CN113930405A

CN113930405A - 一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113930405A
Application number: CN202111223807.8A
Authority: CN
Inventors: 杨政权; 丁春明; 金胜男; 董施杰
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2041-10-21
Also published as: CN113930405B

Abstract

一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用，通过将编码T4 PNK与Mth RNA ligase的两基因进行基因工程改造，在两编码基因中引入链接序列（Linker），制备一种T4 PNK与Mth RNA Ligase的融合蛋白。活性测试和鉴定显示，融合蛋白同时具有T4 PNK和Mth RNA Ligase的催化活性，能够创新性的直接将羟基末端底物直接催化为腺苷酰化产物，且仍然能够将磷酸化底物催化为腺苷酰化产物。

Description

一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及核酸的腺苷酰化修饰技术领域，具体涉及一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用。

背景技术

核酸的序列末端磷酸化（Phosphorylation）是指磷酸基团共价连接到核酸末端的过程。核酸的腺苷酰化（Adenylation）是指一磷酸腺苷（AMP）分子共价连接到核酸末端的过程。磷酸化核酸是含有5’-磷酸基团的核酸，包含磷酸化DNA和磷酸化RNA两类，是各种核酸连接酶催化核酸环化或者连接反应的底物，在分子生物学中应用广泛。

腺苷酰化核酸是含有5’-腺苷焦磷酸基帽的核酸，具有高能焦磷酸键，是一种活化形式的核酸分子。腺苷酰化核酸是核酸连接酶催化的核酸连接反应的中间产物，在一般的连接反应中，连接反应分三个阶段进行。在第一阶段，核酸连接酶的催化赖氨酸残基与ATP形成腺苷酰化的酶；在第二阶段，腺苷酰化的酶将其腺苷基团转移至核酸的5’磷酸末端，形成腺苷酰化的核酸中间产物；在第三阶段，连接酶的赖氨酸残基催化核酸的5’腺苷酰化末端与3’羟基末端之间脱水缩合形成磷酸二酯键，完成连接反应。因此，磷酸化或者腺苷酰化的核酸均可以作为连接酶的底物，完成连接反应。腺苷酰化的核酸包括腺苷酰化的DNA和腺苷酰化的RNA两种，目前以腺苷酰化DNA（AppDNA）应用较多。

磷酸化修饰和腺苷酰化修饰广泛用于高通量测序接头制备、单链RNA或DNA连接、特定连接酶催化的连接反应等分子生物学技术中。以Illumina测序平台的miRNA建库过程为例，传统的建库方式需要在第一接头连接前将RNA去磷酸化处理，防止在连接反应过程中底物RNA的自身环化和连接副产物产生；随后进行第一接头的连接和以第一接头作为引物结合位点进行cDNA第一链的合成。随后对反应产物重新磷酸化和第二接头的连接。这一过程繁琐且复杂。而使用5’预腺苷酰化的接头时，在特定的连接酶催化下，无需ATP的参与，能够避免连接反应的发生，因此无需对底物进行去磷酸化处理，减少了反应步骤，简化了实验流程，有效提升建库的效率。

在单链DNA连接中，5’-腺苷酰化DNA底物由于含有高能焦磷酸键处于活化状态，比5’磷酸化DNA底物更易于进行连接反应。某些DNA连接酶，如K159S位点突变的T4DNA连接酶，仅能催化5’-腺苷酰化DNA底物与3’-羟基末端连接，且其连接活性较野生型连接酶催化磷酸化底物的活性更高，连接反应更容易进行。

DNA或RNA的磷酸化目前主要通过化学合成法和酶法合成进行。化学合成法需要特殊的仪器设备进行，酶法合成主要依赖于T4多核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase,T4 PNK）的方法合成。DNA或RNA的腺苷酰化也主要通过化学合成法和酶法合成进行。但是，腺苷酰化修饰的化学合成法合成难度大、效率低、成本高，目前中国境内尚无公司可以完成，国外也仅有少数引物合成公司如Integrated DNA Technologies（IDT）能够完成。这些因素导致腺苷酰化化学修饰合成价格昂贵，单条引物合成价格超过万元，且到货周期长，无法满足飞速进展的分子生物学研究和应用。腺苷酰化修饰的酶法合成具有操作简单、反应迅速、催化效率高等优势，非常适合各种实验室研究和技术研发使用，能够个性化的设计和合成各种腺苷酰化修饰的核酸样品。目前，酶法催化腺苷酰化反应以NEB公司的5’AdenylationKit为代表，该试剂盒利用Mth RNALigase连接酶在高浓度ATP作用下连接效率较低的特性，催化5’-磷酸化DNA末端在ATP的作用下形成5’-腺苷酰化DNA产物。但是，由于MthRNALigase连接酶活性的存在，该酶无法完全避免连接反应形成的环化副产物或连接副产物。同时，该酶以5’-磷酸化DNA或RNA为底物，仍然需要化学合成5’-磷酸化DNA或RNA后再进行酶法腺苷酰化合成。因此，从一般合成的羟基底物、PCR产物和天然核酸产物进行酶法腺苷酰化产物的制备过程需要预先进行磷酸化和纯化等步骤，过程繁琐，产率不高。

与核酸的腺苷酰化相关的现有的技术：

现有技术方案一

通过对合成的5’羟基末端DNA或RNA底物依次单独进行磷酸化激酶处理磷酸化和腺苷酰化酶处理腺苷酰化

此技术的方案是：第一步，先通过引物合成公司化学合成5’羟基末端的DNA或RNA。第二步，使用商业化T4多核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase， T4 PNK）进行磷酸化反应，使核酸的5’端加上磷酸基团成为磷酸化产物。第三步，对磷酸化反应产物进行纯化处理。第四步，使用腺苷酰化酶对纯化后的5’磷酸末端产物进行腺苷酰化反应。第五步，将腺苷酰化的核酸从酶反应液中纯化出来，得到腺苷酰化修饰的DNA或RNA。

存在的的缺点：

（1）需要经过多步的反应和纯化，操作步骤较为繁琐；（2）商业化磷酸化试剂、腺苷酰化试剂、纯化试剂的使用都增加了腺苷酰化DNA或RNA合成的成本；（3）不同纯化方法的核酸回收率有差别，对于片段较短的核酸分子回收效率更差，多个步骤的纯化过程导致更多的核酸损失，影响腺苷酰化核酸的产量。此技术方案合成腺苷酰化核酸成本较高，耗时耗力，不适合用于大用量腺苷酰化DNA或RNA的制备。

现有技术方案二

其与技术一类似，不同之处在于通过公司化学合成磷酸化底物直接进行腺苷酰化。

此技术的方案是：第一步，通过引物合成公司先合成5’末端磷酸化修饰的DNA或RNA。第二步，使用腺苷酰化酶对磷酸化样品进行腺苷酰化。第三步，通过纯化回收腺苷酰化产物。

存在的的缺点：

（1）需要从公司化学合成5’磷酸化的DNA或RNA作为反应底物，如果需要防止底物自身环化副产物产生还需要在底物3’端进行特殊修饰以防止核酸自连，这些化学修饰耗时较长且增加了腺苷酰化DNA或RNA的合成成本（2）现有商品化腺苷酰化酶价格较为昂贵，反应成本较高。现有技术二合成腺苷酰化DNA或RNA需要订购磷酸化底物，周期较长且成本仍然较高。

现有技术方案三

现有技术方案三是通过引物合成公司使用化学合成法合成5’腺苷酰化的DNA或RNA。化学合成腺苷酰化DNA或RNA的关键步骤是焦磷酸键的形成，合成方法一般包括五步：第一步，以常规引物合成的方式采用β-乙腈亚磷酰胺合成一段DNA或RNA序列；第二步，在核酸的5’端偶联上磷酸基团；第三步，使用磷酰咪唑烷、磷酸N-甲基咪唑烷等化合物合成活化形式的腺苷酸衍生物；第四步，将腺苷5’-咪唑磷酸酯（adenosine 5’-phosphorimidazolidate）与固定化的DNA或RNA 5’磷酸基团偶联，生成腺苷酰化的DNA或RNA；第五步，通过PAGE电泳纯化相差一个碱基的腺苷酰化DNA或RNA产物。

存在的缺点：

（1）通过化学合成法直接合成腺苷酰化DNA或RNA的方案要经过多步反应，步骤繁琐，需要有较高的专业技术知识和操作能力的技术人员才能进行合成，不适合普通实验室独立制备；（2）合成原料价格高；（3）在合成大于11碱基的DNA或RNA时反应效率不高，产物需要通过PAGE电泳从相差1个碱基的底物和产物之间分离开来，纯化过程耗时费力，进一步增加了合成的成本。（4）目前国内还没有提供直接化学合成腺苷酰化DNA或RNA的公司，从国外合成公司订购成本高昂且货期较长。

发明内容

为了解决现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用，可以一步法从5’-羟基末端DNA或RNA合成腺苷酰化DNA或RNA，可以简便、快捷、低成本、高效地合成腺苷酰化DNA或RNA。同时，该酶还仍然保留了对磷酸化DNA或RNA底物腺苷酰化的功能。

本发明采用的技术解决方案是：一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶，包含以下项或由其组成：

（a）SEQ ID NO：3至4中所示的氨基酸序列；或；

（b）SEQ ID NO：3至4中所示的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；或；

（c）包含表达MthRNALigase蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：1和表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：2，中间接或不接linker肽段，linker肽段可为长度1至任意长度的氨基酸序列。

所述的包含表达MthRNALigase蛋白的氨基酸序列和/或表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列的任意端具有亲和纯化氨基酸标签。

所述的包含表达MthRNALigase蛋白的氨基酸序列的N端带有6-8个组氨酸的纯化氨基酸标签和/或所述的表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列的C端带有6-8个组氨酸纯化标签。

所述的包含表达MthRNALigase蛋白的氨基酸序列和/或表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列的任意端的亲和纯化氨基酸标签，可以在蛋白制备和纯化过程中通过酶切方法去除亲和纯化标签。

所述的包含表达MthRNALigase蛋白的氨基酸序列和/或表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列的任意端的亲和纯化氨基酸标签，可以是连续组氨酸标签、GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签等可用于亲和纯化的标签氨基酸。

一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）将T4 PNK和MthRNALigase连接酶两种酶的基因编码序列通过一段编码连接肽（Linker）的序列连接在一起，分别设计T4 PNK编码序列在MthRNALigase编码序列的N端和C端两种不同的融合顺序，形成T4PNK与MthRNALigase融合酶的编码序列；

（2）在融合酶的编码序列N端和/或C端分别加上纯化氨基酸标签用于蛋白纯化，构建到pET28a原核表达载体中，转化到大肠杆菌感受态细胞中；

（3）诱导表达T4PNK-MthRNALigase融合蛋白并进行纯化，得到的融合酶用于一步法腺苷酰化DNA或RNA的合成；

（4）分别使用5’-羟基单链DNA或5’-磷酸化单链DNA对融合酶的磷酸化腺苷酰化活性进行测试，经尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定为腺苷酰化修饰的单链DNA。

所述的大肠杆菌感受态细胞为BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞。

一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶在作为制备催化核酸腺苷酰化试剂上的应用。

所述的核酸的腺苷酰化包括磷酸化DNA或羟基末端DNA的腺苷酰化和RNA的腺苷酰化。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用，通过将编码T4 PNK与MthRNAligase的两基因进行基因工程改造，在两编码基因中引入链接序列（Linker），制备一种T4 PNK与MthRNALigase的融合蛋白。活性测试和鉴定显示，融合蛋白同时具有T4 PNK和MthRNALigase的催化活性，能够直接将羟基末端底物直接催化为腺苷酰化产物，且仍然能够将磷酸化底物催化为腺苷酰化产物。

附图说明

图1为PCR产物鉴定目的产物；其中，M：marker；T4 PNK泳道示T4 PNK目的PCR产物条带，目的片段为965bp；MthRnl泳道示Mth RNA Ligase蛋白表达质粒PCR扩增条带，目的片段为6422bp。

图2为菌液PCR鉴定结果图，黑色箭头示目的条带。

图3为融合蛋白SDS-PAGE电泳鉴定。箭头示目的蛋白。

图4为融合酶活性鉴定；其中图4A示使用17碱基的5’末端羟基单链DNA进行酶活性测试，图4B示示意17碱基的5’末端磷酸化修饰单链DNA进行活性测试，在Mg2+和Mn2+两种不同金属离子条件下进行催化反应。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

构建表达T4 PNK和Mth RNA Ligase融合酶的重组质粒

（1）将T4PNK和MthRNALigase连接酶两种酶的基因编码序列通过一段连接肽（Linker）顺序连接在一起，分别设计T4PNK编码序列在MthRNALigase编码序列的N端和C端两种不同的融合顺序，形成T4PNK与MthRNALigase融合酶的编码序列。

（2）在融合酶的编码序列N端或C端加上组氨酸标签用于蛋白纯化，构建到pET28a原核表达载体中，转化到BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞中。

（3）诱导表达T4PNK-MthRNALigase融合蛋白并进行纯化，得到的融合酶用于一步法腺苷酰化DNA或RNA的合成。

（4）使用5’-羟基DNA对融合酶的腺苷酰化活性进行测试，经尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定为腺苷酰化修饰的DNA，此融合酶方案可成功应用于以羟基末端DNA为底物的腺苷酰化DNA合成。

（5）使用5’-磷酸化DNA对融合酶的腺苷酰化活性进行测试，经尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定为腺苷酰化修饰的DNA，此融合酶及其技术可成功应用于以磷酸化修饰DNA为底物的腺苷酰化DNA合成，仍然保留有磷酸化底物的腺苷酰化合成能力。

扩增T4 PNK蛋白表达DNA序列并添加Linker序列和酶切位点

配制PCR体系

设置PCR程序

第二次PCR

设置PCR程序

扩增Mth RNA Ligase蛋白表达质粒DNA序列并添加酶切位点

配制PCR体系

设置PCR程序

电泳鉴定

使用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定两PCR产物结果如图1所示。

产物纯化

产物纯化使用Zymo DNA Clean & Concentrator™-5试剂盒按照说明书进行。

酶切、连接和感受态细胞转化

a. 在冰上依次加入下列成分 (PaqCI Activator (20uM)稀释成5uM)。

上述体系37°C 30 minutes，60℃5min后加入0.5µl的T4 DNA ligase，16℃孵育3.5h后取10uL产物转化至BL21（DE3）感受态细胞，加入900uL LB培养液，37℃，220rpm孵育3h后，2000rpm离心5min，弃去部分上清，取200uL菌液涂布至kana平板培养12h。

菌液PCR鉴定

a. 在酒精灯旁随机挑取14个菌落加入到1mLKanaLB液体培养基中，震荡混匀, 37℃摇床中孵育4h；

b. 配制PCR体系；

c. 设置PCR程序

d. 电泳鉴定：用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，选择目的条带对应菌液进行一代测序，结果如图2所示。

蛋白表达纯化

（1）菌种接种：取10μL保存的pET28a-8His-M-L-T4甘油菌种到5ml LB培养基(Kana+)中，250rpm，37℃摇床培养8h；

（2）取2ml（1：25比例）菌液转移至50ml LB培养基中（Kana+，无菌操作），250rpm，37℃摇床培养9.5h；

（3）将摇好的菌液取20ml（1:50）转移至1L的LB培养基(Kana+)中，在250rpm、37℃条件下摇床培养至OD600值达0.6时，向培养基中加入1mL 1mmol/mL的IPTG(终浓度1mmol/L)，16℃诱导表达16h；

（4）收取菌体：5000g离心10min收集菌体，弃上清；

（5）用50ml的His Binding buffer重悬菌体，转移至50ml离心管；

（6）将每管菌液高压破碎4次，直至破碎液变得澄清；

（7）在提前预冷的高速离心机中4℃，14000g离心45 min。用50mL注射器装0.22 μm滤器过滤收集上清到50ml去酶离心管中，冰上待纯化；

（8）开启蛋白纯化仪，使用镍柱亲和层析模式进行亲和纯化。

（9）将A1和A2管道进液口放入His Binding Buffer中，将B1进液口放入HisElution buffer 中，用His Elution buffer清洗B1流路前段，再用His Binding Buffer清洗仪器各流路(A1和A2）。至少5个柱体积的His Binding Buffer清洗和平衡Ni柱；

（10）清洗完后用A2管道上样，流速5mL/min，上完样后结束程序；

（11）打开蛋白纯化程序编辑器：

a、参数设定：方法学-亲和层析，流速5mL/min；

b、洗柱：His Binding Buffer 从A1流路清洗Ni柱10个柱体积；

c、洗脱：梯度分步洗脱 His Elution Buffer从B1流路进入，浓度10% 5个CV-20%5 CV，50% 5 CV，100% 5 CV。设置峰收集，收集起始吸光度120mAu，终止吸光度120mAu，每管收集体积1mL；

d、再平衡：His Binding Buffer 5个柱体积；

（12）Ni纯化结束后，ddH₂O清洗系统各流路，装HiTrap Heparin HP 5ml肝素柱；

（13）将Ni柱收集到的蛋白样用Heparin buffer A 稀释10 倍；

（14）调节柱前压报警压力0.5 MPa，A1空气报警，降低系统流速，用ddH₂O清洗肝素柱 5个柱体积，再用ddH₂O清洗各个流路；

（15）用Heparin buffer B(pH7.6)冲洗B1流路，再用Heparin buffer A (pH7.6)充满系统流路，平衡肝素柱5个柱体积，清洗完后用A2管道上样，流速为4mL/min，上完样后结束程序；

（16）设置肝素柱纯化程序

a、洗柱-1：Heparin buffer A 清洗肝素柱 10个柱体积；

b、洗脱：梯度分步洗脱 Heparin buffer B(浓度15%-35%-50%)各5个柱体积。设置峰收集，收集起始吸光度80mAu，终止吸光度80mAu，每管收集样品0.5mL，在35%浓度洗脱时出现最大值为230mAu的目的蛋白峰，取浓度最大的6管；

c、洗柱-2：Heparin buffer B 5个柱体积；

d、再平衡：Heparin buffer A 5个柱体积；

（17）纯化程序结束后，ddH₂O清洗系统流路，再用20%乙醇溶液清洗系统流路，卸下肝素柱。

（18）酶产物加等比例100%甘油，混匀后于-20℃保存。

蛋白浓度和纯度测定

BCA法测定纯化产物蛋白浓度；

使用8%的SDS-PAGE电泳鉴定蛋白样品，结果如图3所示。

融合酶活性鉴定

a, 按照下表配制反应体系

注：10×Reaction Buffer（700mM Tris-HCl, 50mM DTT, pH=7.0）

反应条件如下：

条件A：37℃反应1h后65℃反应30 min，85℃反应5min；

条件B：50℃反应1h后65℃反应30 min，85℃反应5min；

条件C：50℃反应1.5h，85℃反应5min；

条件D：65℃反应1.5h，85℃反应5min；

反应完成后，20%变性Urea-PAGE鉴定反应产物。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<120> 一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶及其制备方法与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn Ser Asp Ile Pro Phe Asp Leu Ile Gln Glu Arg Thr Gly Val Pro

1 5 10 15

Ser Ser Arg Leu Lys Val Ala Phe Ala Arg Gly Ser Leu Arg Leu Leu

20 25 30

Glu Ser Ala Gly Met Gln Ala Leu Leu Phe Lys Lys Pro Leu Gly Asp

35 40 45

Leu Glu Ala Gly Thr Val Ile Tyr Leu Gly Asp Glu Thr Glu Val Ile

50 55 60

Arg Gly Phe Pro Lys Ile Arg Arg Thr Leu Leu Leu Ser Pro Thr Ile

65 70 75 80

Gln Glu His Phe Arg Asp Arg Val Ala Val Glu Glu Lys Met Asn Gly

85 90 95

Tyr Asn Val Arg Ile Ala Cys Leu Ser Ser Gly Glu Thr Val Ala Leu

100 105 110

Thr Arg Gly Gly His Val Cys Pro Phe Thr Thr Arg Lys Ala Gln Glu

115 120 125

Leu Leu Asp Leu Ser Glu Phe Phe Arg Glu His Pro Asp Leu Val Ile

130 135 140

Cys Gly Glu Met Ile Gly Arg Asp Asn Pro Tyr Val Ser Gln Asp Tyr

145 150 155 160

Pro Glu Val Gly Pro Leu Gly Phe Arg Val Phe Asp Leu Arg Glu Lys

165 170 175

Asn Thr Asn Arg Pro Leu Pro Val Glu Glu Arg Arg Ala Leu Leu Asp

180 185 190

Ser Tyr Gly Leu Pro Asn Val Arg Leu Phe Gly Val Tyr Pro Ile Glu

195 200 205

Glu Ala Ala Ser Glu Val Ala Asp Ile Ile Arg Ala Leu Gly Met Ala

210 215 220

Gly Arg Glu Gly Val Val Met Lys Asp Pro Ser Met Glu Val Pro Pro

225 230 235 240

Leu Lys Tyr Thr Ser Ser Gln Ala His Ala Arg Glu Leu Ala Tyr Ala

245 250 255

Phe Ser Tyr Pro Phe Asp Phe Gly Arg Pro Phe Phe Phe Ser Arg Val

260 265 270

Ile Arg Glu Gly Phe Gln Ala Tyr Glu Leu Asp Glu Ser Asp Asp Glu

275 280 285

Thr Arg Glu Arg Ala Arg Arg Leu Gly Glu Ala Ile Ile Tyr Pro Met

290 295 300

Leu Glu Arg Ile Lys Ser Ile Ser Ala Gly Glu Ala Ala Tyr Glu Asp

305 310 315 320

Thr Val Ile Asp Val Glu Asp Arg Glu Ala Ala Glu Glu Phe Ile Arg

325 330 335

His Leu Val Arg Leu Gly Val Ser Ala Thr Leu Ala Asp Tyr Arg Asp

340 345 350

Gly Arg Ala Thr Ile Arg Arg Phe Tyr Gln Ser Thr Thr Asp Arg Ile

355 360 365

Asn Asn Tyr Leu Lys Gly Gly Leu Tyr

370 375

<210> 2

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Lys Ile Ile Leu Thr Ile Gly Cys Pro Gly Ser Gly Lys Ser Thr

1 5 10 15

Trp Ala Arg Glu Phe Ile Ala Lys Asn Pro Gly Phe Tyr Asn Ile Asn

20 25 30

Arg Asp Asp Tyr Arg Gln Ser Ile Met Ala His Glu Glu Arg Asp Glu

35 40 45

Tyr Lys Tyr Thr Lys Lys Lys Glu Gly Ile Val Thr Gly Met Gln Phe

50 55 60

Asp Thr Ala Lys Ser Ile Leu Tyr Gly Gly Asp Ser Val Lys Gly Val

65 70 75 80

Ile Ile Ser Asp Thr Asn Leu Asn Pro Glu Arg Arg Leu Ala Trp Glu

85 90 95

Thr Phe Ala Lys Glu Tyr Gly Trp Lys Val Glu His Lys Val Phe Asp

100 105 110

Val Pro Trp Thr Glu Leu Val Lys Arg Asn Ser Lys Arg Gly Thr Lys

115 120 125

Ala Val Pro Ile Asp Val Leu Arg Ser Met Tyr Lys Ser Met Arg Glu

130 135 140

Tyr Leu Gly Leu Pro Val Tyr Asn Gly Thr Pro Gly Lys Pro Lys Ala

145 150 155 160

Val Ile Phe Asp Val Asp Gly Thr Leu Ala Lys Met Asn Gly Arg Gly

165 170 175

Pro Tyr Asp Leu Glu Lys Cys Asp Thr Asp Val Ile Asn Pro Met Val

180 185 190

Val Glu Leu Ser Lys Met Tyr Ala Leu Met Gly Tyr Gln Ile Val Val

195 200 205

Val Ser Gly Arg Glu Ser Gly Thr Lys Glu Asp Pro Thr Lys Tyr Tyr

210 215 220

Arg Met Thr Arg Lys Trp Val Glu Asp Ile Ala Gly Val Pro Leu Val

225 230 235 240

Met Gln Cys Gln Arg Glu Gln Gly Asp Thr Arg Lys Asp Asp Val Val

245 250 255

Lys Glu Glu Ile Phe Trp Lys His Ile Ala Pro His Phe Asp Val Lys

260 265 270

Leu Ala Ile Asp Asp Arg Thr Gln Val Val Glu Met Trp Arg Arg Ile

275 280 285

Gly Val Glu Cys Trp Gln Val Ala Ser Gly Asp

290 295

<210> 3

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Asp Ile Pro Phe Asp Leu Ile Gln Glu Arg Thr Gly Val Pro

1 5 10 15

Ser Ser Arg Leu Lys Val Ala Phe Ala Arg Gly Ser Leu Arg Leu Leu

20 25 30

Glu Ser Ala Gly Met Gln Ala Leu Leu Phe Lys Lys Pro Leu Gly Asp

35 40 45

Leu Glu Ala Gly Thr Val Ile Tyr Leu Gly Asp Glu Thr Glu Val Ile

50 55 60

Arg Gly Phe Pro Lys Ile Arg Arg Thr Leu Leu Leu Ser Pro Thr Ile

65 70 75 80

Gln Glu His Phe Arg Asp Arg Val Ala Val Glu Glu Lys Met Asn Gly

85 90 95

Tyr Asn Val Arg Ile Ala Cys Leu Ser Ser Gly Glu Thr Val Ala Leu

100 105 110

Thr Arg Gly Gly His Val Cys Pro Phe Thr Thr Arg Lys Ala Gln Glu

115 120 125

Leu Leu Asp Leu Ser Glu Phe Phe Arg Glu His Pro Asp Leu Val Ile

130 135 140

Cys Gly Glu Met Ile Gly Arg Asp Asn Pro Tyr Val Ser Gln Asp Tyr

145 150 155 160

Pro Glu Val Gly Pro Leu Gly Phe Arg Val Phe Asp Leu Arg Glu Lys

165 170 175

Asn Thr Asn Arg Pro Leu Pro Val Glu Glu Arg Arg Ala Leu Leu Asp

180 185 190

Ser Tyr Gly Leu Pro Asn Val Arg Leu Phe Gly Val Tyr Pro Ile Glu

195 200 205

Glu Ala Ala Ser Glu Val Ala Asp Ile Ile Arg Ala Leu Gly Met Ala

210 215 220

Gly Arg Glu Gly Val Val Met Lys Asp Pro Ser Met Glu Val Pro Pro

225 230 235 240

Leu Lys Tyr Thr Ser Ser Gln Ala His Ala Arg Glu Leu Ala Tyr Ala

245 250 255

Phe Ser Tyr Pro Phe Asp Phe Gly Arg Pro Phe Phe Phe Ser Arg Val

260 265 270

Ile Arg Glu Gly Phe Gln Ala Tyr Glu Leu Asp Glu Ser Asp Asp Glu

275 280 285

Thr Arg Glu Arg Ala Arg Arg Leu Gly Glu Ala Ile Ile Tyr Pro Met

290 295 300

Leu Glu Arg Ile Lys Ser Ile Ser Ala Gly Glu Ala Ala Tyr Glu Asp

305 310 315 320

Thr Val Ile Asp Val Glu Asp Arg Glu Ala Ala Glu Glu Phe Ile Arg

325 330 335

His Leu Val Arg Leu Gly Val Ser Ala Thr Leu Ala Asp Tyr Arg Asp

340 345 350

Gly Arg Ala Thr Ile Arg Arg Phe Tyr Gln Ser Thr Thr Asp Arg Ile

355 360 365

Asn Asn Tyr Leu Lys Gly Gly Leu Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Ser Ala Gly Lys Lys Ile Ile Leu Thr Ile Gly Cys Pro

385 390 395 400

Gly Ser Gly Lys Ser Thr Trp Ala Arg Glu Phe Ile Ala Lys Asn Pro

405 410 415

Gly Phe Tyr Asn Ile Asn Arg Asp Asp Tyr Arg Gln Ser Ile Met Ala

420 425 430

His Glu Glu Arg Asp Glu Tyr Lys Tyr Thr Lys Lys Lys Glu Gly Ile

435 440 445

Val Thr Gly Met Gln Phe Asp Thr Ala Lys Ser Ile Leu Tyr Gly Gly

450 455 460

Asp Ser Val Lys Gly Val Ile Ile Ser Asp Thr Asn Leu Asn Pro Glu

465 470 475 480

Arg Arg Leu Ala Trp Glu Thr Phe Ala Lys Glu Tyr Gly Trp Lys Val

485 490 495

Glu His Lys Val Phe Asp Val Pro Trp Thr Glu Leu Val Lys Arg Asn

500 505 510

Ser Lys Arg Gly Thr Lys Ala Val Pro Ile Asp Val Leu Arg Ser Met

515 520 525

Tyr Lys Ser Met Arg Glu Tyr Leu Gly Leu Pro Val Tyr Asn Gly Thr

530 535 540

Pro Gly Lys Pro Lys Ala Val Ile Phe Asp Val Asp Gly Thr Leu Ala

545 550 555 560

Lys Met Asn Gly Arg Gly Pro Tyr Asp Leu Glu Lys Cys Asp Thr Asp

565 570 575

Val Ile Asn Pro Met Val Val Glu Leu Ser Lys Met Tyr Ala Leu Met

580 585 590

Gly Tyr Gln Ile Val Val Val Ser Gly Arg Glu Ser Gly Thr Lys Glu

595 600 605

Asp Pro Thr Lys Tyr Tyr Arg Met Thr Arg Lys Trp Val Glu Asp Ile

610 615 620

Ala Gly Val Pro Leu Val Met Gln Cys Gln Arg Glu Gln Gly Asp Thr

625 630 635 640

Arg Lys Asp Asp Val Val Lys Glu Glu Ile Phe Trp Lys His Ile Ala

645 650 655

Pro His Phe Asp Val Lys Leu Ala Ile Asp Asp Arg Thr Gln Val Val

660 665 670

Glu Met Trp Arg Arg Ile Gly Val Glu Cys Trp Gln Val Ala Ser Gly

675 680 685

Asp

<210> 4

<211> 698

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met His His His His His His His His Asn Ser Asp Ile Pro Phe Asp

1 5 10 15

Leu Ile Gln Glu Arg Thr Gly Val Pro Ser Ser Arg Leu Lys Val Ala

20 25 30

Phe Ala Arg Gly Ser Leu Arg Leu Leu Glu Ser Ala Gly Met Gln Ala

35 40 45

Leu Leu Phe Lys Lys Pro Leu Gly Asp Leu Glu Ala Gly Thr Val Ile

50 55 60

Tyr Leu Gly Asp Glu Thr Glu Val Ile Arg Gly Phe Pro Lys Ile Arg

65 70 75 80

Arg Thr Leu Leu Leu Ser Pro Thr Ile Gln Glu His Phe Arg Asp Arg

85 90 95

Val Ala Val Glu Glu Lys Met Asn Gly Tyr Asn Val Arg Ile Ala Cys

100 105 110

Leu Ser Ser Gly Glu Thr Val Ala Leu Thr Arg Gly Gly His Val Cys

115 120 125

Pro Phe Thr Thr Arg Lys Ala Gln Glu Leu Leu Asp Leu Ser Glu Phe

130 135 140

Phe Arg Glu His Pro Asp Leu Val Ile Cys Gly Glu Met Ile Gly Arg

145 150 155 160

Asp Asn Pro Tyr Val Ser Gln Asp Tyr Pro Glu Val Gly Pro Leu Gly

165 170 175

Phe Arg Val Phe Asp Leu Arg Glu Lys Asn Thr Asn Arg Pro Leu Pro

180 185 190

Val Glu Glu Arg Arg Ala Leu Leu Asp Ser Tyr Gly Leu Pro Asn Val

195 200 205

Arg Leu Phe Gly Val Tyr Pro Ile Glu Glu Ala Ala Ser Glu Val Ala

210 215 220

Asp Ile Ile Arg Ala Leu Gly Met Ala Gly Arg Glu Gly Val Val Met

225 230 235 240

Lys Asp Pro Ser Met Glu Val Pro Pro Leu Lys Tyr Thr Ser Ser Gln

245 250 255

Ala His Ala Arg Glu Leu Ala Tyr Ala Phe Ser Tyr Pro Phe Asp Phe

260 265 270

Gly Arg Pro Phe Phe Phe Ser Arg Val Ile Arg Glu Gly Phe Gln Ala

275 280 285

Tyr Glu Leu Asp Glu Ser Asp Asp Glu Thr Arg Glu Arg Ala Arg Arg

290 295 300

Leu Gly Glu Ala Ile Ile Tyr Pro Met Leu Glu Arg Ile Lys Ser Ile

305 310 315 320

Ser Ala Gly Glu Ala Ala Tyr Glu Asp Thr Val Ile Asp Val Glu Asp

325 330 335

Arg Glu Ala Ala Glu Glu Phe Ile Arg His Leu Val Arg Leu Gly Val

340 345 350

Ser Ala Thr Leu Ala Asp Tyr Arg Asp Gly Arg Ala Thr Ile Arg Arg

355 360 365

Phe Tyr Gln Ser Thr Thr Asp Arg Ile Asn Asn Tyr Leu Lys Gly Gly

370 375 380

Leu Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gly Lys

385 390 395 400

Lys Ile Ile Leu Thr Ile Gly Cys Pro Gly Ser Gly Lys Ser Thr Trp

405 410 415

Ala Arg Glu Phe Ile Ala Lys Asn Pro Gly Phe Tyr Asn Ile Asn Arg

420 425 430

Asp Asp Tyr Arg Gln Ser Ile Met Ala His Glu Glu Arg Asp Glu Tyr

435 440 445

Lys Tyr Thr Lys Lys Lys Glu Gly Ile Val Thr Gly Met Gln Phe Asp

450 455 460

Thr Ala Lys Ser Ile Leu Tyr Gly Gly Asp Ser Val Lys Gly Val Ile

465 470 475 480

Ile Ser Asp Thr Asn Leu Asn Pro Glu Arg Arg Leu Ala Trp Glu Thr

485 490 495

Phe Ala Lys Glu Tyr Gly Trp Lys Val Glu His Lys Val Phe Asp Val

500 505 510

Pro Trp Thr Glu Leu Val Lys Arg Asn Ser Lys Arg Gly Thr Lys Ala

515 520 525

Val Pro Ile Asp Val Leu Arg Ser Met Tyr Lys Ser Met Arg Glu Tyr

530 535 540

Leu Gly Leu Pro Val Tyr Asn Gly Thr Pro Gly Lys Pro Lys Ala Val

545 550 555 560

Ile Phe Asp Val Asp Gly Thr Leu Ala Lys Met Asn Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Tyr Asp Leu Glu Lys Cys Asp Thr Asp Val Ile Asn Pro Met Val Val

580 585 590

Glu Leu Ser Lys Met Tyr Ala Leu Met Gly Tyr Gln Ile Val Val Val

595 600 605

Ser Gly Arg Glu Ser Gly Thr Lys Glu Asp Pro Thr Lys Tyr Tyr Arg

610 615 620

Met Thr Arg Lys Trp Val Glu Asp Ile Ala Gly Val Pro Leu Val Met

625 630 635 640

Gln Cys Gln Arg Glu Gln Gly Asp Thr Arg Lys Asp Asp Val Val Lys

645 650 655

Glu Glu Ile Phe Trp Lys His Ile Ala Pro His Phe Asp Val Lys Leu

660 665 670

Ala Ile Asp Asp Arg Thr Gln Val Val Glu Met Trp Arg Arg Ile Gly

675 680 685

Val Glu Cys Trp Gln Val Ala Ser Gly Asp

690 695

Claims

1.一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶，其特征在于，包含以下项或由其组成：

（a）SEQ ID NO：3至4中所示的氨基酸序列；或；

（c）包含表达Mth RNA Ligase蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：1和表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：2，中间接或不接linker肽段，linker肽段可为长度1至任意长度的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶，其特征在于，所述的包含表达MthRNALigase蛋白的氨基酸序列和/或表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列的任意端具有亲和纯化氨基酸标签。

3.根据权利要求2所述的一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶，其特征在于，所述的亲和纯化氨基酸标签包括但不限于连续组氨酸标签（His）、GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签，及其他用于亲和纯化的标签氨基酸序列融合。

4.根据权利要求2所述的一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶，其特征在于，所述的包含表达MthRNALigase蛋白的氨基酸序列的N端带有6-8个组氨酸的纯化氨基酸标签和/或所述的表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列的C端带有6-8个组氨酸纯化标签。

5.根据权利要求4所述的一种新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶，其特征在于，所述的包含表达Mth RNA Ligase蛋白的氨基酸序列和/或表达T4 PNK蛋白的氨基酸序列的任意端的亲和纯化氨基酸标签，可以在蛋白制备和纯化过程中通过酶切方法去除亲和纯化标签。

6.一种权利要求1所述的新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（4）分别使用5’-羟基DNA或5’-磷酸化单链DNA对融合酶的磷酸化腺苷酰化活性进行测试，经尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定为腺苷酰化修饰的DNA。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌感受态细胞为BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞。

8.一种权利要求1所述的新型热稳定磷酸化和腺苷酰化一步法催化酶在作为制备催化核酸腺苷酰化试剂上的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的核酸的腺苷酰化包括磷酸化DNA或羟基末端DNA的腺苷酰化和RNA的腺苷酰化。