CN113797201B - 胡椒碱在制备作为人的苦味受体14亚型的激动剂中的应用 - Google Patents

胡椒碱在制备作为人的苦味受体14亚型的激动剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及胡椒碱的新用途，胡椒碱在制备作为人的苦味受体14亚型（hTAS2R14）的激动剂中的应用，胡椒碱能够增加肠内分泌细胞Caco‑2中hTAS2R14的mRNA水平和蛋白表达，以及增加其下游磷脂酶C β2和瞬时受体电位离子通道蛋白M5蛋白表达，增加胞内钙的动员，进而增加胰高血糖素样肽1(GLP‑1)前体胰高血糖素原的基因表达和GLP‑1的分泌。hTAS2R14拮抗剂6‑甲氧基黄酮没有减弱胡椒碱对胞内钙的动员的效应，反而促进了胡椒碱对胞内钙的动员。与hTAS2R14藕联的G蛋白的Gβγ亚基抑制剂明显减弱了胡椒碱对GLP‑1的分泌，磷脂酶C β2抑制剂显著减弱了胡椒碱对GLP‑1的分泌。该研究说明胡椒碱是hTAS2R14的高效激动剂。

Description

胡椒碱在制备作为人的苦味受体14亚型的激动剂中的应用
本发明涉及胡椒碱作用靶点的发现，胡椒碱能够激活人的苦味受体14亚型(hTAS2R14)，是hTAS2R14的一个高效激动剂。具体为胡椒碱能够激活消化道内分泌细胞hTAS2R14，可作为在制备糖尿病、肥胖症等治疗和预防药物中的应用。
背景技术
味觉强烈影响着食物的偏好和摄取，脊椎动物对食物或化合物的感受器是不同的味觉受体(taste receptors,TASRs)，味觉受体最初被发现于口腔的味蕾中。人的味觉受体包括两种类型，即甜味受体(hTAS1Rs)和苦味受体(hTAS2Rs)。hTAS2Rs是一类G蛋白藕联受体(GPCRs)，由疏水性七次跨膜区域、胞外较短的氨基末端、胞内羧基末端、3个细胞外环状结构和3个细胞内环状结构构成。hTAS2Rs信号通路具有高度的保守性。hTAS2Rs被配体激活后，hTAS2Rs与Gαβγ复合体分离，通过两种途径发挥作用：(1)Gαgust-PDE途径，TAS2Rs被激活后使G蛋白α亚基味导素(Gαgust)分离，从而导致磷酸二酯酶(PDE)异构化，cAMP水平下降；cAMP水平下降导致cAMP对离子通道的抑制作用解除，触发选择性的Ca2+通道开放，继而引起细胞内Ca2+浓度的升高，细胞膜去极化，使神经递质或激素释放。(2)Gβγ-PLCβ2途径，hTAS2Rs被激活后释放Gβγ亚基，进而使磷脂酶β2(PLCβ2)活化，产生三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油，IP3激活内质网上其受体3(IP3R3)，引起Ca2+动员、胞内Ca2+增加，而DAG使PKC活化引起胞内Ca2+增加，这些使细胞膜上的瞬时受体电位离子通道蛋白M5(TRPM5)激活，导致阳离子如Na+等内流和膜去极化，使神经递质或激素释放。
目前已知的人类TAS2Rs有25个，包括hTAS2R1，3，4，5，7，8，9，10，13，14，16，19，20，30，31，38，39，40，41，42，43，45，46，50，60，其中hTAS2R14、10、46三个亚型的激动剂谱远远大于其他亚型。TAS2Rs还存在于口腔外组织中，如呼吸、胃肠、脑等系统。
肠是最早被发现存在味觉感受信号的口腔外组织(Proc Natl Acad SciUSA1996；93(13):6631-6634)。早期报道发现胃肠道hTAS2R14激活可促进肠促胰酶肽的分泌，从而抑制食欲。近年来的报道显示，呼吸道hTAS2R14激活后可改善阻塞性气道疾病。目前hTAS2R14被激活后引起的生物功能仍有待研究，。
胡椒碱(piperine，Pip)是黑胡椒(胡椒科胡椒属)的主要刺激性成分和特有气味的化合物，是黑胡椒中含量最高的天然生物碱(2％-9％)。黑胡椒的粗提物和活性成分(主要是生物碱)具有广泛的药理活性，特别是抗氧化、抗抑郁、肝保护、抗微生物、抗肥胖、治疗认知障碍、降血糖、抗高脂血症、免疫增强和抗炎等。然而，未见胡椒碱作为苦味受体14激动剂的报道。
发明内容
1.发明目的
本发明目的发现胡椒碱在作为人的苦味受体14亚型的激动剂，拓展了胡椒碱的新用途。
2.技术方案
胡椒碱在制备作为hTAS2R14以及hTAS2R14的啮齿类动物的同源受体的激动剂中的应用，其中hTAS2R14的啮齿类动物的同源受体包括Tas2r140，113，116，125。
本发明研究思路：以肠道内分泌细胞中hTAS2R14激活后能够促进肠促胰岛素GLP-1的分泌为指标，研究胡椒碱激活hTAS2R14信号通路后所产生的生物效应。通过实验证明胡椒碱是人的苦味受体14亚型的激动剂。
文献报道人的结直肠腺癌细胞系NCI-H716和Caco-2细胞均具有肠内分泌细胞(enteroendocrine)的功能，能够分泌一些肠肽激素。Caco-2细胞为贴壁生长细胞，不需要分化等，容易培养及给药观察。我们对Caco-2细胞中hTAS2R4，10和14基因表达的丰度进行了研究，发现hTAS2R14，4和10基因表达的丰度依次降低，其中hTAS2R14基因表达最高，分别为hTAS2R4和hTAS2R10的9.46倍和28.84倍。因此，本发明以Caco-2细胞为研究对象，观察胡椒碱对hTAS2R14信号通路的激活作用，以及GLP-1分泌的影响。我们通过上海交通大学分子设计实验室开发的网络平台Bitter X，预测了能够与胡椒碱结合的hTAS2Rs，发现有9个亚型，其中hTAS2R4，14和10的可能性较高，最大可能性在75％-80％。
本发明公开了胡椒碱是一个hTAS2R14的高效激动剂，能够激活肠道内分泌细胞中hTAS2R14信号通路，进而促进GLP-1分泌的作用，我们研究发现，胡椒碱能够增加Caco-2细胞胞内钙的动员和GLP-1的分泌，增加hTAS2R14的蛋白表达和mRNA水平，增加PLCβ2蛋白表达和TRPM5蛋白表达。另一方面，与hTAS2R14藕联的G蛋白的Gβγ亚基抑制剂和胡椒碱合用明显减弱了胡椒碱对GLP-1的分泌，PLCβ2抑制剂和胡椒碱合用显著减弱了胡椒碱对GLP-1的分泌。最重要的是，我们建立了敲低hTAS2R14的Caco-2细胞，发现敲低hTAS2R14后，胡椒碱增加PLCβ2和TRPM5蛋白表达的作用被抵消。另外，文献报道化合物6-甲氧基黄酮(6-Methoxyflavone)是hTAS2R14拮抗剂，能够拮抗hTAS2R14激动剂sensing competencestimulating peptide 1的效应(FASEB J.2021；35(3):e21375.)，然而，我们发现不同浓度的6-甲氧基黄酮和胡椒碱共处理Caco-2细胞后，胞内钙离子浓度没有降低反而显著增加，表明6-甲氧基黄酮不是拮抗而是激动hTAS2R14，与胡椒碱有协同效应。
通过上述胡椒碱和hTAS2R14信号通路的各种药理试验及其结果，来说明胡椒碱是hTAS2R14的一个高效激动剂。
3.有益效果
以上药理试验结果表明本发明具有以下优点：
(1)本发明首次发现胡椒碱能够激活hTAS2R14信号通路，是hTAS2R14的一个高效激动剂。hTAS2R14在机体的多个系统中都有表达，尤其是消化道的内分泌细胞中表达丰富。而且，hTAS2R14具有非常广泛的激动剂谱，与hTAS2R10和hTAS2R46属于激动剂谱最广的三个苦味受体亚型。
文献报道，南非原产蝴蝶仙人掌中提取的甾体皂苷能够选择性地激活hTAS2R7和hTAS2R14，进而促进胃肠道肠促胰酶肽的分泌，从而抑制食欲，这提示hTAS2R14激动剂还可以通过影响消化道其他肠肽激素的分泌发挥改善代谢性疾病的作用。由于hTAS2R14的功能并不完全清晰，并非强调胡椒碱治疗如糖尿病等代谢疾病，本发明所要强调的是胡椒碱作为hTAS2R14的激动剂，hTAS2R14的激动剂可以启动多种信号通道和产生不同功能，如改善代谢疾病、呼吸道疾病等作用。
(2)本发明使用的天然产物胡椒碱是一种高效hTAS2R14激动剂，促进胞内钙离动员和GLP-1分泌的有效浓度较低，属于几微摩尔每升级别，而且低于合成的hTAS2R14激动剂氟芬那酸(Cellular and Molecular Life Sciences 2020；77:531–542)的有效浓度(属于几十微摩尔每升级别)，通常hTAS2Rs激动剂促进胞内钙离动员的有效浓度都在百微摩尔每升及以上级别。这些表明本发明中胡椒碱激动hTAS2R14引起肠肽激素的分泌的效价强度较高，为良好的潜在抗代谢性疾病药物。
(3)本发明使用的两种hTAS2R14激动剂胡椒碱和氟芬那酸能够显著促进GLP-1分泌及hTAS2R14信号通路的激活，而hTAS2R14敲低明显减弱了胡椒碱对hTAS2R14信号通路的激活作用。然而，文献报道的hTAS2R14拮抗剂6-甲氧基黄酮没有拮抗、反而增强了胡椒碱对hTAS2R14的激动作用。这些表明hTAS2R14为胡椒碱的作用靶点，同时也表明hTAS2R14的拮抗剂的发现任重而道远，因此而说明hTAS2R14作用的复杂性。
附图说明
图1胡椒碱对Caco-2细胞PLCβ2蛋白表达的影响。Ctrl:Control；Pip-2，Pip-10，Pip-50分别代表2,10,50μM胡椒碱piperine.细胞免疫荧光法测定蛋白表达水平。Scalebar:20μm。
图2hTAS2R14敲低对胡椒碱增加Caco-2细胞PLCβ2蛋白表达的影响。Ctrl:Control；NC:negative control；Pip-50:50μM胡椒碱piperine；shRNA:sh-hTAS2R14 RNA.细胞免疫荧光法测定蛋白表达水平。Scale bar:20μm。
具体实施方式
实施例1：胡椒碱和氟芬那酸对Caco-2细胞胞内钙离动员和GLP-1分泌的影响
1材料与方法
1.1细胞系
Caco-2细胞(FH0029)购自上海富衡生物科技有限公司。
1.2药品与主要试剂
1.2.1药品：胡椒碱(purity>98％)购自成都普思生物科技股份有限公司；氟芬那酸(purity>99％)购自上海源叶生物科技有限公司。
1.2.2试剂：DMEM高糖培养基(4.5g/L葡萄糖)购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂(15596-026)购自美国Invitrogen公司；PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)(RR037A)和SYBR Premix Ex Taq II购自大连TaKaRa公司；DNase/RNase-FreeH2O(T121-02)购自天根生化科技(北京)有限公司；CCK-8试剂盒购自上海Dongren化学科技有限公司；Fura-2钙离子荧光探针购自江苏碧云天生物技术研究所；人的GLP-1(7-36)ELISA试剂盒购自上海博蕴生物科技有限公司。
1.3方法
1.3.1分组及给药：Caco-2为贴壁生长细胞，常规培养于含10％FBS和1％双抗(青链霉素)DMEM高糖培养液中，5％CO2、37℃恒温培养箱中培养。生长状态良好时，换成无血清的培养基使细胞周期同步化12h，分为对照组(Ctrl)、不同浓度Pip及FA处理组，培养30min后收集细胞，进行胞内钙离子浓度测定；培养1h后收集培养基进行GLP-1水平测定；培养24h后进行其他相关指标测定。
1.3.2细胞活力测定：采用CCK-8法测定细胞活力。根据1.3.1培养细胞，Pip设置0.1，1，10，50，100μmol/L五个浓度，同时设置Ctrl组，培养24h后收集细胞，按照试剂盒操作步骤进行测定。
1.3.3mRNA水平测定：RT-qPCR法测定mRNA水平。采用Trizol提取总RNA，测定总RNA浓度，依据试剂说明书进行操作。测定其纯度，OD260/280在1.8-2.0间的样本为合格样本。每个样本取0.5μg总RNA用于逆转录成cDNA，具体操作依据cDNA反转录合成试剂盒说明书进行。合成的cDNA用罗氏480荧光定量PCR仪进行扩增。在扩增结束后，扩增溶解曲线以检测扩增片段的纯度。Cp值越小，目的基因的含量就越高。以2-⊿Cp值(⊿Cp＝⊿Cpβ-actin﹣⊿Cp目的)作为该样本的基因表达的相对数值。
1.3.4钙离子浓度测定：采用荧光探针法测定细胞内钙离子浓度。细胞接种于96孔板预培养24h，PBS洗三次，加入Fura-2钙离子荧光探针工作液避光孵育45min，PBS洗三次，加入含不同浓度两种药物的培养基避光孵育30min。采用荧光酶标仪，分别检测激发波长340nm和380nm，发射波长510nm处的荧光强度，钙离子浓度用340nm与380nm处的荧光强度比值反映，比值越大，钙离子浓度越高。
1.3.5GLP-1浓度测定：采用ELISA法测定GLP-1浓度。根据1.3.1培养细胞，收集细胞培养基，严格按照试剂盒说明书进行测定。
2结果
2.1Caco-2细胞中hTAS2R14，4，10的表达丰度的比较
Caco-2细胞培养24h后，实时定量PCR法测定三种人苦味受体的表达，发现hTAS2R14，4，10都有表达，而hTAS2R14表达量最高，且依hTAS2R14，4，10顺序mRNA水平依次降低(见表1)。因此，Caco-2细胞可用于hTAS2R14激动剂的功能研究。
表1 Caco-2细胞中hTAS2R14，4，10的表达丰度
注RT-qPCR法测定hTAS2Rs水平。Mean±SD。
2.2Caco-2细胞中胡椒碱浓度的筛选
以细胞活力为指标筛选胡椒碱对Caco-2细胞无损伤的药物浓度。结果发现，与药物未处理组相比，胡椒碱浓度小于100μmol/L时对Caco-2细胞的细胞活力无明显影响(见表2)。因此，初步设置50，10，2μmol/L三个浓度的胡椒碱进行其对胞内钙动员影响的研究。
表2胡椒碱对Caco-2细胞活力的影响
注Ctrl:Control；Pip-0.1，Pip-1，Pip-10，Pip-50，Pip-100分别代表0.1,1,10,50,100μM胡椒碱piperine.Mean±SD，n为复孔数.##P<0.01,与Ctrl组比较。
2.3氟芬那酸和胡椒碱对Caco-2细胞胞内钙动员的影响
本研究采用氟芬那酸作为胡椒碱对hTAS2R14激动作用的一个阳性对照药。尽管文献报道氟芬那酸增加胞内钙离子水平的EC50值为238nmol/L，但使用的是工具细胞HEK293过表达hTAS2R14后进行研究所测得的钙动员的EC50值。因细胞类型不同，EC50值有差异，所以本研究对其浓度进行了筛选。结果发现，氟芬那酸在20和50μmol/L时显著增加胞内钙离子水平(见表3)。由于50μmol/L时，胞内钙离子水平增加的百分率更明显，因此，选择50μmol/L氟芬那酸进行后续研究。
表3 hTAS2R14激动剂氟芬那酸对Caco-2细胞胞内钙动员的影响
注Ctrl:Control；FA-2，FA-5，FA-10，FA-20，FA-50分别代表2,5,10,20,50μM氟芬那酸flufenamic acid.Mean±SD，n为复孔数.#P<0.05,##P<0.01,与Ctrl组比较。
我们采用胡椒碱低、中、高三个浓度2，10，50μmol/L处理Caco-2细胞，发现10和50μmol/L胡椒碱显著增加胞内钙离子水平，而2μmol/L胡椒碱仅表现出增加的趋势(见表4)。另外，10μmol/L胡椒碱的效应稍强于20μmol/L氟芬那酸的效应(见表3，4)。
表4 hTAS2R14激动剂胡椒碱对Caco-2细胞胞内钙动员的影响
注Ctrl:Control；Pip-2，Pip-10，Pip-50分别代表2,10,50μM胡椒碱piperine.Mean±SD，n为复孔数.##P<0.01,与Ctrl组比较。
2.4胡椒碱和氟芬那酸对Caco-2细胞GLP-1分泌的影响
与Ctrl组(25mmol/L葡萄糖培养)相比，10和50μmol/L胡椒碱处理后明显刺激Caco-2细胞分泌GLP-1，使培养基中GLP-1浓度显著增加，而2μmol/L胡椒碱仅表现出增加的趋势(见表5)。而且，50μmol/L氟芬那酸处理后也能够显著增加胞外GLP-1浓度，但作用远弱于10μmol/L胡椒碱(见表5)。
表5胡椒碱和氟芬那酸对Caco-2细胞GLP-1分泌的影响
注Ctrl:Control；Pip-2，Pip-10，Pip-50分别代表2,10,50μM胡椒碱piperine；
FA代表50μM氟芬那酸flufenamic acid.Mean±SD,n为细胞批数.#P<0.05,
##P<0.01,与Ctrl组比较。
2.5胡椒碱对Caco-2细胞GLP-1前体胰高血糖素原mRNA水平的影响
与Ctrl组相比，高浓度胡椒碱能够显著增加Caco-2细胞中GCG水平，而低、中浓度胡椒碱仅表现出增加的趋势(见表6)。结果表明，胡椒碱能够促进GLP-1前体胰高血糖素原的表达，进而增加GLP-1的合成。
表6胡椒碱对Caco-2细胞GLP-1前体胰高血糖素原mRNA水平的影响
注Ctrl:Control；Pip-2，Pip-10，Pip-50分别代表2,10,50μM胡椒碱piperine.GCG为胰高血糖素原(proglucagon)的基因符号.以β-actin为内参，RT-qPCR法测定hTAS2Rs水平。Mean±SD,n为细胞批数.##P<0.01,与Ctrl组比较。
实施例2：胡椒碱对Caco-2细胞hTAS2R14信号通路的影响
1材料与方法
1.1细胞系 实施例1。
1.2药品与主要试剂BCA蛋白分析试剂盒(23225)购自Thermo-Scientific(Rockford,IL,USA)；兔hTAS2R14抗体(DF5159)购自Affinity抗体公司；兔PLCβ2抗体(A8141)购自ABclonal抗体公司；兔TRPM5抗体(18027-1-AP)购自Proteintech抗体公司；兔β-actin(#AP0060)抗体购自BioworldTechnology抗体公司；羊抗兔Dylight 594AffinipureIgG(H+L)二抗(#V926-32211)购自Li-Cor,Inc.(Lincoln,NE)；其他同实施例1。
1.3方法
1.3.1分组及给药：同实施例1。
1.3.2蛋白表达测定(Westernblot法)：细胞匀浆上清液用BCA法测定蛋白浓度，SDS上样缓冲液稀释蛋白液。常规Westernblot方法测定蛋白表达，即依次进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影、扫描，以目标蛋白与内参蛋白相对灰度为指标，分析目标蛋白表达量的变化。
1.3.3蛋白表达测定(Immunofluorescence法)：将无菌的圆形盖玻片置12孔板中，接种细胞于孔板中，细胞在盖玻片上稳定生长后，给予无血清的培养基进行细胞周期同步化处理12h，给药时更换完全培养基，分别给予药物处理，24h后弃去培养基，进行后续实验。
1)PBS清洗细胞爬片，5min/次×3次；
2)加入4％多聚甲醛或者甲醇覆盖爬片，-20℃固定15min；
3)PBS清洗，5min/次×3次；
4)加入0.1％TritonX-100穿孔10min；
5)PBS清洗，5min/次×3次；
6)加1％BSA(PBS配制)封闭30min；
7)按照说明书要求稀释一抗，覆盖整个爬片，放入湿盒4℃过夜。
8)PBS清洗，5min/次×3次；
9)按照说明书要求配制Dylight 594(抗兔)标记的二抗，覆盖整个爬片，37℃孵育1h；
10)PBS清洗，5min/次×3次；
11)DAPI染色2min；
12)PBS清洗，5min/次×3次；
13)用滤纸吸干残余的PBS，加入一滴抗荧光淬灭剂，爬片转移至载玻片上，正面朝下。
14)荧光显微镜拍照，观察细胞中目标蛋白的细胞定位。
最终结果，目标蛋白为红色荧光，细胞核为蓝色荧光。
1.3.4mRNA水平测定(RT-qPCR法)：同实施例1。
2结果
2.1胡椒碱对Caco-2细胞hTAS2R14mRNA水平和蛋白表达的影响
与Ctrl组相比，高浓度胡椒碱能够显著增加Caco-2细胞中hTAS2R14 mRNA水平，低、中浓度胡椒碱也能够增加hTAS2R14 mRNA水平，但差异不显著(见表7)。同时，中、高浓度胡椒碱能够显著增加Caco-2细胞中hTAS2R14蛋白表达，低浓度胡椒碱也能够增加hTAS2R14蛋白表达，但差异不显著(见表7)。结果表明，胡椒碱能够上调Caco-2细胞中hTAS2R14。
表7胡椒碱对Caco-2细胞hTAS2R14 mRNA水平和蛋白表达的影响
注Ctrl:Control；Pip-2，Pip-10，Pip-50分别代表2,10,50μM胡椒碱piperine.以β-actin为内参，RT-qPCR法测定hTAS2Rs水平。以β-actin为内参，Westernblot法测定蛋白表达水平。Mean±SD,N＝4(protein)细胞批数,N＝5(mRNA)
细胞批数.#P<0.05,##P<0.01,与Ctrl组比较。
2.2胡椒碱对Caco-2细胞PLCβ2蛋白表达的影响
与Ctrl组相比，中、高浓度胡椒碱能够显著增加Caco-2细胞中PLCβ2蛋白表达，低浓度胡椒碱无明显增加(见图1)。结果表明，胡椒碱能够激活Caco-2细胞中hTAS2R14，从而使G蛋白的Gα和Gβγ亚基分离而增加PLCβ2的表达。
2.3胡椒碱对Caco-2细胞TRPM5蛋白表达的影响
与Ctrl组相比，中、高浓度胡椒碱能够显著增加Caco-2细胞中TRPM5蛋白表达，低浓度胡椒碱无明显增加(见表8)。结果表明，胡椒碱能够激活Caco-2细胞中hTAS2R14/Gβγ通路，促进胞内钙的动员，进而增加TRPM5的表达。
表8胡椒碱对Caco-2细胞TRPM5蛋白表达的影响
注Ctrl:Control；Pip-2，Pip-10，Pip-50分别代表2,10,50μM胡椒碱piperine.以β-actin为内参，Westernblot法测定蛋白表达水平。Mean±SD，n为细胞批数.#P<0.05,##P<0.01,与Ctrl组比较。
实施例3：Caco-2细胞hTAS2R14通路抑制对其激动剂胡椒碱效应的影响
1材料与方法
1.1细胞系 实施例1。
1.2药品与主要试剂：Gallein(GC13945，purity>98％)购自美国Glpbio公司；U73122(T6243，purity＝97.98％)购自美国TargetMol公司；6-甲氧基黄酮(6-methoxyflavone，6-MF,purity>98％)购自上海源叶生物科技有限公司。其他同实施例1、例2。
1.3方法
1.3.1分组及给药：Caco-2常规培养于含10％FBS和1％双抗(青链霉素)DMEM高糖培养液中，5％CO2、37℃恒温培养箱中培养。生长状态良好时，换成无血清的培养基使细胞周期同步化12h，分为Pip高浓度组(Pip-50)，以及Pip-50与不同干预制剂共处理组，培养30min后进行胞内钙离子浓度测定；培养1h后进行培养基中GLP-1水平测定。
1.3.2钙离子浓度测定(荧光探针法)：同实施例1。
1.3.3GLP-1水平测定(ELISA法)：同实施例1。
2结果
2.16-甲氧基黄酮对胡椒碱促进Caco-2细胞胞内钙动员的影响
文献报道化合物6-甲氧基黄酮是hTAS2R14拮抗剂，6-甲氧基黄酮(30μmol/L)能够拮抗hTAS2R14激动剂sensing competence stimulating peptide 1的效应(FASEBJ.2021；35(3):e21375.)，然而，在研究中我们发现25，50，100μmol/L浓度的6-甲氧基黄酮和高浓度胡椒碱(50μmol/L)共处理Caco-2细胞后，胞内钙离子浓度没有降低反而显著增加(见表9)，表明6-甲氧基黄酮没有拮抗而是激动hTAS2R14，与胡椒碱有协同效应。
表9 6-甲氧基黄酮对胡椒碱促进Caco-2细胞胞内钙动员的影响
注Pip-50代表50μM胡椒碱piperine；6-MF-25，6-MF-50，6-MF-100分别代表25，50，100μM6-甲氧基黄酮6-methoxyflavone.Mean±SD，n为复孔数.##P<0.01,与Pip-50组比较。
2.2hTAS2R14通路抑制对胡椒碱促进Caco-2细胞GLP-1分泌的影响
与高浓度胡椒碱组相比，高浓度胡椒碱与Gβγ抑制剂Gallein共处理Caco-2细胞后，GLP-1分泌显著降低(见表10)；同时，高浓度胡椒碱与PLCβ2抑制剂U73122共处理Caco-2细胞后，GLP-1分泌也显著降低(见表10)。这些结果表明，hTAS2R14/Gβγ通路抑制减弱了胡椒碱促进GLP-1分泌作用。
表10 hTAS2R14通路抑制对胡椒碱促进Caco-2细胞GLP-1分泌的影响
注Pip-50代表50μM胡椒碱piperine；Gallein:aGβγinhibitor；U73122:aPLCβ2inhibitor.Mean±SD，n为细胞指数.##P<0.01,与Pip-50组比较。
实施例4：Caco-2细胞hTAS2R14敲低对其激动剂胡椒碱效应的影响
1材料与方法
1.1细胞系 实施例1。
1.2药品与主要试剂：三个LV-sh-hTAS2R14RNA(shRNA)产品及其阴性对照(NC)购自上海吉凯基因科技有限公司；其他同实施例1、例2。
1.3方法
1.3.1hTAS2R14敲低的Caco-2细胞的建立：将细胞计数按1×105个细胞/ml接种到6孔板中，生长至约60-80％，换至无血清或1％的血清的DMEM培养基，开始加入慢病毒(LV)进行转染。LV携带hTAS2R14和空载体(NC)shRNA，转染至72h后观察GFP荧光强度，当荧光丰度在90％左右，转染完成。同时，加入2μg/ml嘌呤霉素进行筛杀细胞，24h后，降至1μg/ml维持浓度培养72h，待正常组细胞全部死亡，即转染结束，收取稳转细胞株进行转染效果的验证或进行传代保种。
1.3.2分组及给药：转染的LV-sh-hTAS2R14及NC的Caco-2细胞常规培养于含10％FBS和1％双抗(青链霉素)DMEM高糖培养液中，5％CO2、37℃恒温培养箱中培养。生长状态良好时，换成无血清的培养基使细胞周期同步化12h，分为NC组、hTAS2R14敲低组，以及两组经Pip高浓度(Pip-50)处理组，培养24h后进行相关指标测定。
1.3.3mRNA水平测定(RT-qPCR法)：同实施例1。
1.3.4蛋白表达测定(Westernblot法)：同实施例2。
1.3.5蛋白表达测定(Immunofluorescence法)：同实施例2。
2结果
2.1Caco-2细胞敲低hTAS2R14的验证
Caco-2细胞分别转染三个LV-sh-hTAS2R14及其阴性对照后，发现第三个sh-hTAS2R14组的hTAS2R14 mRNA水平极显著降低，而第一个sh-hTAS2R14和阴性对照组的反而表现出增加的趋势，第二个sh-hTAS2R14只表现出降低的趋势，无显著性差异(见表11)。这些结果表明第三个sh-hTAS2R14是有效的，而且对其转染后hTAS2R14蛋白表达进行了验证。结果发现，第三个sh-hTAS2R14转染Caco-2细胞后，hTAS2R14蛋白表达显著降低(见表12)。
表11三个LV-sh-hTAS2R14转染Caco-2细胞后hTAS2R14mRNA水平的变化
注Ctrl：Control；NC:negativecontrol；shRNA-1，2，3分别为三个LV-sh-hTAS2R14RNA.Mean±SD,n为细胞批数.##P<0.01,与Ctrl组比较。
表12三个LV-sh-hTAS2R14转染Caco-2细胞后hTAS2R14蛋白表达的变化
注NC:negative control；shRNA-3表示为第三个LV-sh-hTAS2R14 RNA.Mean±SD,n为细胞批数.##P<0.01,与NC组比较。
2.2敲低hTAS2R14对胡椒碱对PLCβ2蛋白表达的影响
与Ctrl组比较，NC组的PLCβ2蛋白表达无明显变化。与NC组比较，高浓度胡椒碱组PLCβ2蛋白表达显著增加，而hTAS2R14敲低组显著降低。与高浓度胡椒碱培养的NC组比较，高浓度胡椒碱培养的hTAS2R14敲低组，PLCβ2蛋白表达显著降低。这些结果表明，敲低hTAS2R14减弱了胡椒碱对PLCβ2蛋白表达增加的效应(见图2)。
2.3敲低hTAS2R14对胡椒碱对TRPM5蛋白表达的影响
与NC组比较，高浓度胡椒碱组TRPM5蛋白表达显著增加，而hTAS2R14敲低组显著降低。与高浓度胡椒碱培养的NC组比较，高浓度胡椒碱培养的hTAS2R14敲低组，TRPM5蛋白表达显著降低。这些结果表明，敲低hTAS2R14减弱了胡椒碱对TRPM5蛋白表达增加的效应(见表13)。
表13敲低sh-hTAS2R14对TRPM5蛋白表达的变化
注NC:negative control；shRNA：LV-sh-hTAS2R14 RNA；Pip-50:50μM胡椒碱piperine.Mean±SD,n为细胞批数.#P<0.05,##P<0.01,与NC组比较；**P<0.01,与NC+Pip-50组比较。

Claims (2)

1.胡椒碱在制备激活苦味受体14亚型的非治疗目的的试剂中的应用，其中所述的苦味受体14亚型为hTAS2R14；所述的胡椒碱的分子结构如下：
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，胡椒碱作用于苦味受体14亚型后促进了肠内分泌细胞分泌胰高血糖素样肽1。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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