CN113939201A - bZIP转录因子调节烟碱向去甲烟碱的转化并降低烟草特异性(TSNA)前体的水平 - Google Patents
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Abstract
本文提供一种减少烟碱向去甲烟碱转化的方法。所述方法包括向有此需要的生物体施用至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子抑制剂。本文还提供一种减少烟碱向去甲烟碱转化的方法，所述方法包括突变烟碱N‑脱甲基酶(NND)启动子上的bZIP型转录因子结合位点。本文进一步提供一种减少烟碱向去甲烟碱转化的方法，所述方法包括突变植物基因组以敲除至少一种bZIP型转录因子。
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技术领域
本发明涉及用于调节烟碱向去甲烟碱的转化的物品和方法。特别地，当前公开的主题涉及用于调节烟碱向去甲烟碱的转化的转录因子及其使用方法。
发明背景
烟草(Nicotiana tabacum)(普通烟草)是一种起源于约200,000年前的天然异源四倍体。母本S-基因组源自美花烟草(N.sylvestris)的祖先，而父本T-基因组来自绒毛烟草(N.tomentosiformis)的亲属。烟碱是大多数栽培烟草品种中积累的主要生物碱。在过去的几十年中，在分离和表征烟碱生物合成途径中的结构基因方面已取得重大进展。茉莉酸(JA)是烟碱生物合成的主要激发子。JA反应性转录因子(TF)属于两个主要家族，APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTORS(AP2/ERFs)和碱性HELIX-LOOP-HELIX(bHLH)，并且已知诱导编码烟碱生物合成途径中的关键酶的基因表达。
烟碱和其他托品烷类生物碱如莨菪碱和莨菪胺在根中合成，并且通过木质部运输至叶。已分离许多转运蛋白并表征它们在植物中生物碱的运输和液泡螯合中的作用。在烟草中，许多属于MULTIDRUG和TOXIC COMPOUND ETRUSION(MATE)家族的转运蛋白，包括MATE1/2和茉莉酸诱导的生物碱转运蛋白(JAT1/2)，参与烟碱的运输和液泡摄取(sequestration)。但是，没有彻底研究参与这些转运蛋白调节的TF。
除了烟碱，烟草植物还积累三种其他吡啶生物碱，即去甲烟碱、新烟碱和新烟草碱。去甲烟碱是通过酶促过程从烟碱衍生的去甲基化烟碱(不含甲基)。它还是N-亚硝基去甲烟碱(NNN)的前体，N-亚硝基去甲烟碱(NNN)是在烟草材料的烤制和加工过程中产生的。更具体地，在收获后加工期间，去甲烟碱与硝化剂发生化学反应以形成NNN。因为NNN属于一类称为烟草特异性亚硝胺(TSNA)的吸烟相关致癌物，所以非常需要减少烟草产品中的TSNA。
有两种可能的方式减少TSNA。一种是减少总体烟碱含量；另一种是消除烟碱向去甲烟碱的转化。烟碱向去甲烟碱的转化由烟碱N-脱甲基酶(NND)催化，该酶是细胞色素P450酶的一个小家族。在烟草中烟碱向去甲烟碱的转化中已鉴定三个NND基因，CYP82E4v1(源自绒毛烟草)、CYP82E5v2(源自绒毛烟草)和CYP82E10(源自美花烟草)。CYP82E4v1(E4)在衰老叶中烟碱向去甲烟碱的转化中起主要作用，而据报道CYP82E10(E10)在根中表达，并且CYP82E5(E5)在根和叶中均起作用。但是，到目前为止，尚未鉴定参与调节烟碱向去甲烟碱转化的转录因子(TF)(即，E4、5和10基因的转录调节因子)。因此，尽管在这些烟碱转运蛋白和参与去甲烟碱生物合成的酶的生化和分子表征方面已取得重大进展，但是这些基因调控的分子机制仍有待阐明。
因此，需要调节烟碱向去甲烟碱的转化的物品和方法。
发明概述
当前公开的主题满足一些或所有上述需要，在研究本文件提供的信息之后本领域普通技术人员会清楚此主题。
本概述描述了当前公开的主题的若干实施方案，并且在许多情况下列出了这些实施方案的变化和排列。本概述仅是许多不同实施方案的示例。提及给定实施方案的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方案通常可以在具有或不具有所提及的特征的情况下存在；同样，那些特征可以应用于当前公开的主题的其他实施方案，无论是否在本概述中列出。为了避免过度重复，本概述并未列出或建议这类特征的所有可能组合。
在一些实施方案中，当前公开的主题包括减少烟碱向去甲烟碱转化的方法和/或降低至少一种烟草特异性(TSNA)前体水平的方法，所述方法包括降低烟草植物、烟草植物的部分、烟草植物细胞或细胞培养物、烟草植物种子或者另一包含烟碱的生物体中至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达。
在一些实施方案中，本文还提供降低烟草植物、烟草植物的部分、烟草植物细胞或细胞培养物、烟草植物种子或者另一包含烟碱的生物体中至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达在烟草植物、烟草植物的部分、烟草植物种子或包含烟碱的生物体中用于减少烟碱向去甲烟碱的转化和/或用于降低至少一种烟草特异性(TSNA)前体的水平的用途。
在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包括C bZIP转录因子、S组bZIP转录因子及其组合。在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包括NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a、NtbZIP2b及其组合。在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP1a和NtbZIP1b。在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP2a和NtbZIP2b。在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a和NtbZIP2b。
在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与SEQ ID NO:1编码的氨基酸；SEQ ID NO:2的氨基酸；SEQ ID NO:3编码的氨基酸；SEQ ID NO:4的氨基酸；SEQ ID NO:5的氨基酸；以及SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。在一实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与SEQ ID NO:1编码的氨基酸或者SEQ ID NO:2的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；以及与SEQ ID NO:3编码的氨基酸或者SEQ ID NO:4的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。在一实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；以及与SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。在一实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与SEQ IDNO:1编码的氨基酸或者SEQ ID NO:2的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；与SEQ ID NO:3编码的氨基酸或者SEQ ID NO:4的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；与SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；和/或与SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
在一些实施方案中，降低至少一种bZIP型转录因子的活性和/或表达包括：突变bZIP型转录因子，如在bZIP型转录因子的结合位点中提供突变；使用bZIP型转录因子抑制剂；或者使用基因沉默技术，如RNAi。在一些实施方案中，bZIP转录因子抑制剂包括反义寡核苷酸、miRNA、siRNA、锁核酸(LNA)核苷酸或其组合。
在一些实施方案中，突变bZIP型转录因子包括突变烟碱N-脱甲基酶(NND)启动子上的结合位点。在一实施方案中，所述NND包括CYP82E4v1、CYP82E5v2或CYP82E10。在另一实施方案中，所述NND是CYP82E4v1，并且CYP82E4v1启动子上的bZIP结合位点是具有TACGTC的预突变序列的A/G盒。在另一实施方案中，突变的结合位点具有序列TGCGTC。在另一实施方案中，突变的结合位点是通过位点定向诱变形成的。
在一些实施方案中，突变bZIP型转录因子包括突变植物基因组以敲除至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子。在一实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包括C bZIP转录因子、S组bZIP转录因子或其组合。在一实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包括NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a、NtbZIP2b或其组合。在一实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与SEQ ID NO:1编码的氨基酸或SEQ ID NO:2的氨基酸；SEQ ID NO:3编码的氨基酸或SEQ ID NO:4的氨基酸；SEQ ID NO:5的氨基酸；或者SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文还提供分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列；编码与SEQID NO:2、4、5或6的序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的序列的核酸序列；或者其组合。
在一些实施方案中，本文还提供分离的核酸分子，其编码具有至少一个突变的bZIP型转录因子。在一实施方案中，所述突变在烟碱N-脱甲基酶(NND)启动子上的结合位点中。在另一实施方案中，所述NND包括CYP82E4v1、CYP82E5v2或CYP82E10。在另一实施方案中，所述NND是CYP82E4v1，并且CYP82E4v1启动子上的bZIP结合位点是具有TACGTC的预突变序列的A/G盒。在另一实施方案中，突变的结合位点具有序列TGCGTC。在一些实施方案中，所述bZIP转录因子包含NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a、NtbZIP2b或其组合。在一些实施方案中，所述bZIP转录因子包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列的核酸序列；编码具有SEQ ID NO:2、4、5或6的序列的序列的核酸序列。
在一些实施方案中，本文还提供包含本文所述核酸分子的构建体或载体。
在一些实施方案中，本文还提供烟草植物细胞：a)包含外源基因，所述外源基因包含本文描述的核酸分子；b)包含本文描述的构建体或载体；c)通过本文描述的方法获得或可获得；和/或d)通过降低至少一种bZIP型转录因子的活性和/或表达或者敲除至少一种bZIP型转录因子的突变获得。
在一些实施方案中，本文还提供本文描述的烟草细胞在生产烟草工业产品中的用途。
在一些实施方案中，本文还提供烟草细胞培养物或植物：a)包含本文描述的植物细胞；b)其已被修饰，以实现与未修饰的培养物或植物相比，烟碱向去甲烟碱的转化减少和/或所述培养物或植物的至少一种烟草特异性(TSNA)前体的水平降低；c)包含本文描述的构建体或载体。
在一些实施方案中，本文还提供可从本文描述的植物或所述植物的部分获得的植物繁殖材料或植物提取物。在一实施方案中，所述植物繁殖材料是植物种子。
在一些实施方案中，本文还提供本文描述的烟草植物在培育烟草植物中的用途。在一些实施方案中，本文描述的烟草植物的用途是生产烟草工业产品。在一些实施方案中，本文描述的烟草植物的用途是种植作物。在一些实施方案中，本文描述的烟草植物的用途是生产加工的烟叶。在一实施方案中，所述加工的烟叶是烤制烟叶。
在一些实施方案中，本文还提供本文描述的烟草植物的收获的叶。在一些实施方案中，所述收获的叶是切割的收获的叶。
在一些实施方案中，本文还提供加工的烟叶：a)包含本文描述的植物细胞；b)可通过加工本文描述的烟草植物获得；c)可从本文描述的植物繁殖材料繁殖的植物获得；和/或d)可通过加工本文描述的收获的叶获得。在一些实施方案中，加工的烟叶是非存活的加工的烟叶。在一些实施方案中，通过烤制、发酵、巴氏杀菌或其组合加工植物或叶。在一些实施方案中，加工的烟叶是切割的加工的烟叶。
在一些实施方案中，本文还提供由本文描述的植物、其部分、其提取物或细胞培养物制备的烤烟材料。
在一些实施方案中，本文还提供包含本文描述的烤烟材料的烟草混合物。
在一些实施方案中，本文还提供一种烟草工业产品，其包括：a)从本文描述的烟草植物或其部分制备；b)从通过本文描述的方法获得或可获得的烟草植物或其部分(优选从植物收获的叶)制备；c)从本文描述的植物繁殖材料繁殖的植物(优选叶)制备；d)从本文描述的收获的叶制备；e)从本文描述的加工的叶制备；f)从获得自本文描述的经修饰的植物的植物提取物制备或包含本文描述的经修饰的植物的植物提取物；g)本文描述的烤烟材料；和/或h)本文描述的烟草混合物。在一些实施方案中，所述烟草工业产品是生烟物品(smoking article)。在一些实施方案中，所述烟草工业产品是无烟烟草产品。在一些实施方案中，所述烟草产品是不可燃气溶胶供应系统如烟草加热装置，例如气溶胶发生装置。
在一些实施方案中，本文还提供可燃生烟物品、不可燃气溶胶供应系统、无烟烟草产品或烟草加热器，其包含本文描述的物种烟草或黄花烟草(Nicotiana rustica)的植物或其部分或者其提取物或者本文描述的烟草细胞培养物或者本文描述的烤烟材料或者本文描述的烟草混合物。
在一些实施方案中，本文还提供编码具有至少一个突变的bZIP型转录因子的至少一种基因的核苷酸序列的用途，其中所述bZIP型转录因子的序列包括由包含相对于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的序列具有至少一个突变的核酸序列的核酸序列编码的序列；相对于SEQ ID NO:2、4、5或6的序列具有至少一个突变的序列；或者其组合。在一些实施方案中，所述序列用于选择烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA前体含量降低的植物。
在研究本文件中的描述、附图和非限制性实例之后，本领域普通技术人员会清楚当前公开的主题的进一步特征和优点。
序列表简述
本申请含有所附的序列表。
SEQ ID NO:1是编码NtbZIP1a的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是NtbZIP1a的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是编码NtbZIP1b的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是NtbZIP1b的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是NtbZIP2a的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是NtbZIP2b的氨基酸序列。
附图说明
当考虑以下详细描述时，会更好地理解当前公开的主题，并且会清楚除上文所示那些以外的特征、方面和优点。这样的详细描述参考以下附图，其中：
图1示出说明8种不同烟草组织的转录物组数据的系统聚类分析(hierarchicalcluster analysis)的图。每种组织基于表达形成不同的簇。
图2示出说明烟草及其祖先中不同TF家族分布的图。
图3示出说明不同组织中烟碱生物合成途径中的TF基因和结构基因的共表达分析的图。基于它们的表达将TF和结构基因分为8种不同模块(颜色编码的旁边的条(color-coded side bar))。黑色模块含有大部分结构基因烟碱生物合成途径。YF，幼花；MF，成熟花；YL，幼叶；ML，成熟叶；SL，衰老叶。
图4示出说明NtbZIP1 a/b和NND在不同烟草组织中的表达的图。
图5示出说明烟草中的bZIP家族的图像。NtbZIP1a和NtbZIP1b由*表示。
图6示出比较NtbZIP1a和1b的核苷酸和氨基酸序列的图像。
图7示出说明烟草叶中NtbZIP1a的瞬时过量表达诱导CYP82E4v1、CYP82E5v2和CYP82E10表达的图。
图8示出说明NtbZIP1a显著激活烟草细胞中的CYP82E4v1和CYP82E10启动子的图。
图9示出说明NtbZIP1a通过结合至A/G盒来激活烟草细胞中的CYP82E4v1启动子的图。
图10示出说明NtbZIP1a和b显著激活烟草细胞中的CYP82E4v1启动子的图。
图11示出说明烟草植物的打顶下调NtbZIP和NND表达的图。
图12A-C示出说明烟草植物中NtbZIP1a的过量表达的图和图像。(A)对照和3个转基因品系(品系#4、5和9)的基因组DNA PCR和cDNA PCR分别证实抗生素选择标记新霉素磷酸转移酶II(npt II；Kan)的整合和表达。(B)定量实时(qRT-PCR)分析显示NtbZIP1和E4在对照(EV)和转基因品系(品系#4、5和9)中的相对表达。(C)代谢分析显示对照和转基因品系(T0或第一代转基因植物)中烟碱转化为去甲烟碱。
图13示出说明NtbZIP2a和2b的氨基酸序列比对的图像。
图14示出说明NtbZIP2a和b在烟草组织中具有相似表达模式的图。
图15示出说明NtbZIP2与NtbZIP1协同作用以激活烟草细胞中的E4启动子的图。
图16A-B示出使用酵母双杂交测定说明NtbZIP1和NtbZIP2的蛋白-蛋白相互作用的图像。(A)酵母双杂交测定显示NtbZIP1和NtbZIP2之间的蛋白-蛋白相互作用。在缺少亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤(-leu-trp-his-ade)的合成缺陷型(SD)培养基上的菌落生长表明蛋白(bZIP)之间的相互作用。(B)NtbZIP1和NtbZIP2的示意图。bZIP结构域由“阴影”矩形表示。数字表示氨基酸。
图17包括RNAi载体的示意图，所述RNAi载体包含具有内含子的正义和反义方向的一部分烟草bZIP1。部分cDNA和内含子的在CaMV 35S启动子和rbcS终止子的控制下表达。RNAi引物(由箭头指示)设计为扩增保守结构域之外的序列。
图18A-B说明(A)与EV对照相比，在RNAi品系中NtbZIP1a和NtbZIP1b的表达降低70-80％，E4的表达降低80-90％。(B)与EV植物相比，在RNAi品系中烟碱向去甲烟碱转化下降约50％。
虽然本公开易于出现各种修饰和替代形式，但是其具体实施方案已通过示例的方式在附图中显示，并且在下文中详细描述。然而，应当理解，具体实施方案的描述不是为了限制本公开以涵盖落在所附权利要求定义的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实施或测试，包括下文描述的方法和材料。
遵循长期的专利法常规，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”在本申请包括权利要求中使用时是指“一个(种)或多个(种)”。因此，例如，对“一个细胞”的引用包括许多细胞，等等。
术语“包含”、“包括”和“具有”旨在包括，并且表示可以有除所列要素以外的额外要素。
除非另有说明，本说明书和权利要求中使用的所有表示成分、特性如反应条件等的量的数字应当理解为在所有情况下受到术语“约”的修饰。因此，除非有相反的说明，本说明书和权利要求中所示的数值参数为近似值，其可以根据当前公开的主题寻求获得的期望特性而变化。
如本文所用，当提及质量、重量、时间、体积、浓度、百分比等的值或量时，术语“约”意在涵盖在一些实施方案中±50％，在一些实施方案中±40％，在一些实施方案中±30％，在一些实施方案中±20％，在一些实施方案中±10％，在一些实施方案中±5％，在一些实施方案中±1％，在一些实施方案中±0.5％，在一些实施方案中由指定量±0.1％，以及在一些实施方案中由指定量±0.01％的变化(当这样的变化适合进行所公开的方法)。
如本文所用，范围可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。还应当理解本文公开了许多值，并且除值本身以外，每个值在本文中还公开为“约”该特定值。例如，如果公开值“10”，则还公开“约10”。还应当理解还公开两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开10和15，则还公开11、12、13和14。
本文参考序列“相同性”描述了某些序列。序列相同性比较可以通过肉眼进行，或者更通常地，借助容易获得的序列比较程序进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％相同性。
可以在连续序列上计算％相同性，即一个序列与另一个序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸直接与另一个序列中的相应氨基酸进行比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。通常，这类无空位比对仅在相对较短数量的残基上进行。
虽然这是一种非常简单且一贯的方法，但是它没有考虑到，例如，在其他方面相同的序列对中，一个插入或缺失会导致随后的氨基酸残基错位，因此在进行全局比对时可能导致％相同性大幅降低。因此，大多数序列比较方法设计为产生最佳比对，其考虑可能的插入和缺失而不对整体相同性评分过度罚分。这是通过在序列比对中插入“空位”以尝试最大化局部相同性来实现的。
但是，这些更复杂的方法为比对中出现的每个空位分配“空位罚分”，以便对于相同数量的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对-反映两个比较的序列之间更高的相关性-会获得比具有许多空位的序列比对更高的评分。通常使用“仿射空位成本”，其对空位的存在收取相对高的成本，并且对空位中的每个后续残基收取较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有较少空位的优化比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。但是，当使用这类软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此最大％相同性的计算首先需要产生最佳比对，同时考虑空位罚分。用于进行这样的比对的合适的计算机程序是Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于例如BLAST包(参见Ausubel et al 1999Short Protocols inMolecular Biology,4th Ed-Chapter 18)、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul et al 1990J.Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel et al 1999,pages 7-58to 7-60)。
虽然最终的％相同性可以根据相同性来测量，但是比对过程本身通常不是基于全有或全无的对比较。取而代之的是，一般使用缩放的相似性评分矩阵，其基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配分数。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM6矩阵-BLAST套件程序的默认矩阵。Vector NTI程序一般使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供)(进一步详情参见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI包的默认值。
或者，可以基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988),Gene 73(1),237-244)的算法，使用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算百分比相同性。
软件已产生最佳比对后，就可以计算％序列相同性。软件通常将此作为序列比较的一部分并产生数值结果。
如果在确定序列相同性时使用空位罚分，以下参数可以用于成对比对：
| 对于BLAST | |
| GAP OPEN | 0 |
| GAP EXTENSION | 0 |
| 对于CLUSTAL | DNA | 蛋白质 | |
| WORD SIZE | 2 | 1 | K triple |
| GAP PENALTY | 15 | 10 | |
| GAP EXTENSION | 6.66 | 0.1 |
在一实施方案中，BLAST可以与上文定义的空位罚分和空位扩展集一起使用。
在一实施方案中，CLUSTAL可以与上文定义的空位罚分和空位扩展集一起使用。
在一些实施方案中，用于BLAST或CLUSTAL比对的空位罚分可能与上文详述的那些不同。技术人员会理解用于进行BLAST和CLUSTAL比对的标准参数可以周期性地改变，并且能够基于当时为BLAST或CLUSTAL比对算法详述的标准参数选择适当的参数。
合适地，在至少20个连续核苷酸/氨基酸，优选在至少30个连续核苷酸/氨基酸，优选在至少40个连续核苷酸/氨基酸，优选在至少50个连续核苷酸/氨基酸，优选在至少60个连续核苷酸/氨基酸，优选在至少100个连续核苷酸/氨基酸，确定关于核苷酸序列或氨基酸序列的相同性程度。
合适地，可以在整个序列上确定关于核苷酸序列或氨基酸序列的相同性程度。
序列还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并导致功能等同的物质。可以基于残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留该物质的次级结合活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以例如根据下表进行保守取代。在第二列中的相同区块中并且优选在第三列中的相同行中的氨基酸可以互相取代：
本发明还涵盖可能发生的同源取代(取代和置换在本文中均用来表示现有氨基酸残基与替代残基的互换)，即同类取代如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。非同源取代也可能发生，即从一类残基至另一类，或者涉及包括非天然氨基酸如鸟氨酸(以下称作Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称作B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称作O)、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。
还可以由非天然氨基酸进行置换，包括；α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯丙氨酸*、p-Br-苯丙氨酸*、p-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、p-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。对于上述讨论的目的(涉及同源或非同源取代)，符号*用于表示衍生物的疏水性质，而#已用于表示衍生物的亲水性质，#*表示两亲特征。
变体氨基酸序列可以包括合适的间隔基团，可以将所述间隔基团插入序列的任何任何两个氨基酸残基之间，除了氨基酸间隔如甘氨酸或β-丙氨酸之外，还包括烷基如甲基、乙基或丙基。本领域技术人员会充分理解变异的另一种形式，包括拟肽形式的一个或多个氨基酸残基的存在。为了避免疑问，“拟肽形式”用来指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基在残基的氮原子而不是α-碳上。制备拟肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ etal.,PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995)13(4),132-134。
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或者能够与本发明的序列或与其互补的序列杂交的序列。
如本文所用的术语“杂交”应当包括“核酸链通过碱基配对与互补链接合(join)的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明还涉及可以与本发明的序列(包括本文提出的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列。
优选地，杂交是在严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015MNa3citrate pH 7.0})下确定的。
更优选地，杂交是在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015M Na3citrate pH 7.0})下确定的。
术语“商业上可取的性状”包括性状如产量、质量(例如叶质量、适当烤制的叶质量)、非生物(例如干旱)胁迫耐受性、除草剂耐受性和/或生物(例如昆虫、细菌或真菌)胁迫耐受性和/或疾病耐受性。
叶质量可以基于烤制的叶的颜色、质地和香味来测量，例如根据美国农业部(USDA)等级和标准。
基于以下因素评价烟草等级，所述因素包括但不限于叶柄位置、叶大小、叶色、叶均匀性和完整性、成熟性、质地、弹性、光泽(与叶着色的强度和深度以及光泽度相关)、吸湿性(烟叶吸收和保持环境水分的能力)以及绿色的细微差别或外表。
叶等级可以使用本领域已知的标准方法来确定，例如，使用
美国农业部公布的官方标准等级
农业部(7U.S.C.§511)。参见，例如，白肋烟的官方标准等级
烟草(美国31型和外国93型)，1990年11年5日生效(55F.R.40645)；
烤烟(美国11、12、13、14型和外国92型)的官方标准等级，1989年3月27日生效(54F.R.7925)；宾夕法尼亚州SeedleafTobacco(美国41型)的官方标准等级，1965年1月8日生效(29F.R.16854)；俄亥俄州雪茄叶烟草(美国42、43和44型)的官方标准等级，1963年12月8日生效(28F.R.11719和28F.R.11926)；威斯康辛州Cigar-Binder烟草(美国54和55型)的官方标准等级，1969年11月20日生效(34F.R.17061)；威斯康辛州Cigar-Binder烟草(美国54和55型)的官方标准等级，1969年11月20日生效(34F.R.17061)；乔治亚州和佛罗里达州ShadeGrown Cigar-Wrapper烟草(美国62型)的官方标准等级，1971年4月生效。USDA等级指数值可以根据行业认可的等级指数确定。参见，例如，Bowman et al,Tobacco Science,32:39-40(1988)；Legacy Tobacco Document Library(Bates Document#523267826-523267833,July 1,1988,Memorandum on the Proposed Burley Tobacco Grade Index)；和Miller et al.,1990,Tobacco Intern.,192:55-57(所有前述参考文献均整体并入本文)。
在一方面，USDA等级指数是收到的联邦等级的0-100数字表示，是所有柄位置的加权平均值。较高的等级指数表示较高的质量。或者，叶等级可以通过高光谱成像确定。参见例如，WO 2011/027315(其援引加入本文)。
在一实施方案中，本发明的烟草植物提供商业上可接受等级的烟草。
合适地，本发明的烟草植物提供商业上可接受等级的烤烟。
在一实施方案中，当在相似生长条件下生长时，本发明的烟草植物能够产生的叶的USDA等级指数值是可比的植物叶的USDA等级指数值的至少约70％。合适地，当在相似生长条件下生长时，本文公开的烟草植物能够产生的叶的USDA等级指数值是对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％。合适地，本文公开的烟草植物能够产生的叶的USDA等级指数值是可比植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％。
在一方面，本发明的烟草植物能够产生具有至少50的USDA等级指数值的叶。合适地，本文公开的烟草植物能够产生具有55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高以及95或更高的USDA等级指数值的叶。
除非另有说明，如本文所用，烟草产量是指按照标准农艺和烤制实践在标准田间条件下基于每英亩烤制烟叶的重量计算的烤制叶产量。
在一方面，当在相似田间条件下生长时，本发明的烟草植物具有的产量是可比的植物产量的50％-150％、55％-145％、60％-140％、65％-135％、70％-130％、75％-125％、80％-120％、85％-115％、90％-110％、95％-105％、50％-100％、55％-100％、60％-100％、65％-100％、70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％、90％-100％、95％-100％、100％-150％、105％-150％、110％-150％、115％-150％、120％-150％、125％-150％、130％-150％、135％-150％、140％-150％或145％-150％。
在另一方面，当在相似田间条件下生长时，本发明的烟草植物的产量是可比植物的产量的大约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0倍。
在另一方面，当在相似田间条件下生长时，本发明的烟草植物的产量与烤制的可比植物的产量相当。
在一方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200-3500、1300-3400、1400-3300、1500-3200、1600-3100、1700-3000、1800-2900、1900-2800、2000-2700、2100-2600、2200-2500和2300-2400磅/英亩。
在另一方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200-3500、1300-3500、1400-3500、1500-3500、1600-3500、1700-3500、1800-3500、1900-3500、2000-3500、2100-3500、2200-3500、2300-3500、2400-3500、2500-3500、2600-3500、2700-3500、2800-3500、2900-3500、3000-3500和3100-3500磅/英亩。
在另一方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200-3500、1200-3400、1200-3300、1200-3200、1200-3100、1200-3000、1200-2900、1200-2800、1200-2700、1200-2600、1200-2500、1200-2400、1200-2300、1200-2200、1200-2100、1200-2000、1200-1900、1200-1800、1200-1700、1200-1600、1200-1500和1200-1400磅/英亩。
如本文所用的术语“烟草植物”是指用于生产烟草工业产品的烟草属(Nicotiana)植物。合适的烟草植物的非限制性实例包括烟草(N.tabacum)和黄花烟草(N.rustica)(例如，LA B21、LN KY171、Tl 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。
因此，在一实施方案中烟草植物包括皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)。
烟草材料可以源自烟草物种的品种，通常称作白肋烟品种、烟熏或亮色品种、深色品种以及东方/土耳其品种。在一些实施方案中，烟草材料源自白肋烟、弗吉尼亚、烟熏烤制、空气烤制、火烤制、东方或深色烟草植物。烟草植物可以选自马里兰烟草、稀有烟草、特种烟草、膨胀烟草等。
本文还考虑使用烟草栽培种和优良烟草栽培种。因此用于本文的烟草植物可以是烟草品种或优良烟草栽培种。
特别有用的烟草品种包括白肋烟型、深色型、烟熏烤制型和东方型烟草。
例如，烟草植物可以选自以下品种中的一种或多种：烟草AA 37-1，烟草B13P，烟草Xanthi(Mitchell-Mor)，烟草KT D#3杂种107，烟草Bel-W3，烟草79-615，烟草SamsunHolmes NN，来自杂交烟草BU21 x烟草Hoja Parado的F4，品系97，烟草KTRDC#2杂种49，烟草KTRDC#4杂种1 10，烟草白肋烟21，烟草PM016，烟草KTRDC#5KY 160SI，烟草KTRDC#7FCA，烟草KTRDC#6TN 86SI，烟草PM021，烟草K 149，烟草K 326，烟草K 346，烟草K 358，烟草K394，烟草K 399，烟草K 730，烟草KY 10，烟草KY 14，烟草KY 160，烟草KY 17，烟草KY 8959，烟草KY 9，烟草KY 907，烟草MD 609，烟草McNair 373，烟草NC 2000，烟草PG 01，烟草PG 04，烟草P01，烟草P02，烟草P03，烟草RG 1 1，烟草RG 17，烟草RG 8，烟草Speight G-28，烟草TN86，烟草TN 90，烟草VA 509，烟草AS44,烟草Banket A1，烟草Basma Drama B84/31，烟草Basma I Zichna ZP4/B，烟草Basma Xanthi BX 2A，烟草Batek，烟草Besuki Jember，烟草C104，烟草Coker 319，烟草Coker 347，烟草Criollo Misionero，烟草PM092，烟草Delcrest，烟草Djebel 81，烟草DVH 405，烟草Galpao Comum，烟草HB04P，烟草HicksBroadleaf，烟草Kabakulak Elassona，烟草PM102，烟草Kutsage E1，烟草KY 14xL8，烟草KY171，烟草LA BU 21，烟草McNair 944，烟草NC 2326，烟草NC 71，烟草NC 297，烟草NC 3，烟草PVH 03，烟草PVH 09，烟草PVH 19，烟草PVH 21 10，烟草红俄罗斯，烟草Samsun，烟草Saplak，烟草Simmaba，烟草Talgar 28，烟草PM132，烟草Wislica，烟草Yayaldag，烟草NC 4，烟草TR Madole，烟草Prilep HC-72，烟草Prilep P23，烟草Prilep PB 156/1，烟草PrilepP12-2/1，烟草Yaka JK-48，烟草Yaka JB 125/3，烟草ΤI-1068，烟草KDH-960，烟草TI-1070，烟草TW136，烟草PM204，烟草PM205，烟草Basma，烟草TKF 4028，烟草L8，烟草TKF2002，烟草TN90，烟草GR141，烟草Basma xanthi，烟草GR149，烟草GR153以及烟草PetitHavana。
品种或栽培种的非限制实例为：BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CD263、DF91 1、DT 538LC Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB04P、HB 04P LC、HB3307PLC、杂种403LC、杂种404LC、杂种501LC、K 149、K 326、K 346、K358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302LC、PD7309LC、PD 7312LC'Periq'e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、Tl 1406、Tl1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC 2号杂种49、白肋烟21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、P01、P02、P03、RG 1 1、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、BasmaXanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 21 10、红俄罗斯、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、PrilepP12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。即使在本文中没有具体标识，也考虑上述的低转换亚变种(low converter subvariety)。
烟草植物可以是例如白肋烟型烟草植物，合适地是白肋烟PH2517。
植物繁殖材料可以例如可获得自本发明的烟草植物。
如本文所用的“植物繁殖材料”是指取自植物的任何植物物质，可以从其产生其他植物。合适地，植物繁殖材料可以选自种子、植物愈伤组织和植物丛。
合适地，植物繁殖材料可以是种子。合适地，植物繁殖材料可以是植物愈伤组织。合适地，植物繁殖材料可以是植物丛。
细胞(例如烟草细胞)、烟草植物和/或植物增殖材料可以例如通过根据本发明的方法可获得(例如获得)。
如本文所用的术语“加工的烟叶”是指已经历本领域对烟草进行的一个或多个加工步骤的烟叶。“加工的烟叶”不包含或基本上不包含活细胞。
术语“活细胞”是指能够生长和/或具有代谢活性的细胞。因此，如果说细胞不是活的，也称作“非存活的”，则细胞不表现出活细胞的特征。
术语“基本上没有活细胞”表示少于总细胞的约5％是活的。优选地，总细胞的少于约3％，更优选少于约1％，甚至更优选少于约0.1是活的。
在一实施方案中，加工的烟叶可以通过以下一种或多种方式加工：烤制、发酵和/或巴氏杀菌。
如本文所用的“再造”也可以称作重构、再循环或均质化的薄片烟草，并且是指加工后从烟叶的残余部分产生的烟草材料。再造烟草允许产生一致的、高质量混合物，并且允许调整各个组分的比例。
再造烟草可以是纳米纤维重构(纳米纤维可以以固体或液体形式提取)、造纸重构(其使用茎、碎屑和中脉等作为原料)或浆型重构(其使用细粉和烟梗和混合物，研磨成粉末，与水和蔬菜粘合剂混合。通过提取水，可溶性残留物形成薄片。)
如本文所用，“烟草工业产品”旨在包括可燃性生烟物品如香烟，小雪茄，雪茄，用于烟斗或自己卷烟的烟草，(无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造烟草、烟草替代品或其他可吸烟材料)，不可燃气溶胶供应系统如从基材材料释放化合物而不燃烧的加热产品，如电子烟，烟草加热产品，以及从基材材料的组合产生气溶胶的混合系统，例如包含液体或凝胶或固体基材的混合系统，以及这些气溶胶供应系统内使用的可气雾化基材材料；以及无气溶胶递送物品如锭剂、口香糖、贴剂、包含可呼吸粉末的物品和无烟烟草工业产品如湿鼻烟和鼻烟，这些无气溶胶递送物品可以递送或可以不递送烟碱。
本文在烟草植物的上下文中使用的术语“其部分”是指烟草植物的部分。合适地，“其部分”可以是烟草植物的叶、根或茎或者花。合适地，“其部分”可以是烟草植物的叶、根或茎。优选地，“其部分”是烟草植物的叶。
如本文所用，术语“生烟物品”可以包括可生烟产品，如卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造烟草或烟草替代品。
如本文所用的术语“无烟烟草工业产品”是指不打算抽吸和/或经受燃烧的烟草工业产品。
无烟烟草工业产品(包括加热不燃烧材料)可以包含任何形式的烟草，包括干燥颗粒、碎片、颗粒、粉末或浆状物，沉积在其他成分上、混合在其他成分中、被其他成分包围或与其他成分结合，所述其他成分为任何形式，如薄片、薄膜、药片、泡沫或珠。
本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。
如本文所用，术语“蛋白”包括蛋白、多肽和肽。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的三字母代码如依照IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)定义的。还应当理解由于遗传密码的简并性，多肽可以由一种以上核苷酸序列编码。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,20ED.,John Wiley and Sons,New York(1994),和Hale&Marham,THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，分别地，任何核酸序列均按照5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列按照氨基至羧基方向从左至右书写。
如本文所用的方法或工艺步骤的所有组合可以以任何顺序进行，除非另有说明或在进行所引用的组合的上下文中明确暗示相反。
发明详述
本文件陈述了当前公开的主题的一个或多个实施方案的细节。在研究本文件中提供的信息之后，本领域普通技术人员会清楚对本文件中描述的实施方案和其他实施方案的修改。本文件中提供的信息，特别是描述的示例性实施方案的具体细节，主要是为了清楚理解而提供的，不应由此理解不必要的限制。在冲突的情况下，以本文件的说明书(包括定义)为准。
当前公开的主题涉及用于调节烟碱向去甲烟碱的转化和/或调节烟草特异性(TSNA)前体的水平的物品和方法。在一些实施方案中，所述物品包括一种或多种转录因子(TF)抑制剂。在一实施方案中，例如，所述物品包括一种或多种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子抑制剂。在另一实施方案中，bZIP型转录因子源自烟草。在另一实施方案中，在本发明人在烟草中鉴定的133种bZIP型转录因子中，将其分为10个亚组：A、B、C、D、E,、F、G、H和S，合适的bZIP型转录因子包括亚组S中的27种bZIP中的至少一种、亚组C中的6种bZIP中的至少一种、其他bZIP 63同系物或它们的组合。在某些实施方案中，S亚组bZIP转录因子包括但不限于NtbZIP1a(SEQ ID NO:1和2)、NtbZIP1b(SEQ ID NO:3和4)或其组合；和/或C亚组bZIP转录因子包括但不限于NtbZIP2a(SEQ ID NO:5)、NtbZIP2b(SEQ ID NO:6)或其组合。
一种或多种转录因子抑制剂包括但不限于反义寡核苷酸、miRNA、siRNA、锁核酸(LNA)核苷酸或其组合。在一些实施方案中，抑制剂提供RNAi介导的bZIP型转录因子的敲低/沉默。如本领域技术人员会理解的，转录因子抑制剂的特定序列/结构是基于特定转录因子的序列。因此，如本领域技术人员还会理解的，反义寡核苷酸和/或LNA可以使用本文提供的bZIP型转录因子序列通过任何合适的方法形成。例如，在一实施方案中，抑制剂包括与互补的bZIP型转录因子具有100％序列同源性的反义寡核苷酸。在另一实施方案中，转录因子抑制剂包括与NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a和/或NtbZIP2b互补的bZIP型转录因子具有100％序列同源性的反义寡核苷酸。在这类实施方案中，转录因子抑制剂提供RNAi介导的烟草中NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a和/或NtbZIP2b表达的敲低/沉默。
在一些实施方案中，本文还提供一种调节烟草植物或其他含烟碱生物体中烟碱向去甲烟碱的转化的方法。在一实施方案中，所述方法包括向含有烟碱的生物体施用一种或多种本文公开的bZIP抑制剂。这些一种或多种bZIP抑制剂的施用减少或消除烟碱向去甲烟碱的转化。可以针对单一类型的bZIP转录因子或针对bZIP转录因子的组合施用一种或多种抑制剂。例如，在一实施方案中，所述方法包括施用一种或多种S bZIP型转录因子或C bZIP型转录因子的抑制剂。在另一实施方案中，所述方法包括施用一种或多种S bZIP型转录因子的抑制剂以及一种或多种C bZIP型转录因子的转录因子。在另一实施方案中，所述方法包括向生物体施用一种或多种NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a和/或NtbZIP2b的抑制剂。在某些实施方案中，抑制S bZIP型转录因子和C bZIP型转录因子对减少或消除烟碱转化为去甲烟碱具有协同作用。
本文公开的方法包括施用单一类型的抑制剂或任何合适的抑制剂组合，对于每种被抑制的bZIP转录因子，其可以相同或不同。例如，在一实施方案中，所述方法包括施用NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a和/或NtbZIP2b的反义寡核苷酸。在另一实施方案中，所述方法包括施用一种bZIP转录因子如NtbZIP1a的反义寡核苷酸和另一种bZIP转录因子如NtbZIP1b的LNA核苷酸。如本领域技术人员会理解的，尽管上文关于bZIP转录因子和转录因子抑制剂的某些组合进行了讨论，但是本公开不限于此，并且可以包括TF和TF抑制剂的任何其他合适的组合。
额外地或替代地，所述方法可以包括bZIP型转录因子敲除和/或烟碱N-脱甲基酶(NND)启动子上bZIP型转录因子结合位点的突变。例如，在一实施方案中，所述方法包括编辑植物基因组以敲除NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a和/或NtbZIP2b。基因组编辑可以通过任何合适的过程进行，例如但不限于CRISPR/Cas9介导的基因组编辑。在另一实施方案中，所述方法包括通过位点定向诱变将称为A/G盒(TACGTC)的E4启动子中的bZIP结合元件突变为TGCGTC。尽管上文关于E4启动子中的特定突变进行了讨论，如本领域技术人员会理解的，本公开不限于此，并且包括E4、E5和/或E10启动子中的任何其他突变以减少或消除bZIP型转录因子对各自NND的激活。
本文公开的TF抑制剂的施用、TF敲除和/或结合位点突变减少或消除bZIP型转录因子对NND的激活，这减少或消除烟碱向去甲烟碱的转化。与包括E4、E5和E10突变体的现有物品相反，本文公开的物品控制E4、E5和E10的表达以减少或消除烟碱向去甲烟碱的转化。通过减少或消除烟碱向去甲烟碱的转化，本文公开的物品和方法减少通常包含致癌去甲烟碱的产品(例如但不限于烟草产品)的有害影响。
当前公开的主题包括减少烟碱向去甲烟碱转化的方法和/或降低至少一种烟草特异性(TSNA)前体水平的方法，所述方法包括降低烟草植物、烟草植物的一部分、烟草植物种子或另一包含烟碱的生物体中至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达。
当前公开的主题进一步包括降低烟草植物、烟草植物的一部分、烟草植物细胞、烟草植物种子或另一包含烟碱的生物体中至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达的用途，在烟草植物、烟草植物的一部分、烟草植物种子或包含烟碱的生物体中用于减少烟碱向去甲烟碱的转化和/或用于降低至少一种烟草特异性(TSNA)前体的水平。
在本文描述的方法和用途的实施方案中，至少一种bZIP转录因子可以选自C组bZIP转录因子、S组bZIP转录因子及其组合。在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子选自NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a、NtbZIP2b及其组合。
在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与选自由SEQ ID NO:1编码的氨基酸；SEQ ID NO:2的氨基酸；SEQ ID NO:3编码的氨基酸；SEQ ID NO:4的氨基酸；SEQID NO:5的氨基酸；以及SEQ ID NO:6的氨基酸组成的组的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP1a和NtbZIP1b。在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP2a和NtbZIP2b。在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a和NtbZIP2b。
在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与选自SEQ ID NO:1编码的氨基酸和SEQ ID NO:2的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；以及与选自SEQ ID NO:3编码的氨基酸和SEQ ID NO:4的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；以及与SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
在一些实施方案中，所述至少一种bZIP转录因子包含与选自SEQ ID NO:1编码的氨基酸和SEQ ID NO:2的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；与选自SEQ ID NO:3编码的氨基酸和SEQ ID NO:4的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；与SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；以及与SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
在本文描述的方法和用途的实施方案中，降低至少一种bZIP型转录因子的活性和/或表达可以包括突变bZIP型转录因子，如在bZIP型转录因子的结合位点中提供突变；使用bZIP型转录因子抑制剂；或者使用基因沉默技术，如RNAi。
在一些实施方案中，bZIP转录因子抑制剂选自反义寡核苷酸、miRNA、siRNA、锁核酸(LNA)核苷酸及其组合。
在一些实施方案中，突变bZIP型转录因子包括突变烟碱N-脱甲基酶(NND)启动子上的结合位点。在一些实施方案中，所述NND选自CYP82E4v1、CYP82E5v2和CYP82E10。在一些实施方案中，所述NND是CYP82E4v1，并且其中CYP82E4v1启动子上的bZIP结合位点是具有TACGTC的预突变序列的A/G盒。在一些实施方案中，突变的结合位点具有序列TGCGTC。在一些实施方案中，突变的结合位点是通过位点定向诱变形成的。
在一些实施方案中，突变bZIP型转录因子包括突变植物基因组以敲除至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子。
本发明进一步包括如本文描述的核酸分子和氨基酸分子。在一些实施方案中，分离的核酸分子可以包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列；编码与SEQ ID NO:2、4、5或6的序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的序列的核酸序列；或者其组合。
在一些实施方案中，所述氨基酸分子可以包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列编码的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列；与SEQID NO:2、4、5或6的序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的序列；或者它们的组合。
在一些实施方案中，所述分子包含或编码具有至少一个突变的bZIP型转录因子。在一些实施方案中，所述突变在烟碱N-脱甲基酶(NND)启动子上的结合位点中。在一些实施方案中，所述NND选自CYP82E4v1、CYP82E5v2和CYP82E10。在一些实施方案中，所述NND是CYP82E4v1，并且其中CYP82E4v1启动子上的bZIP结合位点是具有TACGTC的预突变序列的A/G盒。在一些实施方案中，突变的结合位点具有序列TGCGTC。
当前公开的主题进一步包括一种构建体或载体，其包含如本文公开的核酸分子。
当前公开的主题进一步包括烟草植物细胞，其可以包括包含如本文公开的核酸分子的外源基因，可以包括如本文公开的构建体或载体，可以通过如本文公开的方式获得或可获得，和/或可以通过突变获得以降低至少一种bZIP型转录因子的活性或表达或者敲除至少一种bZIP型转录因子。
当前公开的主题进一步包括如本文公开的烟草细胞在生产烟草工业产品中的用途。
当前公开的主题进一步包括烟草细胞、细胞培养物或植物，其包含如本文公开的植物细胞，其已被修饰以与未修饰的培养物或植物相比，实现烟碱向去甲烟碱的转化减少和/或所述培养物或植物的至少一种烟草特异性(TSNA)前体的水平降低；或者其包括如本文公开的构建体或载体。
合适地，根据本发明的烟草植物可以具有例如与未修饰的烟草植物相比含量减少的烟草特异性亚硝胺(TSNA)前体。合适地，所述烟草植物细胞可以是突变的、非天然存在的或转基因的植物。所述植物可以包含一个或多个突变，其降低至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达。
在一实施方案中，根据本发明的烟草植物包含本发明的烟草细胞。
在另一实施方案中，植物繁殖材料可以是从本发明的烟草植物可获得(例如获得)的。
在一实施方案中，提供如本文描述的烟草植物在培育烟草植物中的用途。
在另一实施方案中，本发明还提供前述实施方案的烟草植物在生产烟草工业产品中的用途。
在另一实施方案中，提供本发明的烟草植物在种植作物中的用途。
在一实施方案中，提供如前述实施方案中提供的细胞在生产烟草工业产品中的用途。
在一实施方案中，本发明提供一种细胞(例如烟草植物细胞)，其具有降低的至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达。合适地，所述细胞可以是突变的、非天然存在的或转基因的细胞。所述细胞可以包含一个或多个突变，其降低至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达。
在一实施方案中，本发明提供细胞培养物(例如体外培养物)。合适地，所述细胞培养物可以包含许多根据本发明的细胞。
烟草细胞培养物可以是细胞悬浮培养物。可以将这些体外培养的细胞掺入烟草工业产品中，例如作为传统烟草颗粒、碎片、细切或长切烟草叶片的替代品，作为添加剂成分或者既作为替代品又作为添加剂。合适地，所述细胞培养物可以产生烟碱。
在一实施方案中，提供根据本发明的细胞培养物，例如收获和/或加工的细胞培养物在生产烟草工业产品中的用途。
可以将收获自体外培养物的细胞干燥，例如冷冻干燥，例如产生粉末。
在一实施方案中，所述细胞培养物是烟草细胞培养物。
技术人员会知道用于建立烟草细胞的体外培养物的已知方法。仅为了举例，可以使用以下方法：从感兴趣的烟草植物收集种子并对它们的外部进行消毒以消除不需要的生物体，种植所述种子以生长感兴趣的烟草植物，从烟草植物(例如，从烟草茎)移出组织用作外植体，从烟草外植体建立愈伤组织培养物，从愈伤组织培养物建立细胞悬浮培养物，并且收获培养材料(例如包括烟草细胞)以产生烟草细胞培养物。
可以通过各种方法收获烟草细胞，包括过滤，例如真空过滤。可以通过添加水在滤器中洗涤样品，并且通过过滤去除剩余的水，例如真空过滤。
可以将收获的烟草细胞进一步加工，例如干燥，如风干和/或冷冻干燥。可以将收获的烟草细胞培养物或干燥的收获的烟草细胞培养物掺入根据本发明的烟草工业产品中。
当前公开的主题进一步包括可获得自根据权利要求34的植物或所述植物的部分的植物繁殖材料或植物提取物。在一些实施方案中，所述植物繁殖材料是植物种子。
当前公开的主题进一步包括如本文公开的烟草植物在培育烟草植物中的用途。
本发明还提供从根据本发明的烟草可获得或获得的产品。
在一实施方案中，提供本发明的烟草植物在生产烟叶中的用途。
合适地，所述烟叶可以用于下游应用如加工。
因此，在一实施方案中，使用前述实施方案可以提供加工的烟叶。合适地，烟叶可以经受烤制、发酵、巴氏杀菌或其组合。在另一实施方案中，可以将烟叶切割。在一些实施方案中，烟叶可以在经受烤制、发酵、巴氏杀菌或其组合之前或之后进行切割。
当前公开的主题包括如本文公开的烟草植物在生产烟草工业产品中的用途。当前公开的主题进一步包括如本文公开的烟草植物在种植作物中的用途。当前公开的主题进一步包括如本文公开的烟草植物在生产加工的烟叶中的用途。在一些实施方案中，所述加工的烟叶是烤制烟叶。
在一实施方案中，本发明提供本发明的烟草植物的收获的叶。在另一实施方案中，收获的叶可以是从繁殖自本发明的繁殖材料的烟草植物可获得(例如获得)的。在另一实施方案中，提供可获得自本发明的方法或用途的收获的叶。合适地，所述收获的叶可以是切割的收获的叶。在一些实施方案中，所述收获的叶可以包含活烟草细胞。在其他实施方案中，所述收获的叶可以进行进一步加工。
还提供加工的烟叶。加工的烟叶可以从本发明的烟草植物获得。合适地，加工的烟叶可以从根据本发明的任何方法和/或用途获得的烟草植物获得。在另一实施方案中，加工的烟叶可以从繁殖自根据本发明的烟草植物繁殖材料的烟草植物获得。本发明的加工的烟叶可以通过加工本发明的收获的叶获得。
合适地，加工的烟叶可以通过烤制加工。烟叶可以通过本领域已知的任何方法进行烤制。在一实施方案中，烟叶可以通过选自以下的一种或多种烤制方法进行烤制：风干(air curing)、火烤(fire curing)、烟熏烤制(flue curing)和晒干(sun curing)。
合适地，烟叶可以风干。通常风干是通过将烟叶悬挂在通风良好的谷仓并使其干燥来实现的。这通常在4-8周的时间内进行。风干特别适合白肋烟。
合适地，烟叶可以火烤。火烤通常是通过将烟叶悬挂在大谷仓中实现的，在大谷仓中，使硬木的火保持在连续或间歇的低阴燃，并且通常需要三天到十周之间，这取决于过程和烟草。
在另一实施方案中，可以将烟叶烟熏烤制。烟熏烤制可以包括将烟叶串到烟草棒上，并且将它们悬挂在烤房的挂烟杆(tier-pole)上。烤房通常具有从外部供给的火箱延伸的烟道。通常这导致烟草在没有暴露于烟雾的情况下被热烤制。通常在烤制过程中温度会缓慢升高，整个过程大约需要1周。
合适地，烟叶可以晒干。这种方法通常包括将未覆盖的烟草暴露在阳光下。
合适地，加工的烟叶可以通过发酵加工。发酵可以以本领域已知的任何方式进行。通常在发酵过程中，将烟叶堆积成堆(大块)的烤烟，覆盖有例如麻布以保持水分。叶内剩余的水和烟草的重量组合产生使烟草成熟的自然热量。每天监测块体中心的温度。在一些方法中，每周打开整个块体。然后取出叶以摇晃并湿润，并且旋转块体，从而使里面的叶到外面，底部的叶放在块体的顶部。这确保整块的均匀发酵。叶上的额外水分，加上叶本身的实际旋转，产生热量，释放烟草的天然氨并减少烟碱，同时还加深颜色并改善烟草的香味。通常发酵过程持续长达6个月，这取决于烟草的种类、叶上的柄位置、厚度和叶的预期用途。
合适地，加工的烟叶可以通过巴氏杀菌加工。当烟叶会用来制造无烟烟草工业产品，最优选湿鼻烟时，巴氏杀菌可能是特别优选的。
烟叶巴氏杀菌可以通过本领域已知的任何方法进行。例如，巴氏杀菌可以如Foulds,L Ramstrom,M Burke,K Fagerstrom.Effect of smokeless tobacco(snus)onsmoking and public health in Sweden.Tobacco Control(2003)12:349–359中详述的那样进行，其教导援引加入本文。
在湿鼻烟的生产过程中，巴氏杀菌通过通过以下过程进行，其中将烟草用蒸汽热处理24–36小时(达到大约100℃的温度)。这导致几乎无菌的产品，并且不希望受理论束缚，其后果之一据信是限制进一步的TSNA形成。
在一实施方案中，巴氏杀菌可以是蒸汽巴氏杀菌。
在一些实施方案中，可以将加工的烟叶切割。加工的烟叶可以在加工之前或之后切割。合适地，加工的烟叶可以在加工之后切割。在一实施方案中，使用前述实施方案可以提供再造烟草。
本领域已知的任何方法可以用于制造再造烟草，例如参见CORESTA Congress,Sapporo,2012,Smoke Science/Product Technology Groups,SSPT 12(援引加入本文)。
在一些实施方案中，烟草植物、烟草植物的收获叶和/或加工的烟叶可以用来提取烟碱。可以使用本领域已知的任何方法实现烟碱的提取。例如，在US 2,162,738中教导了从烟草提取烟碱的方法，其援引加入本文。
在一方面，本发明提供由根据本发明的烟草植物或其部分制成的烤制烟草材料。
在另一方面，本发明提供一种烟草混合物，其包含由根据本发明的烟草植物或其部分、或者由根据本发明的烟草细胞培养物制成的烟草材料。在一方面，本发明提供包含根据本发明的烤制烟草材料的烟草混合物。
合适地，根据本发明的烟草混合物可以包含大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约10％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约20％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约30％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约40％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约50％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约60％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约70％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约80％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，烟草混合物可以包含大约90％来自根据本发明的烟草植物或其部分、或者来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。
在一方面，本发明的烟草混合产品包含至少约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或95干重％的由根据本发明的烟草植物或其部分、或者根据本发明的烟草细胞培养物烤制的烟草。
合适地，烤制烟草材料可以是风干的。合适地，烤制烟草材料可以是烟熏烤制的。合适地，烤制烟草材料可以是晒干的。合适地，烤制烟草材料可以是火烤的。
根据本发明的烟草工业产品或生烟物品可以包含根据本发明的烟草材料(例如烤制烟草材料或再造烟草材料)。
在另一方面，本发明提供一种烟草工业产品。在一实施方案中，根据本发明的烟草工业产品可以是混合烟草工业产品。合适地，烟草混合物可以包含根据本发明的烤制烟草材料。在一实施方案中，烟草工业产品可以由本发明的烟草植物或其部分制备。合适地，所述烟草植物或其部分可以繁殖自根据本发明的烟草植物繁殖材料。
在一实施方案中，烟草工业产品可以制备自(例如可以包含)本发明的烟草植物或其部分。
合适地，所述烟草植物或其部分可以繁殖自根据本发明的烟草植物繁殖材料。
在另一实施方案中，烟草工业产品可以制备自本发明的收获的叶。在另一实施方案中，烟草工业产品可以制备自本发明的加工烟叶。
合适地，烟草工业产品可以制备自通过烤制、发酵和/或巴氏杀菌的一种或多种加工的烟叶。
合适地，烟草工业产品可以包含切割的烟叶，任选地按照前述实施方案进行加工。
在另一实施方案中，烟草工业产品可以制备自根据本发明的烟草细胞培养物。
在另一实施方案中，烟草工业产品可以制备自(例如可以包含)根据本发明的烤制烟草材料。
在另一实施方案中，烟草工业产品可以制备自(例如可以包含)根据本发明的烟草混合物。
在一实施方案中，烟草工业产品可以是生烟物品。
在另一实施方案中，烟草工业产品可以是无烟烟草工业产品。
在一实施方案中，无烟烟草工业产品可以包括湿鼻烟、鼻烟、咀嚼烟草等。
在一实施方案中，烟草工业产品是可燃的生烟物品，选自香烟、小雪茄和雪茄。
在一实施方案中，烟草工业产品包含可燃生烟物品的一个或多个组件，如滤嘴、滤棒、滤棒段、烟草、烟支、烟支段、溢出物、添加剂释放组件如胶囊、线、珠、纸，如滤棒成型纸(plug wrap)、水松纸或香烟纸。
在一实施方案中，烟草工业产品是不可燃的气溶胶供应系统。
在一实施方案中，烟草工业产品包含不可燃的气溶胶供应系统的一个或多个组件，如加热器和可气雾化基材。
在一实施方案中，气溶胶供应系统是一种电子烟，也称作蒸汽电子烟(vaping)装置。
在一实施方案中，电子烟包含加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化的基材如液体或凝胶、外壳以及任选存在的烟嘴。
在一实施方案中，可气雾化的基材包含在基材容器中。在一实施方案中，基材容器与加热器组合或包含加热器。
在一实施方案中，烟草工业产品是一种加热产品，其通过加热而不是燃烧基材材料来释放一种或多种化合物。基材材料是可气雾化的材料，其可以是例如烟草或其他非烟草产品，其可以包含或不包含烟碱。在一实施方案中，加热产品是烟草加热产品。
在一实施方案中，加热产品是电子设备。
在一实施方案中，烟草加热产品包括加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化的基材如固体或凝胶材料。
在一实施方案中，加热产品是非电子物品。
在一实施方案中，加热产品包括可气雾化的基材如固体或凝胶材料以及热源，所述热源能够在没有任何电子手段的情况下向可气雾化的基材提供热能，例如通过燃烧燃烧材料如木炭。
在一实施方案中，加热产品还包括能够过滤加热可气雾化的基材所产生的气溶胶的滤器。
在一些实施方案中，可气雾化的基材材料可以包含蒸汽或气溶胶发生剂或湿润剂，如甘油、丙二醇、乙酸甘油酯或二甘醇。
在一实施方案中，烟草工业产品是一种混合系统，通过加热而不是燃烧基材材料的组合来产生气溶胶。基材材料可以包含例如固体、液体或凝胶，其可以包含或不包含烟碱。在一实施方案中，混合系统包括液体或凝胶基材以及固体基材。固体基材可以是例如烟草或其他非烟草产品，其可以包含或不包含烟碱。在一实施方案中，混合系统包括液体或凝胶基材以及烟草。
在另一实施方案中，烟草工业产品可以是烟草加热装置或混合装置或电子烟等。
通常在烟草加热装置或混合装置中，气溶胶是通过将热量从热源传递至物理分离的气溶胶形成基材或材料而产生的，所述基材或材料可以位于热源内、周围或下游。在吸烟过程中，挥发性化合物通过来自热源的热传递从气溶胶形成基材释放，并且夹带在通过生烟物品吸入的空气中。当释放的化合物冷却时，它们凝结形成使用者吸入的气溶胶。
用于消耗或吸食烟草加热装置的气溶胶产生物品和装置是本领域已知的。例如，它们可以包括电加热的气溶胶产生装置，其中通过将热量从气溶胶产生装置的一个或多个电加热元件传递至烟草加热装置的气溶胶形成基材来产生气溶胶。
合适地，烟草加热装置可以是气溶胶产生装置。优选地，烟草加热装置可以是加热不燃烧装置。加热不燃烧装置是本领域已知的，并且通过加热而不是燃烧烟草来释放化合物。合适的加热不燃烧装置的实例可以是WO2013/034459或GB2515502中教导的实例，其援引加入本文。
在一实施方案中，烟草加热装置的气溶胶形成基材可以是根据本发明的烟草工业产品。在一实施方案中，烟草加热装置可以是混合装置。
在另一实施方案中，提供至少一种编码具有至少一个突变的至少一种bZIP型转录因子的基因的核苷酸序列的用途，其中所述bZIP型转录因子的序列包括：由包含相对于SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的序列具有至少一个突变的核酸序列的核酸序列编码的序列；相对于SEQ ID NO:2、4、5或6的序列具有至少一个突变的序列；或者它们的组合，以便选择烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA前体含量减少的植物。
在一实施方案中，提供一种植物的突变体，其在至少一种bZIP转录因子中携带至少一个可遗传突变，所述突变由包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列具有至少一个突变的核酸序列的核酸序列编码；相对于SEQ ID NO:2、4、5或6的序列具有至少一个突变的序列；或者它们的组合；其中相对于不携带所述可遗传突变的可比植物，所述可遗传突变减少突变烟草植物中烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA前体的含量。
在另一实施方案中，提供携带根据本发明的可遗传突变的突变植物的后代或种子。
在另一实施方案中，提供从植物产生的收获叶、加工叶或烤制烟草材料，所述植物在至少一种bZIP转录因子中包含至少一个突变，所述突变由包含相对于SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的序列具有至少一个突变的核酸序列的核酸序列编码；相对于SEQ ID NO:2、4、5或6的序列具有至少一个突变的序列；或者它们的组合，并且其中相对于在所述bZIP转录因子中不携带所述突变的可比植物，所述植物的烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA前体的含量减少。
当前公开的主题通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明。以下实施例可以包括数据的汇编，这些数据代表在与当前公开的主题相关的开发和实验过程中的不同时间收集的数据。
实施例
实施例1
这个实施例描述了不同烟草组织的转录物组数据集的分析，包括叶(幼叶、成熟叶和衰老叶)、根、茎、花(幼花和成熟花)和蒴果以产生共表达网络。首先，进行系统聚类分析，其显示每个单独的组织类型表现出独特的表达模式(图1)。接下来，鉴定了烟草及其祖先中编码所有主要TF家族的基因。烟草基因组包含比其祖先更多的TF基因，并且属于MYB、AP2/ERF和bHLH家族的TF的数量显著高于其他家族(图2)。鉴于此，然后基于它们在不同组织中的表达模式将烟碱生物合成途径中的TF和结构基因分为8种不同的模块(颜色编码的旁边的条)(图3)。“黑色”模块特别令人感兴趣，因为在这个模块中发现了大部分烟碱生物合成基因以及许多TF基因。这些TF中的许多属于MYB、bHLH、bZIP和ERF家族。如以下实施例2-4中所讨论的，这些TF在烟草中烟碱生物合成中的作用是通过其分离和功能表征来确定的。
实施例2
这个实施例描述了来自烟草的两种bZIP型转录因子(图4)，其调节烟碱向去甲烟碱的转化，可以用于减少吸烟相关的致癌物、烟草特异性亚硝胺(TSNA)。
bZIP TF的特征在于保守的亮氨酸拉链基序，其介导用于DNA结合的二聚体形成。在植物中，bZIP TF调节包括病原体防御、光和胁迫信号传导、种子成熟和花发育在内的过程。许多bZIP因子，特别是烟草中的那些，没有很好地表征。通过共表达和聚类分析，本文鉴定了与E4、E5和E10共表达的两个bZIP TF基因。这些烟草bZIP TF被称为NtbZIP1a和NtbZIP1b。
NtbZIP1 a/b与CYP82E4v1相比表现出相似的表达模式，CYP82E4v1是参与烟碱向去甲烟碱转化的主要NND酶，并且在花和衰老的叶中高表达(图4)。如图5所示，在烟草中鉴定出133种bZIP，并且分为10个亚组：A、B、C、D、E、F、G、H、I和S，其中NtbZIP1 a/b属于S亚组。在玉米中，S组bZIP的表达由创伤、寒冷和干旱胁迫诱导。参考图6，还发现NtbZIP1a和b在核苷酸和氨基酸水平上超过97％相同。不希望受理论束缚，相信这两种同源bZIP源自烟草的两个祖先，美花烟草和N.tometosiformis。
在鉴定了两种bZIP TF之后，测试了NtbZIP1a的过量表达是否导致E4、5和10的上调。将NtbZIP1a克隆至pCAMBIA2300(二元载体)中，在CaMV 35S启动子和rbcS终止子的控制下。将二元载体(空对照和NtbZIP1a)转移到农杆菌(Agrobacterium)中，并且使用转化的农杆菌浸润烟草叶片。从农杆菌浸润的叶盘分离的总RNA用于cDNA合成，并且实时定量PCR(qRT-PCR)用来检测NtbZIP1a、NtbZIP1b、E4、5和10的转录水平。普遍表达的看家基因微管蛋白用作qRT-PCR的内部对照。结果表明，当NtbZIP1a瞬时高表达时，内源性NtbZIP1b、E4、5和10上调(约3-10倍)，表明NtbZIP1a诱导NtbZIP1b、E4、5和10的表达，因此可能是这些基因的转录激活物(图7)。
接下来，测试了NtbZIP1a是否可以结合至其潜在靶基因的启动子。分离E4、5和10的启动子(每个编码基因的5’非翻译区的大约1.0kb片段)，并且将单独的启动子融合至萤火虫萤光素酶报告基因。将NtbZIP1a基因克隆至pBlueScript(pBS)载体中，在CaMV35S启动子和rbcS终止子的控制下。将质粒电穿孔至烟草原生质体中。NtbZIP1a显著诱导E4和E10启动子控制的萤光素酶基因表达，但不诱导E5启动子，表明NtbZIP1a可以直接激活E4和E10，可能是通过结合至它们的启动子(图8)。NtbZIP1a看来不结合至用于激活实验的E5的1.0kb启动子区。但是，如上所述，NtbZIP1a的过量表达导致E5以及E4和10的上调。启动子激活实验表明NtbZIP1a与E5基因的两种可能的调控关系：(1)NtbZIP1a结合至1.0kb启动子片段之外的位点，或者(2)NtbZIP1a通过烟草中另一种未鉴定的激活物间接激活E5(例如，NtbZIP1a激活另一激活物，进而激活E5)。
为了支持NtbZIP1a直接结合至E4启动子以调节反式激活的可能性，通过位点定向诱变将称为A/G盒(TACGTC)的E4启动子中的bZIP结合元件突变为TGCGTC。将突变的启动子融合至如上所述的萤光素酶报告基因。然后如上所述，使用突变报告质粒和NtbZIP1a表达载体进行反式激活实验。结果表明NtbZIP1a不能激活突变启动子控制下的萤光素酶基因表达(图9)。这个实验证实E4启动子是通过A/G-box结合因子激活的，最有可能是NtbZIP1a。
参考图10，还使用NtbZIP1b表达载体和E4启动子-萤光素酶报告质粒进行反式激活实验，如对NtbZIP1a所述。NtbZIP1b也以与NtbZIP1a相似的水平激活E4启动子。
最后，因为已经确定烟草打顶(去除腋芽(axillary shoot))的农艺实践诱导烟碱产生，所以本发明人分析了来自打顶或未打顶的烟草植物的转录物组数据。更具体地，24小时后从对照(未打顶的)和打顶的植物收集叶样品。从未打顶和打顶的叶分离的RNA用于cDNA合成和qRT-PCR分析。结果显示，与未打顶的植物相比，打顶导致bZIP1 a/b以及E4、5和10的表达减少约70-90％，表明打顶负调节烟草中的bZIP1 a/b和NND表达(图11)。结果还表明bZIP1 a/b和NND在烟草中协调表达，正如基因调节子和它们的靶基因通常所做的那样。
基于以上实施例，据信NtbZIP1a和1b作为激活物参与三个NND基因的调节。NtbZIP1a/b的减少或失活可以导致去甲烟碱的减少。
实施例3
这个实施例描述过量表达NtbZIP1a的转基因品系的形成以及这些转基因品系对内源性E4表达的影响。
为了形成转基因品系，将包含在CaMV 35S启动子和rbcS终止子控制下的NtbZIP1a的pCAMBIA2300(二元载体)转移到农杆菌中，并且用转化的农杆菌感染烟草叶盘。从农杆菌感染的叶盘产生超过20个过量表达NtbZIP1a的转基因品系。从对照和三个转基因品系分离的基因组DNA用来通过抗生素选择标记新霉素磷酸转移酶II(nptII；kan)的PCR扩增来验证植物的转基因状态。从对照和三个转基因品系的叶分离的总RNA用于cDNA合成。RT-PCR用来验证转基因植物中nptII(kan)基因的表达(图12A)。实时定量PCR(qRT-PCR)用来检测NtbZIP1a和E4的转录水平(图12B)。普遍表达的看家基因tubulin用作qRT-PCR的内部对照。
这个实施例的结果表明，与对照相比，转基因植物中的NtbZIP1a表达显著更高。当NtbZIP1a高表达时，内源性E4表达上调(约6-8倍)，表明NtbZIP1a诱导E4的表达，因此可能是E4基因的转录激活物。此外，代谢分析表明，与对照相比，在转基因烟草叶中烟碱向去甲烟碱转化率更高(图12C)。用于计算烟碱向去甲烟碱的转化率的公式为：
分析三个品系中的两个显示更高的烟碱向去甲烟碱转化。因为代谢分析是用独立的T0(第一代转基因植物)分离种群进行的，所以代谢结果可能变化。
实施例4
如以上实施例2所述，本发明人表征了NtbZIP1a和b，属于S组bZIP因子的两种NtbZIP。在拟南芥(Arabidopsis)中，已知S组bZIP因子与某些C组因子相互作用以调节基因表达。鉴于这种相互作用，本发明人鉴定了拟南芥bZIP 63的烟草同系物，拟南芥bZIP 63是与S组因子相互作用的C组成员。在烟草中，有两个bZIP 63同系物，此处称作NtbZIP2a和b，它们享有超过95％的氨基酸相同性(图13)。不希望受理论束缚，相信NtbZIP2a和b源自两种烟草祖先美花烟草和N.tometosiformis，并且功能冗余。
根据转录物组分析，NtbZIP2a和b在烟草花、叶、茎和根中具有相似的表达模式(图14)。基于前述讨论，本发明人假设NtbZIP2a和b还单独和/或与NtbZIP1a和b协同调节E4/5/10。因此，测试了NtbZIP2a的E4启动子的反式激活，单独或与NtbZIP1a组合。更具体地，将E4启动子融合至萤火虫萤光素酶报告基因，并且将bZIP TF克隆至pBS载体中，在CaMV 35S启动子和rbcs终止子的控制下。结果表明，单独地，NtbZIP1a和NtbZIP2a均激活E4启动子；但是，当NtbZIP1a和2a共表达时，与每个因子单独诱导的相比，E4启动子的反式激活显著增加(图15)。
接下来，为了确定NtbZIP1a/b是否与NtbZIP2a相互作用，发明人进行了酵母杂交测定。酵母细胞在缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的合成的缺陷型(SD)培养基(SD-leu-trp-his-ade)上的生长表明NtbZIP1a/b与NtbZIP2a相互作用(图16A；1和2)。此外，NtbZIP2与其自身相互作用以形成同源二聚体(图16A；3)。NtbZIP1和NtbZIP2的bZIP结构域在图16B中示出。
虽然本实施例仅测试了NtbZIP2a对E4的活性，而没有E5或E10，但是相信两种NtbZIP2因子是E4/5/10基因的激活物。也就是说，这个实施例表明C组NtbZIP2a和b是两种以前未表征的E4/5/10基因的调节物。此外，这个实施例表明NtbZIP1和NtbZIP2在激活E4(可能E5和10)启动子中协同作用。特别地，不希望受理论束缚，相信NtbZIP2a和/或b与NtbZIP1a和/或b相互作用以增强DNA结合能力并显著增加E4/5/10启动子的激活(与单独NtbZIP1或NtbZIP2相比)。
总的来说，本文表征了作为E4/5/10基因的正调节物两个S组和两个C组NtbZIP因子。NtbZIP1a和2a对E4启动子的反式激活活性是相加的。因此，不希望受理论束缚，相信使这些基因中的一个或全部失活的敲除方法会减少E4/5/10基因表达。
实施例5
产生了NtbZIP1 RNAi品系(烟草栽培种Samsun NN)，并且进行分子和生化分析。
构建RNAi载体并转化植物。为了构建RNAi质粒，将来自NtbZIP1a cDNA的3’末端的200bp片段PCR扩增并以正义和反义方向克隆至包含内含子(来自大豆FAD3基因；Schardlet al.1987)的pKYLX80载体中。从pKYLX80切下具有内含子的正义和反义片段并克隆至包含CaMV35S启动子和rbcS终止子的二元载体pCAMBIA2300中(图17)。通过冻融方法将质粒动员至根癌农杆菌(Agrobacterium tumefasiens)中(Weigel and Glazebrook,2006)。用包含如前所述二元载体的农杆菌转化烟草植物(烟草栽培种Samsun NN)(Pattanaik etal.2008)，并且选择两个独立的卡那霉素抗性转基因品系(品系#3和9)用于进一步分析。
从NtbZIP RNAi和空载体(EV)对照植物的叶分离的RNA用于cDNA合成和定量RT-PCR(qPCR)。与EV品系相比，两个独立的RNAi品系中的NtbZIP1a表达降低大约80％(图18A)。此外，与EV相比，在两个RNAi品系中NtbZIP1b表达降低大约70％(图18A)。在两个转基因品系中E4的表达显著降低，例如在品系9中降低高达90％(图18A)。结果表明NtbZIP1的抑制导致E4的下调，表明NtbZIP1a和NtbZIP1b调节E4基因。此外，在RNAi和EV品系的叶中测量了烟碱向去甲烟碱转化。与EV品系相比，在RNAi品系中烟碱向去甲烟碱转化降低约50％(图18B)。
总之，与EV相比，RNAi介导的NtbZIP1沉默显著降低转基因烟草植物中的E4表达。此外，与EV相比，在转基因RNAi烟草的叶中烟碱向去甲烟碱的转化低大约50％。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请援引加入本文，与具体并单独地表明每个单独的出版物、专利或专利申请援引加入本文相同，包括以下列表中列出参考文献：
参考文献
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虽然本公开易于出现各种修改和替代形式，但是其特定实施方案已通过实例的方式在附图中显示，并且在下文中详细描述。然而，应当理解，具体实施方案的描述不是为了限制本公开以涵盖落在所附权利要求定义的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。
序列表
<110> R·J·雷诺烟草公司
肯塔基大学研究基金会
<120> bZIP转录因子调节烟碱向去甲烟碱的转化并降低烟草特异性(TSNA)前体的水平
<130> 13177N/2183W2
<150> US 62/857,718
<151> 2019-06-05
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 435
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 1
atggctttga cacagcaacc ggctagttca ggttctgatg gccaacgtta tgccacaaat 60
gacgatagaa aacgaaagag aatggagtcc aaccgtgaat ctgcaaggcg gtcacggatg 120
agaaagcagc agcatttgga ggagttgatg agccaaatga cacagctaca gaatcagaac 180
gttctgtggc gcgagaagat tgatgctgtg ggaagaaact acctcaccct cgatgcggag 240
aacaatgtct tgagggctca aatggcagaa ctgactgaac gcttggattc tctcaattcg 300
ctcactcgtt tctgggctga tgctaatgga ctagctgtgg atatccctga aattcctgac 360
actttgcttg agccctggca gcttccttgc ccaattcaac ccatcactgc ttctgctgat 420
atgtttcagt tttga 435
<210> 2
<211> 144
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 2
Asn Ala Leu Thr Gln Gln Pro Ala Ser Ser Gly Ser Asp Gly Gln Arg
1 5 10 15
Tyr Ala Thr Asn Asp Asp Arg Lys Arg Lys Arg Met Glu Ser Asn Arg
20 25 30
Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Met Arg Lys Gln Gln His Leu Glu Glu
35 40 45
Leu Met Ser Gln Met Thr Gln Leu Gln Asn Gln Asn Val Leu Trp Arg
50 55 60
Glu Lys Ile Asp Ala Val Gly Arg Asn Tyr Leu Thr Leu Asp Ala Glu
65 70 75 80
Asn Asn Val Leu Arg Ala Gln Met Ala Glu Leu Thr Glu Arg Leu Asp
85 90 95
Ser Leu Asn Ser Leu Thr Arg Phe Trp Ala Asp Ala Asn Gly Leu Ala
100 105 110
Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Asp Thr Leu Leu Glu Pro Trp Gln Leu
115 120 125
Pro Cys Pro Ile Gln Pro Ile Thr Ala Ser Ala Asp Met Phe Gln Phe
130 135 140
<210> 3
<211> 435
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 3
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gacgatagaa aacgaaagag aatggagtcc aaccgtgaat ctgcaaggcg gtcacggatg 120
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<210> 4
<211> 144
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 4
Asn Ala Ser Ile Gln Gln Pro Ala Ser Ser Gly Ser Asp Gly Gln Arg
1 5 10 15
Tyr Ala Met Asn Asp Asp Arg Lys Arg Lys Arg Met Glu Ser Asn Arg
20 25 30
Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Met Arg Lys Gln Gln His Leu Glu Glu
35 40 45
Leu Met Ser Gln Met Thr Gln Leu Gln Asn Gln Asn Val Leu Trp Arg
50 55 60
Glu Lys Ile Asp Ala Val Gly Arg Asn Tyr Leu Thr Leu Asp Ala Glu
65 70 75 80
Asn Asn Val Leu Arg Ala Gln Met Ala Glu Leu Thr Glu Arg Leu Asp
85 90 95
Ser Leu Asn Ser Leu Ala Arg Phe Trp Ala Asp Ala Asn Gly Leu Ala
100 105 110
Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Asp Thr Leu Leu Glu Pro Trp Gln Leu
115 120 125
Pro Cys Pro Ile Gln Pro Ile Thr Ala Ser Ala Asn Met Phe Gln Phe
130 135 140
<210> 5
<211> 455
<212> PRT
<213> Nicotiana tabacum
<400> 5
Met Asp Arg Val Phe Ser Val Asp Asp Asp Ile Gly Asp His Phe Trp
1 5 10 15
Ser Thr Pro Pro Thr Ala Asp Leu Gly Val Asp Ser Pro Thr Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Val Ser Tyr Ser Lys Met Met Asn Arg Ser Ser Ser Glu Trp
35 40 45
Ala Phe Gln Arg Phe Leu Gln Glu Ala Thr Ala Ala Gly Thr Ser Thr
50 55 60
Ser Ser Pro Pro Gln Pro Pro Thr Met Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ser His Gln Asn Asp Val Val Glu Ile Lys Asp Glu Asn Leu Ser Ile
85 90 95
Pro Asn Leu Asn Pro Ser Thr Ala Leu Asn Ser Lys Pro Ala Ser Ser
100 105 110
Phe Gly Leu Ala Pro Pro Pro Asn Ile Ala Val Asp Ser Glu Glu Tyr
115 120 125
Gln Ala Phe Leu Lys Ser Gln Leu His Leu Ala Cys Ala Ala Val Ala
130 135 140
Leu Thr Arg Gly Lys Ser Leu Asn Pro Gln Asp Ser Gly Ser Thr Ala
145 150 155 160
His Asp Lys Gly Ser Glu Thr Ala Ser Ala Ala Gln Ser Gly Ser His
165 170 175
Val Ser Thr Leu Gly Lys Cys Tyr Leu Arg Ser Gly Gln Glu Val Ala
180 185 190
Lys Ile Gln Asp Lys Asp Ala Gly Gly Pro Val Gly Ile Pro Ser Leu
195 200 205
Pro Pro Val Gln Lys Lys Pro Val Val Gln Val Arg Ser Thr Thr Ser
210 215 220
Gly Ser Ser Arg Glu Gln Ser Asp Asp Asp Glu Ala Glu Gly Glu Ala
225 230 235 240
Glu Thr Thr Gln Gly Met Asp Pro Ala Asp Ala Lys Arg Val Arg Arg
245 250 255
Met Leu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Arg Arg Lys Gln
260 265 270
Ala His Leu Thr Glu Leu Glu Thr Gln Val Ser Gln Leu Arg Val Glu
275 280 285
Asn Ser Ser Leu Leu Lys Arg Leu Thr Asp Ile Ser Gln Lys Tyr Asn
290 295 300
Glu Ala Ala Val Asp Asn Arg Val Leu Lys Ala Asp Val Glu Thr Leu
305 310 315 320
Arg Ala Lys Val Lys Met Ala Glu Glu Thr Val Lys Arg Val Thr Gly
325 330 335
Leu Asn Pro Leu Phe Gln Ala Met Ser Glu Ile Ser Ser Met Val Met
340 345 350
Pro Ser Tyr Ser Gly Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ala Asp Ala Ala Val
355 360 365
Pro Val Gln Asp Asp Pro Lys His His Tyr Tyr Gln Gln Pro Pro Asn
370 375 380
Asn Leu Met Pro Thr His Asp Pro Arg Ile Gln Asn Gly Met Val Asp
385 390 395 400
Val Pro Pro Ile Glu Asn Val Glu Gln Asn Pro Ala Thr Ala Ala Val
405 410 415
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420 425 430
Leu Glu His Leu Gln Lys Arg Ile Arg Gly Glu Val Ser Ser Cys Gly
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Thr Gln Gly Arg Gly Glu Gln
450 455
<210> 6
<211> 442
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<213> Nicotiana tabacum
<400> 6
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1 5 10 15
Ser Thr Pro Pro Thr Ala Asp Leu Gly Val Asp Ser Pro Thr Thr Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
Gln Ala Phe Leu Lys Ser Gln Leu His Leu Ala Cys Ala Ala Val Ala
130 135 140
Leu Thr Arg Gly Lys Ser Leu Asn Pro Gln Asp Ser Gly Ser Thr Ala
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His Asp Lys Gly Ser Glu Thr Ala Ser Ala Ala Gln Ser Gly Ser His
165 170 175
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Gly Glu Ala Glu Thr Thr Gln Gly Met Asp Pro Ala Asp Ala Lys Arg
225 230 235 240
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Val Thr Gly Leu Asn Pro Leu Phe Gln Ala Met Ser Glu Ile Ser Ser
325 330 335
Met Val Met Pro Ser Tyr Ser Gly Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ala Asp
340 345 350
Ala Ala Val Pro Val Gln Asp Asp Pro Lys His His Tyr Tyr Gln Gln
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420 425 430
Ser Cys Gly Thr Gln Gly Arg Gly Glu Gln
435 440
Claims (56)
1.一种减少烟碱向去甲烟碱转化的方法和/或一种降低至少一种烟草特异性(TSNA)前体水平的方法，所述方法包括降低烟草植物、烟草植物的部分、烟草植物细胞或细胞培养物、烟草植物种子或者另一包含烟碱的生物体中至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达。
2.降低烟草植物、烟草植物的部分、烟草植物细胞或细胞培养物、烟草植物种子或者另一包含烟碱的生物体中至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子的活性和/或表达在烟草植物、烟草植物的一部分、烟草植物种子或包含烟碱的生物体中用于减少烟碱向去甲烟碱的转化和/或用于降低至少一种烟草特异性(TSNA)前体的水平的用途。
3.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子选自C组bZIP转录因子、S组bZIP转录因子及其组合。
4.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子选自NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a、NtbZIP2b及其组合。
5.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子包含与选自SEQ IDNO:1编码的氨基酸；SEQ ID NO:2的氨基酸；SEQ ID NO:3编码的氨基酸；SEQ ID NO:4的氨基酸；SEQ ID NO:5的氨基酸；以及SEQ ID NO:6的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
6.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP1a和NtbZIP1b。
7.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP2a和NtbZIP2b。
8.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子包含NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a和NtbZIP2b。
9.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子包含：
与选自SEQ ID NO:1编码的氨基酸和SEQ ID NO:2的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；以及
与选自SEQ ID NO:3编码的氨基酸和SEQ ID NO:4的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
10.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子包含：
与SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；以及
与SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
11.权利要求1或2的方法或用途，其中所述至少一种bZIP转录因子包含：
与选自SEQ ID NO:1编码的氨基酸和SEQ ID NO:2的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；
与选自SEQ ID NO:3编码的氨基酸和SEQ ID NO:4的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；
与SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；和/或
与SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中降低至少一种bZIP型转录因子的活性和/或表达包括：突变bZIP型转录因子，如在bZIP型转录因子的结合位点中提供突变；使用bZIP型转录因子抑制剂；或者使用基因沉默技术，如RNAi。
13.权利要求12的方法，其中所述bZIP转录因子抑制剂选自反义寡核苷酸、miRNA、siRNA、锁核酸(LNA)核苷酸及其组合。
14.权利要求12的方法，其中突变bZIP型转录因子包括突变烟碱N-脱甲基酶(NND)启动子上的结合位点。
15.权利要求14的方法，其中所述NND选自CYP82E4v1、CYP82E5v2和CYP82E10。
16.权利要求15的方法，其中所述NND是CYP82E4v1，并且其中CYP82E4v1启动子上的bZIP结合位点是具有TACGTC的预突变序列的A/G盒。
17.权利要求16的方法，其中所述突变的结合位点具有序列TGCGTC。
18.权利要求17的方法，其中所述突变的结合位点是通过位点定向诱变形成的。
19.权利要求12的方法，其中突变bZIP型转录因子包括突变植物基因组以敲除至少一种碱性区域/亮氨酸拉链(bZIP)型转录因子。
20.权利要求19的方法，其中所述至少一种bZIP转录因子选自C组bZIP转录因子、S组bZIP转录因子及其组合。
21.权利要求19的方法，其中所述至少一种bZIP转录因子选自NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a、NtbZIP2b及其组合。
22.权利要求19的方法，其中所述至少一种bZIP转录因子包含选自以下的氨基酸序列：
与选自SEQ ID NO:1编码的氨基酸和SEQ ID NO:2的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；
与选自SEQ ID NO:3编码的氨基酸和SEQ ID NO:4的氨基酸的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；
与SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子；以及
与SEQ ID NO:6的氨基酸具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸分子。
23.一种分离的核酸分子，其包含：与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的核酸序列；编码与SEQ ID NO:2、4、5或6的序列具有至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的序列的核酸序列；或者其组合。
24.一种分离的核酸分子，其编码具有至少一个突变的bZIP型转录因子。
25.权利要求24的核酸分子，其中所述突变在烟碱N-脱甲基酶(NND)启动子上的结合位点中。
26.权利要求25的核酸分子，其中所述NND选自CYP82E4v1、CYP82E5v2和CYP82E10。
27.权利要求26的核酸分子，其中所述NND是CYP82E4v1，并且其中CYP82E4v1启动子上的bZIP结合位点是具有TACGTC的预突变序列的A/G盒。
28.权利要求27的核酸分子，其中所述突变的结合位点具有序列TGCGTC。
29.权利要求24-28中任一项的核酸分子，其中所述bZIP转录因子包含NtbZIP1a、NtbZIP1b、NtbZIP2a、NtbZIP2b或其组合。
30.权利要求24-28中任一项的核酸分子，其中所述bZIP转录因子包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列的核酸序列；编码具有SEQ ID NO:2、4、5或6的序列的序列的核酸序列；或其组合。
31.一种构建体或载体，其包含权利要求23-30中任一项的核酸分子。
32.一种烟草植物细胞：
a.包含外源基因，所述外源基因包括权利要求23-30中任一项的核酸分子；
b.包含权利要求31的构建体或载体；
c.通过权利要求1-22中任一项的方法获得或可获得；和/或
d.通过突变降低至少一种bZIP型转录因子的活性和/或表达或者敲除至少一种bZIP型转录因子而获得。
33.权利要求32的烟草细胞在生产烟草工业产品中的用途。
34.一种烟草细胞培养物或植物：
a.包含权利要求32的植物细胞；
b.其已被修饰以实现与未修饰的培养物或植物相比，所述培养物或植物的烟碱向去甲烟碱的转化减少和/或至少一种烟草特异性(TSNA)前体的水平降低；和/或
c.包含权利要求31的构建体或载体。
35.可从权利要求34的植物或所述植物的部分获得的植物繁殖材料或植物提取物。
36.权利要求35的植物繁殖材料，其是植物种子。
37.权利要求34的烟草植物在培育烟草植物中的用途。
38.权利要求34的烟草植物在生产烟草工业产品中的用途。
39.权利要求34的烟草植物在种植作物中的用途。
40.权利要求34的烟草植物在生产加工烟叶中的用途。
41.权利要求40的用途，其中所述加工烟叶是烤制烟叶。
42.权利要求34的烟草植物的收获叶。
43.权利要求42的收获叶，其中所述叶是切割的收获叶。
44.一种加工的烟叶：
a.包含权利要求32的植物细胞；
b.可通过加工权利要求34的烟草植物获得；
c.可从权利要求35的植物繁殖材料繁殖的植物获得；和/或
d.可通过加工权利要求42的收获叶获得。
45.权利要求44的加工的烟叶，其中所述叶是非存活的加工的烟叶。
46.权利要求44的加工的烟叶，其中所述植物或叶通过烤制、发酵、巴氏消毒或其组合进行加工。
47.权利要求44的加工的烟叶，其中所述加工的烟叶是切割的加工的烟叶。
48.由权利要求34的植物、其部分、其提取物或细胞培养物制成的烤制烟草材料。
49.一种包含权利要求48的烤制烟草材料的烟草混合物。
50.一种烟草工业产品：
a.制备自权利要求34的烟草植物或其部分；
b.制备自通过权利要求40或41的方法获得或可获得的烟草植物或其部分(优选收获自所述植物的叶)；
c.制备自由权利要求35和36的植物繁殖材料繁殖的植物(优选叶)；
d.制备自权利要求42或43的收获叶；
e.制备自权利要求44-47的加工的叶；
f.制备自或包含由权利要求34的经修饰的植物获得的植物提取物；
g.权利要求48的烤制烟草材料；和/或
h.权利要求49的烟草混合物。
51.权利要求50的烟草工业产品，其中所述烟草工业产品是生烟物品。
52.权利要求50的烟草工业产品，其中所述烟草工业产品是无烟烟草产品。
53.权利要求50的烟草工业产品，其中所述烟草产品是不可燃的气溶胶供应系统如烟草加热装置，例如气溶胶发生装置。
54.一种可燃的生烟物品、不可燃的气溶胶供应系统、无烟烟草产品或烟草加热器，其包含权利要求34的来自物种烟草(Nicotiana tabacum)或黄花烟草(Nicotiana rustica)的植物或其部分或者其提取物，或者权利要求34的烟草细胞培养物，或者权利要求48的烤制烟草材料或者权利要求49的烟草混合物。
55.编码具有至少一个突变的bZIP型转录因子的至少一种基因的核苷酸序列的用途，其中所述bZIP型转录因子的序列包括：
由包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列具有至少一个突变的核酸序列的核酸序列编码的序列；
相对于SEQ ID NO:2、4、5或6的序列具有至少一个突变的序列；或者
其组合。
56.权利要求55的用途，其中所述序列用于选择烟草特异性亚硝胺(TSNA)或TSNA前体含量降低的植物。
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