧洲骨移植替代品市场为1.77亿美元，同年全球骨科生物材料市场价值为19亿美元，2017年已达到30多亿美元。但是，全球前20大医疗器械厂商中，强生、美敦力、贝朗等国际知名企业，利用资本和技术优势，不断挤压国产生物医用材料市场，威胁我国健康产业安全。这给我国患者疾病治疗带来沉重的负担，给国家医保带来空前的压力。因此，研究新型高活性、强自适应性修复材料，实现对骨组织缺损的灵活高效修复，并最大限度地满足临床急需，不仅具有科学意义、临床意义，同时将带来显著的经济效益，解决国外对我国骨修复领域的卡脖子技术，具有重大的社会意义。
低生物活性、自适应整合性是目前骨修复材料的主要缺点，尤其是针对于难愈性创面和形状不规则性创面。陶瓷是一种具有良好机械性能和骨传导性的无机材料，已成功用于牙槽骨的修复，但其不可降解的性能限制其应用。在过去的几十年中，聚合物支架在骨组织工程中得到了广泛的研究。常用的天然材料(例如胶原蛋白、羟基磷灰石和天然多糖)以及合成聚合物(例如聚乳酸(PLA)和聚(D，l-丙交酯-乙交酯)乙交酯)具有良好的可生物相容性，同时具有可调的机械性能。然而，此类支架在设计中很少考虑天然组织的结构和特征，具有较低的生物活性，同时支架通常表现出与周围骨组织的不良整合，严重影响了骨愈合。因此，发展具有高的生物活性、自适应整合性的骨修复材料是已成为目前主要研究的方向。
然而，如何将这两种特性有效的结合起来，使一个材料能够满足骨修复过程不同阶段对材料性能需求：初期可完整的填充任意形状的创面，随着时间延长固定创面；在治疗期间可释放活性药物，有效地促进骨缺损的修复；治疗后期材料逐渐降解，具有优异的生物安全性。这已成为本领域诸多具有前瞻性的研究人员关注的焦点之一，对于获取优异的生物活性和丰富支架构建体系的使用场景也具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种原位矿化水凝胶及其制备方法和应用，具有较高的生物活性和自适应整合性。
本发明提供了一种原位矿化水凝胶，通过含有羧酸根的可降解高分子化合物和含磷酸根小分子在碱性条件下，于溶剂中共混后制备前体水凝胶，然后由金属离子交联制备得到原位矿化水凝胶。
现有的骨缺损填充材料在设计中很少考虑天然组织的结构和特征，生物活性较低，尤其在修复较大缺损区域或出现感染等复杂情况，或是对于组织再生能力衰退的老龄患者，修复周期长、修复效果差。同时支架通常表现出与周围骨组织的不良整合，严重影响了骨愈合。本发明针对上述问题，设计了一种原位矿化水凝胶，无需对高分子原料进行化学修饰，采用共混法，仅通过药物本身的作用引导体系内部逐渐交联形成水凝胶。水凝胶中含磷酸根小分子一方面是促进骨修复的活性药物，同时也是促进水凝胶成胶的重要组分。该水凝胶填充于骨缺损部位，体系内部的药物缓慢释放，释放的药物将有效的促进骨缺损部位的愈合。此方法既解决了传统骨修复材料的生物安全性问题，同时含磷小分子药物在水凝胶中的高稳定性也有利于工业化生产。此外凝胶初始可设计形状填充于任意形状的创面，固化后可固定完全填充创面，并具有较高的强度，完美地解决了目前骨组织修复材料低生物活性和难以完全适应骨组织创面的两大缺点。
优选的，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物具有式1-1～1-5所示结构中的一种或多种：
Figure BDA0003323432140000031
上述结构中，n和m均为重复单元个数。
优选的，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物选自聚氨基酸盐、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、透明质酸钠中的一种或多种。
所述羧甲基纤维素钠的黏度范围优选为η＝300～15000mPa·s。
所述羧甲基壳聚糖的黏度范围优选为η＝10～80mPa·s。
优选的，所述含磷酸根小分子为含双磷酸根小分子。更优选具有以下2-1～2-4所示结构中的一种或多种：
Figure BDA0003323432140000032
优选的，所述金属离子选自Ca2+、Mg2+、Zn2+等中的一种或多种。
优选的，所述溶剂选自水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液等中的一种或多种。
优选的，提供上述碱性环境的碱性化合物选自NaOH、KOH、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液和三乙胺中的一种或多种。
所述碱性环境的pH值优选为9-10。
优选的，所述水凝胶中，所述前体水凝胶含水量为50％～99％；最终制得的原位矿化水凝胶含水量为50％～99％。
本发明中，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物为整个体系提供三维网络结构和黏度，所述含磷酸根小分子自身结晶同时充当晶核引起金属离子沉积后晶核生长，同时含有羧酸根的可降解高分子化合物的负电性可加速金属离子沉积。
制备的原位矿化水凝胶具有原位机械增强功能，水凝胶随着温度升高或时间延长将从高韧性凝胶转变为高强度凝胶，形态可以从初始无定形态到部分有序态转变。
所述水凝胶中，原位机械现象原理为升高温度或延长时间有助于水凝胶内部结晶以增强水凝胶强度。
优选的，所述原位矿化水凝胶升温强度增强现象，温度范围为0℃～60℃。
所述水凝胶具有高黏附性能，可预涂覆于不同基材或直接作用于人体组织。
所述原位矿化水凝胶的黏附基材包括但不限于中性玻璃片、正电荷玻璃片、负电荷玻璃片、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、金属基材、木材、硅胶、橡胶、乳胶等其中的一种或多种；所述人体组织包括但不限于皮肤创面、骨创面、人体器官等。
所述水凝胶还具有生物矿化性能。
本发明所述水凝胶的成胶原理均为物理相互作用成胶。
优选的，所述水凝胶的制备方法为共混法，可通过机械搅拌、手动搅拌等方式制备。
本发明提供了上述原位矿化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
A)将含磷酸根小分子和含有羧酸根的可降解高分子化合物在溶剂中共混，得到前体水凝胶；
B)将金属离子化合物溶液与所述前体水凝胶混合，得到预制水凝胶；
C)将预制水凝胶放置，进行原位交联得到原位矿化水凝胶。
图1为本发明提供的具有原位矿化水凝胶的构建的技术路线示意图，通过共混的方法制备水凝胶，磷酸盐小分子充当成核位点，金属离子沉积晶核增长，同时形成羧酸根，磷酸根和金属离子的共配位。
优选的，所述金属离子化合物选自氯化钙、氯化镁、氯化锌、醋酸钙、醋酸镁和醋酸锌中的一种或多种。
优选的，所述步骤A)共混的温度为0～65℃，更优选为25～40℃，共混时间优选为5～20min，更优选为10min。
优选的，所述步骤B)混合的温度为10～65℃，时间为5～20min。
优选的，所述放置的温度为0～65℃，更优选为25～40℃；时间优选为0.5h～21d，更优选为0.5h～2d。
本发明中，将上述原位矿化水凝胶放置于外部环境，浸泡使其进行离子置换得到生物模拟磷酸盐水凝胶。该步骤可证明凝胶在模拟体液的环境中最终可变为类生物骨结构，进而在使用时，预制水凝胶在人体固化后可通过体液置换缓慢变为类生物骨结构并最终降解，进一步说明其具有优良的生物相容性。
所述外部环境包括但不限于含有磷酸盐的缓冲溶液，骨骼，体液等其中的一种或多种。
所述离子置换达到平衡时间的范围优选为20d～25d。
所述离子置换的环境温度范围优选为4℃～40℃。
优选具体的，将上述原位矿化水凝胶放置于4～40℃外部环境下静置20～25d使其进行充分的离子置换得到生物模拟磷酸盐水凝胶。
在本发明的一些具体实施例中，所述制备方法包括以下步骤：
1)将含磷酸根小分子溶于碱性溶剂后得到第一中间体；
将金属离子化合物和缓冲液共混后得到第二中间体；
2)将含有羧酸根的可降解高分子化合物与第一中间体共混，搅拌得到前体水凝胶；所述共混的温度优选为0～65℃；所述搅拌的时间优选为5～20min；
3)在搅拌状态下，将第二中间体缓慢滴加入前体水凝胶，直至形成预制水凝胶；
4)将预制水凝胶放置，使其充分原位交联得到原位机械增强生物矿化水凝胶；所述放置的温度优选为0～65℃，时间优选为0.5h～21d。
优选的，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物的质量浓度为0.1％～50％，优选为12％。
在本发明的一些具体实施例中，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物为聚谷氨酸。
优选的，所述聚谷氨酸的Mn为3.8～880kDa，更优选为500kDa～700kDa。
在本发明的一些具体实施例中，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物为羧甲基纤维素钠。
优选的，所述羧甲基纤维素钠的黏度范围为η＝300～15000mPa·s，更优选为600～3000mPa·s。
在本发明的一些具体实施例中，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物为海藻酸钠。
优选的，所述海藻酸钠的Mn为11～1650kDa，更优选为100～300kDa。
在本发明的一些具体实施例中，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物为羧甲基壳聚糖。
优选的，所述羧甲基壳聚糖的黏度范围为η＝10～80mPa·s，更优选为30～50mPa·s。
在本发明的一些具体实施例中，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物为透明质酸钠。
优选的，所述透明质酸钠的Mn为8.2～2460kDa，更优选为800～1000kDa。
所述含磷酸根小分子的质量浓度优选为0.01％～10％，更优选为3.5％。
所述金属离子化合物的质量浓度优选为0.1％～5％，更优选为1％。
所述含磷酸根小分子的磷酸基团和体系中碱性物质的碱性基团的摩尔比优选为(0.01～100):1，更优选为(0.01～20):1。
所述含有羧酸根的可降解高分子化合物的羧酸根基团和含磷酸根小分子的磷酸基团的摩尔比优选为(0.01～100):1，更优选为(0.01～20):1。
本发明提供的原位矿化水凝胶随着温度的升高或时间的延长，结晶逐渐完善，结晶度逐渐增大。
本发明提供的原位矿化水凝胶具有时温等效性能，成胶过程同一时间下升高温度或同一温度下延长时间均具有相似的力学性质转变。
本发明提供的原位矿化水凝胶具有高黏附性能。
本发明提供了上述原位矿化水凝胶或上述制备方法制备的原位矿化水凝胶在制备骨修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种原位矿化水凝胶，通过含有羧酸根的可降解高分子化合物和含磷酸根小分子在碱性条件下，于溶剂中共混后制备前体水凝胶，然后由金属离子交联制备得到。
本发明以可降解高分子化合物作为骨架材料，含磷酸根小分子自身结晶同时充当晶核引起金属离子沉积矿化，同时可降解高分子化合物的负电性可加速金属离子沉积，最终羧酸根、磷酸根和金属离子的共配位和体系的结晶作用形成以矿化晶体交联的水凝胶。初始凝胶具有一定的延展性，随着温度的升高或时间的延长体系内部结晶度的增加使得该水凝胶的机械性能逐渐增强，具有原位机械性能增强的特性。此方法构建的水凝胶制备简单，初始的延展性利于填充不规则的骨缺损部位，原位矿化后的水凝胶能够为组织修复提供多孔支架；同时，小分子药物的缓慢释放可以进一步促进骨组织修复，有望应用于临床骨缺损修复。
具体的：
1、本发明制备的原位矿化水凝胶在初始状态为无定形水凝胶，可自适应的填充任意形状创面，而且通过人体的环境温度或时间的延长，凝胶内部逐渐进行原位结晶，极大的提升了凝胶的强度，使得凝胶从无定形态转变为局部有序状态，水凝胶逐渐固化，黏附创面，实现水凝胶与周围骨组织的完美整合并可进一步固定创面，极大的提升骨愈合速率。同时本发明提供的水凝胶含有磷酸基团，可与骨表面产生较强的结合力，进一步黏附创面，在治疗周期不会有脱落的危险。
2、本发明提供的水凝胶可在骨创面修复后期转变为生物模拟磷酸盐水凝胶。在修复期间，人体内的磷酸根将和水凝胶内部的药物发生置换作用，磷酸根将与水凝胶内部的金属离子结合，使得水凝胶转变为含有磷酸盐水凝胶。其结构类似于人体骨成分，进一步促进骨缺损部位的修复，同时具有优异的生物相容性，生物可降解性。
3、本发明提供的原位机械增强可生物矿化水凝胶由特定结构的高分子和小分子药物组成，还包括金属离子和碱类，其核心是小分子药物。该水凝胶可以通过直接涂抹的方式完美的契合各种形状的创面，实现骨修复类材料与创面高自适应整合度；同时释放小分子药物，进一步提高骨缺损修复速率。而且具有制备简单、无化学修饰和使用简单的特点，为构建骨修复材料提供了一种全新的思路。
实验结果表明，本发明制备的水凝胶，随着时间的延长机械性能从高韧转变为高强，具有较高的黏附，降解后SEM结构恢复为小孔径形成无机矿化水凝胶，具有低溶血率和细胞毒性，具有优异的生物相容性，可有效的促进骨髓间充质干细胞增殖。
附图说明
图1为本发明提供的具有原位矿化水凝胶的构建的技术路线示意图；
图2为实施例1所述水凝胶初始状态的SEM图；
图3为实施例1所述水凝胶固化后的SEM图；
图4为实施例6所述水凝胶初始状态的流变数据；
图5为实施例6所述水凝胶固化后的流变数据；
图6为实施例8所述水凝胶黏附性能测试示意图；
图7为实施例8所述水凝胶黏附性能数据；
图8为实施例10所述水凝胶PBS浸泡后SEM图；
图9为实施例14所述水凝胶固化后XRD图；
图10为实施例14所述水凝胶PBS浸泡后XRD图；
图11为实施例15所述水凝胶溶血数据；
图12为实施例15所述水凝胶细胞毒性数据；
图13为实施例15所述水凝胶细胞增殖数据。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的原位矿化水凝胶及其制备方法和应用进行详细描述。
实施例1
a.在常温下将32.5mg的羟基乙叉二磷酸盐加入1mL pH＝9.5的氢氧化钠溶液中，充分溶解，配置溶液；
b.将250mg的海藻酸钠(Mn＝100kDa)加入a步骤最终所得的溶液中搅拌15min，使其充分溶解制备前体水凝胶；
c.配置275mg/mL的氯化钙溶液，将26μL的氯化钙溶液加入b步骤所得的体系中，搅拌20min使其混合均匀；
d.将c步骤所得的体系放置于50℃烘箱静置24h成功制备水凝胶。
e.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡10d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸钙水凝胶。
实施例2
a.将16mg的伊班膦酸钠加入2mL的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液(pH＝9.4)中，充分溶解，配置溶液；
b.将360mg的海藻酸钠(Mn＝300kDa)加入步骤a最终所得的溶液中搅拌15min，使其充分溶解制备前体水凝胶。
实施例3
a.配置400mg/mL的氯化镁溶液，将20μL的氯化镁溶液加入实施例2所得的体系中，充分搅拌使其混合均匀；
b.将a步骤所得的体系放置于50摄氏度下0.5天可成功制备该水凝胶。
c.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡10d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸镁水凝胶。
实施例4
a.配置400mg/mL的氯化锌溶液，将66μL的氯化锌溶液加入实施例2所得的体系中，充分搅拌使其混合均匀；
b.将a步骤所得的体系放置于24摄氏度下3天可成功制备该水凝胶。
c.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡10d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸锌水凝胶。
实施例5
a.配置400mg/mL的醋酸钙溶液，将24μL的醋酸钙溶液加入实施例2所得的体系中，充分搅拌使其混合均匀；
b.将a步骤所得的体系放置于37摄氏度下2天可成功制备该水凝胶。
c.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡12d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸钙水凝胶。
实施例6
a.将40mg的伊班膦酸钠加入2mL的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液(pH＝9.4)中，充分溶解，配置溶液；
b.将180mg的羧甲基纤维素钠(η＝600～3000Pa·s)加入步骤a最终所得的溶液中搅拌15min，使其充分溶解；
c.配置400mg/mL的氯化锌溶液，将10μL的氯化锌溶液加入步骤b所得的体系中，充分搅拌使其混合均匀；
d.将c步骤所得的体系放置于15摄氏度下7天可成功制备该水凝胶。
e.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡25d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸锌水凝胶。
实施例7
a.将48mg的唑来膦酸钠加入2mL的PBS缓冲溶液(pH＝7.5)中，使用100mg/mL NaOH调节溶液pH到9左右，配置溶液；
b.将300mg的羧甲基壳聚糖(η＝30～50mPa·s)加入步骤a最终所得的溶液中搅拌10min，使其充分溶解。
实施例8：
a.配置500mg/mL的氯化钙溶液，将65μL的氯化钙溶液加入实施例7所得的体系中，充分搅拌20min使其混合均匀；
b.将a步骤所得的体系放置于25摄氏度下4天可成功制备该水凝胶。
c.最终固化后水凝胶在37摄氏度下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡15d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸钙水凝胶。
实施例9
a.配置300mg/mL的氯化锌溶液，将56μL的氯化锌溶液加入实施例7所得的体系中，充分搅拌15min使其混合均匀；
b.将a步骤所得的体系放置于20摄氏度下4天可成功制备该水凝胶。
c.最终固化后水凝胶在25摄氏度下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡20d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸锌水凝胶。
实施例10
a.将30mg的阿伦膦酸钠加入2mL的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液(pH＝9.4)中，充分溶解，配置溶液；
b.将500mg的聚谷氨酸(Mn＝100kDa)加入步骤a最终所得的溶液中搅拌15min，使其充分溶解；
c.配置400mg/mL的氯化钙溶液，将50μL的氯化钙溶液加入步骤b所得的体系中，充分搅拌使其混合均匀；
d.将c步骤所得的体系放置于37摄氏度下1天可成功制备该水凝胶。
e.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡25d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸钙水凝胶。
实施例11
a.将60mg的羟基乙叉二磷酸盐加入2mL的PBS(pH＝7.5)中，使用50mg/mL NaOH溶液调节体系pH＝9左右，配置溶液；
b.将650mg的羧甲基壳聚糖(η＝30～50mPa·s)加入步骤a最终所得的溶液中搅拌5min，使其充分溶解制备前体水凝胶。
实施例12
a.将60mg的阿仑膦酸钠加入2mL的PBS(pH＝7.5)中，使用100mg/mL KOH溶液调节体系pH＝9左右，配置溶液；
b.将650mg的聚谷氨酸(Mn＝500kDa)加入步骤a最终所得的溶液中搅拌5min，使其充分溶解制备前体水凝胶。
实施例13
a.将50mg的唑来膦酸钠加入2mL的PBS(pH＝7.5)中，使用50mg/mL三乙胺溶液调节体系pH＝9左右，配置溶液；
b.将650mg的透明质酸钠(Mn＝800kDa)加入步骤a最终所得的溶液中搅拌5min，使其充分溶解制备前体水凝胶。
实施例14
a.配置600mg/mL的氯化钙溶液，将55μL的氯化钙溶液加入实施例11所得的体系中，充分搅拌使其混合均匀；
b.将a步骤所得的体系放置于30摄氏度下2天可成功制备该水凝胶。
c.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡25d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸钙水凝胶。
实施例15
a.配置600mg/mL的醋酸钙溶液，将55μL的醋酸钙溶液加入实施例12所得的体系中，充分搅拌使其混合均匀；
b.将a步骤所得的体系放置于40摄氏度下1天可成功制备该水凝胶。
c.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡15d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸钙水凝胶。
实施例16
a.配置500mg/mL的氯化锌溶液，将68μL的氯化锌溶液加入实施例13所得的体系中，充分搅拌使其混合均匀；
b.将a步骤所得的体系放置于37摄氏度下1天可成功制备该水凝胶。
c.最终固化后水凝胶在常温下浸泡于体外模拟体液PBS中，浸泡15d使其充分进行内外的离子交换，制备生物模拟磷酸锌水凝胶。
实施例17
测试水凝胶初始状态和放置于同一温度下静置不同的时间固化后的表面形貌
将实施例1、3-5所制备的水凝胶初始状态(刚搅拌完成的状态)和固化后的状态各自放置于-20℃冰箱中冷冻12h后放置于冷冻干燥机中冻干除水。将得到的冻干水凝胶放置于液氮中急速冷冻迅速扳断，通过扫描电子显微镜观察其断面的表面形貌。
参照图2、3，图2为实施例1的水凝胶初始状态表面形貌图，其中凝胶内部网格为无规则的小孔，图3为实施例1的水凝胶固化后凝胶形貌，三维骨架变为大孔且具有较厚的网络壁。
实施例18
通过测试水凝胶初始状态和放置于同一温度下静置不同的时间固化后的流变学行为证明水凝胶模量的变化
参照图4、5，图4为实施例6的水凝胶初始状态的角速度-模量测试结果，图5为实施例6的水凝胶固化后的角速度-模量测试结果，相比于图4结果，图5水凝胶具有更高的弹性模量。其证明水凝胶初始状态为无定形具有低的弹性模量，易于涂抹，固化后水凝胶具有高的弹性模量，更易填充固定创面。
实施例19
通过测试水凝胶黏附性能证明水凝胶可以更好的黏附固定创面
使用拉力试验机通过玻璃板黏附测试水凝胶的黏附性能(如图6所示)。取凝胶32mg涂抹于A玻璃板边缘，涂抹面积为25mm*12.5mm，将B玻璃板桥接于玻璃板A凝胶涂抹部位之上，按压两玻璃板1min，使用拉力试验机进行测试，得到拉应力F。仪器设定参数为拉力速度＝2mm/min，最大限制力＝45N。最终通过公式Adhesive strength＝F/(25mm*12.5mm)得到凝胶对于玻璃板的黏附力。
结果参照图7，图7为实施例8的水凝胶黏附性能测试结果，结果表明，水凝胶对于基材的粘附力在50kpa左右，具有较好的黏附行为，可更好的固定创面。
实施例20
通过测试固化后的水凝胶在外部环境浸泡后凝胶内部结构的改变证明凝胶交联结构的改变，由药物水凝胶变为磷酸盐水凝胶
在37℃下，将300mg的矿化水凝胶放置于1mL PBS中，在不同的时间点取出试管中PBS，加入新的1mL PBS，凝胶在PBS中置换25d后，取出凝胶，放置于-20℃冰箱中冷冻，随后使用冻干机干燥。最后将得到的冻干样品使用扫描电镜获取凝胶内部形貌照片和制成粉末测试XRD分析凝胶内部的交联结构。
参照图8，图8为实施例10的水凝胶在PBS中浸泡25d后的凝胶内部形貌，相比于图3，凝胶孔径变小，交联网络变密，证明凝胶内部交联结构的改变。
实施例21
通过XRD测试固化后的水凝胶在外部环境浸泡后交联结构的改变，由药物水凝胶变为磷酸盐水凝胶；
参照图9，10，图9为实施例14的水凝胶固化后XRD，图10为实施例14的水凝胶在PBS中浸泡25d后的凝胶XRD，相比于图9，图10新出现磷酸钙衍射峰。
实施例22
通过溶血实验评价水凝胶的血液相容性
首先取新鲜的兔血2mL加入到20mL生理盐水中，离心机中1500rpm/min离心10min，弃掉上层清液，在下层的血细胞中新加20mL生理盐水，再次离心重复3次。收集下层血细胞。将下层血细胞配置成2％的血细胞悬浮液，与水凝胶在37℃共培养，阳性对照组为纯生理盐水，阳性对照组为无菌水。3h后，取出上清液，使用紫外分光光度计测试545nm处吸收光，最终得到溶血率。
溶血率％＝(Abs凝胶组-Abs阴性组)/(Abs阳性组-Abs阴性组)*100％
结果参照图11，图11为实施例15的水凝胶的溶血率，溶血率低于5％，证明水凝胶具有优异的血液相容性。
实施例23
通过细胞毒性实验评价水凝胶的生物相容性；
首先培养骨间充质干细胞(BMSCs)，96孔板每孔种植8000个细胞，37℃5％的CO2条件下使用细胞培养液培养24h后弃掉原培养液，加入含有凝胶的细胞培养液，继续在37℃5％的CO2条件下培养24h，阴性对照组为纯细胞培养液，阳性对照组为无菌水。随后弃掉含有凝胶的培养液，每孔加入100μL含有CCK8的无血清培养液，在37℃5％的CO2条件下孵育2h后使用酶标仪测试450nm的吸收光谱，最终的通过以下公式计算细胞存活率。
细胞存活率％＝(OD凝胶组-OD阳性组)/(OD阴性组-OD阳性组)*100％
结果参照图12，图12为实施例15的水凝胶的细胞毒性，细胞存活率接近于100％，证明水凝胶具有优异的生物相容性。
实施例24
通过细胞增值实验评价水凝胶在细胞层次可有效促进细胞增殖
首先培养骨间充质干细胞(BMSCs)细胞，24孔板每孔加入500μL细胞培养液，其中含有30000个/孔细胞，37℃5％的CO2条件下使用细胞培养液培养24h后弃掉原培养液，加入含有凝胶的细胞培养液，继续在37℃5％的CO2条件下培养24h，阴性对照组为纯细胞培养液，阳性对照组为无菌水。随后弃掉含有凝胶的培养液，每孔加入500μL含有CCK8的无血清培养液，在37℃5％的CO2条件下孵育2h后使用酶标仪测试450nm的吸收光谱，最终根据吸光度比较细胞增殖。
结果参照图13，图13为实施例15的水凝胶的细胞增殖，凝胶组细胞增殖效果大于纯培养液组，证明水凝胶可有效的促进细胞增殖。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种原位矿化水凝胶，其特征在于，通过含有羧酸根的可降解高分子化合物和含磷酸根小分子在碱性条件下，于溶剂中共混后制备前体水凝胶，然后由金属离子交联制备得到原位矿化水凝胶。
2.根据权利要求1所述的原位矿化水凝胶，其特征在于，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物具有式1-1～1-5所示结构中的一种或多种：
Figure FDA0003323432130000011
3.根据权利要求1所述的原位矿化水凝胶，其特征在于，所述含有羧酸根的可降解高分子化合物选自聚氨基酸盐、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、透明质酸钠中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的原位矿化水凝胶，其特征在于，所述含磷酸根小分子具有以下2-1～2-4所示结构中的一种或多种：
Figure FDA0003323432130000012
5.根据权利要求1所述的原位矿化水凝胶，其特征在于，所述金属离子选自Ca2+、Mg2+、Zn2+中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的原位矿化水凝胶，其特征在于，所述溶剂选自水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种或多种。
7.权利要求1～6任一项所述的原位矿化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
A)将含磷酸根小分子和含有羧酸根的可降解高分子化合物在溶剂中共混，得到前体水凝胶；
B)将金属离子化合物溶液与所述前体水凝胶混合，得到预制水凝胶；
C)将预制水凝胶放置，进行原位交联得到原位矿化水凝胶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将上述原位矿化水凝胶放置于外部环境，浸泡使其进行离子置换得到生物模拟磷酸盐水凝胶。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述放置的温度为0～65℃，时间为0.5h～21d。
10.权利要求1～6任一项所述的原位矿化水凝胶或权利要求7～9任一项所述的制备方法制备的原位矿化水凝胶在制备骨修复材料中的应用。
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