CN113846166A

CN113846166A - 用于检测肝癌的生物标志物及其应用

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Publication number: CN113846166A
Application number: CN202111179039.0A
Authority: CN
Inventors: 唐嘉吕; 沈美娜; 王秋南; 蔡文品; 季敬璋
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN116103399A; CN113846166B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测肝癌的生物标志物。本发明发现了十个circRNA在肝癌肿瘤组织中的表达与正常组织中的表达有显著差异，可以作为肝癌的诊断目的的生物标志物。另外，本发明发现提高hsa_circ_0072309在肝癌细胞中的表达会其促癌作用，因此，通过抑制hsa_circ_0072309的表达可以起到抑癌作用，可以作为肝癌的治疗目的的生物标志物。

Description

用于检测肝癌的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测肝癌的生物标志物。

背景技术

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,按细胞分型可将其分为肝细胞型、胆管细胞型及混合型肝癌，按肿瘤的形态可分为弥漫型、巨块型和结节型肝癌。肝癌发病率和死亡率在过去二十年中在全世界范围内迅速上升，每年大约有50-100万的新发病例，而其死亡率位居所有恶性肿瘤的第6位。中国目前发病人数占全球肝癌病人的一半以上，肝癌死亡率高居各种肿瘤死亡率的第2 位。因此，肝癌已经成为严重威胁世界人民特别是我国人民健康的杀手，对我国的卫生事业造成了严峻挑战。目前对于肝癌的治疗方法主要有传统的手术治疗、介入治疗、放疗和超声消融等，但是这些传统方法的治疗结果均难以令人满意。近年来，随着医学分子生物学的发展以及人们对肝癌的病理机制的深入探索，越来越多的新的治疗方案被提出并进行临床试验，取得了可喜的成果。在此过程中，对肝癌发病机制和相关基因功能的深入研究，以及对新的早期诊断标志物的探索显得尤为重要。

circ RNAs(Circular RNAs，环形RNA分子)是一类不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴，并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。circRNA是由非经典剪接方式进行反向剪接而形成。circRNAs广泛存在于人体细胞中。近年来，circRNA在癌症中所起的作用和功能成为癌症研究领域的新焦点。circRNA的独特特征不断地被揭示和发现，circRNA可以作为肿瘤的生物标志物的应用也不断的被揭示。但是目前在肝癌中是否存在同样的circRNA类潜在标志物国内外报道较少。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供用于检测肝癌的生物标志物。

本发明提供的第一方面，为用于检测肝癌的生物标志物，所述标志物为hsa_circ_0099634、hsa_circ_0003914、hsa_circ_0013225、hsa_circ_0006475、hsa_circ_0106467、hsa_circ_0035435、hsa_circ_0080960、hsa_circ_0072309、hsa_circ_0055113、hsa_circ_0008844中的一种或多种

其中标志物hsa_circ_0099634、hsa_circ_0003914、hsa_circ_0013225、hsa_circ_0006475、hsa_circ_0106467在肝癌组织中表达上调；标志物hsa_circ_0035435、hsa_circ_0080960、hsa_circ_0072309、hsa_circ_0055113、hsa_circ_0008844在肝癌组织中表达下调。

优选的，所述标志物为hsa_circ_0072309。

本发明提供的第二方面，为如上所述的用于检测肝癌的生物标志物在制备肝癌诊断产品中的应用。

本发明提供的第三方面，提供一种用于肝癌诊断的试剂盒，其包含特异性扩增如上所述的用于检测肝癌的生物标志物的引物。

本发明提供的第四方面，提供hsa_circ_0072309作为肝癌的生物标志物在制备肝癌的治疗产品中的应用。

本发明提供的第五方面，用于治疗肝癌的药物组合物，含hsa_circ_0072309抑制剂。

本发明的有益效果如下：本发明发现了十个circRNA在肝癌肿瘤组织中的表达与正常组织中的表达有显著差异，可以作为肝癌的诊断目的的生物标志物。另外，本发明发现提高hsa_circ_0072309在肝癌细胞中的表达会其促癌作用，因此，通过抑制hsa_circ_0072309的表达可以起到抑癌作用，可以作为肝癌的治疗目的的生物标志物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1中为circRNA表达折叠变化的热图；

图2为3对匹配的肝癌组织和相邻正常组织中差异表达的circRNA火山图；

图3为前10种差异显著的circRNA；

图4为采用qRT-PCR法检测10例HCC患者配对HCC及癌旁组织中三种

circRNA的表达水平；

图5为hsa_circ_0072309的Sanger测序界面位置序列；

图6 为双酶切载体构建及circLIFR过表达质粒转染细胞后的表达情况；

图7为载体转染293T细胞后的RNA电泳结果;其中，1为293T-control，2为293T-pLC5，3为293T-circLIFR;

图8为RT-qPCR实验结果显示转染circLIFR的293T细胞明显高表达；

图9为pLO5-ciR 载体图谱,载体测序引物:pC5-seqF: TGTGAATTTGACCCTTAAGA,插入序列为circLIFR;

图10为图为载体转染的SK-Hep-1细胞的RNA电泳结果；其中：1为SK-Hep-1-control，2为SK-Hep-1-pLO5，3为SK-Hep-1-circLIFR；

图11为RT-qPCR实验结果显示转染了circLIFR的SK-Hep-1细胞明显高表达；其中，HepG2-control和SK-Hep-1-control为不做处理的人肝癌细胞的空白对照组，HepG2-pLC5和SK-Hep-1-pLC5为转染空载质粒的肝癌细胞的阴性对照组，HepG2-circLIFR和SK-Hep-1-circLIFR为转染circLIFR的肝癌细胞的实验组。数据均已均值±标准差表示；

图12为RT-qPCR实验结果显示肝癌HepG2细胞转染过表达circLIFR后，实验组circLIFR明显高表达，其中， HepG2-control和SK-Hep-1-control为不做处理的人肝癌细胞的空白对照组，HepG2-pLC5和SK-Hep-1-pLC5为转染空载质粒的肝癌细胞的阴性对照组，HepG2-circLIFR和SK-Hep-1-circLIFR为转染circLIFR的肝癌细胞的实验组。数据均已均值±标准差表示；

图13为RT-qPCR实验结果显示肝癌SK-Hep-1细胞转染过表达circLIFR后，实验组circLIFR明显高表达，其中， HepG2-control和SK-Hep-1-control为不做处理的人肝癌细胞的空白对照组，HepG2-pLC5和SK-Hep-1-pLC5为转染空载质粒的肝癌细胞的阴性对照组，HepG2-circLIFR和SK-Hep-1-circLIFR为转染circLIFR的肝癌细胞的实验组。数据均已均值±标准差表示；

图14为CCK-8法检测转染对照过表达hsa_circ_0072309的SK-Hep-1及HepG2细胞的增殖情况;

图15为过表达hsa_circ_0072309后SK-Hep-1及HepG2细胞迁移能力的创面愈合试验；

图16为Transwell实验显示过表达hsa_circ_0072309促进SK-Hep-1及HepG2细胞的转移和侵袭；

图17为对照组转染hsa_circ_0072309后SK-Hep-1及HepG2肝癌细胞集落形成能力;

图18为细胞周期法检测转染对照过表达hsa_circ_0072309的SK-Hep-1及HepG2细胞的增殖情况;

图19为流式细胞术检测对照组过表达hsa_circ_0072309对SK-Hep-1及HepG2细胞凋亡和更新的影响;

图20为RNA Pull-down实验的示意图；

图21为RNA pull-down捕获的可能与circLIFR结合蛋白列表；

图22为对捕获的相关蛋白进行PPI分析的蛋白互作网络图；

图23为TCGA数据分析TBK1在肿瘤中的表达情况；

图24为RIP试验证实过表达circLIFR显著促进了TBK1蛋白之间的特异性结合；

图25为IF-FISH检测LO2细胞，图分别为circLIFR-cy3、Anti-TBK ICC、DAPI 染色核定位、Merged的荧光图像；

图26为NF-κB荧光素酶报告系统结果；

图27为Western blotting分析，提示circLIFR过表达可激活NF-κB通路；图28为RT-qPCR分析过表达circLIFR与TBK1相互作用影响NF-κB下游癌基因MMP13、MMP3、VEGF和MAPK的水平。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：

收集13对人原发性肝细胞癌及其邻近的非肿瘤性肝组织，入选标准为临床诊断及活检标本病理学检查为肝癌患者组织。输入3对HCC和非肿瘤肝组织进行高通量RNA测序，另外10对HCC和非肿瘤肝组织用于所选circRNA的QPCR检测。

按照手册说明，使用TRIZOL（Life technologies）提取3对HCC和相邻非癌肝组织的总RNA。核糖体缺失的RNA样品被片段化，然后用随机六聚体引物用于第一和第二链互补DNA（cDNA）的合成。PCR扩增。对一个合适大小的文库进行了纯化和筛选。最后，用X对文库进行测序。这是折叠变化的标准≥ 1.5或折叠更改≤-1.5设置为截止值。circRNA的表达存在显著差异。

按照制造商的说明，使用TRIZOL试剂（Life technologies）从组织和培养细胞中提取总RNA。根据Geneseed®II第一链cDNA合成试剂盒（Geneseed），使用特定引物将总RNA反转录为互补DNA（cDNA）。使用Geneseed®qPCR SYBR®绿色主混合物（Geneseed）进行qRTPCR。扩增参数为：变性：95℃，5min。退火：95℃下10秒，60℃下延伸34秒，重复40个循环。熔化曲线计算如下：95°C持续15秒，60°C持续60秒，95°C持续15秒。qRT-PCR检测至少进行三次。使用的引物如下所示：

GAPDH

GAPDH-F AGAAGGCTGGGGCTCATTTG（SEQ ID NO： 1）；

GAPDH-R GCAGGAGGCATTGCTGATGAT（SEQ ID NO：2）。

hsa_circ_0099634

hsa_circ_0099634-F2:5'-gccaagctcacttttaatcatg-3'（SEQ ID NO：3）；

hsa_circ_0099634-R2:5'-catcatcctgagaatctcatg-3'（SEQ ID NO：4）。

hsa_circ_0006475

hsa_circ_0006475-F2:5'-tcgctgaaggttcgagga-3'（SEQ ID NO：5）；

hsa_circ_0006475-R2:5'-acagtaattatccaccgtgcg-3'（SEQ ID NO：6）。

hsa_circ_0106467

hsa_circ_0106467-F1:5'-gtatatcacactaaaggctatgg-3'（SEQ ID NO：7）；

hsa_circ_0106467-R1:5'-ctagtgtctacaacttgctg-3'（SEQ ID NO：8）。

hsa_circ_0003914

hsa_circ_0003914-F1:5'-ctaagcaatgggaaacttggttaa-3'（SEQ ID NO：9）；

hsa_circ_0003914-R1:5'-ctttaagcgctgttccttag-3'（SEQ ID NO：10）。

hsa_circ_0013225

hsa_circ_0013225-F1:5'-gatcttacccttaaagctgatttc-3'（SEQ ID NO：11）；

hsa_circ_0013225-R1:5'-ggaacttaaggacttgagcc-3'（SEQ ID NO：12）。

hsa_circ_0035435

hsa_circ_0035435-F1:5'-gaagaagcaaccaaggcttgt-3'（SEQ ID NO：13）；

hsa_circ_0035435-R1:5'-ttcttgacttccagttgaagctg-3'（SEQ ID NO：14）。

hsa_circ_0080960

hsa_circ_0080960-F1:5'-ggcagctctggataagattaac-3'（SEQ ID NO：15）；

hsa_circ_0080960-R1:5'-gttacatttccacggccataac-3'（SEQ ID NO：16）。

hsa_circ_0072309

hsa_circ_0072309-F1:5'-ggagctcgtaaaattagactg-3'（SEQ ID NO：17）；

hsa_circ_0072309-R1:5'-aatgttgataacagccactgga-3'（SEQ ID NO：18）。

hsa_circ_0055113

hsa_circ_0055113-F1:5'-gatgaagtatctgggcctct-3'（SEQ ID NO：19）；

hsa_circ_0055113-R1:5'-ccattgtatgtgccacatcg-3'（SEQ ID NO：20）。

hsa_circ_0008844

hsa_circ_0008844-F1:5'-gccttatgccctgaaagaac-3'（SEQ ID NO：21）；

hsa_circ_0008844-R1:5'-gccacatccaataggtagatct-3'（SEQ ID NO：22）。

实施例2：

以PCR扩增hsa_circ_0072309全长580bp序列（SEQ ID NO：8），In-fusion连接到修改的pLO5-ciR（EcoRI和BamHI位点不保留）中。具体过程如下：

一、过表达载体构建

（1）目的片段PCR扩增：PCR扩增反应程序：95℃ 5 min，38个循环（98℃ 10 s，58℃30 s，68℃ 60 s ），68℃ 5 min，4℃保存。反应体系如表1所示。

（2）PCR扩增产物回收：按照凝胶DNA回收试剂盒（上海捷瑞）说明书进行凝胶回收，PCR产物-20℃保存。

（3）目的片段与空载体双酶切

分别向目的片段和空载体中加入两种内切酶进行双酶切。反应体系如表所示，37℃温育1 h。然后灌制1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的条带。

（4）目的片段与载体连接

双酶切后用T4 DNA 连接酶连接目的片段和载体质粒，在0.2 mL的离心管中配置连接反应液，用移液器吹打混匀连接反应物，常温反应30 min。反应体系如表3所示。

（5）转化感受态细胞Trans1 T1

1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上融化；

2)无菌状态下取50 μL的感受态细胞置于灭菌后的1.5 mL 的离心管中；

3)加入10 μL连接产物，冰中放置30分钟；

4)42℃ 放置30秒（热休克），不要摇动离心管；

5)快速转移离心管于冰中放置2～3 min；

加入200 μL LB液体培养基，吹打混匀，涂布于LA琼脂平板培养基上，37℃倒置培养12～16 h。

（6）阳性菌落的PCR鉴定：挑取单个菌落接种于LA培养液中，37℃摇床220 rpm培养4h后取1 μL菌液作为模板进行PCR扩增。然后灌制1.5%琼脂糖凝胶，取5 μL PCR产物进行电泳检测。

阳性菌液测序鉴定：将通过菌液PCR检测的阳性菌液进行测序，将得到的结果进行BLAST序列对比分析，确定其是否为目的基因。

测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明hsa_circ_0072309成功插入修改的pLO5-ciR（EcoRI和BamHI位点不保留）中，过表达载体构建成功。

（7）无内毒素质粒抽提

按照E.Z.N.A. ® Endo-free Plasmid Mini Kit I（Omega）试剂盒说明书进行无内毒素质粒抽提，-20℃保存。

二、细胞转染

使用HCC细胞系（SK-Hep-1，HepG2）和人正常肝细胞系（LO2）购自美国类型培养物收集中心（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。所有细胞系均在Roswell Park MemorialInstitute-1640培养基（RPMI；Invitrogen，CA，USA）中生长，并添加10%胎牛血清（FBS，Gibco，Carlsbad，USA）、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Invitrogen）。细胞在37°C、添加5%CO2的增湿培养箱中培养。培养基每三天更换一次。当细胞附着率达到80–90%时，细胞传代。

将人肝癌细胞株SK-hep-1和HepG2接种在两个六孔板上。质粒和Lipofectamine2000（3µg质粒：4μL）在70-90%的细胞汇合处混合，并添加到无血清培养基中至细胞样品中。将细胞系置于37°C的培养箱中，并保持在5%的CO2下。培养5-6h后，移除转染培养基并用完整培养基替换。48小时后采集细胞样本。PCR证实细胞转染。提取的RNA用NanoDropND2000和1%琼脂糖凝胶电泳检测。

三、细胞功能试验

（1）细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析

在细胞转染48小时后，将一组4个（96孔板）接种100µl 1×104细胞/mL到每个孔中，设置3个重复。正常培养细胞，并在（24小时、48小时、72小时）向每个孔中添加10µl CCK-8溶液。然后在37℃下培养2h，并使用微孔板读取器（BioTek）在450nm处读取吸光度。以下公式用于计算：

细胞增殖率：增殖率（同一处理样本）=day0 NOD值/日平均OD值，

细胞抑制率公式：抑制率（同一时间点）=（1-实验组增殖率）/对照组平均增殖率。

（2）伤口愈合试验

转染48小时后，将细胞接种到6孔板上。10μL移液管尖端用于使细胞划痕垂直于6孔板。移除旧培养基，用无菌PBS洗涤细胞三次，移除受损细胞并添加新培养基。在0小时、24小时和48小时观察并计算细胞划痕迁移率。

（3）井间迁移分析

通过溶解Matrigel并使其在4°C下过夜来制备Matrigel。然后用预冷无血清培养基以1:3的体积比将其稀释，然后将40μL添加到预冷Transwell培养箱中，并在37°C下培养2h以凝固基质凝胶。48小时后获得的转染细胞然后用胰蛋白酶EDTA溶液消化，以800 rpm离心3分钟，并重新悬浮在无血清DMEM培养基中。向Transwell培养箱上部添加100µL细胞悬浮液，向培养箱下部添加600µL完整培养基。在37°C条件下，在5%CO2的环境中培养24小时。用棉签从上腔擦拭去除未研磨的细胞。过滤器用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS洗涤。对穿过下室的细胞进行计数，并收集图像证据。

（4）菌落形成试验

转染48h后用胰蛋白酶EDTA消化细胞，制备细胞悬浮液。台盼蓝染色用于活细胞计数，并用完整培养基制备细胞悬浮液。在六孔培养皿中，每孔接种约200个活细胞，获得50到200个菌落。然后将其置于37°C的培养箱中，并补充5%的二氧化碳10-15天。然后移除培养基，用多聚甲醛固定，用PBS洗涤一次，用结晶紫染色10分钟，然后用PBS重新洗涤。然后对形成的菌落进行计数。

（5）细胞周期分析

转染48小时后，用胰蛋白酶EDTA消化细胞，收集1×106个细胞。然后固定细胞，离心，用含有50µg/mL溴化丙啶（PI）、100µg/mL核糖核酸酶A、0.2%Triton X-100的1mL PBS和500µL PBS洗涤一次，然后添加并在4°C的黑暗中培养30分钟进行染色。然后用流式细胞仪检测488nm激发波长下的红色荧光。利用细胞周期模拟软件ModFit对结果进行分析。

（6）细胞凋亡测定

将来自每个细胞培养板的培养基转移到15mL锥形管中并放置在冰上。然后在培养皿中使用2ml PBS溶液轻轻冲洗细胞。然后添加不含EDTA的胰酶（0.5ml，0.25%），并孵育，直到细胞开始从培养板壁上分离，如显微镜下所示。然后将细胞重新悬浮在培养基或预冷却的1×结合缓冲液中，密度约为1×106个细胞/ml。然后将0.5ml细胞悬浮液从细胞培养板（5×105个细胞）转移到干净的离心管中。然后添加1.25μl AnnexinV APC，并在18-24°C条件下在黑暗中反应15分钟。在室温下以1000×g离心5分钟，并去除上清液。用0.5 ml预冷1×结合缓冲液轻轻地重新悬浮细胞，然后添加10μl 7-AAD。样品储存在冰上，并避光。流式细胞术用于分析。

实施例3：

一、circRNA体内沉淀（circRIP）

将样品加入500μl裂解液、蛋白酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂中，混合并在低温下裂解10分钟。离心后获得上清液并放置在-80°C下。然后将100μl蛋白质A+G磁珠添加到1ml结合缓冲液中并洗涤三次。然后添加1ml反应溶液和5μg抗体，并在4°C下搅拌1-2小时，以将抗体连接到磁珠上。然后添加400μl结合缓冲液和400μl细胞裂解液，并在2°C下搅拌2小时。然后收集抗原。旋涡后加入缓冲液RL。然后进行离心，并将上清液添加到gDNA过滤器MIN I柱中。

按照制造商的说明进行。

离心后也收集含有蛋白质的颗粒。然后在添加600μL RW1后，在12000g下重复离心30-60s。还添加相似量的RW2，并重复离心。然后将过滤柱转移到一个新的无核糖核酸酶离心管中。然后向柱膜中心添加30-100μL不含RNase的水；离心并将收集的RNA储存在-80°C下。将四倍体积的冰冷丙酮添加到先前获得的滤液中，旋转并混合30秒，然后蛋白质沉淀并放置在冰上30分钟。向上清液中添加1ml无水乙醇，然后再次离心，通过添加缓冲液溶解获得蛋白质沉淀。

二、荧光素酶报告试验

复苏的细胞（293T）培养并接种在24孔板上。在转染到has_circ_0072309质粒之前，让细胞生长到70%Mel 80%。转染后24小时，用TBK1抑制剂处理细胞1小时。然后，改变常规培养基并培养12-16小时。转染48小时后，细胞完全裂解后检测到荧光素酶报告基因。

三、蛋白质印迹分析

用试剂从细胞中分离总蛋白。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）处理每条蛋白带，并将其转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。然后在室温下将薄膜密封在Tris缓冲盐水中。然后用X进行培养。然后用TBST清洗膜3次，并在室温下用X培养2小时。最后，用增强化学发光试剂显示蛋白条带。至少进行了3次westernblot试验。

四、免疫荧光原位杂交

细胞在载玻片的培养板中培养。收获时，首先用4%多聚甲醛固定细胞，然后用0.5%Triton X-100渗透15分钟。然后，用变性探针（hsa_circ_0072309）在37℃过夜（12-18小时）培养细胞。之后，用3%BSA将一抗稀释过夜，荧光二抗（1:200）在室温下黑暗中培养1h。DAPI用于核染色。共聚焦显微镜使用TCS SP2 AOBS激光扫描共聚焦显微镜。、

以上实施例的实验结果如下所示：

1、circLIFR在HCC样本和细胞系中降低

为发现肝癌不同表达的circRNA，我们对6个组织样本(3个癌组织和3对相邻部位的正常组织)进行了高通量RNA测序(RNA-seq)。结果显示，与正常组织相比，癌组织中有56个circRNA上调，70个circRNA下调(图1，2)。并列出了10种差异显著的circRNA (图3)。在这些表达不同的circRNA中，我们选择了3个下调的circRNA，并在其他10个HCC和配对的正常肝组织中验证了其表达。结果显示，这3种circRNA在HCC中均显著低于配对的相邻正常组织(图4)。特别是在HCC样本和SK-hep-1细胞株中，来自LIFR基因的circRNA (hsa_circ_0072309,circLIFR)明显降低。Sanger测序显示了circLIFR的界面位置序列(图5)。

2、circLIFR过表达质粒转染及效率评价

（circLIFR-F: cgGAATTCTAATACTTTCAGGACTGACTGCATTGCACAGATG；circLIFR -R:cgGGATCCAGTTGTTCTTACTAATTTTACGAGCTCCATACTCPCR）通过扩增circLIFR的580bp序列，以EcoRI和BamHI双酶切连接到pLC5-ciR载体中（图6），测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明circLIFR成功插入pLC5-ciR中，过表达载体构建成功。分circLIFR、NC(pLC5-ciR)和control三组转染293T细胞，40h后收集细胞进行RT-qPCR检测，结果显示RNA电泳图28s，18s，5s条带清晰，RNA完整性良好，可以进行后续的实验（图7），转染circLIFR的293T细胞明显高表达（图8），。以 PCR 扩增 circLIFR（circBank ID: hsa_circLIFR_002）全长580bp 序列，In-fusion 连接到修改的 pLO5-ciR（EcoRI 和 BamHI 位点不保留）中（图9），测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明 circLIFR 成功插入修改的 pLO5-ciR中，过表达载体构建成功。分circLIFR、NC（pLO5-ciR）和 control 三组转染SK-Hep-1细胞，48 h后收集细胞进行RT-qPCR 检测，结果显示RNA 电泳图28s，18s 条带清晰，RNA 完整性良好，可以进行后续的实验（图10），转染circLIFR的SK-Hep-1细胞明显高表达（图11）。

我们利用双酶切载体质粒分别转染肝癌HepG2和SK-Hep-1细胞株，并分别设立不做处理的人肝癌细胞作为空白对照组，转染空载质粒的肝癌细胞作为阴性对照组，转染circLIFR的肝癌细胞作为实验组。实验结果显示，在转染细胞实验中，circLIFR在肝癌HepG2和SK-Hep-1细胞株均稳定表达，对比不做处理的人肝癌细胞的空白对照组，转染circLIFR的肝癌细胞作为实验组明显高表达（图12，13）；

3、circLIFR过表达促进细胞生长和转移

CCK8细胞增殖实验表明过表达circLIFR可促进Sk-Hep-1细胞和HepG2细胞(图14)的细胞生长。伤口愈合和Transwell实验表明，circLIFR过表达促进Sk-Hep-1细胞和HepG2细胞(图15，16)的迁移和侵袭。菌落形成实验也显示circLIFR促进Sk-Hep-1细胞和HepG2细胞(图17)的菌落数量。细胞周期和凋亡检测也显示过表达circLIFR能够促进更多的细胞进入细胞周期循环，促进细胞增殖，并能够减少肝癌细胞凋亡的比例。(图18，19)。

4、在肝癌细胞中circLIFR直接作用于TBK1

内源性低表达circLIFR的功能分析显示其具有促肿瘤作用。我们采用RNA Pull-down技术对包括TBK1在内的相互作用蛋白进行捕获分析（图20）。我们捕获了10个相互作用蛋白，包括TBK1（图21）。PPI对这些捕获蛋白的蛋白质相互作用网络进行了预测，结果显示TBK1为蛋白质相互作用网络的中心(图22)。TBK1常在肿瘤中高表达，TCGA数据分析显示，TBK1在大多数肿瘤类型中的表达均高于癌旁对照组(图23)。因此，我们希望进一步验证和分析circLIFR与TBK1之间的相互作用，这种相互作用是否介导了circLIFR的促肿瘤作用。通过Anti-TBK1 RIP实验验证内源性TBK1和circLIFR之间的相互作用(图24)。FISH和IF共定位分析也符合circLIFR和TBK1之间的共定位(图25)。通过原位杂交及免疫荧光双染（IF-FISH），可以在组织细胞中对核酸分子和蛋白指标同时进行共定位、以及定性分析，可以用来从共定位角度提示核酸和蛋白存在相互作用。我们通过以红色荧光标记的cy3探针对circLIFR进行荧光原位杂交（FISH），以绿色荧光物质标记TBK1蛋白抗体进行免疫荧光（IF）抗原定位，DAPI染色对核进行定位，来检测circLIFR与TBK1蛋白的相互作用。结果显示，LO2细胞与过表达circLIFR的SK-Hep-1细胞中circLIFR与TBK1蛋白定位均基本一致，提示circLIFR与TBK1蛋白之间存在相互作用（图25）。

5、circLIFR-TBK1抑制NF-κB活性，促进下游基因表达

核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是TBK1的重要下游靶分子，为进一步验证circLIFR与TBK1的相互作用关系，我们分析了NF-κB可结合的启动子报告基因。结果显示，单独过表达circLIFR能够显著促进NF-κB报告基因的表达效率，证明circLIFR具有促进NF-κB活性的作用。与此相反，单独添加TBK1抑制剂则显著抑制NF-κB报告基因的表达，而同时过表达circLIFR和抑制TBK1时，NF-κB报告基因的影响得到回补(图26)。

NF-κB亚基p65是TBK1的一个已知作用位点。为分析circLIFR-TBK1对NF-κB的调控作用，采用Western blotting检测p65的磷酸化状态。结果表明，circLIFR过表达显著促进p65的磷酸化水平，而TBK1抑制剂抑制p65的磷酸化。circLIFR的过表达也可以逆转TBK1抑制剂削弱p65磷酸化的影响。这些结果表明，circLIFR-TBK1调节NF-κB通路的激活状态，circLIFR能够逆转TBK1抑制剂的效应(图27)。

NF-κB是一种重要的转录因子，介导了许多与细胞增殖、迁移和侵袭有关的基因的表达。我们挑选了人基质金属蛋白酶-13（MMP-13），基质金属蛋白酶-3（MMP3），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）作为靶分子进行RT-qPCR检测，显示circLIFR-TBK1对下游基因的影响。结果表明，circLIFR过表达增强了几个下游基因的表达，而TBK1抑制剂可抑制这些基因的表达。circLIFR过表达逆转TBK1抑制剂的作用(图28)。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<120> 一种用于检测肝癌的生物标志物及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 11

agaaggctgg ggctcatttg 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 12

gcaggaggca ttgctgatga t 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 13

gccaagctca cttttaatca tg 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 14

catcatcctg agaatctcat g 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 15

tcgctgaagg ttcgagga 18

<210> 16

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 16

acagtaatta tccaccgtgc g 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 17

gtatatcaca ctaaaggcta tgg 23

<210> 18

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 18

ctagtgtcta caacttgctg 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 19

ctaagcaatg ggaaacttgg ttaa 24

<210> 20

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 20

ctttaagcgc tgttccttag 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 21

gatcttaccc ttaaagctga tttc 24

<210> 22

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 22

ggaacttaag gacttgagcc 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 23

gaagaagcaa ccaaggcttg t 21

<210> 24

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 24

ttcttgactt ccagttgaag ctg 23

<210> 25

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 25

ggcagctctg gataagatta ac 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 26

gttacatttc cacggccata ac 22

<210> 27

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 27

ggagctcgta aaattagact g 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 28

aatgttgata acagccactg ga 22

<210> 29

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 29

gatgaagtat ctgggcctct 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 30

ccattgtatg tgccacatcg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 31

gccttatgcc ctgaaagaac 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213>人工序列

<400> 32

gccacatcca ataggtagat ct 22

Claims

1.肝癌的生物标志物，其特征在于：所述标志物为hsa_circ_0099634、hsa_circ_0003914、hsa_circ_0013225、hsa_circ_0006475、hsa_circ_0106467、hsa_circ_0035435、hsa_circ_0080960、hsa_circ_0072309、hsa_circ_0055113、hsa_circ_0008844中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的肝癌的生物标志物，其特征在于：其中标志物hsa_circ_0099634、hsa_circ_0003914、hsa_circ_0013225、hsa_circ_0006475、hsa_circ_0106467在肝癌组织中表达上调；标志物hsa_circ_0035435、hsa_circ_0080960、hsa_circ_0072309、hsa_circ_0055113、hsa_circ_0008844在肝癌组织中表达下调。

3.根据权利要求2所述的肝癌的生物标志物，其特征在于：所述标志物为hsa_circ_0072309。

4.如权利要求1-3任一项所述的肝癌的生物标志物在制备肝癌的诊断产品中的应用。

5.用于肝癌的诊断试剂盒，其特征在于：包含特异性扩增如权利要求1所述的用于检测肝癌的生物标志物的引物。

6.如权利要求3所述的肝癌的生物标志物在制备肝癌的治疗产品中的应用。

7.用于治疗肝癌的药物组合物，其特征在于：包含hsa_circ_0072309抑制剂。