CN113912713A

CN113912713A - 一种抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN113912713A
Application number: CN202111526647.4A
Authority: CN
Inventors: 马咏翔; 庞晓静
Original assignee: Beijing Kaixiang Hongkang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Kaixiang Hongkang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN113912713B

Abstract

本发明公开了一种抗α‑突触核蛋白的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株53A2G6分泌，其具有如SEQ ID NO.1‑3所示的重链的CDR1‑3，SEQ ID NO.11‑13所示的轻链的CDR1‑3，该单克隆抗体具有较高的亲和力以及特异性。

Description

一种抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物技术、免疫学领域，涉及一种抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

α-突触核蛋白（-synuclein，α-syn）由 140个氨基酸组成。其结构包括3部分，即N-端结构域、可变中央非β淀粉样成分（non-Aβ-component，NAC）结构域及C-端结构域。α-突触核蛋白在脑细胞中表达较高，其主要位于突触前端，α-突触蛋白在脑组织中广泛表达，约占脑细胞中胞质总蛋白的1%，尤其在新皮质、海马、黑质、丘脑和小脑中高表达，也在心脏、肌肉和其它组织中少量表达。

α-突触核蛋白构成的病理性包涵体常见于帕金森病（Parkinson s disease，PD）、路易体痴呆（dementia with Lewy bodies，DLB）、多系统萎缩（multiple systematrophy，MSA）以及一些罕见疾病，由于这些疾病中突触核蛋白的异常聚集，因此它们统称为α-突触核蛋白病。

α -突触核蛋白是开发α -突触核蛋白病(例如帕金森病)的治疗剂的靶标。主要的开发策略包括抑制聚集体形成、基因沉默和去除聚集体。目前针对α-syn的抗体有针对不同聚集状态的α-syn的抗体(抗单体，抗寡聚体，抗纤维化抗体)；α-syn分为三个结构域，N端，NAC区及C端，所以也有针对识别α-syn不同区域的抗体(抗N端，抗C端，抗NAC区抗体)，但是目前均没有应用到临床上。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌抗α-突触核蛋白的杂交瘤细胞株和抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用。

本发明的第一方面提供了一种抗α-突触核蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含：

分别如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3；以及分别如SEQ ID NO.11、12、13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3。

进一步，所述重链可变区还包含：

分别如SEQ ID NO.4、5、6、7所示氨基酸序列的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4；以及分别如SEQ ID NO.14、15、16、17所示氨基酸序列的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4。

进一步，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列。

进一步，所述重链可变区具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列。

进一步，所述单克隆抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。

本发明的第二方面提供了核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段。

进一步，所述编码重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的核酸分子具有与SEQ ID NO.21、22、23所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列的同一性的序列；编码轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的核酸分子具有与SEQ ID NO.31、32、33所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列的同一性的序列。

进一步，编码重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的核酸分子具有与SEQ IDNO.24、25、26、27所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列的同一性的序列；编码轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的核酸分子具有与SEQ ID NO.34、35、36、37所示的核苷酸序列至少90%，优选95%序列的同一性的序列。

进一步，编码重链可变区的核酸分子具有与SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列至少85%，优选90%，更为优选95%序列同一性的序列；编码轻链可变区的核酸分子具有与SEQ IDNO.39所示的核苷酸序列至少85%，优选90%，更为优选95%序列同一性的序列。

进一步，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。

本发明的第三方面提供了含有本发明第二方面所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、宿主细胞、工程菌或转基因细胞系。

进一步，所述生物材料包含与所述单克隆抗体重链可操作地连接的第一信号肽，和/或与所述单克隆抗体可操作地连接的第二信号肽。

进一步，所述第一信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述第二信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

进一步，编码所述第一信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，编码所述第二信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示。

本发明的第四方面提供了一种产品，所述产品包括第一方面所述的单克隆抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的生物材料。

进一步，所述产品包括试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括：胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒(ELISA)、荧光免疫试剂盒和微流体芯片。

本发明第五方面提供了如下任一项所述的应用：

1）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的生物材料、本发明第四方面所述的产品在检测α-突触核蛋白中的应用；

2）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的生物材料、本发明第四方面所述的产品与α-突触核蛋白病的试剂中的应用；

3）本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的生物材料、本发明第四方面所述的产品在制备预防和/或治疗与α-突触核蛋白病的药物中的应用。

进一步，所述α-突触核蛋白病为神经退行性疾病。

进一步，所述神经退行性疾病包括帕金森病、路易体痴呆、弥漫性路易体疾病、阿兹海默氏病的路易体变型、合并型阿兹海默氏病和帕金森氏病、多系统萎缩、具有I型脑铁积聚的神经退化。

附图说明

图1是western检测免疫小鼠抗血清对重组抗原识别能力图；

图2是western检测53A2G6单克隆抗体培养上清对重组抗原识别能力图；

图3是纯化抗体与抗原结合的特异性检测图，其中图A为53A2G6和3D4H7联合检测；图B为53A2G6和34E10D8联合检测；图C为53A2G6和25F5C5联合检测。

具体实施方式

为了制备特异性强，亲和力高的抗α-突触核蛋白的抗体，本发明通过制备α-突触核重组蛋白来免疫动物，从而获得分泌阳性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而纯化得到特异性高的单克隆抗体。

术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子，获自一群基本相同的抗体。该单克隆抗体显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。典型地，免疫球蛋白具有重链和轻链。各重链和轻链包含恒定区和可变区（区域也称为"域"）。轻链和重链可变区包含四个框架区，被三个超变区打断，也称为"互补决定区" （CDR）。CDR主要负责结合到抗原的表位。各链的CDR通常为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始连续编号，通常也用特定CDR所处的链标识。

“功能片段”是指抗体的对抗原具有特异性结合亲和力的部分，或包括该部分的多肽。例如，功能片段可以是抗体的包括通过与抗原(例如表位)相互作而赋予抗体对抗原的特异性和/或亲和力的氨基酸残基的部分，或包括该部分的多肽。该功能片段通常包含一个或多个 “互补决定区(CDR)” ，以及另外一个或多个 “框架(FR)”区。CDR是有助于抗体与抗原结合的特异性和亲和力的氨基酸序列，而框架区是有助于维持这些CDR的适当构象并促进抗原结合区与抗原之间结合的氨基酸序列。

如本文所用，抗体或免疫球蛋白的链(重链或轻链)的 “功能片段” 包括抗体的与全长链相比缺少一些氨基酸但可特异性结合至抗原的部分。在可以特异性结合至靶抗原或可以与其他抗体或功能片段竞争结合至特异性表位的方面，该片段可以被认为具有生物学活性。一方面，该片段包含存在于全长轻链或重链中的至少一个CDR，并且在一些实施方式中，该片段包含重链和/或轻链的单链或其部分。该生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以例如通过酶促或化学方法切割完整的抗体来产生。具有免疫功能的免疫球蛋白片段包括Fab、Fab '、F(ab ')2、Fv、结构域抗体和单链抗抗体(例如scFv、scFv-Fc等) ，但不限于此，并且可以来源自任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔子，但不限于此。抗体的功能性部分，例如本文所述的一个或多个CDR，可以通过共价键与二级蛋白质或小分子化合物连接，并用作针对特定靶标的靶标治疗剂。

本发明的单克隆抗体还包括该抗体的功能性变异体，所述功能性变异体可结合至α-突触核蛋白，且具有抗所述亚型或片段的中和活性。

具体地，如果功能性变异体包括（但并不限于）：在一级结构序列中基本类似、但包含本发明的亲本单克隆抗体中没有的例如体外或体内的化学和/或生物化学的改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。

可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能够键合至α-突触核蛋白。例如，与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体对α-突触核蛋白可具有升高或降低的结合亲和力。

进一步，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是CDR3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域（包括三个CDR）和更保守的区域（所谓的构架区域（FR））。高可变区域包括来自CDR 的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如Gap或Bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法（包括PCR、寡核苷酸定点诱变（oligonucleotide-directed mutagenesis）和定点诱变（site-directed mutagenesis））改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。

本领域技术人员还将理解的是，本发明涵盖所述α-突触核蛋白抗体的氨基酸序列修饰。举例而言，可需要改良抗体之结合亲和力及/或其它生物学特性。α-突触核蛋白抗体之氨基酸序列变体是由向α-突触核蛋白抗体核酸中引入适当核苷酸变化或由肽合成制备。该等修饰包括（例如）α-突触核蛋白抗体氨基酸序列内之残基缺失及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代之任何组合以达成最终构建体，其限制条件为该最终构建体具有所要特征。氨基酸变化亦可改变α-突触核蛋白抗体之转译后过程，诸如改变糖基化位点之数目或位置。

术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒和人工染色体，如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1衍生的人工染色体（PAC）；噬菌体，如λ噬菌体或M13 噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多空病毒（例如SV40）。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。术语“复制起点”是指当在载体中存在时其起始复制的序列。复制起点可被复制起始因子或替代地被DNA解螺旋酶识别。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。

本发明对表达载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞（例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞）、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞（如大肠杆菌（E.coli））在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。

载体可以是重组表达载体或克隆载体。本公开提供了载体（例如表达载体），其含有编码抗α-突触核蛋白中和抗体的本文提供的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子和/或至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒（例如SV40）、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3 .3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2 .2、pCMV-SCRIPT .RTM .、pCDM8、pCDNA1 .1/amp、 pcDNA3 .1、pRc/RSV、PCR 2 .1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

本发明中的用于导入载体的细胞包括原核细胞和真核细胞，上述细胞包含（但并不限于）细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；酵母细胞；真菌细胞如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇或夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞，SP2/0，人淋巴样母细胞，COS，NSO，293T，Bowes黑素瘤细胞，HT-1080，BHK（幼仓鼠肾细胞），HEK（人胚肾细胞），PERC.6（人视网膜细胞）等；和植物细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

术语“导入”是指将包括编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。此导入可以通过本领域中已知的各种方法，包括磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，脂质体融合，脂转染和原生质体融合进行。此外，转染是指用病毒颗粒通过感染将期望材料递送入细胞。此外，该载体可以通过基因轰击导入宿主细胞。在本发明中，导入与转染可以互换使用。

本发明的重组细胞接着可以用于表达以及培养目的，用于大量药物生产的抗体表达。还可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。

作为一种可选择的实施方式，本发明中的产品包括本发明所制备的抗体或其功能片段。作为另外一种可选择的实施方式，本发明的产品包括诊断组合物，所述诊断组合物包括至少一种可检测的标签，诸如可检测的部分/试剂。标签可非共价地缀合至本发明的单克隆抗体。标签还可通过共价键直接缀合至单克隆抗体。可选择地，标签可利用一种或多种连接化合物缀合至上述单克隆抗体。用于将标签缀合至单克隆抗体的技术对本领域的技术人员是公知的。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自由（但并不限于）酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光物质包括鲁米诺；合适的生物发光物质包括荧光素酶、荧光素和水母素；并且合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。

本发明中的药物组合物包括本发明的单克隆抗体，以及药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂可另外含有液体，诸如水、生理盐水、甘油和乙醇。另外，诸如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质的辅助物质可存在于所述组合物中。这些载剂使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以便患者摄入。

合适的施用形式包括适用于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过快速注射或连续输液、静脉内、可吸入或皮下形式。在产品用于注射或输注的情况下，其可采用在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且其可含有配制试剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可呈干燥形式，用于在使用之前用合适的无菌液体重构。还可制备适于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。

一旦配制，本发明的组合物可直接施用至受试者。因此，本文提供根据本发明的抗体或其抗原结合片段用于制造药剂的用途。

待治疗的受试者可以是动物。优选地，根据本发明的药物组合物经调整以用于向人受试者施用。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 抗α-突触核蛋白抗体的制备

1、免疫原处理：免疫原为重组α-突触核蛋白，经SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和分子量，经过ImmunoPlus技术处理，增强免疫原性。

2、动物免疫：选取BALB/c小鼠，常规方法免疫。经三次免疫后，用间接ELISA方法测试抗血清效价，选取效价高的小鼠进行后续实验，使用western测试抗血清对重组抗原的识别。

3、脾细胞制备：引颈处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于已消毒的90~100目不锈钢网中。用注射器向脾脏内注入3 ml无血清培养液，反复抽吸数次获取细胞，再制成细胞悬液。把细胞悬液注入50ml离心管中，加10~20ml培养液，轻轻吹打数次，室温中静置5分钟。离心（800~1000转/分）计数，备用。

4、细胞融合：将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞按1：5比例混合，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。将1ml 40%的PEG溶液60秒内逐滴加入到细胞团中，同时并不断轻微转动离心管。在不断转动的离心管中，60秒内逐滴加入1ml无血清培养液。而后于5 分钟内缓慢加完20ml无血清培养基。离心（800 转/分，8 分钟），去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀。将细胞悬液加入96孔板内，每孔50微升。37℃ CO₂培养箱中培养24小时后更换成HAT选择性培养液。

5、融合后细胞培养：融合后7~10天用HAT培养液半量换液，以后每隔2~3天半量换液一次。2~3周后出现杂交细胞集落。待集落增殖生长至1/3孔时，取培养上清用ELISA方法进行抗体检测。以重组蛋白作为抗原包被酶标板，包被抗原浓度为1μg/ml, 100μl/孔。包被缓冲液为PBS（PH=7.4）。4℃放置过夜。次日PBS洗涤3次，每次5分钟。以1% BSA封闭，每孔加入200μl。37℃恒温箱孵育2小时。弃去BSA，加入含有单克隆抗体的细胞培养上清，每孔100μl。以小鼠的阳性抗血清作为阳性对照，以空白培养上清作为阴性对照。37℃恒温箱孵育2小时。弃去一抗，洗涤液洗5次，加Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG，37℃恒温箱孵育1小时。加入底物显色后，以酶标仪测定吸光值。

将检测的阳性细胞进行再一轮的克隆化培养，经验证后确定阳性细胞株，增殖后进行冻存和体外培养。

6、结果

经过三次免疫后，用间接ELISA方法对六只免疫小鼠（#4142~#4147）抗血清识别重组抗原的效价检测的结果如表1所示，结果表明重组α-突触核蛋白具有较好的免疫原性，免疫小鼠后能产生较强的免疫应答反应。

表1 小鼠血清效价测定

使用western检测免疫小鼠抗血清对重组抗原的识别，结果如图1所示，结果表明免疫小鼠抗血清对重组抗原具有较好的识别能力。

阳性细胞株经亚克隆后，得到多株稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株：53A2G6、22B5G6、25F5C5、34E10D8、3D4H7。杂交瘤细胞株53A2G6培养上清的ELISA检测结果如表2所示，说明杂交瘤细胞株53A2G6产生了针对重组α-突触核蛋白的抗体。

表2 杂交瘤细胞株的ELISA测定

实施例2 单克隆抗体的纯化及测序

首先将产生单克隆抗体的培养液，应用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；再用亲和层析法进一步纯化。

1、硫酸铵溶液初步沉淀

用饱和硫酸铵溶液进行盐析。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8；将产生抗体的培养液移入烧杯中，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液5ml，继续缓慢搅拌30分钟；10000rpm/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于PBS（0.01mol/L PH7.2）缓冲液中。

用透析法对盐析样本进行脱盐。将透析袋于2% NaHCO₃，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

2、亲和层析法进行抗体纯化

将初步纯化的抗体溶液经过protein A/G亲和层析柱过滤，经过结合、洗脱、收集，得到高纯度的抗体。利用分光光度计测定抗体浓度。将纯化的抗体分装后在-80℃保存。

3、单克隆抗体序列的测定

取对数生长期的杂交瘤细胞53A2G6，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入载体，测序、进行序列分析。

4、结果

序列检测结果如表3所示，重链的CDR1-3以及轻链的CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3和SEQ ID NO.11-13所示；重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.19所示。

表3 单克隆抗体序列

实施例3 单克隆抗体的鉴定

1、以临床样本中的α-突触核蛋白作为抗原，以小鼠杂交瘤细胞53A2G6的单克隆培养上清进行检测，使用间接ELISA方法检测抗体识别抗原的能力。

2、以临床样本中的α-突触核蛋白作为抗原，以含有单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞53A2G6培养上清进行检测，使用western blot检测抗体抗原的结合能力。

3、应用双抗体夹心ELISA方法，检测杂交瘤细胞53A2G6产生的单克隆抗体对抗原的识别能力，检测抗体为杂交瘤细胞株产生的抗体：3D4H7-biotin、22B5G6-biotin、25F5C5-biotin、34E10D8-biotin、49B2G9-biotin、53A2G6-biotin、63E12C2-biotin、68E6D6-biotin、71G2F7-biotin、75G12C8-biotin、77G9C11-biotin。

以2.5μg/ml的纯化抗体包被酶标板，包被液为PBS（pH=7.4），4℃放置过夜。洗涤液洗涤3次，加入重组蛋白作为抗原，抗原浓度分别为0、1、10、100ng/ml。37℃孵育1小时。洗涤3次，加入生物素标记的检测抗体，浓度为1μg/ml。37℃孵育1小时。洗涤3次，加入HRP标记的链酶亲和素，与检测抗体结合，浓度为1mg/ml，1:10,000稀释，每孔加入100μl。37℃孵育30分钟。加底物显色，酶标仪测定吸光值。

4、将单克隆抗体53A2G6与抗体3D4H7-biotin、34E10D8-biotin、25F5C5-biotin配对组合，检测纯化抗体与抗原结合的特异性，将抗原进行倍比稀释，根据抗原浓度与吸光值进行绘图。

5、结果

间接ELISA法检测结果如表4所示，抗体的吸光值>2，远远大于阴性对照值0.256，说明抗体对α-突触核蛋白有很好的亲和力。

表4 单克隆抗体的ELISA检测

Western法检测结果如图2所示，在14KD左右的位置，出现强阳性条带，说明抗体对临床样本中的抗原有很强的结合力。

双抗夹心ELISA检测结果如表5所示，该抗体与其它抗体3D4H7-biotin、22B5G6-biotin、25F5C5-biotin、34E10D8-biotin配对成功，随着抗体含量的增加，吸光值随之上升。抗原浓度为100ng/ml 时，吸光值>3，明显高于阴性对照。说明该抗体对抗原有很强的识别和捕获作用。

表5 纯化抗体对抗原的识别

单克隆抗体53A2G6与抗体3D4H7-biotin、34E10D8-biotin、25F5C5-biotin配对组合检测抗原抗体的特异性结合如图3所示，随着抗原浓度升高，吸光值也随之升高，说明抗体与抗原结合具有特异性。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京凯祥弘康生物科技有限公司

<120> 一种抗α-突触核蛋白的单克隆抗体及其应用

<141> 2021-12-10

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Tyr Thr Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Tyr Ala Gln Val

1 5

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Thr Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 9

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Tyr Ala Gln Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 10

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Thr Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Tyr Ala Gln Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

115 120 125

Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Trp Gln Gly Thr His Leu Val Thr

1 5

<210> 14

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 16

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

1 5 10

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu

1 5 10 15

Ala Asn Gly

<210> 19

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Leu Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu

1 5 10 15

Ala Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val

20 25 30

Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Leu Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Trp Gln Gly Thr His Leu Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Leu Lys

130

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

acctatacca tgtct 15

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

accattacta gtggtggtac ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg c 51

<210> 23

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcctatgctc aagtc 15

<210> 24

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gacgtgaagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt 90

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgggttcgcc agactccgga gaagaggctg gagtgggtcg ca 42

<210> 26

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cgattcacca tctccagaga caatgccaag aacaccctgt acctgcaaat gaacactctg 60

aagtctgagg acacagccat ctattactgt acaagg 96

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tca 33

<210> 28

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgaacttcg ggctcagatt gattttcctt gtccttactt taaaaggtgt ccagtgt 57

<210> 29

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gacgtgaagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatacca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attactagtg gtggtactta cacctactat 180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga acactctgaa gtctgaggac acagccatct attactgtac aaggtcctat 300

gctcaagtct ggggcgcagg gaccacggtc accgtctcct ca 342

<210> 30

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atgaacttcg ggctcagatt gattttcctt gtccttactt taaaaggtgt ccagtgtgac 60

gtgaagctgg tggagtctgg gggagactta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtacc tataccatgt cttgggttcg ccagactccg 180

gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt actagtggtg gtacttacac ctactatcca 240

gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300

caaatgaaca ctctgaagtc tgaggacaca gccatctatt actgtacaag gtcctatgct 360

caagtctggg gcgcagggac cacggtcacc gtctcctca 399

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aagtcaagtc agagcctctt agatagtgat ggaaagacat atttgagt 48

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctggtgtcta cactggactc t 21

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tggcaaggta cacatttggt cacg 24

<210> 34

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgc 69

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tggttgttac agaggccagg ccagtctcca aagcgcctaa tctat 45

<210> 36

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagc 60

agagtggagg ctgaggattt gggagtttat tattgc 96

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 30

<210> 38

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaagc caacggt 57

<210> 39

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgagttgg 120

ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc tacactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acatttggtc 300

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333

<210> 40

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaagc caacggtgat 60

gttgtgatga cccagactcc actcactttg tcggttacca ttggacaacc agcctccatc 120

tcttgcaagt caagtcagag cctcttagat agtgatggaa agacatattt gagttggttg 180

ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc ctaatctatc tggtgtctac actggactct 240

ggagtccctg acaggttcac tggcagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagc 300

agagtggagg ctgaggattt gggagtttat tattgctggc aaggtacaca tttggtcacg 360

ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 390

Claims

1.一种抗α-突触核蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含：

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区还包含：

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区具有如SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区具有如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。

5.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的单克隆抗体或其功能片段。

6.含有权利要求5所述的核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体、转座子、宿主细胞、工程菌或转基因细胞系。

7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含与所述单克隆抗体重链可操作地连接的第一信号肽，和/或与所述单克隆抗体可操作地连接的第二信号肽。

8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述第一信号肽的氨基酸序列如SEQID NO.8所示；所述第二信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

9.一种产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的生物材料。

10.如下任一项所述的应用：

1）权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的生物材料、权利要求9所述的产品在检测α-突触核蛋白中的应用；

2）权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的生物材料、权利要求9所述的产品在制备诊断α-突触核蛋白病的试剂中的应用；

3）权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6-8任一项所述的生物材料、权利要求9所述的产品在制备预防和/或治疗与α-突触核蛋白病的药物中的应用。