CN113916753A - 基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统及分选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统及分选方法，系统包括激光源、二向色分束器、凸透镜、声分选芯片、光电倍增管、带通滤波器；激光源，用于发射一束1.2mm的激光束；二向色分束器a，用于将激光源发射的激光束反射至下方；凸透镜；位于二向色分束器a的下方，将反射的激光束聚焦成直径为70μm的微小激光光斑，使激光光斑与声分选芯片的荧光审问区对齐；荧光粒子或荧光标记细胞通过激光光斑时，将被激发并发出比激发波长更长的光。本发明提供微流控技术具有精确细胞操作的能力，在改造和小型化传统FACS系统方面具有巨大潜力。利用高度聚焦的表面声波束在千赫速率下的荧光审问来分类微米大小的粒子和生物细胞。
Description
技术领域
本发明属于细胞分选技术领域，尤其涉及基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选方法。
背景技术
荧光激活细胞分选(FACS)是一种能够在单细胞水平上进行高通量细胞分析和分选的精确微尺度操作技术，已成为生物研究和临床诊断的基础技术。在传统的FACS系统中，含有荧光染料标记的目标细胞类型的细胞悬浮也通过毛细管连续引入，并通过更快的鞘流技术进行流体动力学限制。有序的单个细胞通过激光束，目标生物细胞中的荧光标记被激发。这些荧光信号代表了独特的细胞表面生物标志物，能够对下游的单个细胞进行高度特异性的分类。然后一个振动机制将连续的流动液体打断成单个微米大小的液滴。基于荧光审问，含有目标细胞的液滴被选择性的地带电并静电偏转到一个收集容器中。与离心、磁激活细胞分选等批处理细胞分选方法相比，FACS系统在单个细胞的基础上分离目标细胞，因此具有更高的分选精度。
虽然非常高效和准确，但复杂的分选机制使当前的FACS系统昂贵和笨重，而且在分选过程之前，在开放环境中产生的气溶胶会对环境造成潜在的样本污染，并通过吸入有害生物的气溶胶对机器操作人员造成生物安全风险。目前的FACS系统也通常部署在多个研究实验室共享的核心设施中，导致了调度冲突和测试样品的潜在交叉污染。此外，由于分选所需的强电场，分选细胞的活力可能会受到损害。
微流控技术是一种很有前途的方法，以克服传统FACS系统的缺点，微米大小的颗粒可以在微型化的设备中精确操作。采用完全集成的执行机构和无气溶胶分拣设计，基于微流控技术的FACS设备已经证明了可以避免样品污染和最大限度降低用户健康风险的能力。此外，额外的微流控功能的灵活集成，包括特性描述、培养、混合和聚合酶链反应，可以为基于微流控技术的FACS系统提供更复杂的预处理和分析能力。与传统的基于静电的FACS分选机制相比，基于介质电泳、声电泳、MEMS阀和起泡喷射的微流体分选机制得到了验证。尽管这些研究已经证明了先进的微流体方法在连续流中精确的细胞分选，许多仍然遭受内在的限制，阻止它们的实际应用的可行性。例如以介电泳为基础的细胞分选需要对缓冲液的电性能进行细致的维护，特别是电导率，这在不同的生物样品之间可能存在显著差异。此外，外加强电场可诱发细胞电穿孔和热损伤。气泡喷射驱动依赖于主微流控通道侧腔的微气泡产生和膨胀所产生的流动廓线的瞬时变化。当微泡在每次动作后崩溃时，它会导致回流进入空腔，从而将细胞拉向目标出口的相反方向，从而增加错误分类的风险。
由于低功耗和良好的生物相容性，声学电泳已被证明是一种有前途的微流控技术，可根据大小、密度和可压缩性对微尺度细胞和颗粒进行分类。一些最近的研究已经利用声学电泳来荧光活化筛选微粒、细胞和液滴。Johansson等人[1]和Jokobsson等人[2]分别演示了使用驻波进行荧光激活的细胞和粒子分选。这些设备是基于体声波(BAW)换能器构建的，导致了一个广泛的分选区域(在几毫米量级)，在那里大量的非目标细胞可以被分选到目标细胞的收集出口。Nawaz等人[3]演示了驻场表面声波(SAW)驱动的FACS系统，利用聚焦换能器在声波波长(120μm)的量级上产生分选区域宽度。然而，驻波的使用固有地限制了目标细胞的最大平移位移小于声学波长的四分之一。靶细胞与非靶细胞分离距离过小可能会影响细胞分选的准确性，特别是对于较大的细胞。另外，用于粒子操纵的移动声场传输并定位到100μm宽的区域，并证明了在荧光激活系统中分选液滴和细胞的可行性。然而，流体和压电衬底之间的额外聚合物层灰衰减声波，并降低声传播效应的有效性增加声功率可能引起不小的温度上升，可能会损害细胞，并在分类后危及它们的生存能力。利用集中的声波行波，提出了另一种创造局部声学力的途径。
现有技术一的技术方案
一种基于驻场表面声波(SSAWs)的高通量细胞分选方法。利用一对聚焦数字间换能器(FIDTs)产生高分辨率和高能效的SSAW。因此，与传统的声学单元分选方法相比，分选吞吐量显著提高。并且成功地对10μm聚苯乙烯颗粒进行了分选，最小的驱动时间为72μs，这意味着潜在的分选速率超过13800次/秒。在不使用检测单元的情况下，能够演示每秒3300个试件的实际排序吞吐量。
现有技术的缺点
这些设备是基于体声波(BAW)换能器构建的，导致了一个广泛的分选区域(在几毫米量级)，在那里大量的非目标细胞可以被分选到目标细胞的收集出口。且目前的FACS系统相当复杂、昂贵、体积庞大，并且由于开放环境中气溶胶的产生，存在潜在的样品污染和生物安全问题。
现有技术二的技术方案
一种声流孔荧光激活细胞分选(FACS)设备，该设备可以同时进行按需、高通量、高分辨率的细胞检测和分选，集成在一个芯片上。给技术声流孔FACS设备使用“微流控漂移”技术精确地三维聚焦细胞/粒子，并实现单文件粒子/细胞通过激光询问区时的流动。然后利用由电子反馈系统触发的驻场表面声波(SSAW)短脉冲(150μs)对荧光标记的粒子/细胞进行分类。
现有技术二的缺点
驻波使用固有地限制了目标细胞的最大平移位移小于声学波长的四分之一。靶细胞与非靶细胞分离距离过小可能会影响细胞分选的准确性，特别是对于较大的细胞。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种基于移动聚焦表面声波束的荧光激活细胞分选系统及分选方法，微流控技术具有精确细胞操作的能力，在改造和小型化传统FACS系统方面具有巨大潜力。利用高度聚焦的表面声波束在千赫速率下的荧光审问来分类微米大小的粒子和生物细胞。该声波束的宽度为50μm，可以对单个粒子和细胞进行高度精确的分类，提升了分选细胞的纯度和细胞活力，具有良好的生物相容性。
本发明采用如下技术方案：
基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统，包括激光源、二向色分束器、凸透镜、声分选芯片、光电倍增管、带通滤波器；
激光源，用于发射一束1.2mm的激光束；
二向色分束器a，用于将激光源发射的激光束反射至下方；
凸透镜；位于二向色分束器a的下方，将反射的激光束聚焦成直径为70μm的微小激光光斑，使激光光斑与声分选芯片的荧光审问区对齐；
荧光粒子或荧光标记细胞通过激光光斑时，将被激发并发出比激发波长更长的光；
二向色分束器b，位于二向色分束器a的上侧，将通过凸透镜和二向色分束器a的荧光反射；
带通滤波器，位于二向色分束器的一侧，作用在于滤除低频和高频的干扰信号，将目标波长信号接受至光电倍增管；
悬浮颗粒或细胞被两个鞘流流体动力学限制，非荧光亚群遵循原始流线，默认流进废物出口；
光电倍增管，位于带通滤波器的一侧，用于识别出被激发出更长波长荧光的荧光粒子或荧光细胞；
光电倍增管一旦检测到单个靶细胞的荧光发射，将输出电压峰值触发一个函数发生器产生脉冲交流信号；
声分选芯片，位于凸透镜的下侧，将放大后的脉冲交流信号应用到聚焦的数字间换能器上，产生聚焦的表面声波束，并将表面声波束耦合到相邻的流体中，使检测到了的荧光粒子或荧光细胞横向转换为同向目标出口的流线，从而实现将荧光细胞或荧光粒子筛选出来。
进一步的，还包括红色LED灯、物镜、常规镜面、长通滤光片，高速摄像机；
红色LED灯，位于二向色分束器b的上侧，照亮声分选芯片；
物镜，位于声分选芯片的下侧，将光放大；
常规镜面，位于物镜的下侧，将光反射；
长通滤光片，位于常规镜面的一侧，阻挡激光波长的强光；
高速摄像机，位于长通滤光片的一侧，用于监控整个分拣过程。
进一步的是，声分选芯片安装在3D打印支架上。
进一步的是，声分选芯片的微流控通道通过管道与注射器泵连接，声分选芯片的聚焦数字换能器与功率放大器的输出连接。
进一步的是，激光源是35mW、473nm波长的固态激光源。
进一步的是，聚焦的数字间换能器上，产生聚焦的表面声波束的宽度是50um。
基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选方法，包括如下步骤：
步骤1.激光源发射一束直径为1.2mm的激光束；
步骤2.二向色分束器a将步骤1中的激光束反射到凸透镜，凸透镜将反射的激光束聚焦为直径为70μm的微小激光光斑，激光光斑需与声分选芯片的荧光审问区对齐；
荧光粒子或荧光标记细胞进入激光光斑，荧光物质被激发并发出比激发波长更长的光；
步骤3.通过凸透镜和二向色分束器a的荧光发射被二向色分束器反射，经过带通滤波器的过滤作用，进入光电倍增管进行显示；
步骤4.声分选芯片对粒子进行分选操作
(4.1).当光电倍增管未检测到单个靶细胞的荧光发射时；
悬浮颗粒或细胞被两个鞘流流体动力学限制，非荧光亚群遵循原始流线，默认流进废物出口；
(4.2).当光电倍增管检测到单个靶细胞的荧光发射时；
光电倍增管输出的电压峰值触发一个函数发生器产生脉冲交流信号，经过信号放大后，脉冲交流信号被应用到聚焦的声分选芯片的数字间换能器上，产生聚焦的表面声波束，并将其耦合到相邻的流体中，使得荧光粒子或荧光细胞横向转向为同向目标出口的流线。
进一步的，利用红色LED灯照射声分选芯片，图像通过物镜放大、常规镜面的反射、长通滤光片的过滤，最终记录在高速摄像机内，完成筛选过程的监控。
进一步的是，聚焦为直径为70μm的微小激光光斑的调整方式为：激光源,红色LED灯,带通滤波器,凸透镜,光电倍增管,二向色分束器a和二向色分束器b被组装并安装在手动z轴平台上，集成为系统，在xy平面上手动将系统与物镜对齐，再沿z轴进行调整，使声分选芯片微流控通道内激光光斑最小。
本发明的有益效果：
1.利用声分选芯片分选细胞或粒子不会产生气溶胶，从而不会对环境造成潜在的样本污染，并通过吸入有害生物的气溶胶对系统操作人员造成生物安全风险。
2.提高了细胞或粒子的分选精度以及细胞的存活率。应用本系统从稀释的全血样本中分离出荧光标记的MCF-7乳腺癌细胞，分选的MCF-7细胞纯度高于86％。声学分选前后的细胞活力均高于95％，表明其具有良好的生物相容性。
3.利用微流控技术极大的缩小了系统的体积。
附图说明
图1为本发明的声学FACS系统设计示意图；
图2为声学分选芯片中单细胞的隔离情况图；
图3为声波分选芯片的显微图；
图4为声分选芯片的组装流程图；
图5为利用本发明从11.8um非荧光聚苯乙烯颗粒中分离出7μm荧光聚苯乙烯颗粒图；
图6为声波束脉冲持续时间对分选过程纯度和回收率的影响曲线图。
图中：1-激光源、2-二向色分束器a、3-凸透镜、4-声分选芯片、5-二向色分束器b、6-光电倍增管、7-带通滤波器、8-物镜、9-常规镜面、10-高速摄像机、11-红色LED灯、12-长通滤光片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明的基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统，包括激光源1、二向色分束器、凸透镜3、声分选芯片4、光电倍增管6、带通滤波器7。
其中，一束直径为1.2mm的激光束从激光源1发射出来，然后通过二向色分束器a2反射下来。激光束通过凸透镜3聚焦成直径为70μm的微小激光光斑，与声分选芯片4的荧光审问区对齐。一旦荧光粒子或荧光标记细胞进入激光光斑，荧光物质被激发并发出比激发波长更长的光。通过凸透镜3和二向色分束器a2的荧光发射被另一个二向色分束器b5反射到光电倍增管(PMT)6，光电倍增管(PMT)6可以将接收到的光强度转换为电压信号。带通滤波器7放置在光电倍增管(PMT)6的前面，光电倍增管(PMT)6只对荧光发射波长透明。
如图2所示，悬浮颗粒或细胞被两个鞘流流体动力学限制，因此非荧光亚群遵循原始流线，默认流进废物出口。一旦光电倍增管6(PMT)检测到单个靶细胞的荧光发射，其输出电压峰值触发一个函数发生器产生脉冲交流信号。信号放大后，脉冲交流信号被应用到聚焦数字换能器(FIDT)上，产生聚焦的表面声波束，它耦合到相邻的流体中，并将检测到的粒子或细胞横向转换为同向目标出口的流线。
综上所述，荧光检测将激活脉冲聚焦行声表面声波束(FTSAW)，从异质群体中筛选出单个目标粒子或细胞。
如图3所示，红色发光LED灯11从上至下照亮声分选芯片。在经过物镜8的光放大和常规镜面9的反射后，整个分选过程由高速摄像机10监控，从设备的底部成像。长通滤光片12阻挡激光波长的强光，以避免高速摄像机10过度曝光。
本发明中声分选芯片4由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的微流控通道层和在铌酸锂(LiNbO3)衬底上制作的聚焦数字换能器(FIDT)组成。其中40μm深的微流控通道是通过一种广泛使用的软光刻工艺制作的，通过在预制的母模上铸造聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
采用标准提离工艺在128°旋转y切割x传播LiNbO3衬底表面沉积Cr/Al层(7nm/200nm)，制备了聚焦数字换能器(FIDT)。该聚焦数字换能器(FIDT)由36对同轴弓状电极组成，电极宽度和间距均为7.5μm，对应于声衬底波长为30μm，共振频率为132MHz。
该聚焦数字换能器(FIDT)近端孔径为160μm，与远端夹角为26°。随后利用电子束增发沉积了300nm厚的SiO2层，以防止腐蚀并促进与聚二甲基硅氧烷(PDMS)的结合。随后聚二甲基硅氧烷(PDMS)和铌酸锂(LiNbO3)衬垫经过150秒的空气等离子体处理后排列并结合在一起，形成最终的声分选芯片4。
如图4所示，使用标准软光刻技术分别制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道和带有微支柱和支架的的薄聚二甲基硅氧烷(PDMS)层。等离子体处理后将聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道与带有微支柱和支架的的薄聚二甲基硅氧烷(PDMS)层(微柱层)粘接，形成一次性聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道。一次性聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道用手放置在SAW换能器上，该换能器由一个带有数字间换能器(IDTs)的压电衬底组成。通道器件可以毫不费力地拆卸和丢弃，而声表面换能器可以重复使用。
本发明中声分选芯片4安装在3D打印支架上，微流控通道通过管道与注射器泵连接，聚焦数字换能器(FIDT)与功率放大器的输出连接。然后将带有声分选芯片4的3D打印支架放置在带有高速摄像机10的导致显微镜的台上。
如图1所示，光学组件和声学分选芯片4包括35mW、473nm波长的固态激光源1，纯红色LED灯11，带通滤波器7,凸透镜3,光电倍增管6,二向色分束器a2和二向色分束器b5。这些被组装并安装在手动z轴平台上，集成为本发明系统。在xy平面上手动将本发明系统与显微镜物镜对齐，然后沿z轴进行调整，使声分选芯片4微流控通道内激光光斑最小。
通过移动显微镜的XY平台，可以调节激光光斑与聚焦声波光束的距离。每次荧光检测时，本系统向函数发生器输出高电平电压信号。在0.1μs延迟触发模式下，函数发生器向功率放大器产生一个确定持续时间和功率的脉冲交流信号，然后将其应用于聚焦数字换能器(FIDT)上产生表面声波。
实施例
如图5-6所示，微米级聚合物颗粒作为各种抗体和生物标志物的载体，在生物医学研究和诊断中发挥着至关重要的作用，对微米级聚合物颗粒的筛选和分类需求日益增加。首先使用本系统演示7.0μm(荧光)和11.8μm(普通)聚苯乙烯颗粒的分选。在颗粒分选实验中，上鞘流、中鞘流和下鞘流的流速分别为2.8μl min-1、1.0μl min-1和1.0μl min-1。脉冲交流信号作用在聚焦数字换能器(FIDT)上的功率P＝8mW。
图5中为一副延时的图像，它叠加了每秒10毫秒记录的125帧的所有粒子位置。在激光光斑中进行荧光询问后，7μm的荧光粒子横向平移并切换到目标出口，而11.8μm的普通粒子沿原流线移动到废料出口。当脉冲持续时间大于0.25ms(t＝0.25ms)时，7μm目标颗粒在目标出口混合溶液中的回收率随脉冲持续时间的增加而提高，接近100％。图6中，脉冲持续时间的延长导致目标出口纯度略有下降。这是由于当一个荧光粒子紧跟着一个非荧光粒子时，较长的脉冲持续时间增加了非目标粒子被翻译的机会。
本发明证明了单粒子水平操纵使用高度聚焦的传播表面声波束，展示了本发明系统，利用高度聚焦的表面声波束在千赫速率下的荧光探讯来分类微米大小的粒子和生物细胞。该声波束的宽度为50μm，可以对单个粒子和细胞进行高度精确的分类。应用声学本系统从稀释的全血样本中分离出荧光标记的MCF-7乳腺癌细胞，分选的MCF-7细胞纯度高于86％。声学分选前后的细胞活力均高于95％，表明其具有良好的生物相容性，可在生物医学研究中广泛应用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统，其特征在于,包括激光源、二向色分束器、凸透镜、声分选芯片、光电倍增管、带通滤波器；
激光源，用于发射一束1.2mm的激光束；
二向色分束器a，用于将激光源发射的激光束反射至下方；
凸透镜；位于二向色分束器a的下方，将反射的激光束聚焦成直径为70μm的微小激光光斑，使激光光斑与声分选芯片的荧光审问区对齐；
荧光粒子或荧光标记细胞通过激光光斑时，将被激发并发出比激发波长更长的光，并作为目标波长信号；
二向色分束器b，位于二向色分束器a的上侧，将通过凸透镜和二向色分束器a的荧光反射；
带通滤波器，位于二向色分束器b的一侧，用于滤除低频和高频的干扰信号，将目标波长信号接受至光电倍增管；
光电倍增管，位于带通滤波器的一侧，用于识别出被激发出更长波长荧光的荧光粒子或荧光细胞；光电倍增管一旦检测到单个靶细胞的荧光发射，将输出电压峰值触发一个函数发生器产生脉冲交流信号；
声分选芯片，位于凸透镜的下侧，将放大后的脉冲交流信号应用到聚焦的数字间换能器上，产生聚焦的表面声波束，并将表面声波束耦合到相邻的流体中，使检测到了的荧光粒子或荧光细胞横向转换为同向目标出口的流线，从而实现将荧光细胞或荧光粒子筛选出来。
2.根据权利要求1所述的基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统，其特征在于，还包括红色LED灯、物镜、常规镜面、长通滤光片，高速摄像机；
红色LED灯，位于二向色分束器b的上侧，照亮声分选芯片；
物镜，位于声分选芯片的下侧，将光放大；
常规镜面，位于物镜的下侧，将光反射；
长通滤光片，位于常规镜面的一侧，阻挡激光波长的强光；
高速摄像机，位于长通滤光片的一侧，用于监控整个分拣过程。
3.根据权利要求1所述的基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统，其特征在于，声分选芯片安装在3D打印支架上。
4.根据权利要求1所述的基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统，其特征在于，声分选芯片的微流控通道通过管道与注射器泵连接，声分选芯片的聚焦数字换能器与功率放大器的输出连接。
5.根据权利要求1所述的基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统，其特征在于，激光源是35mW、473nm波长的固态激光源。
6.根据权利要求4所述的基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选系统，其特征在于，聚焦数字换能器上，产生聚焦的表面声波束的宽度是50um。
7.基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.激光源发射一束直径为1.2mm的激光束；
步骤2.二向色分束器a将步骤1中的激光束反射到凸透镜，凸透镜将反射的激光束聚焦为直径为70μm的微小激光光斑，激光光斑与声分选芯片的荧光审问区对齐；当荧光粒子或荧光标记细胞进入激光光斑时，荧光物质被激发并发出比激发波长更长的光；
步骤3.通过凸透镜和二向色分束器a的荧光发射被二向色分束器b反射，经过带通滤波器的过滤作用，进入光电倍增管进行显示；
步骤4.声分选芯片对粒子进行分选操作，包括
(4.1).当光电倍增管未检测到单个靶细胞的荧光发射时；
悬浮颗粒或细胞被两个鞘流流体动力学限制，非荧光亚群遵循原始流线，默认流进废物出口；
(4.2).当光电倍增管检测到单个靶细胞的荧光发射时；
光电倍增管输出的电压峰值触发一个函数发生器产生脉冲交流信号，经过信号放大后，脉冲交流信号被应用到聚焦的声分选芯片的数字间换能器上，产生聚焦的表面声波束，并将其耦合到相邻的流体中，使得荧光粒子或荧光细胞横向转向为同向目标出口的流线。
8.根据权利要求7所述的基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选方法，其特征在于，还包括步骤5.利用红色LED灯照射声分选芯片，图像通过物镜放大、常规镜面的反射、长通滤光片的过滤，最终记录在高速摄像机内，完成筛选过程的监控。
9.根据权利要求7所述的基于移动聚焦表面声束的荧光激活细胞分选方法，其特征在于，步骤2中，聚焦为直径70μm的微小激光光斑的调整方式为：激光源,红色LED灯,带通滤波器,凸透镜,光电倍增管,二向色分束器a和二向色分束器b被组装并安装在手动z轴平台上，集成为系统，在xy平面上手动将系统与物镜对齐，再沿z轴进行调整，使声分选芯片微流控通道内激光光斑最小。
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