CN113874715A - 在毛细管模型中评估止血剂的体外方法 - Google Patents

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Abstract

一种确定血小板聚集面积和血小板滚动速度的体外血小板评估方法，所述方法包括：产生血小板悬浮液样品；产生测试基质(129)，其中测试基质(129)包括胶原；设置评估系统(10)，包含将测试基质(129)放入评估系统(10)内；使血小板悬浮液样品流动通过评估系统(10)；调节通过评估系统(10)的血小板悬浮液样品流动；停止通过评估系统(10)的血小板悬浮液样品流动；产生测试血小板悬浮液；使测试血小板悬浮液流动通过评估系统(10)；调节通过评估系统(10)的测试血小板悬浮液流动；以及停止通过评估系统(10)的血小板悬浮液流动。优选地，所述评估系统(10)包括介质源(150)、平行板流动室(100)、流动泵(200,300)、显微镜(400)、相机(400)和计算机(600)。

Description

在毛细管模型中评估止血剂的体外方法
背景技术
牙龈出血与许多常见的口腔病状如牙龈炎相关。牙龈出血可由牙菌斑的累积、在牙齿和牙龈上形成的细菌的柔软、粘性、无色膜引起，并产生可能会使牙龈组织发炎或感染牙龈组织的毒素而引起牙龈炎。牙龈炎是牙龈疾病的初始阶段，并且如果不治疗，可能导致牙周炎。
已经开发出各种临床评估方法来评估口腔护理组合物对牙龈出血的功效，如牙龈出血指数、龈沟出血指数和乳头状出血评分等。然而，还没有用于评估口腔护理组合物对牙龈出血或作为止血剂的功效的临床前和/或体外测试。
因此，开发用于临床前和/或体外评估针对牙龈出血和/或作为止血剂的口腔护理组合物或活性成分的系统和方法将是有用的。而且确切地说是用于评估口腔护理组合物或活性成分在毛细管模型中作为止血剂的功效的体外系统和方法。
发明内容
本发明内容仅旨在引入对本公开的一个或多个实施方案的一些方面的简化概述。从下文提供的详细描述，本发明的其它适用领域将是显而易见的。本发明内容并非详尽概述，也不旨在确定本教导的关键或重要要素，也并不旨在划定本公开的范围。实际上，其目的仅仅是提供一个或多个概念的简化形式，作为以下具体实施方式的前序。
本公开中体现的前述和/或其它方面和效用可通过提供体外血小板评估方法来实现，所述方法包含产生血小板悬浮液样品；产生测试基质，其中所述测试基质包括胶原；设置评估系统，包含将所述测试基质放入所述评估系统内；使所述血小板悬浮液样品流动通过所述评估系统；调节通过所述评估系统的所述血小板悬浮液样品流动；停止通过所述评估系统的所述血小板悬浮液样品流动；产生测试血小板悬浮液；使所述测试血小板悬浮液流动通过所述评估系统；调节通过所述评估系统的所述测试血小板悬浮液流动；以及停止通过所述评估系统的所述测试血小板悬浮液流动。
所述评估系统可包含：介质源，其保持血小板悬浮液样品和测试血小板悬浮液中的至少一种；流动室，其从所述介质源接收所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种；流动泵，其促进所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种流动通过所述流动室；显微镜，其被配置成用于评估在所述流动室中的所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种；以及相机和计算机，其可操作地连接至所述显微镜并且被配置成通过所述显微镜记录图像并促进对所述流动室中所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中至少一种的评估。
所述流动室可以是平行板流动室，所述平行板流动室包含：底板，其被配置成用于控制通过所述流动室的所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种的流动；滑板，其被配置成用于从所述介质源接收所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种；以及垫圈，其被配置成用于控制所述流动室中流动路径的高度，其中所述底板包含被配置成连接至所述介质源的流动入口、被配置成连接至所述流动泵的流动出口，以及被配置成连接至真空泵的真空端口。
调节通过所述评估系统的所述血小板悬浮液样品流动可以包含调节模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型流动的所述血小板悬浮液样品的流动速率；并且所述方法还可以包含记录在所述评估系统中的所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为。
所述模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型的流动速率可以是约0.04mL/min。
所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为可以在50fps/s下记录2分钟。
记录在所述评估系统中的所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为可用于确定血小板悬浮液样品的血小板聚集面积和血小板滚动速度。
产生测试血小板悬浮液可包含将口腔护理组合物或活性剂的样品添加至所述血小板悬浮液样品中以产生测试血小板悬浮液。
调节通过所述评估系统的所述测试血小板悬浮液流动可包含调节模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型流动的所述测试血小板悬浮液的流动速率；并且所述方法还可包含记录在所述评估系统中的所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为。
所述模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型的流动速率可以是约0.04mL/min。
所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为可以在50fps/s下记录2分钟。
记录通过所述评估系统的所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为可用于确定所述测试血小板悬浮液的血小板聚集面积和血小板滚动速度。
本公开中体现的前述和/或其它方面和效用也可通过提供体外血小板评估方法实现，所述方法包含产生血小板悬浮液样品；通过将测试剂添加至所述血小板悬浮液样品中来产生测试血小板悬浮液；使所述血小板悬浮液样品流动通过评估系统，并记录在所述评估系统中的所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为；使所述测试血小板悬浮液流动通过所述评估系统，并记录在所述评估系统中的所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为；将在所述评估系统中的所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为与在所述评估系统中的所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为相比较，以确定所述测试剂的止血功效；其中使所述血小板悬浮液样品流动通过所述评估系统和使所述测试血小板悬浮液流动通过所述评估系统中的至少一种包括调节模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型流动的流动速率，并且其中比较所述血小板的行为包括比较所述血小板悬浮液样品与所述测试血小板悬浮液的平均血小板聚集面积和平均血小板滚动速度。
附图说明
并入本说明书并构成本说明书的一部分的附图示出了本发明教示内容的实施方案，并且与说明书一起用于解释本公开的原理。在附图中：
图1示出了根据本公开的实施方式的体外血小板评估系统
图2示出了根据本公开的实施方式的体外血小板评估方法。
图3-4是示出位于胶原基质上的单个血小板与聚集血小板之间的差异的照片。
应当注意，附图的一些细节已被简化并且绘制成便于理解本发明教示内容而非保持严格的结构准确性、细节和比例。
具体实施方式
现将具体地参考本发明教示内容的示例性实施方式，其实施例在附图中示出。一般来说，所有附图中将使用相同的元件符号指示相同或类似部件。
下文描述了实施方案以提供对本文公开的组分、方法、组合物和设备的更全面的理解。给出的任何实施例均旨在说明而非限制。然而，对于本领域的普通技术人员而言将显而易见的是，本发明可以在没有这些具体细节的情况下实施。在其它情况下，众所周知的方法、程序和组件尚未详细描述，以免不必要地模糊实施方案的各方面。
在整篇说明书和权利要求书中，除非上下文另外明确规定，否则以下术语采取本文明确相关的含义。如本文所用，短语如“在一个实施方案中”、“在某些实施方案中”和“在一些实施方案中”不一定指相同的实施方案，尽管其可以是相同的。此外，如本文所用，短语“在另一个实施方案中”和“在一些其它实施方案中”不一定指不同实施方案，尽管它们可以是不同的。如下文所描述，在不脱离本公开的范围或精神的情况下，可以容易地组合各种实施方案。
如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则术语“或”是包括性的运算符，且等同于术语“和/或”。除非上下文另外明确规定，否则术语“基于”不是排他性的，且允许基于未描述的另外因素。在说明书中，“A、B和C中的至少一个”的叙述包括含有以下的实施方案：A、B或C；A、B或C的多个实例；或A/B、A/C、B/C、A/B/B/B/B/C、A/B/C的组合等。另外，在整篇说明书中，“一(a/an)”和“所述”的含义包含多个提及物。“在……中”的含义包含“在……中”和“在……上”。
还应当理解，尽管术语第一、第二等在本文中可以用于描述各种元件，但是这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用以将一个元件与另一元件区分开来。例如，在不背离本发明范围的情况下，第一对象、组分或步骤可以被称为第二对象、组分或步骤，并且，类似地，第二对象、组分或步骤可以被称为第一对象、组分或步骤。第一对象、组分或步骤和第二对象、组分或步骤分别都是对象、组分或步骤，但其不应被视为相同的对象、组分或步骤。应进一步了解，术语“包含(includes/including)”和/或“包括(comprises/comprising)”当在本说明书中使用时，是指所述特征、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、组分和/或其群组。此外，如本文所用，术语“如果”可以理解为意指“当……时”或“在……时”或“响应于确定……”或“响应于检测……”，这根据上下文而定。
除非另有说明，否则在下文定义的所有物理特性均在20℃至25℃下测量。
当本文中提及任何数值范围时，此类范围被理解为包括所述范围最小值与最大值之间的每个数字和/或分率以及端点。例如，0.5-6％的范围将明确包括所有中间值，例如，0.6％、0.7％和0.9％，一直到并包括5.95％、5.97％和5.99％等。除非上下文另外明确规定，否则这同样适用于本文中所阐述的每个其它数值特性和/或元件范围。
此外，所有数值都是“约”或“近似”指定值，并且将本领域普通技术人员将预想到的实验误差和偏差考虑在内。应理解，本文公开的所有数值和范围都是近似的值和范围，无论“约”是否与其结合使用。
除非另外指明，否则本文和在本说明书中其它地方表述的所有百分数和量均应理解为是指重量百分数。给定的量基于材料的有效重量。
关于根据一些实施方案的程序、方法、技术和工作流程，在本文中公开的程序、方法、技术和工作流程中的一些操作可以组合和/或可以更改一些操作的顺序。
如本文所用，“牙龈出血”或“出血”是指血液从循环系统中受损的血管漏出。例如，如上所述，牙龈出血可能是由于血液从牙齿周围的牙龈中受损的毛细管漏出，并且可以是牙龈炎或牙周疾病的一种症状。
血小板是血液的一种组分，它通过凝集和引发血凝块来对由血管损伤引起的出血作出反应。也就是说，血小板聚集是血液凝固的第一步，其包含血小板粘附和软聚集物栓子的形成。
口腔护理组合物或活性成分预防、减少或停止牙龈出血的效力可通过血小板聚集面积和/或血小板滚动速度来度量。例如，抗牙龈出血或止血效力可通过较高的血小板聚集面积和/或较低的血小板滚动速度来证实。
本发明人已开发出评估口腔护理组合物或活性成分对牙龈出血或作为止血剂的效力的新颖体外血小板评估系统和方法。确切地说，新颖流动室系统被设计成用于评估在特定口腔护理组合物或活性成分存在下血小板聚集的生长和稳定性。在一些实施方案中，流动室系统被配置成表示毛细管出血模型，并且可用于测量口腔护理组合物或活性成分对血小板聚集面积和/或血小板滚动速度的作用。
图1示出了根据本公开的实施方式的体外血小板评估系统。如图1中所示，体外血小板评估系统10包含流动室100、介质源150、真空泵200、流动泵300、显微镜400、相机500和计算机600。
流动室100可以实施为平行板流动室100。例如，流动室100可以是圆形平行板流动室100，其包含底板110、滑板120和垫圈130(例如可从美国GlycoTech Corporation商购的GlycoTech Flow Chamber 31-001圆形平行板流动室)。
底板110可包含流动入口111和流动出口112，测试介质可通过其进行灌注。底板110还可包含真空端口113，真空可以通过所述真空端口施加。在一些实施方式中，真空被配置成用于将底板110、垫圈130和滑板120保持在一起，并且帮助维持均一的通道高度。在一些实施方案中，测试介质可包含血小板悬浮液样品和/或测试血小板悬浮液，所述测试血小板悬浮液包括适合量的口腔护理组合物或活性成分样品以供评估。
滑板120可被配置成用于保持测试基质129。例如，滑板120可以实施为35mm的皮氏细胞培养皿(所述培养皿可例如由玻璃制成)，并且被配置成用于保持胶原基质。
垫圈130被配置成用于控制流动室100的流动路径的高度。例如，可选择垫圈130的宽度或厚度以控制流动室100的间隙高度。也就是说，垫圈厚度可以控制通道高度。垫圈130可以根据所希望的流动室类型、测试样品和侧壁剪切应力来选择。
在一个实施方式中，通道高度可以是0.127mm，宽度可以是2.5mm，并且长度可以是5mm。流动室可被配置成用于提供具有稳定粘度的平行板动态流动。
介质源150被配置成用于保持将流过流动室100的测试介质。介质源150可以连接至流动入口111以将测试介质提供至流动室100。测试介质可包含作为对照进行测试的血小板悬浮液样品和/或作为止血剂进行评估的测试血小板悬浮液，所述测试血小板悬浮液包含适合量的口腔护理组合物或活性成分。在一些实施方式中，流动室100维持在37℃。
真空泵200连接至真空端口113且被配置成用于在流动室100中保持真空环境。在一些实施方式中，真空泵200还有助于保持体外血小板评估系统10的稳定流动速率。例如，真空泵200可被配置成用于排出空气并以流体方式连接体外血小板评估系统10以产生稳定流动。
流动泵300被配置成用于向系统提供动态流动。例如，流动泵300可以实施为连接至流动出口110的注射式流动泵300。注射式流动泵300的实例是可商购的，例如购自马萨诸塞州霍利斯顿(Holliston,MA)的Harvard Apparatus的Harvard PHD 22/2000注射泵。
流动室100可以被放在显微镜400(例如可从德国Zeiss商购的Axio Observer A1)内，所述显微镜连接至高速相机500(例如Mikrotron GmbH MC 1310；可从加拿大的NorpixInc.商购)。显微镜400和相机500可以连接至计算机600，以便于介质在流动室100中流动和/或沉积时进行观察和记录。例如，计算机600可包含用于自动图像分析的图像分析软件。
图2示出了根据本公开的实施方式的体外血小板评估方法。体外血小板评估方法800可参照图1的体外血小板评估系统10描述。
方法800可以通过在操作810中产生血小板悬浮液样品开始。例如，可以对新鲜血液的样品进行离心和/或抽吸以从血液中分离血小板，然后，可以使血小板再悬浮于中性溶液，如PBS中，以产生血小板悬浮液样品。在一些实施方式中，每个血小板悬浮液样品含有预定数目的血小板。在一些实施方式中，血小板悬浮液样品也可以充当对照样品。
在操作820中，可以制备测试基质。例如，可将胶原基质放在滑板120上并温育以制备胶原基质来与血小板悬浮液相互作用。虽然不受任何特定理论束缚，但本发明人认为，在凝血期间，血小板彼此粘附并粘附至胶原以形成血小板栓子。因此，在将血小板溶液输注至流动室100中之后，血小板可以与胶原相互作用并在滑板120中的胶原基质上彼此结合。有效的凝血剂不仅可以帮助血小板结合至流动室100中的胶原基质以减慢其滚动速度，而且还可以增强稳定的血小板-血小板粘附，这为样品带来更多聚集的血小板，从而增加总血小板聚集面积。
在操作830中，设置评估系统。例如，可以设置体外血小板评估系统10：可以将滑板120(其中放置有胶原基质)与垫圈120和底板110放在一起以形成流动室100。血小板悬浮液样品可以被放在介质源150内，并且介质源150可以连接至流动室100的流动入口111。类似地，流动出口112可以连接至注射式流动泵300，并且真空端口113可以连接至真空泵200。然后，可以将流动室100放在显微镜400和/或相机500(连接至计算机600)内，其被配置成用于观察、记录和测量体外血小板评估系统10内血小板悬浮液样品的行为。
在操作840中，血小板悬浮液样品流入流动室110中。例如，流动室100可以输注来自介质源150的血小板悬浮液样品，并且注射式流动泵300可以被配置成以0.04mL/min(0.1dyn/cm2流动应力)产生通过流动室100的血小板悬浮液样品的流动。然而，最初可使用更高的流动速率将血小板悬浮液样品装载至流动室110中。血小板悬浮液样品最初可流动通过流动室100，持续2分钟。在一些实施方式中，操作840中的流动速率可以在0～0.5dyn/cm2的范围内。在一些实施方式中，流动室110保持在室温(25℃)。
根据以下体积流动速率公式，使用0.04mL/min的流动速率将产生0.1dyn/cm2的流动应力：
(1)
Figure BDA0003371517590000081
其中τw是以dyn/cm2为单位的侧壁剪切应力，μ是介质的表观粘度(例如在37℃下H2O＝0.0076P)，Q是以l/秒为单位的体积流动速率，“a”是通道高度(垫圈厚度，以cm为单位)，并且“b”是通道宽度(垫圈宽度，以cm为单位)。
在操作850中，调节流动速率并记录血小板行为。例如，注射式流动泵300可以被配置成用于将通过流动室100的血小板悬浮液样品的流动调节(或维持)为0.04mL/min。在一些实施方式中，0.04mL/min(0.1dyn/cm2)流动速率模拟口腔毛细血管中的血液剪切应力。在其它实施方式中，将流动速率调节为小于0.2dyn/cm2，以模拟毛细管出血模型。在又其它实施方式中，调节流动速率以模拟毛细管出血模型。
血小板悬浮液样品可以流动通过流动室100，再持续3分钟，并且相机500可以设置成以高速(50fps/s)记录2分钟的血小板行为。在一些实施方式中，高速记录可以用于计算样品的血小板滚动速度和/或血小板聚集面积。2分钟长度可用于模拟平均刷牙时间，并因此模拟暴露于所评估的口腔护理组合物或活性成分的时间段。然而，根据所评估的作为止血剂的口腔护理组合物或活性成分的预期暴露时间段，可使用从小于1分钟至2.5分钟且至多90分钟的其它视频长度。
然后，可以测量血小板悬浮液样品的血小板滚动速度。例如，可以在上述高速记录中跟踪血小板悬浮液样品中每个血小板的滚动距离达30秒(从90秒点至120秒点)。然后，通过对所获得的所有滚动速度求取平均值，获得血小板悬浮液样品的滚动速度。为便于测量血小板滚动速度，在一些实施方式中，将仅跟踪和测量具有特定平均直径的血小板。例如，仅跟踪平均直径为2.557+/-0.929μm的血小板以测量其滚动速度。在其它实施方式中，选择一组多个血小板进行跟踪。例如，可以跟踪50个具有所需平均直径的血小板，以确定样品的血小板滚动速度。
在一些实施方式中，可使用计算机600对高速记录执行图像分析，以便于测量血小板悬浮液样品的血小板滚动速度和/或血小板聚集面积。例如，可以通过可操作地连接至显微镜400的相机500捕捉血小板滚动距离，并且可以通过可操作地连接至相机500和显微镜400两者的计算机600，利用成像软件(如6.0版Image Pro Plus，Media Cybernetics)测量在特定时间段内的滚动速度。
在操作860中，停止血小板悬浮液样品流动并测量剩余体积。例如，注射式流动泵300可以被配置成用于停止通过流动室100的血小板悬浮液样品的流动。然后，观察胶原基质上血小板的剩余体积和/或血小板聚集面积。例如，可以在上述高速记录的120秒点时测量胶原基质上粘附的血小板的面积总和。
例如，可以通过可操作地连接至显微镜400的相机500捕获血小板聚集面积，并且可以通过可操作地连接至相机500和显微镜400两者的计算机600，利用成像软件(例如6.0版Image Pro Plus，Media Cybernetics)测量在特定时间段内的血小板聚集面积。在一些实施方式中，使用了代表性样品来计算平均血小板聚集面积。例如，计算机可以被配置成仅识别在2～18μm2范围内，即在血小板面积的传统范围的血小板，并在每一时间段期间测量200个血小板细胞。
图3-4是示出单个血小板与在胶原基质上的聚集血小板之间的差异的照片，这是通过可操作地连接至相机500和显微镜400两者的计算机600鉴别。
在操作870中，产生测试血小板悬浮液。例如，将适合浓度的待评估的口腔护理组合物或活性成分添加至在介质源150中的血小板悬浮液样品中以产生测试血小板悬浮液。在一个实施方式中，可以将10ul的口服组合物样品添加至1000ul的血小板悬浮液样品中，即，其比率是1:100。
在操作880中，测试血小板悬浮液流入流动室中。例如，流动室100可以输注来自介质源150的测试血小板悬浮液，并且注射式流动泵300可以被配置成以0.32mL/min产生通过流动室100的测试血小板悬浮液的流动。血小板悬浮液最初可以流动通过流动室100，持续4分钟。
在操作890中，改变流动速率并记录血小板的行为。例如，注射式流动泵300可以被配置成用于调节测试血小板悬浮液的流动以模拟通过流动室100的毛细管出血模型，如0.04mL/min。测试血小板悬浮液可以流动通过流动室100，再持续3分钟，并且相机500可以设置为高速(50fps/s)记录2分钟的血小板行为。
与上述类似，然后，可以通过在上述高速记录中跟踪测试血小板悬浮液中每个血小板的滚动距离达30秒并求取平均值来测量测试血小板悬浮液的血小板滚动速度。
如上文所描述，可使用计算机600对高速记录执行图像分析，以便于测量测试血小板悬浮液的血小板滚动速度和/或血小板聚集面积。
在操作900中，停止测试血小板悬浮液流动并测量剩余体积。例如，注射式流动泵300可以被配置成用于停止通过流动室100的测试血小板悬浮液的流动。然后，观察胶原基质上血小板和/或血小板聚集物的剩余体积。
如上文所描述，测量血小板悬浮液样品和测试血小板悬浮液两者的血小板聚集面积和血小板滚动速度，所述测试血小板悬浮液包含待评估的口腔护理组合物或活性成分样品。例如，使用了相机500来记录通过系统10的两种类型样品的血小板行为的视频(50fps/s，2分钟)。
通过测量每个血小板在30秒时间段(从90秒点至120秒点)期间的滚动距离来捕获血小板滚动速度。然后，对血小板的滚动速度求平均值，以获得样品的血小板滚动速度。类似地，在不同时间点(30秒、60秒和120秒)测量在胶原基质上粘附的血小板的总面积，以确定血小板聚集面积。因为血小板聚集面积不断地增加，并且因为在120秒时发现最高面积，所以在120秒时测量可以用作血小板聚集面积评定的标准统计时间点。
实施例
本公开的各方面可通过参考以下实施例来进一步理解。这些实施例是示意性的，而非旨在限制其实施方案。
表1示出了三种口腔护理组合物。除了测试组合物1包含齐墩果酸和丁子香酚两者，而测试组合物2和测试组合物3分别仅包括齐墩果酸或丁香酚之外，表1组合物中的所有成分具有相同的量。
表1
Figure BDA0003371517590000111
如下文实施例1中所示，使用图1-2中所示的体外血小板评估系统和方法，根据血小板聚集面积和血小板滚动速度评估表1组合物。确切地说，表2描述了表1组合物的血小板聚集面积数据。表3描述了表1组合物的血小板滚动速度数据。如上文所描述，血小板聚集面积和血小板滚动速度可用于确定口腔护理组合物和/或活性成分预防、减少或停止牙龈出血的功效。
实施例1
如下从健康人供体获得血小板并纯化：在抗凝管中收集10mL人血液并在室温下以150g离心15分钟。之后，将上部富血小板血浆(PRP)层抽吸到另一离心管中并在室温下以900g离心15分钟。抽吸上部贫血小板血浆(PPP)层，并且添加1mL PBS缓冲液以将沉积的血小板再悬浮于15ml离心管中，以产生悬浮的血小板溶液。将悬浮的血小板溶液置于显微镜(AXIO OBSERVER A1,Zeiss AG；德国耶拿(Jena,Germany))下并用血细胞计数仪对血小板计数。然后，制备含有每毫升3-6×105个血小板的样品血小板悬浮液管，每管具有5mL体积的PBS。
然后，如下执行体外血小板评估以测量血小板聚集面积和血小板滚动速度：将20μL的200μg/mL胶原在35mm皮氏培养皿(在中心5mm×2.5mm区域中)上于4℃下温育过夜(15-18小时)。然后，用含1％BSA的PBS缓冲液洗涤皮氏培养皿3次并与含1％BSA的PBS溶液一起在室温下温育0.5小时。
设置流动室系统(GLYCOTECH平行板流动室，GlycoTech Corp.；马里兰州盖瑟斯堡)并用0.04mL/min(1dyn/cm2)流量输注血小板悬浮液，持续3分钟。然后，将流动速率变为或维持在0.04mL/min(0.1dyn/cm2)以参考口腔毛细血管中的血液剪切应力，保持3分钟，并使用高速相机(50fps-MIKROTRON MC1310,Mikrotron GmbH；德国下施莱斯海姆(Unterschleissheim,Germany))记录2分钟的基础血小板滚动行为(对照样品)。然后，停止流动并观察血小板悬浮液的剩余体积。然后，向血小板悬浮液样品中添加10μL的表1组合物。然后，以0.32mL/min(8dyn/cm2)流量输注血小板悬浮液样品，持续4分钟(总共1.2mL悬浮液)。然后，将流动速率变为0.04mL/min(0.1dyn/cm2)，保持3分钟，并在添加包含表1组合物样品(活性样品)在内的各血小板悬浮液样品后，使用高速相机(50fps)记录2分钟的血小板滚动行为。
用图像分析软件(IMAGE PRO PLUS，可购自Media Cybernetics，马里兰州银泉(Silver Spring,Maryland))分析并跟踪血小板聚集面积和血小板滚动速度数据并计算如下：
血小板聚集面积
由每个血小板溶液样品的2分钟高速记录测量在不同时间(30秒、60秒、120秒)时粘附的血小板的总面积。然后，使用下式计算在120秒时每个样品的血小板聚集面积相对于对照样品的增加量，并且对每个样品的三次测量值求平均值：
Figure BDA0003371517590000121
血小板滚动速度
选择平均直径为2.557+/-0.929μm的血小板以测量平均血小板滚动速度。从2分钟高速记录中自90秒至120秒标记的每个血小板溶液样品捕获并计算50个血小板的滚动速度。然后，使用下式计算每个血小板溶液的平均血小板滚动速度相对于对照样品的降低量，并且对每个样品的三次测量值求平均值：
Figure BDA0003371517590000122
表2
测试组合物#1 测试组合物#2 测试组合物#3
测试 7.94 7.36 7.52
对照 5.93 5.99 5.92
平均血小板聚集面积相对于对照增加 33.72％ 22.98％ 26.94％
表3
Figure BDA0003371517590000131
如表2-3中所示，本发明的体外血小板评估系统和方法可用于评估对口腔护理组合物或活性成分样品的血小板聚集面积和血小板滚动速度的作用。例如，如以上图2-3中所示，当与测试组合物1-2相比较时，测试组合物1展示平均血小板聚集面积的改善增加和平均血小板滚动速度的改善降低。
本发明的体外血小板评估系统和方法可以提供比传统的动物测试或临床测试要快的评估。例如，传统的动物测试或临床测试需要数周至数月的时间，而本发明的体外血小板评估系统和方法可以在少于1天、少于6小时、少于4小时或约2小时或更短的时间内执行。
已参照示例性实施方案描述了本公开。虽然已示出和描述了几个实施方案，但本领域技术人员将了解，在不脱离先前具体实施方式的原理和精神的情况下，可以在这些实施方案中进行改变。本公开希望按照包含所有此类修改和改变来解释，只要其处于所附权利要求书或其等效物的范围内即可。

Claims (13)

1.一种体外血小板评估方法，其包括：
产生血小板悬浮液样品；
产生测试基质，其中所述测试基质包括胶原；
设置评估系统，包含将所述测试基质放入所述评估系统内；
使所述血小板悬浮液样品流动通过所述评估系统；
调节通过所述评估系统的所述血小板悬浮液样品流动；
停止通过所述评估系统的所述血小板悬浮液样品流动；
产生测试血小板悬浮液；
使所述测试血小板悬浮液流动通过所述评估系统；
调节通过所述评估系统的所述测试血小板悬浮液流动；以及
停止通过所述评估系统的所述测试血小板悬浮液流动。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述评估系统包括：
介质源，其保持所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种，
流动室，其从所述介质源接收所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种，
流动泵，其促进所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种流动通过所述流动室，
显微镜，其被配置成用于评估在所述流动室中的所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种，以及
相机和计算机，其可操作地连接至所述显微镜且被配置成通过所述显微镜记录图像并促进对在所述流动室中的所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种的评估。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述流动室是平行板流动室，其包括：
底板，其被配置成用于控制通过所述流动室的所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中至少一种的流动，
滑板，其被配置成用于从所述介质源接收所述血小板悬浮液样品和所述测试血小板悬浮液中的至少一种，以及
垫圈，其被配置成用于控制所述流动室中流动路径的高度，
其中所述底板包括：
流动入口，其被配置成连接至所述介质源，
流动出口，其被配置成连接至所述流动泵，以及
真空端口，其被配置成连接至所述真空泵。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节通过所述评估系统的所述血小板悬浮液样品流动包括：
调节模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型流动的所述血小板悬浮液样品的流动速率；并且
其中所述方法还包括记录在所述评估系统中的所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型的流动速率是约0.04 mL/min。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为以50fps/s记录2分钟。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述记录在所述评估系统中的所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为是用于确定所述血小板悬浮液样品的血小板聚集面积和血小板滚动速度。
8.根据权利要求1所述的方法，其中产生测试血小板悬浮液包括将口腔护理组合物或活性剂的样品添加至所述血小板悬浮液样品中以产生所述测试血小板悬浮液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述调节通过所述评估系统的所述测试血小板悬浮液流动包括：
调节模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型流动的所述测试血小板悬浮液的流动速率；并且
其中所述方法还包括记录在所述评估系统中的所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型的流动速率是约0.04 mL/min。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为以50fps/s记录2分钟。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述记录通过所述评估系统的所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为是用于确定所述测试血小板悬浮液的血小板聚集面积和血小板滚动速度。
13.一种体外血小板评估方法，其包括：
产生血小板悬浮液样品；
通过将测试剂添加至所述血小板悬浮液样品中来产生测试血小板悬浮液；
使所述血小板悬浮液样品流动通过评估系统，并记录在所述评估系统中的所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为；
使所述测试血小板悬浮液流动通过所述评估系统，并记录在所述评估系统中的所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为；
将在所述评估系统中的所述血小板悬浮液样品中的血小板的行为与在所述评估系统中的所述测试血小板悬浮液中的血小板的行为相比较，以确定所述测试剂的止血功效；
其中所述使所述血小板悬浮液样品流动通过所述评估系统和所述使所述测试血小板悬浮液流动通过所述评估系统中的至少一种包括调节模拟通过所述评估系统的毛细管出血模型流动的流动速率，并且
其中比较所述血小板的行为包括比较所述血小板悬浮液样品与所述测试血小板悬浮液的平均血小板聚集面积和平均血小板滚动速度。
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