CN113905739A - 用于降低β淀粉样蛋白形成的组合物和方法及其组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于降低β淀粉样蛋白形成和用于治疗与β淀粉样蛋白的积累相关的疾病的方法。本发明提供了(1)通过抑制Aβ寡聚体/原纤维形成来抑制Aβ聚集，(2)通过抑制β‑促淀粉样蛋白生成的加工来降低BACE‑1，(3)脑血流量增加以降低细胞外Aβ单体、寡聚体和Aβ原纤维/斑，(4)激活NO/cGMP/PKG/CREB途径以抑制神经元细胞死亡并促进神经发生、突触发生、血管生成，(5)通过激活Wnt信号传导以抑制DKK‑1来恢复突触可塑性，并且阻抑Aβ产生的正反馈回路用于抑制APP生成降低和Aβ积累，(6)在用于治疗的毒性米罗那非、西地那非、伐地那非、他达拉非、乌地那非、达生他非和阿伐那非；以及在含选定的关键成分化合物的药物化合物组合物中的药学上可接受的盐、溶剂化物和水合物内细胞的自噬激活，通过去除可溶性Aβ寡聚体来抑制Aβ原纤维/斑形成；以及此与所提供的治疗方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年3月24日提交的美国临时申请序列号62/822,975的优先权的权益，其内容通过援引并入本文。
技术领域
本发明涉及用于降低β淀粉样蛋白形成和用于治疗与β淀粉样蛋白的积累相关的疾病的方法。
背景技术
痴呆是指患有多重认知损害(或MCD，多重认知缺陷)的临床疾病，为表现出由多种遗传和环境危险因素引起的多方面发病机制的获得性脑疾病。引起痴呆的疾病的代表是阿尔茨海默病，它主要在老年人中流行，并且占全部痴呆的60-70％(Ann Neurol.1993May；33(5):494-501.)。最近人口迅速老龄化，由阿尔茨海默病引起的老年人中更渐进性的痴呆已经增加，并且对痴呆的治疗需求也增加。然而，研究和开发的困难在额外的低成功率下降低了用于痴呆的新治疗剂和治疗方法的开发过程。基于2014年GBI研究数据，阿尔茨海默病的治疗剂的最终批准的成功率小于1％，如临床II期为72％，临床III期为92％，以及失败的NDA申请为99.6％，以及约80％的目前正在进行的流水线仅用于“探索性和/或临床前期”。
目前FDA批准的药物的常规清单包括AChE(乙酰胆碱酯酶)抑制剂和NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体拮抗剂，还与抗氧化剂、NSAID(非甾体抗炎药)、抗炎剂、胆固醇合成酶抑制剂制剂或激素制剂等组合使用。然而，这些药物仅用于缓解症状和延迟或改善认知障碍，但目前没有针对痴呆的根本治疗。
代表性的AChE抑制剂包括多奈哌齐(Donepezil)(AriceptTM)、加兰他敏(Galantamine)(ReminylTM)、利斯的明(Rivastigmine)(ENA-713,ExelonTM)等，并且这些药物暂时增加神经递质乙酰胆碱的浓度以提供对症治疗。另外，规定这些药物用于患有轻度至中度阿尔茨海默病、血管性痴呆、帕金森病性痴呆以及卒中或脑皮质下缺血性血管病的患者(J Korean Med Assoc 2009；52(4):417-425.)。
典型的NMDA受体拮抗剂包括美金刚(Memantine)(EbixaTM)，它引起兴奋性毒性以抑制谷氨酸转运系统，这阻断突触可塑性以有效降低神经元变性。美金刚被证实对中度或中度以上痴呆和路易体痴呆有效，具有相对低的副作用，但仅在疾病的更早期示出有限的活性(Arch Neurol 2011Aug；68(8):991-8)。因此，与单药治疗相比，它更多地与ChE抑制剂一起使用，并且用于轻度和重度痴呆。然而，到目前为止，没有发现明确的证据：AChE抑制剂和美金刚的组合比单独的AChE更有效，并且需要额外的研究(Brain Neurorehabil2015Mar；8(1):19-23.)。
然而，虽然这些药物长期用于治疗痴呆和阿尔茨海默病，但没有明确的使用标准，并且此外即使在最大推荐人用剂量(MRHD)下，但是没有改善疾病或者持续疾病的进展，以在接受治疗的患者中导致患者进入终末期，对这些药物的使用存在持续的担忧。然而，直到现在，在不存在具有确认功效的任何治疗剂的情况下，除了继续努力开发用于痴呆的新治疗之外没有替代方案(Korean J Biol Psychiatry 2016May；23(2):48-56.)。
迄今为止，已经开发的用于痴呆治疗的候选物的主要目标包括：(1)BACE-1(β-分泌酶1)的抑制剂或γ-分泌酶抑制剂以抑制Aβ(β淀粉样蛋白)的产生，(2)抗-Aβ单克隆抗体以去除Aβ(β淀粉样蛋白)，(3)Tau聚集抑制剂和(一种氨基酸激酶)TAOK抑制剂以抑制Tau聚集和磷酸化，(4)AchE抑制剂和NMDA受体拮抗剂以阻断AChE和NMDA受体等。最近，靶向Aβ斑和Tau蛋白的流水线已经增加，其中约70-80％的候选物靶向阻抑Aβ产生或去除Aβ。另外，约30％的流水线是具有占优势地高比率的单克隆抗体或肽的生物药物。然而，由于近期具有高期望的候选物的临床试验失败，包括用于靶向的靶向Aβ的抗-Aβ单克隆抗体，诸如阿杜那单抗(Aducanumab)(Biogen)、苏兰组单抗(Solanezumab)(Eli Lilly)和更汀芦单抗(Gantenerumab)(Roche)，Aβ作为用于治疗痴呆的靶标的假设变得不确定。然而，普遍接受的是，开发痴呆治疗剂的关键目标是阻抑Aβ形成并去除Aβ。
Aβ靶向药物开发的问题之一是具有大分子量的单克隆抗体很难穿透细胞膜，并且因此仅能有效去除细胞外淀粉样斑，并且对于细胞内Aβ寡聚体的去除仅具有有限的功效。此外，据报道细胞内Aβ寡聚体比细胞外Aβ寡聚体引起更多的细胞毒性并且对于神经元细胞死亡起更重要的作用(J Biol Chem.2002May 3；277(18):15666-70.)。因此，开发比大分子能穿透细胞膜的小分子药物，诸如用于去除细胞内Aβ寡聚体的单克隆抗体。
最近在本领域引起关注的观点之一是，对于开发用于痴呆的治疗剂的失败的指导原因可能是常规的方法，“一种药物，一种靶标”范例，因为临床障碍痴呆是多方面发病机制的疾病。接受的是，此种传统方法无法实现成功开发用于痴呆的治疗剂。目前，越来越多的兴趣是基于“一种药物、多靶标/机理”范例来开发新的治疗剂来克服上文提及的问题。诸如具有多靶标/多机理活性的一种化合物的方法成为新药物发现和开发的新概念(J NeuralTransm(Vienna).2013Jun；120(6):893-902.,Future Med Chem.2016Apr；8(6):697-711.)。因此，为了克服开发用于痴呆的治疗剂中的困难并增加开发的成功率，与传统的“一种药物，一种靶标”范例相比，从发现候选物开始以及在临床前期需要开发基于“一种药物、多靶标/机理”范例，尤其是考虑到痴呆的多方面发病机制的小分子/多向药理学药物(Expert Rev Clin Pharmacol 2013Jan；6(1):.10.1586/ecp.12.74.,Curr PharmDes.2016；22(21):3171-81.)。
发明内容
本发明的一种实施方式提供了通过经由给药选自以下的化合物之一以去除细胞内毒性的可溶性Aβ寡聚体来抑制Aβ原纤维/斑的形成的方法：米罗那非(Mirodenafil)、西地那非(Sildenafil)、伐地那非(Vardenafil)、他达拉非(Tadalafil)、乌地那非(Udenafil)、达生他非(Dasantafil)和阿伐那非(Avanafil)；以及其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
通过一种实施方式的本发明的方法提供了：(1)通过阻抑Aβ聚集来抑制Aβ寡聚体/原纤维的形成，(2)通过降低BACE-1来抑制β-促淀粉样蛋白生成的(Amyloidogenic)加工，(3)通过脑血流量增加(血管舒张)来降低细胞外Aβ单体、寡聚体、Aβ原纤维/斑的形成，(4)通过激活NO(一氧化氮)/cGMP(环鸟苷一磷酸)/PKG(蛋白激酶G)、CREB(环AMP(腺苷一磷酸)应答元件结合蛋白)途径来抑制神经元细胞死亡并加速神经发生、突触发生和/或促进血管生成，(5)通过经由DKK-1(Dickkopf WNT信号传导途径抑制剂1)的抑制以激活Wint信号传导来恢复突触可塑性(突触可塑性)，并且通过阻抑Aβ产生的正反馈回路来抑制APP(淀粉样前体蛋白)的产生并降低Aβ积累，以及(6)通过经由激活自噬以去除细胞内毒性且可溶性的Aβ寡聚体来抑制Aβ原纤维/斑的形成。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括选自以下的一种化合物作为活性成分：米罗那非、西地那非、伐地那非、他达拉非、乌地那非、达生他非和阿伐那非；以及其药学上可接受的盐、溶剂化物和水合物，该化合物用于(1)通过降低Aβ聚集来抑制Aβ寡聚体/原纤维形成，(2)减少BACE-1来抑制β促淀粉样蛋白生成的加工，(3)通过增加脑血流量来降低细胞外Aβ单体、寡聚体和Aβ原纤维/斑，(4)通过激活NO/cGMP/PKG/CREB途径来阻抑神经元细胞死亡抑制并促进神经发生、突触发生和/或血管生成，(5)通过经由DKK-1的抑制以激活Wint信号传导来恢复突触可塑性(突触可塑性)，并且通过阻抑Aβ产生的正反馈回路来抑制APP的产生并降低Aβ积累，以及(6)通过经由激活自噬以去除细胞内毒性且可溶性的Aβ寡聚体来抑制Aβ原纤维/斑的形成。
附图说明
I.通过降低Aβ聚集来抑制Aβ寡聚体/原纤维形成
图1呈现了示出以下的硫磺素T测定的结果：通过本发明的组合物对Aβ原纤维聚集有剂量依赖性抑制。
图2呈现了示出以下的PICUP(未修饰蛋白的光诱导交联)/SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析的结果：通过用本发明的组合物处理已经降低了Aβ寡聚体聚集的形成。
II.通过BACE-1降低来阻抑β-促淀粉样蛋白生成的加工
图3呈现了示出以下的qRT-PCR(定量实时聚合酶链反应)的结果：用Aβ1-42寡聚体处理，视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的BACE-1mRNA水平增加，但表明增加的BACE-1mRNA水平通过用本发明的组合物处理而浓度依赖性减少。
III.通过增加脑血流量降低细胞外Aβ单体、寡聚体和Aβ原纤维/斑
图4呈现了示出以下的结果：细胞内钙水平，通过用过氧化氢(H2O2)处理周细胞细胞而增加，已经通过用本发明的组合物处理而减少。
IV.通过激活NO/cGMP/PKG/CREB途径来抑制神经元细胞死亡
图5呈现了示出以下的环GMP Complete ELISA结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的cGMP的量，通过Aβ1-42寡聚体的处理而减少，而在浓度依赖性物质中通过用本发明的组合物处理而增加。
图6呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：细胞凋亡相关蛋白(Capase-3和PARP[聚(二磷酸腺苷-核糖)聚合酶])的比率的降低：切割的Capase-3/Caspase-3和切割的PARP和切割的PARP/PARP，这在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中增加，已经通过用本发明的组合物处理而减少。
图7呈现了示出以下的JC-1线粒体膜电位测定的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的线粒体膜电位的浓度，通过Aβ1-42寡聚体的处理而降低，已经通过用本发明的组合物处理而浓度依赖性地增加。
图8呈现了示出以下的
S3活细胞分析的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的由Cytotox红色试剂染色的死亡细胞数目，通过Aβ1-42寡聚体的处理而增加，已经通过用本发明的组合物处理而降低。
V.通过激活NO/cGMP/PKG/CREB途径来促进神经发生、突触发生和血管生成
图9呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的CREB蛋白的Ser133磷酸化，通过Aβ1-42寡聚体的处理而降低，通过用本发明的组合物处理而浓度依赖性地增加。
图10呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的NGF(神经生长因子)和BDNF(脑源性神经营养因子)的蛋白水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而降低，通过用本发明的组合物处理而浓度依赖性地增加。
图11呈现了示出以下的NGF免疫细胞化学法的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的NGF(神经生长因子)的蛋白水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而降低，通过用本发明的组合物处理而增加。
VI.通过经由DKK-1抑制以激活Wnt信号传导来恢复突触可塑性
图12呈现了示出以下的qRT-PCR的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的DKK-1mRNA的水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而增加，通过用本发明的组合物处理而减少。
图13呈现了示出以下的qRT-PCR的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的DKK-1蛋白水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而增加，通过用本发明的组合物处理而减少。
图14呈现了示出以下的qRT-PCR的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt3a mRNA的水平，首先用Aβ1-42寡聚体处理，与对照组相比，通过用本发明的组合物处理而增加。
图15呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：通过用本发明的组合物处理，已经增加了在阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)的海马中的降低的Wnt1蛋白水平。
图16呈现了示出以下的Wnt/β-联蛋白TF阵列(Array)的结果：在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt/β-联蛋白相关因子，VAX2、c-Myc、NR5A2、Mitf、TCF/LEF、NFAT、CEBP、GLI-1、GBX2和AP-1的活性，首先用Aβ1-42寡聚体处理，与对照组相比，通过用本发明的组合物处理而增加超过两倍。
图17呈现了示出以下的TOPFLASH报道基因测定(Wnt/β-联蛋白信号传导)的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt/β-联蛋白活性，通过Aβ1-42寡聚体的处理而降低，通过用本发明的组合物处理而浓度依赖性地增加。
图18呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的GSK3β蛋白的Ser9磷酸化水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而降低，已经通过用本发明的组合物处理而增加。
图19呈现了示出以下的磷酸化-GSK-3b(Ser9)夹心ELISA的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的GSK3β蛋白的Ser9磷酸化水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而降低，已经通过用本发明的组合物处理而增加。
图20呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：通过用本发明的组合物处理，已经减少了在阿尔茨海默病动物模型(NSE-hAPP-C105)的海马中增加的Tau蛋白的Ser9磷酸化水平。
VII.通过经由阻抑DKK-1以阻抑Aβ产生正反馈回路来降低APP形成和Aβ积累
图21呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的APP和Aβ1-42蛋白水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而增加，已经通过用本发明的组合物处理而减少。
图22呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的APP和Aβ1-42蛋白水平，通过H2O2的处理而增加，已经通过用本发明的组合物处理而减少。
VIII.通过经由激活自噬以去除细胞内毒性且可溶性的Aβ寡聚体来抑制Aβ原纤维/斑形成
图23呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：通过用本发明的组合物处理，已经减少了在阿尔茨海默病动物模型(NSE-hAPP-C105)的海马中增加的Aβ蛋白水平。
图24呈现了示出以下的硫磺素S染色/GFAP(胶质纤维酸性蛋白)免疫组织化学法的结果：通过用本发明的组合物处理，已经减少了在阿尔茨海默病动物模型(NSE-hAPP-C105)的海马中的Aβ斑数目。通过计数由硫磺素S染色的Aβ斑(绿色)的数目和由GFAP染色的星形胶质细胞(红色)的共定位点(黄色)的数目，来计数Aβ斑数目。
图25呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中的AMPK催化亚基α的Thr172磷酸化水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而减少，已经通过用本发明的组合物处理而浓度依赖性地增加。
图26呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中的LC3B蛋白(一种自噬标志物)水平，通过Aβ1-42寡聚体的处理而减少，该水平已经增加，同时诱导自噬流(由LC3B-1比LC3B-II转化)以增加LC3B-II/I比率，并且还增加了泛素结合蛋白p62(SQSTM，Sequestosome 1)(自噬体货物蛋白)的表达，该表达由Aβ1-42寡聚体的处理而降低。此外，将3-MA(3-甲基腺嘌呤)(自噬/PI3K抑制剂)与本发明的组合物同时组合使用，通过本发明的组合物增加的自噬流(LC3B-II/I比率)的水平减少，并且通过本发明的组合物减少的p62的表达已经增加。此外，当3-MA与本发明的组合物一起使用时，通过本发明的组合物减少的APP和Aβ1-42蛋白水平增加，并且通过蛋白质印迹分析的结果在图26中示出。
图27呈现了示出以下的蛋白质印迹分析的结果：通过用本发明的组合物处理，阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)的海马中的ATG7和ATG5/12蛋白(即自噬标志物)水平增加，并且皮质中的ATG5/12蛋白水平增加。
IX.改善认知能力和行为学习能力的作用
图28呈现了示出以下的莫里斯(Morris)水迷宫测试的结果：在评价阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中的认知功能水平的改善中，与转基因小鼠对照相比，用本发明的组合物处理的组获得了降低的对目标的潜伏期和与目标的距离，以及增加的在目标象限内的时间和跨平台的数目。
图29呈现了示出以下的被动回避测试的结果：在评价阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中的认知能力和行为学习能力的改善中，与转基因小鼠对照相比，用本发明的组合物处理的组获得了降低的潜伏期时间。
具体实施方式
本发明的一种实施方式提供了一种通过给药选自米罗那非、西地那非、伐地那非、他达拉非、乌地那非、达生他非和阿伐那非；以及其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物的化合物之一用于以下的方法：(1)通过阻抑Aβ聚集来抑制Aβ寡聚体/原纤维的形成，(2)通过降低BACE-1来抑制β-促淀粉样蛋白生成的加工，(3)通过脑血流量增加(血管舒张)来降低细胞外Aβ单体、寡聚体、Aβ原纤维/斑的形成，(4)通过激活NO(一氧化氮)/cGMP(环鸟苷一磷酸)/PKG(蛋白激酶G)、CREB(环AMP(腺苷一磷酸)应答元件结合蛋白)途径来抑制神经元细胞死亡并加速神经发生、突触发生和/或促进血管生成，(5)通过经由DKK-1(DickkopfWNT信号传导途径抑制剂1)的抑制以激活Wint信号传导来恢复突触可塑性(突触可塑性)，并且通过阻抑Aβ产生的正反馈回路来抑制APP(淀粉样前体蛋白)的产生并降低Aβ积累，以及(6)通过经由激活自噬以去除细胞内毒性且可溶性的Aβ寡聚体来抑制Aβ原纤维/斑的形成。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括选自以下的一种化合物作为活性成分：米罗那非、西地那非、伐地那非、他达拉非、乌地那非、达生他非和阿伐那非；以及其药学上可接受的盐、溶剂化物和水合物，该化合物用于(1)通过降低Aβ聚集来抑制Aβ寡聚体/原纤维形成，(2)减少BACE-1来抑制β促淀粉样蛋白生成的加工，(3)通过增加脑血流量来降低细胞外Aβ单体、寡聚体和Aβ原纤维/斑，(4)通过激活NO/cGMP/PKG/CREB途径来阻抑神经元细胞死亡抑制并促进神经发生、突触发生和/或血管生成，(5)通过经由DKK-1的抑制以激活Wint信号传导来恢复突触可塑性(突触可塑性)，并且通过阻抑Aβ产生的正反馈回路来抑制APP的产生并降低Aβ积累，以及(6)通过经由激活自噬以去除细胞内毒性且可溶性的Aβ寡聚体来抑制Aβ原纤维/斑的形成。
本发明具有区别于先前或目前开发的其他阿尔茨海默治疗剂的多机理。本发明通过采用超过基于“一种药物，一种靶标”范例的常规发现策略的“一种药物，多靶标/机理”策略，与市场中当前药物相比，提供了显著改善的治疗阿尔茨海默病的功效，以提供(1)通过降低Aβ聚集来抑制Aβ寡聚体/原纤维形成，(2)减少BACE-1来抑制β促淀粉样蛋白生成的加工，(3)通过增加脑血流量来降低细胞外Aβ单体、寡聚体和Aβ原纤维/斑，(4)通过激活NO/cGMP/PKG/CREB途径来阻抑神经元细胞死亡抑制并促进神经发生、突触发生和/或血管生成，(5)通过经由DKK-1的抑制以激活Wint信号传导来恢复突触可塑性(突触可塑性)，并且通过阻抑Aβ产生的正反馈回路来抑制APP的产生并降低Aβ积累，以及(6)通过经由激活自噬以去除细胞内毒性且可溶性的Aβ寡聚体来抑制Aβ原纤维/斑的形成。
阿尔茨海默病的治疗机理
1.通过抑制Aβ聚集来抑制Aβ寡聚体/原纤维形成
散发性和家族性阿尔茨海默痴呆的共同病理学特征是称为Aβ的肽积累以形成细胞外老年斑(J Alzheimers Dis 2018；64(s1):S567-S610.)。尽管正常人中也产生Aβ，但其降解足够快，不在体内积累。另一方面，在阿尔茨海默病患者的情况下，Aβ不仅大量形成，而且在组织中不降解并且积累(Alzheimers Res Ther 2013Nov 29；5(6):60.)。这些异常的Aβ积累诱导细胞外老年斑的形成，以干扰神经元之间的信号传递，并且还在海马内积累，其在记忆和学习能力以及皮质中起重要作用，以引起细胞炎症和神经元损伤，并最终损伤正常功能所需的神经网络(EBioMedicine 2016Apr；6:42-49.)。另外，积累的Aβ单体是聚集体，以形成毒性Aβ寡聚体，以增加ROS(活性氧)和RNS(活性氮)的产生，以激活与神经元细胞死亡相关的信号网络，以增加细胞凋亡(Mt Sinai J Med.2010Jan-Feb；77(1):43-9.)。
本发明组合物阻抑Aβ原纤维聚集(图1)以抑制Aβ寡聚体/原纤维形成被抑制(图2)。
因此，本发明的组合物抑制Aβ寡聚体聚集寡聚体以抑制Aβ寡聚体/原纤维形成。
2.通过BACE-1降低来阻抑β-促淀粉样蛋白生成的加工
Aβ由APP产生，因为各种分泌酶切割APP，以生成具有各种数目的氨基酸的Aβ。在其之中，在阿尔茨海默患者的情况下，由BACE-1形成的具有42或43个氨基酸的Aβ比率迅速增加。目前，已知由Aβ1-42或Aβ1-43对神经细胞的损伤是阿尔茨海默病进展中的重要原因之一，并且已知Aβ25-35是引起神经元细胞损伤的Aβ1-42或Aβ1-43的毒性片段(J AminoAcids 2011；2011:198430.,PLoS One 2013；8(1):e53117,J Alzheimers Dis2018；62(3):1345-1367)。特别地，最近报道，西地那非(PDE-5抑制剂)阻抑BACE-1和组织蛋白酶B表达以抑制APP的β-促淀粉样蛋白生成的加工，以降低Aβ1-42或Aβ1-43的产生，并且预期PDE-5抑制剂可以阻抑BACE-1的表达以降低引起神经元细胞损伤的Aβ1-42或Aβ1-43的形成，以对阿尔茨海默病具有治疗作用(J Gerontol a Biol Sci Med Sci 2015Jun；70(6):675-85.,JUrol.2016Apr；195(4Pt 1):1171.)。
本发明的组合物阻抑BACE-1的表达，BACE-1在β-促淀粉样蛋白生成的加工中起关键作用(图3)。
因此，本发明的组合物通过APP抑制β-促淀粉样蛋白生成的加工以降低引起神经元细胞损伤的Aβ1-42或Aβ1-43的形成。
3.通过其他细胞以增加脑血流量来降低Aβ单体、寡聚体和Aβ原纤维/斑
痴呆发作的第一步之一是由各种遗传和环境因素对构成脑血管的细胞(包括内皮细胞、周细胞和血管平滑肌细胞)的损伤，随后破坏血脑屏障，使神经毒性蛋白诸如Aβ蛋白或细胞侵入脑组织，以引起脑组织膨胀或各种退行性病变。在脑中，向组织渗透，引起脑组织炎症和各种退行性病变，这在那里是已知的(Nat Rev Neurol 2018Mar；14(3.):133-150.)。
另外，已经报道，随着由阿尔茨海默痴呆引起的认知功能下降的进展，血脑屏障崩溃，负责记忆的脑区域的脑血流量减少，并且该区域继续扩大(Alzheimers Dement2017May；13(5):531-540.)。此外，最近的研究示出，在阿尔茨海默痴呆患者的脑组织中，由Aβ增加的ROS增加周细胞中的钙浓度，以引起血管周细胞收缩，并且因此降低脑血流量的量(Science.2019Jul19；365(6450))。因此，应保持适当的脑血流量，不仅为脑提供大量的氧气和营养，而且有效去除神经毒素，包括二氧化碳和Aβ脑，或通过新陈代谢自然生成的蛋白废物(Nat Rev Neurosci 2017Jul；18(7):419-434)。
PDE5抑制剂用于治疗肺高压或勃起功能障碍，因为它可以抑制PDE5的激活，以防止cGMP至5'-GMP的转化，并最终增加周细胞中cGMP的浓度，以诱导血管的扩张(Int JImpot Res.2004Jun；16Suppl 1:S4-7.)。特别地，在最近的研究中，PDE5抑制剂示出阿尔茨海默患者(J Cereb Blood Flow Metab 2018Feb；38(2):189-203.)。
本发明的组合物降低了周细胞中的细胞内钙浓度，该浓度通过H2O2处理而增加，以表明该组合物可通过抑制由钙浓度增加引起的周细胞收缩来抑制脑血流量的降低(图4)。
因此，本发明的组合物的组合物对于通过经由增加脑组织Aβ来阻抑脑血流量而收缩血管周细胞，并且积累的蛋白质的相同神经毒性的抑制作用似乎在那里是预期的。
4.通过激活NO/cGMP/PKG/CREB途径来抑制神经元细胞死亡，并且促进神经发生、突触发生、血管生成
Aβ单体通过胞吞作用聚集体转染至细胞，以形成毒性可溶性Aβ寡聚体。这些聚集体不仅可以诱导与神经细胞死亡相关的细胞功能障碍，而且还可以增加Tau蛋白(微管相关蛋白)的氢磷酸化，以促进NFT(神经原纤维缠结)的形成。结果是，在该过程中增加的ROS引起线粒体损伤，并激活Caspase-3，以导致神经元细胞的死亡。(Nat RevNeurosci.2007Jul；8(7):499-509.,Neuron.2008Nov 26；60(4):534-42.,Nat RevNeurosci.2011Feb；12(2):65-72.)。
PDE5(磷酸二酯酶5)在大脑皮质和海马中表达，在脑组织中对认知功能发挥重要作用(J Comp Neurol 2003Dec 22；467(4):566-80.)，以及特别地，已经报道，与正常人相比，患有阿尔茨海默病的患者的脑组织中的大脑皮质中的PDE5表达增加(NeuropatholAppl Neurobiol.2015Jun；41(4):471-82.)。此外，已经报道，在小鼠海马中，对于由Aβ降低的脑认知功能重要的突触可塑性，通过NO/cGMP/CREB途径的作用恢复(J Neurosci2005Jul 20；25(29):6887-97.)。
据报道，PDE5抑制剂还可以抑制神经元细胞凋亡，并且这是因为PED5抑制剂可以抑制PED5活性以防止cGMP至5'-GMP的转化。结果是，cGMP在脑中积累以激活PKG(MolNeurobiol.2010Jun；41(2-3):129-37.,ACS Chem Neurosci.2012Nov 21；3(11):832-44.,Exp Neurol.2014Nov；261:267-77.)。激活的PKG阻抑由毒性可溶性Aβ寡聚体激活的Caspase-3，以阻抑神经元细胞凋亡。(Neurobiol Aging 2014Mar；35(3):520-31,Neuroscience 2016Jul 22；328:69-79,Front Pharmacol.2017Mar 8；8:106.)。此外，CREB蛋白的Ser133(其是基因转录因子)的磷酸化激活PKG，PKG将增加与神经发生、突触发生、血管生成相关的因子的表达(Behav Brain Res2013Aug 1；250:230-7,DNA CellBiol.2018Nov；37(11):861-865.)。
本发明的组合物抑制PDE5的激活以防止cGMP至5'-GMP的转化，以增加细胞中cGMP的量(图5)，阻抑Caspase-3的活性(图6)，恢复线粒体膜电位(图7)，以降低Aβ诱导的神经元死亡(图8)。
本发明的组合物通过增加CREB蛋白中的Ser133的磷酸化来增加与神经发生、突触发生和血管生成相关的因子的表达(图9)。
本发明的组合物增加了主要参与调节神经元的生长、维持、增殖和存活的NGF和BDNF的表达(图10和11)。
因此，本发明提供了通过激活NO/cGMP/PKG/CREB途径来刺激痴呆患者脑中的神经元细胞凋亡、神经发生、突触发生和血管生成的作用。
5.通过经由阻抑DKK-1以激活Wnt信号传导来恢复突触可塑性，以及通过阻抑正反馈回路来降低APP的产生并抑制Aβ积累
Wnt/β-联蛋白途径是控制包括细胞存活的许多细胞过程的至关重要的信号传递途径。尤其，脑中的Wnt/β-联蛋白途径不仅对神经元存活和神经元信号生成重要，而且在控制突触可塑性、血脑屏障完整性和控制其功能也起着至关重要的作用(Biomed Res Int2014；2014:301575.)。目前，已知Wnt拮抗剂DKK-1的表达在阿尔茨海默患者脑组织中增加，以阻抑Wnt/β-联蛋白途径并增加突触可塑性(J Neurosci 2004Jun 30；24(26):6021-7.,Front Cell Neurosci 2013Nov 5；7:162)。据报道，通过海马神经元中积累的Aβ增加了DKK-1的表达，以降低了突触可塑性(J Neurosci 2012Mar 7；32(10):3492-8.)。此外，据报道，DKK-1对Aβ产生起到正反馈回路的作用，并且这给予预期，替代作为常规地靶向Aβ，其可能通过抑制DKK-1(DKK-1是aβ产生的正反馈回路的至关重要的控制器)以降低Aβ产生以降低突触的丢失来减缓阿尔茨海默病的进展(J Mol Cell Biol.2014Feb；6(1):75-80.，Neuron.2014Oct 1；84(1):63-77.，Cell Death Dis.2014Nov 27；5:e1544.，CurrBiol.2016Oct 10；26(19):2551-2561.，Front Neurosci.2016Oct 19；10:459.，TranslPsychiatry.2018Sep 20；8(1):179.)。
另一方面，在包括额颞痴呆、进行性核上性麻痹和阿尔茨海默病的若干退行性脑疾病中，通过经由过度磷酸化的Tau蛋白的聚集而形成的NFT是该疾病的主要原因，并且这些疾患统称为‘Tau蛋白病(Tauopathy)’(Front Mol Neurosci.2011Oct 5；4:24.,FrontNeurosci.2019Dec 13；13:1274.)。已知由于Wnt/β-联蛋白途径被脑中的各种致病性机理阻抑，引起当前的Tau蛋白病(Mol Brain.2019Dec 4；12(1):104.)，尤其是通过Aβ在脑内的积累阻抑Wnt/β-联蛋白途径来降低了GSK3β蛋白中的Ser9磷酸化并且增加了Tyr216磷酸化，以激活GSK3β并增强小鼠海马神经元中的Tau蛋白的磷酸化。结果是，NFT的形成增强，以降低神经元存活、神经元的生成、突触可塑性、血脑屏障完整性和功能性，以增强Tau蛋白病的进展(Neurosci Res.1998Aug；31(4):317-23.,Annu Rev Pathol.2019Jan 24；14:239-261.)。
总之，通过在脑中积累Aβ而增加的DKK-1的表达充当Wnt拮抗剂以阻抑Wbt/β-联蛋白途径，并激活GSK3β以增加NFT的形成，从而降低突触可塑性，并且也充当aβ产生的正反馈回路，以增强aβ的产生和积累，以促使退行性脑疾患的进展。因此，靶向DKK-1表达抑制的疗法预期通过经由激活Wnt信号传导以恢复突触可塑性，并且通过经由阻抑Aβ产生的正反馈回路以降低Aβ的形成和积累，从而抑制包括阿尔茨海默病的退行性脑疾病。
本发明的组合物降低了DKK-1——一种Wnt拮抗剂和Aβ产生的正反馈回路的调节子的表达(图12、13)。
本发明的组合物增加了Wnt3a(图14)和Wnt1(图15)的表达，Wnt/β-联蛋白相关转录因子(VAX2、c-Myc、NR5A2、Mitf、TCF/LEF、NFAT、CEBP、GLI-1、GBX2、AP-1)的活性(图16)，并增加了Wnt/β-联蛋白的活性(图17)。
本发明的组合物增加了GSK3β蛋白的Ser9磷酸化以抑制活性(GSK3β活性)(图18、19)。
本发明的组合物降低了在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中增加的Tau蛋白的Ser199/202磷酸化(图20)。
本发明的组合物抑制Aβ产生正反馈回路，并且结果是降低APP和Aβ蛋白水平(图21、22)。
因此，本发明的组合物预期通过激活来自DKK-1抑制的Wnt信号传导来恢复突触可塑性，并通过阻抑Aβ产生的正反馈回路来降低APP的形成和Aβ的积累。
6.激活自噬以抑制毒性可溶性Aβ寡聚体和Aβ斑的形成
虽然大脑消耗的氧气为人体消耗的总氧气的20％或更多，但去除来自细胞内不可避免生成的活性氧(ROS)的防御机制是弱的，并且因此对氧化应激的抵抗是弱的。通过氧化应激在细胞内积累的ROS诱导内质网中蛋白质的氧化，以抑制蛋白质折叠并积累错折叠蛋白质，并且最终内质网应激(JNeurochem.2006Jun；97(6):1634-58.，Antioxid RedoxSignal.2007Dec；9(12):2277-93.)。结果是，由内质网应激引起的细胞内aβ积累进一步增加内质网应激以及内体(endosomal)和溶酶体渗漏以及线粒体功能障碍，以增强神经元细胞凋亡(J Neurosci Res.2011Jul；89(7):1031-42.)。此外，最近对患有阿尔茨海默痴呆的患者进行全基因组关联研究显示与Aβ释放或去除相关的基因突变(SORL1、BIN1、CD2AP、PICALM)，这证实了Aβ的细胞内积累是阿尔茨海默痴呆进展的主要原因(TrendsNeurosci.2017Oct；40(10):592-602.，Nat Rev Mol Cell Biol.2018Dec；19(12):755-773.)。
最近，自噬作为神经退行性疾病的主要原因引起了关注。自噬是主要的细胞机理之一，并且已经已知，自噬发挥作用以分解长寿蛋白和细胞器(Nat Med.2013Aug；19(8):983-97.)。自噬功能障碍引起细胞内错折叠蛋白质聚集体的积累，从而诱导各种疾病，并且尤其是与四种主要神经退行性疾病，即阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化的发作密切相关(Mol Cells.2015May；38(5):381-9.,Nat Rev Drug Discov.2018Sep；17(9):660-688.)。尤其，阿尔茨海默病患者的脑中功能障碍的自噬诱导阿尔茨海默病的两个主要发作因素，即Aβ和Tau蛋白的积累(J Syst Integr Neurosci.2017；3(4):1-6.)。结果是，脑中积累的Aβ和Tau蛋白形成老年斑，以引起海马和皮质中负责认知能力的神经元细胞坏死，并最终引起阿尔茨海默病患者的认知功能降低(J Cell Biol.2005Oct 10；171(1):87-98.,Front Aging Neurosci.2018Jan 30；10:04.)。
AMPK(腺苷一磷酸激活的蛋白激酶)负责控制若干生物学功能，包括胰岛素敏感性、细胞存活、增殖和细胞凋亡，其中，尤其，通过经由抑制mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)蛋白来激活自噬以维持细胞稳态(Nat Rev Mol Cell Biol.2018Feb；19(2):121-135.,MolCell.2017Jun15；66(6):789-800.)。目前，通过AMPK催化亚基a的Thr172磷酸化是激活自噬的信号传递途径的主要起始点(Exp Mol Med.2016Apr 1；48:e224.,Nat Rev Mol CellBiol.2018Feb；19(2):121–135.，Nat Rev Drug Discov.2019Jul；18(7):527-551.)，并且最近，在退行性脑疾病中，据报道，通过经由来自激活的AMPK的自噬激活，来去除与退行性脑疾病相关的错折叠蛋白质聚集体来抑制神经元变性，这些聚集体包括Aβ和Tau，它们是阿尔茨海默病的主要发作因素(Front Neurosci.2018May 22；12:255.,Nat Rev DrugDiscov.2018Sep；17(9):660-688.J Alzheimers Dis.2019；68(1):33–38)。考虑到30-40％的阿尔茨海默病患者患有具有其他病理学症状的混合病理，通过激活来自激活的AMPK的自噬来去除细胞内积累的错折叠蛋白质聚集体(包括Aβ和Tar聚集体)，将是用于包括阿尔茨海默病的退行性脑疾病疗法的未来发展的新目标(Front Neurosci.2018May 22；12:255.,Nat Rev Drug Discov.2018Sep；17(9):660-688.J Alzheimers Dis.2019；68(1):33–38.)。
本发明的组合物降低了阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)的海马中的Aβ蛋白水平(图23)。
本发明的组合物降低了阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)的海马和皮质中的Aβ斑数目(图24)。
本发明的组合物增加了AMPK催化亚基α的Thr172磷酸化(图25)。
本发明的组合物诱导自噬标志物LC3B的自噬流(由LC3B-I比LC3B-II转化)以增加LC3B-II/I比率并且降低自噬体货物蛋白泛素结合蛋白p62(SQSTM，Sequestosome 1)(图26)。
本发明的组合物增强了阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)的海马中的皮质中的自噬标志物ATG7和ATG5/12的表达以及ATG5/12的表达(图26)。
因此，本发明的组合物增加了自噬标志物LC3BII/I比率，降低了自噬体货物蛋白泛素结合蛋白p62，并增加了ATG7和ATG5/12的表达以激活自噬级联(cascade)。
7.用于认知和行为学习技能改善的阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)
为了测试本发明的组合物对由Aβ42的形成和积累引起的神经退行性疾病阿尔茨海默病中出现的逐渐记忆减退和行为障碍的作用，向13个月龄的C57BL/6-Tg(NSE-hAPP-C105)Kor转基因小鼠腹腔内注射本发明的组合物(以4mg/kg，每天一次，持续4周)，然后通过被动回避测试、莫里斯水迷宫测试来测试认知能力和行为学习技能，以分析认知能力和行为学习技能的任何变化。
证实了在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中，与转基因小鼠对照组相比，用本发明的组合物处理的组中的认知能力和行为学习技能得到改善(图28、29)。
实施例
实施例1.本发明的组合物对PDE5的选择性测试(IC50，抑制浓度50)
实施例1-1.用于PDE5选择性的测试方法
为了测试本发明的组合物对PDE5(磷酸二酯酶5)的选择性抑制活性(IC50，抑制浓度50)，该测试由MDS Pharma Services、分析机构CRO(analysis agency CRO)和ScottishBiomedical进行。使用PDE SPA分析试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)测量结果。MDSPharma Services分析了PDE1(牛心)；PDE 2、3、5(人血小板)；PDE4(人U937细胞)；和PDE6(牛视杆细胞)以及Scottish Biomedical分析了PDE 5、7-11(重组人酶)。将测试样品(各自100μL)添加到PDE家族蛋白(10μl)、[3H]-cGMP(5Ci/mL)、牛血清白蛋白(0.5mg/mL)和MgCl2(5mM)在Tris-HCl缓冲液(15mM,pH 7.5)中的混合物中。反应开始于PDE家族蛋白的添加。将每个样品在30℃水浴中储存30分钟，并然后添加SPA珠(PerkinElmer)(50μL)以终止反应。使试管静置20分钟，随后通过液体闪烁计数器(Tri-carb 1500,Packard)测量。为了确定PDE家族蛋白活性的抑制程度，将本发明的组合物和测试样品溶解在DMSO(二甲基亚砜)中，并且然后用蒸馏水稀释溶液，使最终DMSO浓度为至少0.2％(v/v)。全部抑制测试均在cGMP(环鸟苷一磷酸)水解率不超过15％的条件下进行。GMP形成的量依赖于时间和PDE5家族蛋白，以剂量依赖性且成比例地增加。
实施例1-2.用于本发明的组合物的PDE5选择性测试的结果
基于本发明的组合物对11种PDE家族(MDS Pharma Services和ScotishBiomedical)的抑制活性，本发明的组合物对PDE5的IC50为0.338nM(MDS Pharma Services)并且与剩余10种PDE家族蛋白相比，选择性是剩余10种PDE家族蛋白的30-376,471倍(表1)。
表1.对本发明的PDE家族的选择性结果
aMDS Pharma Services；PDE1(牛心)；PDE 2、3、5(人血小板)；PDE4(人U937细胞)；PDE6(牛视杆细胞)。
bScottish Biomedical；PDE 5、7-11(重组人酶)；NI＝观察到无抑制。
实施例2.通过本发明的组合物抑制Aβ聚集的测试
实施例2-1.Aβ聚集抑制的(Aβ聚集抑制)测试方法
实施例2-1-1.硫磺素T测定
如果将Aβ1-42肽(阿尔茨海默病的主要生物标志物和原因之一)在37℃下温育3天，则生成Aβ原纤维和寡聚体。为了测试本发明的组合物用于抑制Aβ原纤维和寡聚体形成的活性，用各种浓度(5、50、500μM)的本发明的组合物处理Aβ1-42(50μM)，然后将混合物在37℃下温育3天，随后测量Aβ1-42原纤维和寡聚体的量。使用Varioskan LUX多功能微孔板读数仪(Multimode Microplate Reader)(Thermo Fisher Scientific，USA)，测量了硫磺素T在激发450nm/发射485下的荧光强度。硫磺素T测定测量来自作为肽聚集体形成的β-片的荧光响应，并示出较高的值，因为形成了更多的聚集体。尽管硫磺素T测定不能在Aβ寡聚体与原纤维之间区分，但优点是它可以定量示出聚集的蛋白质的总量。
实施例2-1-2.PICUP/SDS-PAGE分析
通过PICUP(未修饰蛋白的光诱导交联)分析方法观察Aβ寡聚体的产生。使用PICUP方法，固定生成的Aβ寡聚体和原纤维/斑，随后使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)通过xize分离。使用银染色观察到分开的Aβ1-42肽。
实施例2-2.通过本发明的组合物抑制Aβ聚集的结果
Aβ-42聚集抑制的结果示出，基于硫磺素T测定，与未处理的对照组相比，本发明的组合物抑制Aβ1-42聚集形成，抑制作用讨论剂量依赖性的结果(图1)，并且还通过PICUP/SDS-PAGE分析，与未处理的对照组相比，本发明抑制了Aβ1-42寡聚体和原纤维/斑形成(图2)。考虑到该结果，预期本发明的组合物抑制Aβ寡聚体和原纤维/斑形成。
实施例3.通过本发明的组合物在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的BACE-1表达变化
实施例3-1.用于SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例3-1-1.细胞传代培养
将DMEM/F12完全培养基、DPBS和胰蛋白酶-EDTA的混合物在37℃恒定水浴中预热30分钟。从培养箱中取出细胞培养瓶，以去除全部培养基并用DPBS冲洗一次(T25:5ml、T75:10ml和T175:20ml)。弃去全部DPBS后，添加胰蛋白酶-EDTA(T25:2mL、T75:5mL和T175:10mL)，并将混合物置于37℃下的具有5％CO2的培养箱中持续4分钟。在50ml锥形管中，将新的完全培养基(T25ml、T75:10ml和T175:20ml)和细胞混合并在1500rpm下离心4分钟。去除全部上清液，并添加1ml新鲜DMEM/F12完全培养基，以通过轻敲或移液重悬细胞。将细胞和培养基添加到细胞培养瓶中，以制造T75:20ml和T175:40ml，然后将混合物在37℃下在5％CO2的培养箱中温育。
实施例3-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
将DMEM/F12完全培养基(Hyclone)、DPBS(Hyclone)和胰蛋白酶-EDTA(Hyclone)的混合物在37℃恒定水浴中预热30分钟。从培养箱中取出细胞培养瓶，以去除全部培养基并用DPBS冲洗一次(T75:10ml和T175:20ml)。弃去全部DPBS后，添加胰蛋白酶-EDTA(T75:5mL和T175:10mL)，并将混合物置于37℃下的具有5％CO2的培养箱中持续4分钟。在50ml锥形管中，将新的完全培养基(T75:10ml和T175:20ml)和细胞混合并在1500rpm下离心4分钟。去除全部上清液，并添加1ml新鲜DMEM/F12完全培养基，以通过轻敲或移液重悬细胞。添加一定量的DMEM/F12完全培养基，并将4×104个细胞/cm2转移到I型胶原蛋白涂覆的6孔板或I型胶原蛋白涂覆的60mm、100mm细胞培养皿(Corning)中。24小时后，用DMEM/F12分化培养基[+1％FBS+1％青霉素/链霉素(Hyclone)+10μM视黄酸(Sigma-Aldrich)]更换培养基。在第5天，再次用新的DMEM/F12分化培养基更换培养基。在第8天，再次用新的DMEM/F12分化培养基更换培养基。在第10天，完成分化。
实施例3-2.本发明的Aβ和制备和处理方法
制备DMEM/F12(+1％FBS+1％青霉素/链霉素)以具有1μM人Aβ1-42(Abcam)。将Aβ溶液在37℃下静置3小时以形成Aβ寡聚体。弃去原始细胞培养基，并将新制备的Aβ1-42寡聚体(1μM)溶液单独或用本发明的组合物(最大浓度为40μM)处理，然后将其在37℃下的5％CO2下的培养箱中温育72小时。72小时后，去除培养基，并将细胞用PBS洗涤一次并收集，然后继续以下实验。
实施例3-3.qRT-PCR方法
使用Easy-Blue TM总RNA提取试剂盒(Intron Biotechnology)制备总RNA，并使用PrimeScriptTMII第1链cDNA合成试剂盒(TAKARA)，逆转录1μg RNA。对于BACE-1和β-肌动蛋白PCR，提供cDNA作为模板，
PCR预混液(TAKARA)以及下一个引物：人BACE-1(正向5′-CTGGTATACACCCATCCGGC-3′，反向5′-CTTGGGCAAACGAAGGTTGG-3′)；人β-肌动蛋白(正向5′-CCAGGTCATCACCATTGG-3′，反向5′-CAGAGTACTTGCGCTCAG-3′)。PCR循环条件如下：变性(95℃下45秒)；退火，人BACE-1(60℃下45秒)，β-肌动蛋白(56℃下45秒)；延伸(72℃下45秒)；40个循环。使用QuantStudioTM5(Thermo Scientific)进行qRT-PCR。
实施例3-4.在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中通过本发明的组合物改变BACE-1表达的结果
本发明剂量依赖性地降低了BACE-1mRNA的表达，该表达通过用Aβ1-42处理视黄酸分化的SH-SY5Y细胞而增加(图3)。考虑到这些结果，预期本发明通过阻抑在APP的β-促淀粉样蛋白生成的加工中起主要作用的BACE-1的表达来阻抑引起神经元细胞损伤的Aβ1-42或Aβ1-43的形成。
实施例4.通过本发明的组合物的周细胞内的钙浓度的变化
实施例4-1.用于培养周细胞的方法
实施例4-1-1.细胞传代培养
使用Attachment Factor TM(Cell Systems，#4Z0-210)、细胞外基质(ECM)涂覆若干个T-75cm2细胞培养瓶(SPL，#70075)，持续1分钟，随后将15mL的具有血清和CultureBoostTM(Cell Systems，#4Z0-500)的完全经典培养基添加到烧瓶中，然后在37℃下在CO2下的培养箱中稳定混合物。将温育的原代人脑周细胞(Cell Systems，#ACBRI 498P)用PBS缓冲液洗涤两次，随后添加3mL的0.25％胰蛋白酶(Hyclone,#SH30042.02)并在37℃下在CO2培养箱中使混合物反应2分钟。添加7mL的具有血清和CultureBoostTM的完全经典培养基，并通过重复移液分离细胞簇，并通过离心分离(1,500rpm，4分钟)去除上清液。将细胞簇在1mL的具有血清和CultureBoostTM的完全经典培养基中匀浆，然后在稳定的T-75cm2细胞培养瓶中在最佳CO2下温育细胞。
实施例4-2.用于用H2O2的制备和处理的方法及处理后细胞内钙浓度变化的测量
用Attachment Factor TM涂覆平底96孔板(SPL,#30096)，并将具有血清和CultureBoostTM的完全经典培养基(100μL/孔)添加到每个孔中，随后将板在37℃下在CO2培养箱中稳定1小时。将用0.25％Tyrypsin处理的原代人脑周细胞添加到包含具有血清和CultureBoostTM的完全经典培养基的Attachment Facotr-涂覆的-96孔板中，并将混合物在37℃的CO2培养箱中温育16小时(5×103个细胞/孔)。去除培养细胞的培养基并将细胞用HEPES-缓冲盐水(132mM NaCl、5.9mM KCl、1.2mM MgCl2、1.5mM CaCl2、11.5mM葡萄糖、11.5mM HEPES、1.2mM NaH2PO4)洗涤一次，转移至包含周细胞的96孔中，其中，用HEPES-缓冲盐水将比率细胞内Ca2+染料(Fura-2)(Molecular Probes,#F1201)稀释至1μM，之后在室温下温育30分钟。从96孔板中去除上清液，将细胞用HEPES-缓冲盐水洗涤三次，并用HEPES-缓冲盐水和H2O2稀释的本发明的组合物处理，然后测量荧光以测量细胞内钙浓度的变化。
实施例4-4.通过本发明的组合物在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞的周细胞中的钙浓度变化的结果
本发明的组合物降低了血管周细胞(周细胞)中的细胞内钙浓度，该浓度通过H2O2的处理而增加(图4)。基于该结果，预期本发明的组合物可以抑制由周细胞收缩引起的脑血流量降低，而周细胞收缩转而是通过经由ROS的过量产生而增加周细胞中的钙浓度所引起的。
实施例5.通过本发明的组合物在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的细胞内cGMP的变化
实施例5-1.SH-SY5Y神经元细胞的细胞培养方法
实施例5-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，传代培养细胞。
实施例5-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，进行SH-SY5Y神经元分化。
实施例5-2.本发明的Aβ和制备和处理方法
使用实施例3-2中描述的方法，进行制备和处理。
实施例5-3.细胞内cGMP测量方法
根据环GMP Complete ELISA试剂盒(Abcam,#ab133052，USA)的使用手册进行实验。去除细胞培养基并用0.1mL的0.1M HCl处理细胞，然后在室温下静置10分钟。通过600g离心回收细胞，并且只收集上清液。其中在样品中包括0.1M HCl，每孔添加50μl的中和试剂。按照使用手册，每剂100μl，并且将标准溶液(0、0.8、4、20、100、500pmol/ml)添加到96孔板的每个孔中，并且将50μl的环GMP完全碱性磷酸酶缀合物也添加到每个孔中。添加50μl的环GMP完全抗体后，在室温下将反应进行2小时。一旦去除全部反应溶液，将孔用400μl的洗涤缓冲液洗涤三次。完全去除洗涤缓冲液后，添加5μl的环GMP完全碱性磷酸酶缀合物。在将200μl的pNpp底物溶液添加到每个孔后，在室温下将反应进行1小时。添加50μl的停止溶液，并立即使用孔板读数仪(Plate Reader)在405nm处测量吸收值。使用试剂盒中的使用手册计算结果。
实施例5-4通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的细胞内cGMP的变化的结果
本发明的组合物浓度依赖性地增加了通过用Aβ1-42寡聚体处理视黄酸分化的SH-SY5Y细胞而降低的cGMP浓度(图5)。考虑到此结果，预期本发明选择性地阻抑PDE5的活性(表1)以抑制cGMP至5'-GMP的转化并增加细胞内cGMP，其阻抑Caspase-3的活性(图6)并恢复线粒体膜电位以抑制神经元细胞死亡(图8)。此外，通过本发明增加的细胞内cGMP增加了CREB的活性(图9)以促进包括NGF和BDNF的神经营养因子表达(图10、11)以改善认知功能。
实施例6.通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的细胞凋亡调节相关的蛋白的表达的变化
实施例6-1.SH-SY5Y神经元细胞的细胞培养方法
实施例6-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例6-1-2.SSH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y神经元细胞分化。
实施例6-2.用于制备Aβ的方法以及通过本发明处理的方法
将人Aβ1-42(Abcam)与DMEM/F12(+1％FBS+1％青霉素/链霉素)混合至10μM浓度。使Aβ溶液在37℃下静置3小时以形成Aβ寡聚体。去除培养基，并将新制备的Aβ1-42寡聚体溶液(10μM)与或不与本发明的组合物(最大浓度40μM)一起在37℃下在5％CO2培养箱中温育72小时。72小时后，除去培养基，并用PBS洗涤细胞一次以收集细胞。通过以下程序进行另外的实验。
实施例6-5.蛋白质印迹分析方法
为了提取蛋白质，将细胞用RIPA裂解缓冲液(Bio-Rad)处理，匀浆，并离心(14,000rpm，10分钟，4℃)，以获得上清液。将5％浓缩胶(DW，30％丙烯酰胺：双丙烯酰胺，1MTris pH 6.8，10％SDS，TEMED，10％过硫酸铵)和12％分离凝胶(DW，30％丙烯酰胺：双丙烯酰胺，1.5M Tris pH 8.8，10％SDS，TEMED，10％过硫酸铵)用于SDS-PAGE。将通过离心获得的上清液与4X Laemmli缓冲液(Bio-Rad)以3:1的比率混合，并在95℃下煮沸10分钟以使蛋白质变性。将混合物在冰浴中冷却10分钟，并旋转沉降。将蛋白质大小标志物(Bio-Rad)和每个样品添加到在Mini-ProteinⅡ双板(Dual-Slab)装置(Bio-Rad)中制备的浓缩胶孔中，并在150伏下电泳，直到全部沉淀至底部。用甲醇润湿聚偏二氟乙烯(PVDF)膜以活化，并用转移缓冲液(190mM甘氨酸、50mM Tris-碱、0.05％SDS、20％甲醇)洗涤。将用转移缓冲液润湿的Whatman 3M纸堆放在Mini Trans-Bolt槽(Mini Trans-Bolt Cell)(Bio-Rad)中，并在200mA下通电60分钟以沉积膜。沉积后，将膜用5％脱脂乳溶液(在TBS-T中：10mM Tris-碱pH8.0，150mM NaCl，0.1％Tween-20)在平台摇床上封闭60分钟。表2中提供了用于当前实验的第一抗体。将第一抗体各自在5％脱脂乳中在最佳浓度下稀释，放在平台摇床上在4℃下持续16小时。将第一抗体回收，用TBS-T洗涤3次，每次10分钟，将第二抗体(山羊抗-兔IgG H&L(HRP)，Abcam；山羊抗-小鼠IgG H&L(HRP)，Abcam)用5％脱脂乳以1:10,000比率稀释，随后放在平台摇床上在室温下持续60分钟，并用TBS-T溶液洗涤10分钟，3次。最后，将膜添加到SuperSignalTMWest Femto最高灵敏度底物(SuperSignalTMWest Femto MaximumSensitivity Substrate)(Thermo ScientificTM)并在使用图像分析系统扫描膜之前正确表达颜色(colro)，并使用Image J软件(NIH，USA)计算蛋白质的量。
表2.第一抗体的列表
实施例6-6通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的细胞凋亡调节相关的蛋白的表达的变化
本发明阻抑了由用Aβ1-42寡聚体处理视黄酸分化的SH-SY5Y细胞而增加的切割的Capase-3的形成。结果是，由切割的Caspase-3切割的RARP的量降低，并且因此降低了切割的PARP的形成量(图6)。考虑到这些结果，本发明阻抑由Aβ1-42寡聚体引起的细胞凋亡并且降低神经元细胞死亡以增加神经元细胞存活。
实施例7.通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的线粒体膜电位的变化
实施例7-1.用于培养SH-SY5Y神经元的方法
实施例7-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例7-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y神经元细胞分化。
实施例7-2.用于制备Aβ的方法以及用本发明处理的方法
使用实施例3-2中描述的方法，进行制备和处理。
实施例7-3.用于测量线粒体膜电位的方法
在去除细胞培养基后，用CPBS洗涤细胞一次。JC-1-线粒体膜电位测定试剂盒(Abcam，USA)的JC-1溶液与不具有FBS的培养基混合，并用混合物处理细胞。将细胞置于5％培养箱中，在37℃下持续15分钟。去除培养基并用DPBS洗涤细胞一次并添加干净的培养基。使用Varioskan LUX多功能微孔板读数仪(Thermo Fisher Scientific，USA)，JC-1单体在激发475nm/发射530nm和JC-1二聚体在激发535nm/发射590nm处的荧光。
实施例7-4.在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的线粒体膜电位的变化
本发明剂量依赖性地增加了由用Aβ1-42寡聚体处理视黄酸分化的SH-SY5Y细胞而降低的线粒体膜电位(图7)。考虑到这些结果，本发明降低了由通过Aβ1-42寡聚体形成的过量ROS引起的线粒体损伤，以增加神经元细胞存活。
实施例8.通过经由本发明阻抑视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的神经元细胞死亡的作用的活细胞分析
实施例8-1.SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例8-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例8-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞分化。
实施例8-2.制备Aβ以及用本发明处理
使用实施例3-2中描述的方法，进行制备和处理。
实施例8-3.IncuCyte S3活细胞分析(Satorius，USA)
以1:1,000(v/v)的浓度添加Cytotox红色试剂(Essen Bioscience目录号4632)，并将细胞在5％CO2中37℃下温育24小时。为了分析细胞毒性，将显微镜的最终比率调整为x200，并每1.5小时拍摄一次照片。使用由IncuCyte提供的软件，图像以1.5fps产生，并且为了分析细胞毒性，比较图像中的总红色物体面积读数。实验重复三次，并且使用学生T检验(Student’s T-Test)用于统计分析。全部显著性检验均在P<0.05水平下进行。
实施例8-4.通过经由本发明阻抑视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的神经元细胞死亡的作用的活细胞分析结果
本发明降低了由Cytotox红色试剂染色的通过用Aβ1-42寡聚体处理在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中增加的细胞凋亡细胞(图8)。考虑到此结果，本发明可以通过阻抑由Aβ1-42寡聚体诱导的神经元细胞死亡来增加神经元细胞存活。
实施例9.通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的CREB表达变化
实施例9-1.SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例9-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例9-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，使SY5Y神经元细胞分化。
实施例9-2.Aβ和本发明的制备和处理方法
使用实施例3-2中描述的方法，进行制备和处理。
实施例9-4.蛋白质印迹分析方法
为了提取蛋白质，将细胞用RIPA裂解缓冲液(Biorad)处理，匀浆，并离心(14,000rpm，10分钟，4℃)，以获得上清液。将5％浓缩胶(DW，30％丙烯酰胺：双丙烯酰胺，1MTris pH 6.8，10％SDS，TEMED，10％过硫酸铵)和12％分离凝胶(DW，30％丙烯酰胺：双丙烯酰胺，1.5M Tris pH 8.8，10％SDS，TEMED，10％过硫酸铵)用于SDS-PAGE。将通过离心获得的上清液与4X Laemmli缓冲液(Bio-Rad)以3:1的比率混合，并在95℃下煮沸10分钟以使蛋白质变性。将混合物在冰浴中冷却，并旋转沉降。将蛋白质大小标志物(Bio-Rad)和每个样品注入到在Mini-ProteinⅡ双板装置(Bio-Rad)中配备的浓缩胶孔中，并在150伏下电泳，直到全部沉降在底部。用甲醇润湿聚偏二氟乙烯(PVDF)膜以活化，并用转移缓冲液(190mM甘氨酸、50mM Tris-碱、0.05％SDS、20％甲醇)洗涤。将用转移缓冲液润湿的Whatman3M纸堆放在Mini Trans-Bolt槽(Bio-Rad)中，并在200mA下通电60分钟以沉积膜。沉积后，将膜用3％BSA(牛血清白蛋白)溶液(在TBS-T中：10mM Tris-碱pH 8.0，150mM NaCl，0.1％Tween-20)在平台摇床上封闭60分钟。表3中提供了用于当前实验的第一抗体。将第一抗体各自在5％脱脂乳溶液中在各自最佳浓度下稀释，放在平台摇床上在4℃下持续16小时。将第一抗体回收，用TBS-T洗涤3次，每次10分钟，将第二抗体(山羊抗-兔IgG H&L(HRP)，Abcam；山羊抗-小鼠IgG H&L(HRP)，Abcam)用5％脱脂乳以1:10,000比率稀释，随后放在平台摇床上在室温下持续60分钟，并用TBS-T溶液洗涤10分钟，3次。最后，将膜添加到SuperSignalTMWestFemto最高灵敏度底物(Thermo ScientificTM)并在使用图像分析系统扫描膜之前正确表达颜色，并使用Image J软件(NIH，USA)计算蛋白质的量。
表3.第一抗体的列表
实施例9-5.通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的CREB表达变化
本发明浓度依赖性增加了通过用Aβ1-42寡聚体处理在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中减少的CREB蛋白的Ser133磷酸化(图9)。考虑到此结果，本发明预期增加通过Aβ1-42寡聚体减少的CREB蛋白中的Ser133磷酸化，以恢复CREB蛋白活性(一种细胞转录因子)的活性，以诱导与神经发生、突触发生和血管生成相关的因子的表达，以改善认知功能。
实施例10.通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的NGF和BDNF表达变化
实施例10-1.SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例10-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例10-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y神经母细胞瘤分化。
实施例10-2.Aβ和本发明的制备和处理方法
使用实施例3-2中描述的方法，进行制备和处理。
实施例10-3.蛋白质印迹分析方法
使用实施例6-5中描述的方法，已进行了蛋白质印迹分析，并且表4中提供了用于当前实验的第一抗体和条件。
表4.第一抗体的列表
实施例10-4.NGF免疫细胞化学法(ICC)
将SH-SY5Y温育在Corning BioCoat胶原蛋白I培养载玻片(Corning，#354630)中，4.8x104个细胞/孔，持续7天，用Aβ1-42寡聚体(72小时)和本发明(24小时)处理，并进行NGF免疫染色实验。将细胞固定在4％多聚甲醛(pH 7.4)下持续10分钟，并用冰冷的PBS缓冲液洗涤三次。在PBS中用0.1％Triton X-100细胞透化后，用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞三次。使用封闭溶液(PBS中10％的正常山羊血清)封闭固定细胞30分钟。用于当前实验的第一抗体是表4中的兔抗-NGF抗体(Abcam，#ab52918)。将细胞温育在兔抗-NGF抗体(X300稀释)溶液中在4℃下持续16小时，用PBS缓冲液洗涤三次，用Alexa 488抗-兔IgG第二抗体(X500稀释)在室温下温育1小时，用PBS洗涤一次，与DAPI染色溶液(Abcam，#ab228549)反应用于核染色持续1分钟，并用PBS缓冲液洗涤3次。用Vector Shield封固介质处理细胞，并使用超分辨率共焦激光显微镜(Carl Zeiss，#LSM800)获得荧光图像。
实施例10-5.通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的NGF和BDNF表达变化
在回顾通过本发明增加表达神经营养因子的作用后，蛋白质印迹分析示出，本发明浓度依赖性地增加了通过用Aβ1-42寡聚体处理在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中减少的NGF和BDNF的表达(图10)，以及免疫细胞化学法也示出，本发明增加了通过用Aβ1-42寡聚体处理在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中的NGF的表达(图11)。基于这些结果，预期本发明增加包括NGF和BDNF的神经营养因子的表达，这些神经营养因子发挥诱导神经元存活、发育和功能的重要作用，以刺激神经元细胞的存活和分化，以改善认知功能。
实施例11.通过本发明对在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中表达DKK-1的作用
实施例11-1.SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例11-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例11-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y细胞分化。
实施例11-2.HT-22小鼠海马神经元细胞系的细胞培养方法
实施例11-2-1.细胞传代培养
将DMEM/高葡萄糖培养基(10％FBS、1％青霉素-链霉素)、DPBS和0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃下恒温浴中预热30分钟。从培养箱中取出细胞培养瓶，并弃去现有培养基并用DPBS洗涤一次(T25:5ml、T75:10ml和T175:20ml)。将DPBS全部弃去，添加0.25％胰蛋白酶-EDTA(T25:2ml、T75:5ml和T175:10ml)，并将混合物置于37℃下的5％CO2下的培养箱中持续2分钟。将新完全培养基(T25:4ml、T75:10ml和T175:20ml)和细胞混合在50ml锥形管中，并在1500rpm下离心4分钟。去除全部上清液后，添加新鲜DMEM/高葡萄糖，并通过轻敲或移液重悬细胞。将细胞和培养基添加到细胞培养瓶(T75-15ml和T175-40ml)中并在37℃下在5％CO2下温育。
实施例11-2-2.HT-22细胞的神经元分化
将DMEM/高葡萄糖培养基(10％FBS、1％青霉素-链霉素)、DPBS和0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃下恒温浴中预热30分钟。从培养箱中取出细胞培养瓶，并弃去现有培养基并用DPBS洗涤一次(T25:5ml、T75:10ml和T175:20ml)。将DPBS全部弃去，添加0.25％胰蛋白酶-EDTA(T25:2ml、T75:5ml和T175:10ml)，并将混合物置于37℃下的5％CO2下的培养箱中持续2分钟。将新完全培养基(T25:4ml、T75:10ml和T175:20ml)和细胞混合在50ml锥形管中，并在1500rpm下离心4分钟。去除全部上清液后，添加1ml的新鲜DMEM/高葡萄糖，并通过轻敲或移液重悬细胞。进一步添加最佳量的DMEM/高葡萄糖培养基，并将2×105个细胞/cm2添加到I型胶原蛋白涂覆的6孔板中。24小时后，将培养基更换为分化培养基[Neurobasal加培养基(Gibco)+B-27补充剂(Gibco)+1％青霉素-链霉素]。24小时后，将培养基更换为新的分化培养基，并用Aβ1-42寡聚体和本发明处理6小时。
实施例11-3.Aβ和本发明的制备和处理
使用实施例3-2中描述的方法，进行制备和处理。
实施例11-4.qRT-PCR方法
使用Easy-BlueTM总RNA提取试剂盒(Intron Biotechnology)制备总RNA，并使用PrimeScriptTMII第1链cDNA合成试剂盒(TAKARA)，逆转录1μg RNA。对于人DKK和β-肌动蛋白PCR，提供cDNA作为模板，使用
PCR预混液(TAKARA)以及下一个引物：人DKK1(正向5′-ATTCCAACGCTATCAAGAACC-3′，反向5′-CCAAGGTGCTATGATCATTACC-3′)；人β-肌动蛋白(正向5′-CCAGGTCATCACCATTGG-3′，反向5′-CAGAGTACTTGCGCTCAG-3′)；小鼠DKK1(正向5’-TCTGCTAGGAGCCAGTGCC-3’,反向5’-GATGGTGATCTTTCTGTATCC-3’)；小鼠β-肌动蛋白(正向5’-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3’，反向5’-ATGTCACGCACGATTTCC-3’)。PCR循环条件如下：变性，95℃下45秒；退火，56℃下45秒；延伸，72℃下45秒；40个循环。使用QuantStudioTM5(Thermo Scientific)进行qRT-PCR。
实施例11-5.蛋白质印迹分析方法
使用实施例6-5中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表5中提供了用于当前实验的第一抗体和条件。
表5.第一抗体的列表
实施例11-6.通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的DKK-1表达的变化
本发明减少了在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中，通过用Aβ1-42寡聚体处理而增加的DKK-1在mRNA(图12)中和在蛋白水平(图13)中的表达。考虑到该结果，预期本发明减少了由Aβ1-42寡聚体而增加的DKK-1表达，通过激活Wnt信号传导来恢复突触可塑性(图14-20)以及通过阻抑Aβ产生的正反馈回路来降低APP形成和Aβ积累(图21、22)。
实施例12.通过本发明在分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt基因表达的变化
实施例12-1.HT-22小鼠海马神经元细胞系的细胞培养方法
实施例12-1-1.细胞传代培养
使用实施例11-2-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例12-1-2.HT-22细胞的神经元分化
使用实施例11-2-2中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例12-3.Aβ和本发明的制备和处理方法
制备人Aβ1-42(Abcam)在DMEM/F12(+1％FBS+1％青霉素/链霉素)中的10μM溶液。将Aβ溶液在37℃下放置3小时以形成Aβ寡聚体。弃去现有培养基，并用新制备的Aβ1-42寡聚体(10μM)溶液，与或不与本发明(最大浓度5μM)一起处理细胞，并在37℃下在5％CO2下温育72小时。72小时后，去除培养基，并用PBS洗涤细胞一次并回收。使用以下程序，进行另外的实验。
实施例12-3.qRT-PCR方法
使用Easy-BlueTM总RNA提取试剂盒(Intron Biotechnology)制备总RNA，使用PrimeScriptTMII第1链cDNA合成试剂盒(TAKARA)，逆转录1μg RNA。对于Wnt和β-肌动蛋白PCR，提供cDNA作为模板，使用
PCR预混液(TAKARA)以及以下引物：小鼠Wnt1(正向5′-CTCTTTGGCCGAGAGTTCGTGG-3′，反向5′-CCTCGGTTGCCGTAAAGGACGC-3′)；小鼠Wnt3a(正向5′-CTCGCATGGCATAGATGGGTGC-3′，反向5′-GCAGGTGTGCACGTCATAGAC-3′)；小鼠Wnt5a(正向5′-CATGGAGTGTCTGGCTCCTG-3′，反向5′-GTCCATCCCCTCTGAGGTCTTG-3′)；小鼠Wnt7a(正向5′-CGGGAGATCAAGCAGAATGC-3′，反向5′-GCCTAGCTCTCGGAACTGTGGC-3′)；小鼠β-肌动蛋白(正向5’-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3’，反向5’-ATGTCACGCACGATTTCC-3’)。PCR循环条件如下：变性(95℃下45秒)；退火，Wnt 1，Wnt3a，Wnt 5a(60℃下45秒)；Wnt7a(57℃下45秒)；β-肌动蛋白(56℃下45秒)；延伸(72℃下45秒)；40个循环。使用QuantStudioTM5(ThermoScientific)进行qRT-PCR。
实施例12-4.通过本发明在分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt基因表达的变化
与对照组相比，本发明增加了在用Aβ1-42寡聚体处理的分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt3a基因表达(图14)。考虑到该结果，预期本发明增加了Wnt3a表达，已知该表达增加对认知功能重要的突触活动，并激活经典Wnt信号传导以恢复突触可塑性。
实施例13.通过本发明在阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)中的Wnt表达变化
实施例13-1阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)
使用国际上广泛使用的阿尔茨海默病转基因小鼠模型5XFAD(C57BL/6x SJL)。此模型的特征是阿尔茨海默病的进展显著快于经由5种不同的基遗传转化(APP KM670/671NL(瑞典)、APP I716V(佛罗里达(Florida))、APP V717I(伦敦)、PSEN1 M146L(A>C)、PSEN1L286V)的其他小鼠模型。换言之，预期在此模型中治疗有效的任何组合物在进展相对缓慢的其他APP模型中有效。使用与认知功能相关的皮质和海马区的脑组织进行分析。
实施例13-2.本发明的剂量
经由腹腔内注射5mg/kg/天或10mg/kg/天，向处于旺盛年龄、患有进展性阿尔茨海默病病理和认知功能恶化(6个月，雄性)的小鼠每日给药，持续4周。
实施例13-3.组织的制备
本发明通过腹腔内注射每日给药，持续4周，使用CO2气体在动物室中麻醉动物，切除脑以测量蛋白表达的量，并将海马和大脑皮质分离并储存在-80℃的深冷器(DeepFreezer)中，直到分析蛋白表达。
实施例13-5.蛋白质印迹分析方法
使用实施例6-5中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表6中提供了用于当前实验的第一抗体和条件。
表6.第一抗体的列表
实施例13-6.通过本发明在阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)中的Wnt1表达变化
本发明增加了阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)的海马中的降低的Wnt1表达(图15)。考虑到该结果，预期本发明增加Wnt1的表达，为神经元之间的突触发生提供重要功能，以恢复突触可塑性。
实施例14.使用Wnt/β-联蛋白TF激活分析板阵列(TF Activation ProfilingPlate Array)确认通过本发明在分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的与Wnt/β-联蛋白相关因子相关的因子的激活
实施例14-1.HT-22小鼠海马神经元细胞系的细胞培养方法
实施例14-1-1.细胞传代培养
使用实施例11-2-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例14-1-2.HT-22细胞的神经元分化
使用实施例11-2-2中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例14-2.用于制备Aβ的方法以及用本发明处理的方法
制备人Aβ1-42(Abcam)在DMEM/F12(+1％FBS+1％青霉素/链霉素)中的10μM溶液。将Aβ溶液在37℃下放置3小时以形成Aβ寡聚体。弃去现有培养基，并用新制备的Aβ1-42寡聚体(1μM)溶液，与或不与本发明(最大浓度5μM)一起处理细胞，并在37℃下在5％CO2下温育6小时。6小时后，去除培养基，并用PBS洗涤细胞一次并回收。使用以下程序，进行另外的实验。
实施例14-3.Wnt/β-联蛋白TF激活分析板阵列方法
从细胞中提取核提取物，并按照供应商提供的程序进行Wnt/β-联蛋白TF激活分析板阵列(Signosis，#FA-1007)。使用Varioskan LUX多功能微孔板读数仪(Thermo FisherScientific，USA)测量相对光单位。
实施例14-4.通过转录因子阵列测量Wnt/β-联蛋白相关的转录相关因子的激活
本发明将用Aβ1-42寡聚体处理的分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的包括以下的Wnt/β-联蛋白相关转录因子的活性增加超过两倍：VAX2、c-Myc、NR5A2、Mitf、TCF/LEF、NFAT、CEBP、GLI-1、GBX2和AP-1(图16)。考虑到该结果，预期本发明增加Wnt/β-联蛋白相关转录因子的活性以刺激Wnt信号传导激活以恢复突触可塑性。
实施例15.使用TOPFLASH报道基因测定测量通过本发明在分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt/β-联蛋白活性的变化
实施例15-1.HT-22小鼠海马神经元细胞系的细胞培养方法
实施例15-1-1.细胞传代培养
使用实施例11-2-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例15-1-2.HT-22细胞的神经元分化
使用实施例11-2-2中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例15-2-3.TOPFLASH报道质粒DNA的转染
在6孔板中，将Fugene HD转染试剂(Promega，#E2311)和TOPFLASH报道质粒DNA(pcDNA-β-半乳糖苷酶，TOPFLASH)添加到以2×105个细胞/孔分化的HT-22细胞中，并将细胞在37℃下在5％CO2下温育24小时。
实施例15-2-3.用于制备和处理Aβ和本发明的方法
制备人Aβ1-42(Abcam)在DMEM/F12(+1％FBS+1％青霉素/链霉素)中的1μM溶液。将Aβ1-42的溶液在37℃下放置3小时以形成Aβ寡聚体。转染24小时后，弃去现有细胞培养基，并用新制备的Aβ1-42寡聚体(1μM)溶液，与或不与本发明(最大浓度5μM)一起处理细胞，并在37℃下在5％CO2下温育6小时。6小时后，去除培养基，并用PBS洗涤细胞一次并回收。通过以下程序进行另外的实验。
实施例15-3.TOPFLASH报道基因测定方法
用PBS缓冲液洗涤HT-22细胞两次，用裂解缓冲液(0.1％Triton X-100、200mMTris-Cl(pH 8.0)、Complete Mini蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和Pierce磷酸酶抑制剂微型片剂)制备细胞裂解物(100μl/孔)，定量蛋白质。使用细胞裂解物的部分，进行β-半乳糖苷酶测定并在420nm处测量光吸收。使用其余的细胞裂解物，进行荧光素酶测定以测量发光。使用β-半乳糖苷酶活性(420nm处的吸光度)将获得的发光值用蛋白浓度归一化以获得相对荧光素酶活性值。
实施例15-4.通过TOPFLASH报道基因测定测量由本发明在分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt/β-联蛋白活性的结果
本发明浓度依赖性地增加了通过用Aβ1-42寡聚体处理而降低的分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的Wnt/β-联蛋白活性(图17)。考虑到该结果，预期本发明增加Wnt表达(图14和15)和Wnt/β-联蛋白相关转录因子的活性(图16)，以促进Wnt信号传导的活性以恢复突触可塑性。
实施例16.通过本发明在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中的GSK3β表达的变化
实施例16-1.SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例16-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例16-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y细胞分化。
实施例16-2.HT-22小鼠海马神经元细胞系的细胞培养方法
实施例16-2-1.细胞传代培养
使用11-2-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例16-2-2.HT-22细胞的神经元分化
使用11-2-2中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例16-3.用于制备Aβ的方法以及用本发明处理的方法
使用实施例3-2中描述的方法。进行制备和处理。
实施例16-4.蛋白质印迹分析方法
使用实施例9-4中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表7中提供了第一抗体和其条件。
表7.第一抗体的列表
实施例16-5.
磷酸化-GSK-3b(Ser9)夹心ELISA
将HT-22细胞(1.5×105个细胞/孔)在6-孔板(SPL，#30006)中温育。将培养基用具有B-27补充剂的Neurobal加培养基更换，以及24小时后，用Aβ1-42寡聚体(1μM)和本发明(1、2、5μM)处理细胞6小时。去除细胞培养基并用PBS缓冲液洗涤细胞三次，并将细胞裂解缓冲液(Cell Signaling，#9803)添加到每个孔(100μl/孔)中。将细胞置于冰顶部5分钟，并弃去细胞裂解物以变化至1.5ml，并使用Bioruptor设备使用超声处理匀浆细胞裂解物。将匀浆的细胞裂解物离心(14,000rpm，10分钟)，并使用PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒分析上清液以定量蛋白质的量。将包括在PathScan磷酸化-GSK-3β(Ser9)夹心ELISA试剂盒(CellSignaling，#7311C)中的GSK-3β小鼠mAb涂覆的微孔在室温下稳定30分钟，并将用ELISA样品稀释剂稀释的相同量的蛋白质(30μg/孔)添加到每个微孔中，并将混合物在4℃下反应16小时。用ELISA洗涤缓冲液洗涤每个微孔四次，使用磷酸化-GSK-3β(Ser9)兔检测mAb和抗-兔IgG(HRP连接抗体)(ELISA配制的)进行ELISA实验。将TMB底物溶液用作ELISA底物以测量在450nm处的吸收，以确定磷酸化-GSK-3β(Ser9)的相对量。
实施例16-6.在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞和分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中通过本发明的GSK3β表达变化
回顾通过本发明对GSK3β蛋白的磷酸化的作用，如蛋白质印迹分析所示出，本发明增加了视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中由Aβ1-42寡聚体降低的蛋白质的Ser9磷酸化(图18)，以及磷酸化-GSK-3b(Ser9)夹心ELISA示出，本发明增加了在分化的HT-22小鼠海马神经元细胞中由Aβ1-42寡聚体降低的蛋白质的Ser9磷酸化(图19)。考虑到这些结果，预期本发明增加蛋白质的Ser9磷酸化以使GSK3失活，以降低Tau蛋白的磷酸化以降低Tau病理。
实施例17.通过本发明在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-Happ-C105)中的Tau表达的变化
实施例17-1.实验动物
用于实验的动物是C57BL/6-Tg(NSE-hAPP-C105)Kor转基因小鼠(13个月)，其中，通过过表达仅在脑组织中表达APP C端105氨基酸的突变的APP基因来诱导阿尔茨海默痴呆。将动物饲养在如温度为20±2℃、湿度为50％、照明为08:00-20:00以及熄灯为20:00-08:00控制的条件中。将组确定为对照/无处理组[非tg对照，NTC(n＝6)，阿尔茨海默病组[tg-对照，TC(n＝6)]、用本发明处理的阿尔茨海默病组[tg-本发明，TM(n＝6)]，并且在实验期间不受限制地供应食物和水。
实施例17-2.本发明的给药方法
在对阿尔茨海默病模型的包括小鼠记忆测试、水中迷宫行为测试、运动功能测试和被动回避测试的一次基础测试后，本发明的人每日剂量，基于Reagan-Shaw,等(2008)，通过腹腔内注射以4mg/kg每日一次向13个月龄的阿尔茨海默病模型小鼠给药，持续4周。用相同量的生理盐水给药对照组(NTC)和阿尔茨海默病组(TC)。
实施例17-3.组织制备
本发明通过腹腔内注射每日给药，持续4周，使用CO2气体在动物室中麻醉动物，切除脑以测量蛋白表达的量，并将海马和大脑皮质分离并储存在-80℃的深冷器中，直到分析蛋白表达。
实施例17-4.蛋白质印迹分析方法
使用实施例9-4中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表8中提供了第一抗体和其条件。
表8.第一抗体的列表
实施例17-5.通过本发明在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-Happ-C105)中的Tau表达变化
本发明降低了在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)的海马中增加的Tau蛋白中的Ser199/202磷酸化(图20)。考虑到该结果，预期本发明降低了Tau蛋白中的Ser199/202磷酸化以阻抑Tau蛋白的聚集，以降低NFT的形成并降低Tau病理。
实施例18.在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中通过本发明的APP形成和Aβ积累的变化
实施例18-1.SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例18-1-1.细胞传代培养
使用实施例5-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例18-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例5-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y神经元细胞分化。
实施例18-2.用于制备Aβ的方法以及用本发明处理的方法
实施例18-2-1.用于制备Aβ的方法以及用本发明处理的方法
使用实施例5-2中描述的方法，进行制备和处理。
实施例18-2-2.用于制备H2O2的方法以及用本发明处理的方法
每24小时将包含100μM H2O2的DMEM/F12(+1％FBS+1％青霉素/链霉素)添加到分化的SH-SY5Y细胞中并更新三次，以各种浓度(10、20、40μM)添加本发明，持续24小时。
实施例18-3.蛋白质印迹分析方法
使用实施例6-5中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表9中提供了第一抗体和其条件。
表9.第一抗体的列表
实施例18-4.在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中通过本发明的APP形成、Aβ积累的变化
在视黄酸分化的SH-SY5Y细胞中，本发明降低了通过用Aβ1-42寡聚体(图21)和H2O2(图22)处理而增加的APP形成和Aβ1-42积累。考虑到该结果，预期本发明通过阻抑Aβ产生的正反馈回路来降低APP形成和Aβ积累。
实施例19.通过本发明在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-Happ-C105)中的Aβ表达的变化
实施例19-1.实验动物
使用实施例17-1中描述的相同类型的动物模型。
实施例19-2.本发明的给药方法
使用实施例17-2中描述的相同方法，给药本发明。
实施例19-3.组织的制备
使用实施例17-3中描述的方法，制备和储存组织样品。
实施例19-4.蛋白质印迹分析方法
使用实施例6-5中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表10中提供了第一抗体和其条件。
表10.第一抗体的列表
实施例19-5.阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中的Aβ表达变化的结果
本发明有效降低了在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中的海马中的Aβ的表达(图23)。基于此结果，预期本发明有效阻抑Aβ的形成和积累。
实施例20.在阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)中通过本发明的Aβ斑变化
实施例20-1阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)
使用实施例13-1中描述的动物模型。
实施例20-2.本发明组合物的给药
使用实施例13-2中描述的方法，给药本发明的组合物。
实施例20-3.组织样品的制备和固定
通过腹腔内注射每日给药本发明，持续4周，并且使用CO2气体在动物室中麻醉动物，之后打开胸部以向左心室给药50mM PBS(磷酸盐缓冲盐水)，持续3分钟，并灌注其中4％PFA(多聚甲醛)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液中的固定溶液，持续10分钟。灌注并固定后，将脑切除，并且添加到4℃下的4％PFA固定溶液中持续12小时固定，随后在30％蔗糖溶液中沉淀组织5天，并且切穿
使用冷冻切片机(Leica)以40μm厚度的连续管状截距用于储存。
实施例20-4.使用硫磺素S染色G和GFAP(胶质纤维酸性蛋白)免疫组织化学(IHC)方法的Aβ斑染色方法
小鼠脑组织在4％多聚甲醛(pH 7.4)溶液中固定24小时后，使用30％蔗糖使组织脱水，并制备冰冻切片。表11中提供了第一抗体和条件。在使用1％SDS对脑组织的冰冻切片进行抗原修复后，将样品在4℃下与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体反应16小时。将样品用500μM硫磺素S在50％乙醇中处理7分钟，用于硫磺素S染色。将Alexa
山羊抗-兔(IgG)第二抗体与GFAP抗体/硫磺素S处理的脑组织冰冻切片反应，并将Hoechst33342(Sigma-Aldrich)用于核染色。
表11.第一抗体的列表
实施例20-5.在阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)7260中通过本发明的Aβ斑的变化
本发明降低了阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)的海马和大脑皮质中的Aβ斑的数目(图24)，这是通过计数由硫磺素S染色的Aβ斑(绿色)的数目以及用GFAP染色的星形胶质细胞(红色)的共定位点(黄色)的数目来确定的。考虑到此结果，预期本发明阻抑Aβ产生和Aβ积累，以降低细胞外Aβ斑形成。
实施例21.在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中通过本发明的AMPK表达变化
实施例21-1.SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例21-1-1.细胞传代培养
使用实施例3-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例21-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例3-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y神经元细胞分化。
实施例21-2.用于制备Aβ的方法以及用本发明处理的方法
制备人Aβ1-42(Abcam)在DMEM/F12(+1％FBS+1％青霉素/链霉素)中的1μM溶液。将Aβ溶液在37℃下放置3小时以形成Aβ寡聚体。弃去现有培养基，并用新制备的Aβ1-42寡聚体(1μM)溶液，与或不与本发明(最大浓度10μM)一起处理细胞，并在37℃下在5％CO2下温育72小时。72小时后，去除培养基，并用PBS洗涤细胞一次并回收。使用以下程序，进行另外的实验。
实施例21-3.蛋白质印迹分析方法
使用实施例9-4中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表12中提供了第一抗体和其条件。
表12.第一抗体的列表
实施例21-4.在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中通过本发明的AMPK表达变化
本发明浓度依赖性地增加了通过Aβ1-42寡聚体处理在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中降低的AMPK催化亚基α的Thr172的磷酸化(图25)。考虑到此结果，预期本发明增加通过Aβ降低的AMPK催化亚基α中的Thr172的磷酸化，以恢复AMPK活性，以激活自噬，以去除与退行性脑疾病相关的错折叠蛋白质聚集体，并抑制神经元变性。
实施例22.在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中通过本发明的包括LC3B和P62的自噬标志物的表达的变化
实施例22-1.SH-SY5Y神经元的细胞培养方法
实施例22-1-1.细胞传代培养
使用实施例2-1-1中描述的方法，进行细胞传代培养。
实施例22-1-2.SH-SY5Y神经母细胞瘤分化
使用实施例2-1-2中描述的方法，使SH-SY5Y神经元细胞分化。
实施例22-2.用于制备Aβ的方法以及用本发明处理的方法
制备人Aβ1-42(Abcam)在DMEM/F12(+1％FBS+1％青霉素/链霉素)中的1μM溶液。将Aβ溶液在37℃下放置3小时以形成Aβ寡聚体。弃去现有培养基，并用新制备的Aβ1-42寡聚体(1μM)溶液，与或不与本发明(最大浓度40μM)和3-MA(3-甲基腺嘌呤，Sigma-Aldrich)(5mM)、自噬/PI3K(磷酸肌醇3-激酶)抑制剂一起处理细胞，并在37℃下在5％CO2下温育72小时。72小时后，去除培养基，并用PBS洗涤细胞一次并回收。使用以下程序，进行另外的实验。
实施例22-3.蛋白质印迹分析方法
使用实施例6-5中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表13中提供了第一抗体和其条件。
表13.第一抗体的列表
实施例22-4.在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中通过本发明导致的包括LC3B和P62的自噬标志物的表达的变化
本发明不仅增加了在视黄酸分化的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中通过Aβ1-42寡聚体降低的自噬标志物LC3B的表达，而且还诱导自噬流(LC3B-I比LC3B-II转化)以同时增加LC3B-II/I比率，并降低泛素结合蛋白p62(SQSTM，Sequestosome 1)(自噬体货物蛋白)的表达，该表达通过Aβ1-42寡聚体而增加。此外，将3-MA(自噬/PI3K抑制剂)与本发明一起使用，降低了通过本发明增加的自噬流(LC3B-II/I比率)，并且增加了通过本发明降低的p62的表达。此外，当用本发明和3-MA一起处理细胞时，APP形成和Aβ1-42积累增加(图26)。考虑到此结果，预期本发明通过激活自噬阻抑APP形成和Aβ1-42积累。
实施例23.在阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)中通过本发明的包括ATG7和ATG5/12的自噬标志物的表达的变化
实施例23-1阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)
使用实施例13-1中描述的动物模型。
实施例23-2.给药本发明的组合物
使用实施例13-2中描述的相同方法，给药该组合物。
实施例23-3.组织样品的制备
使用实施例13-3中描述的方法，制备和储存组织样品。
实施例23-4.蛋白质印迹分析方法
使用实施例6-5中描述的方法，进行蛋白质印迹分析，并且表14中提供了第一抗体和其条件。
表14.第一抗体的列表
实施例23-5.在阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)中通过本发明的包括ATG7和ATG5/12的自噬标志物的表达的变化
本发明增加了在阿尔茨海默病动物模型(5XFAD转基因小鼠)的海马中的包括ATG7和ATG5/12的自噬标志物的表达，并且增加了大脑皮质中的ATG5/12的表达(图27)。考虑到该结果，预期本发明增加自噬流(LC3BII/I比率)、自噬标志物，降低p62(图26)，并增加ATG7和ATG5/12的表达以激活自噬级联。
实施例24.本发明对于改善在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中的认知和行为学习能力的作用
实施例23-1.实验动物
使用实施例17-1中描述的动物模型。
实施例23-2.本发明的给药方法
使用实施例17-2中描述的相同方法，给药该组合物。
实施例23-3.用于认知能力和行为学习能力的测试方法
实施例23-3-1.莫里斯水迷宫测试
在使用水迷宫测试测量认知能力的变化之前，以4mg/kg通过腹腔内注射给药本发明，每天一次，持续4周。在22-25℃水在圆形水浴(直径1m×高度40cm)中进行测试，其中，目标(目标：直径12cm)设置比水面低约3cm。将干奶粉添加到水中，以使目标隐形，在水浴上方的天花板上安装SMART3.0protram(Panlab)，以监测试验前和4周后的测试动物到达目标的时间(到目标的潜伏期)、游泳距离(到目标的距离)和游泳的模式(游泳模式)。将测试受试者在前5天进行训练，每天两次，从起点开始到目标结束。使两次都没有找到目标的小鼠识别目标的位置。间隔5分钟进行每次测试，并且在第6天去除目标，以进行从起点开始持续1分钟的测试，并将结果用作实验数据。
实施例23-3-2.被动回避测试
以4mg/kg剂量通过腹腔内注射给药本发明，每天一次，持续4周，之后进行被动回避测试以评价记忆。被动回避测试包括为白色的明亮室的前室(18×18×25cm)、为黑色的黑暗室的后室(18×18×25cm)，黑暗室的地板上安装了坚固的金属不锈钢，以及前室和后室的墙壁上具有4cm直径的孔，其以闸板类型打开和关闭。将每只测试动物在每个笼子中隔离1分钟，移动至前室10秒以进行调整，同时打开闸板类型门，以允许测试动物在室之间自由移动。一旦测试动物的所有四只脚都进入后室，门迅速关闭，并记录测试动物从前室移动至后室的时间(初始潜伏期时间)，并通电(0.5mA)持续2秒。5秒后，将测试动物移动至其居住笼子中。72小时后，进行相同的测试，以测量进入黑暗的潜伏期，从前室至后室移动直到最长300秒的时间。
实施例23-3-3.数据处理方法
使用SPSS 20.0统计程序处理收集的数据，以计算统计误差(平均值±SD)，通过单因素方差分析(单向方差分析(One-Way ANOVA))进行物种和组间的变量的验证。如果组之间存在显著差异，则使用Bonferroni方法进行后验证。为此，将假设接受度设为α＝0.05。
实施例23-4.通过本发明在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中的认知和行为学习技能的改善
实施例23-4-1.通过本发明在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中认知功能改善的结果：水迷宫测试(莫里斯水迷宫测试)
对C57BL/6-Tg(NSE-hAPP-C105)Kor转基因小鼠进行莫里斯水迷宫测试，以测量处理4周后本发明对认知功能的作用。首先，对到达目标的时间的分析示出，TC组比NTC组在统计学上增加(P＝0.001)，以及TM组比TC组在统计学上降低(P＝0.001)。第二，分析到达目标的游泳距离，TC组比NTC组在统计学上增加(P＝0.001)，以及TM组比TC组在统计学上降低(P＝0.001)。第三，对象限中的从目标开始的游泳时间的分析示出，TC组比NTC组在统计学上降低(P＝0.001)，以及TM组比TC组在统计学增加(P＝0.001)。第四，对通过目标的时间的分析示出，TC组比NTC组在统计学上降低(P＝0.001)，以及TM组比TC组在统计学增加(P＝0.037)(图28)。
实施例23-4-2.通过本发明在阿尔茨海默痴呆动物模型(NSE-hAPP-C105)中行动学习和认知能力的改善的结果：被动回避测试
用C57BL/6-Tg(NSE-hAPP-C105)Kor转基因小鼠进行被动回避测试，以评价用本发明处理4周对行动学习和认知能力的作用(图6A和6B)。结果示出，TC组比NTC组在统计学上减降低(P＝0.001)，以及TM组比TC组在统计学上增加(P＝0.004)(图29)。
Claims (17)
1.一种用于治疗阿尔茨海默病的药物组合物，包括：
化合物，所述化合物选自由以下组成的组：米罗那非、西地那非、伐地那非、他达拉非、乌地那非、达生他非和阿伐那非；以及其药学上可接受的盐、溶剂化物和水合物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述化合物通过血管舒张增加脑中的血流量以阻抑细胞外Aβ单体、寡聚体和/或Aβ原纤维/斑的形成和积累。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述化合物激活NO/cGMP/PKG/CREB途径以降低神经元细胞死亡并促进神经发生、突触发生、血管生成。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述化合物阻抑DKK-1(Dickkopf WNT信号传导途径抑制剂1)以激活Wnt信号传导以恢复突触可塑性并且阻抑Aβ产生的正反馈回路以降低APP(淀粉样前体蛋白)的形成和Aβ的积累。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述化合物激活自噬以去除细胞内毒性的可溶性Aβ寡聚体以阻抑Aβ原纤维/斑的形成和积累。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，化合物改善行为和认知功能。
7.一种用于治疗阿尔茨海默病的方法，包括：
给药药物组合物，所述药物组合物包括化合物，所述化合物选自由以下组成的组：米罗那非、西地那非、伐地那非、他达拉非、乌地那非、达生他非和阿伐那非；以及其药学上可接受的盐、溶剂化物和水合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述化合物通过降低Aβ寡聚体或原纤维的形成来抑制Aβ聚集抑制的形成。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述化合物通过BACE-1降低来抑制β-促淀粉样蛋白生成的加工。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述化合物通过血管舒张来降低β淀粉样单体、寡聚体和/或β淀粉样原纤维和斑的细胞外形成和积累。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述化合物通过激活NO/cGMP/PKG/CREB途径来降低神经元细胞死亡并增强神经发生、突触发生或血管生成。
12.根据权利要求7所述的方法，其中，所述化合物通过经由DKK-1抑制的Wnt信号传导激活来恢复突触可塑性。
13.根据权利要求7所述的方法，其中，所述化合物通过抑制Aβ产生的正反馈回路来阻抑DKK-1以抑制APP的形成和Aβ积累。
14.根据权利要求7所述的方法，其中，所述化合物激活自噬以去除细胞内毒性的可溶性Aβ寡聚体以阻抑Aβ原纤维/斑的形成和积累。
15.根据权利要求7所述的方法，其中，化合物改善行为和认知功能。
16.根据权利要求7所述的治疗阿尔茨海默病的方法，其中，通过给药所述药物化学组合物激活自噬以去除细胞内毒性的可溶性Aβ寡聚体以阻抑Aβ原纤维/斑的形成和积累。
17.根据权利要求7所述的治疗阿尔茨海默病的方法，其中，通过给药所述药物化学组合物改善行为和认知功能。
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