CN113791158A - 一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于在线富集‑分离串联系统优化梯度程序的方法，包括：拟合等度条件下待测组分保留时间与流动相中有机相体积分数之间的保留方程以及等度条件下待测组分保留时间与半峰宽之间的线性方程以及构建待测组分在梯度洗脱条件下的待测组分保留时间、流动相中有机相体积分数、半峰宽之间的基本方程；构建在线富集‑分离串联系统；计算汇总待测组分在整个在线富集‑分离串联系统过程中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度；优化在线富集‑分离串联系统的梯度程序：按给定的分离度最小值、分离度最大值，计算梯度程序下各组分的分离度，输出最佳梯度洗脱程序及其对应的各组分的保留时间、半峰宽及组分之间的分离度。

Description

一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法

技术领域

本发明涉及液相色谱技术领域，尤其涉及一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法。

背景技术

在线选择性富集分离的前处理方法常用于生物样品分析中，与常规的离线前处理方法相比，简化了实验流程，减少了手工操作，不仅提高了工作效率，而且最大限度地减少了人为误差，提高了结果的准确度和精密度。在线富集和液相联用则使其应用更加广泛，是一种前景广阔的应用技术。但开发此类方法时，需考察的因素繁多，过程复杂耗时，现有技术中没有实现在线富集-分离串联系统过程进行完整分析建模，并优化梯度程序。

发明内容

发明目的：针对现有技术中没有实现在线富集-分离串联系统过程进行完整分析建模，并优化梯度程序的缺陷，本发明公开了一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，通过对在线富集-分离串联系统过程进行完整分析建模，并快速优化梯度程序，大大提高了工作效率。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，包括以下步骤：

S1、拟合等度条件下待测组分保留时间与流动相中有机相体积分数之间的保留方程以及等度条件下待测组分保留时间与半峰宽之间的线性方程，确定拟合参数；

S2、在流动相流速恒定时，构建待测组分在梯度洗脱条件下的待测组分保留时间、流动相中有机相体积分数、半峰宽之间的基本方程；

S3、构建在线富集-分离串联系统，待测组分进入在线富集-分离串联系统时依次经过富集、反冲、分离三个阶段；根据步骤S2中的基本方程分别计算待测组分在富集、反冲、分离三个阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，进而计算汇总待测组分在整个在线富集-分离串联系统过程中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度；

S4、优化在线富集-分离串联系统的梯度程序：按给定的分离度最小值、分离度最大值，根据步骤S2计算梯度程序下各组分的分离度，选择使所有组分色谱峰基线分离度且分析时间最短的梯度程序作为最佳梯度洗脱程序，并输出此最佳梯度洗脱程序，以及该程序对应的色谱参数，包括各组分的保留时间、半峰宽及组分之间的分离度。

优选地，所述步骤S1具体包括：输入分离度最小值、分离度最大值、进样体积、色谱柱柱长、仪器延迟时间和死时间、流动相比例及对应待测组分的保留时间、半峰宽、峰面积和峰高，等度条件下待测组分保留时间与流动相中有机相体积分数之间的保留方程为：

其中，t′_R为待测组分调整保留时间，t₀为色谱柱死时间，t_R为待测组分保留时间，

为流动相中有机相体积分数，a、b、c为拟合参数；测量t₀以及待测组分在不同

下的t′_R，计算拟合参数a、b、c；

等度条件下待测组分保留时间与半峰宽之间的线性方程为：

W_1/2＝At′_R+B

其中，W_1/2为半峰宽，A、B为拟合参数；测量待测组分在不同

下的t′_R和 W_1/2，计算拟合参数A、B。

优选地，所述步骤S2中待测组分保留时间、流动相中有机相体积分数、半峰宽之间的基本方程包括：

其中，L_column为色谱柱柱长，t′_R为待测组分调整保留时间，a′、b、c′、A、 B为拟合参数，

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在系统管路中的延迟时间，t为任意时刻，W′_{1/2_t}为待测组分在t时刻的半峰宽，

为梯度程序中任意极小时间内待测组分的半峰宽， W′_{1/2_Front}、W′_{1/2_Back}分别为流动相前进方向前端的半峰宽、流动相前进方向后端的半峰宽。

优选地，所述步骤S3中构建在线富集-分离串联系统，待测组分进入在线富集-分离串联系统时依次经过富集、反冲、分离三个阶段，具体包括：

在线富集-分离串联系统设有六通阀，六通阀1-6相通时，进入富集过程：含待测组分的样品溶液流经富集柱，富集待测组分，并淋洗杂质；

六通阀切换至1-2相通时，进入反冲过程：待测组分由富集柱反冲进分析柱；

六通阀切换至1-6相通时，进入分离过程：左泵清洗富集柱的同时，右泵分析柱分离样品。

优选地，所述步骤S3中待测组分在整个在线富集-分离串联系统过程中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，其计算公式包括：

其中，t_R、W_1/2、R分别为整个在线富集-分离串联系统过程中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，t′_Enrichment、W′_{1/2_Enrichment}、R分别为富集阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，t′_backwash、W′_{1/2_backwash}、R分别为反冲阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，t′_separation、W′_{1/2_separation}、R分别为分离阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度。

优选地，所述步骤S3中富集阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度的计算公式包括：

其中，t′_enrichment为富集阶段中的待测组分保留时间；V_sample为定量环的体积，F为流动相流速，L_enrichment为待测组分在富集柱上的移动距离；L_column1为富集柱柱长；

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在富集柱中的延迟时间，t为任意时刻；W′_{1/2_Enrichment}为富集阶段待测组分的半峰宽；a′、b、c′、A、B为拟合参数，t′_R(t)为极小时间间隔时待测组分在该流动相组成时的调整保留时间，t₀为系统死时间，t′₀为以二通替换富集柱后系统的死时间，

为流动相比例分别为

和

时，待测组分流经整个色谱体系的调整保留时间，δt为梯度程序中的任意极小时间段，δt趋向于无穷小时视作等度条件，R为分离度，t_R1、t_R2分别为相邻两色谱峰的保留时间，W_{1/2_1}、W_{1/2_2}分别为相邻两色谱峰的半峰宽。

优选地，所述步骤S3中反冲阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度的计算公式包括：

其中，t′_backwash、W′_{1/2_backwash}、R分别为反冲阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，t′_backwash1和t′_backwash2分别为反冲第一和第二阶段的时间， W′_{1/2_backwash1}和W′_{1/2_backwash2}分别为反冲第一和第二阶段的时间所对应的待测组分的半峰宽。

优选地，所述步骤S3中分离阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度的计算公式包括：

其中，t′_separation、W′_{1/2_separation}、R分别为分离阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，L_column为分离柱柱长，

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在富集柱中的延迟时间，t为任意时刻；a″、b、c′、A、B为拟合参数，t′_R(t)为极小时间间隔时待测组分在该流动相组成时的调整保留时间，t₀为色谱柱死时间，t′₀为以二通替换富集柱后系统的死时间，

为流动相比例分别为

和

时，待测组分流经整个色谱体系的调整保留时间，δt为梯度程序中的任意极小时间段，δt趋向于无穷小时视作等度条件，R 为分离度，t_R1、t_R2分别为相邻两色谱峰的保留时间，W_{1/2_1}、W_{1/2_2}分别为相邻两色谱峰的半峰宽。

优选地，所述步骤S4具体包括：

a)设定富集过程流动相梯度初始阶数和前一阶结束时刻为0，初始待优化组分为全部组分；

b)富集过程阶数加1，待计算确定最后一阶的流动相梯度值和结束时间；设定最后一阶流动相比例变化范围为0％～100％、变化步长为5％、计算初始值为0％；

c)设定分离过程流动相梯度初始阶数和前一阶结束时刻为0，初始待优化组分为全部组分；

d)分离过程阶数加1，待计算确定最后一阶的流动相梯度值和结束时间；设定最后一阶流动相比例变化范围为100％～1％、变化步长为-1％、计算初始值为100％；

e)将当前待计算流动相比例，与之前已确定的各阶梯度及对应结束时间组合生成梯度序列和时间序列后，按前述方法，计算保留时间、峰宽、分离度，并记录：

①根据步骤S3计算该流动相比例下全部组分的t_R；

②根据步骤S2中半峰宽W_1/2和t_R关系中的拟合系数及上一步骤中得到的t_R，计算全部组分的W_1/2；

③根据公式R＝1.18×(t_R2-t_R1)×(W_{1/2_1}+W_{1/2_2})计算各相邻色谱峰间的分离度，其中，R为分离度，相邻两色谱峰的保留时间和半峰宽分别为t_R2和t_R1、W_{1/2_1}和W_{1/2_2}；

④记录当前流动相比例、全部组分保留时间、全部组分分离度，将保留时间从小到大排序；

f)按指定步长取下一个比例值，重复步骤e)，直到当前最后阶所有待计算的流动相比例变化范围完成计算为止；

g)根据当前阶数下，最后阶比例变化范围所对应的全部数据，选择最后阶的梯度值：

①比较各流动相比例下，待优化组分中的分离度最小值，全部最小值记为集合A，当集合A中所有元素全部小于给定最小值时，选取集合A最大值，否则，选取集合A 中大于给定最小值的元素中的最小元素；

②选定步骤①中选取的元素对应的流动相比例，确定为最后一阶的流动相梯度值；

h)剔除剩余待优化组分中无需优化的组分：

①步骤g)中选定的分离度最小值对应两个组分，剔除它们自身及保留时间更短的全部组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

②若有超过一个待优化组分，依次从后向前扫描各组分间的分离度，直到分离度小于设定最小值，剔除最后扫描到的组分及保留时间更短的组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

③如果还有超过一个待优化组分，依次从前向后扫描分离度，直到分离度大于设定最大值为止，剔除最后扫描到的组分及保留时间更短的组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

i)如果待优化组分少于两个，优化完成，最后一个梯度无需结束时间；否则，前述最后一次记录的保留时间作为当前梯度阶的结束时间，重复步骤d)-h)计算最后一阶流动相梯度值；

j)计算并记录所得最优在线富集-分离系统梯度程序下，组分中保留时间的最大值 t_{max_M}；

k)重复步骤b)-j)计算所有t_{max_M}，将其从小到大排序，最小t_{max_M}对应的梯度程序即为最优在线富集-分离串联系统梯度程序。

有益效果：本发明通过对在线富集-分离串联系统过程进行完整分析建模，并开发快速优化梯度洗脱程序，可快速预测待测组分于在线富集-分离串联系统中最短分析周期内获得最佳分离的的色谱条件，大大提高了工作效率，节约仪器时间、提高检测通量，减少化学品消耗，减少污染。

附图说明

图1为本发明的方法流程图；

图2为本发明的峰宽预测示意图；

图3为本发明的在线富集-分离串联系统示意图；

图4为本发明的在线富集-分离串联系统梯度优化算法流程图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法做进一步的说明和解释。

一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、拟合等度条件下待测组分保留时间与流动相中有机相体积分数之间的保留方程以及等度条件下待测组分保留时间与半峰宽之间的线性方程，确定拟合参数；

S2、在流动相流速恒定时，构建待测组分在梯度洗脱条件下的待测组分保留时间、流动相中有机相体积分数、半峰宽之间的基本方程；

S3、构建在线富集-分离串联系统，待测组分进入在线富集-分离串联系统时依次经过富集、反冲、分离三个阶段；根据步骤S2中的基本方程分别计算待测组分在富集、反冲、分离三个阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，进而计算汇总待测组分在整个在线富集-分离串联系统过程中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度；

S4、优化在线富集-分离串联系统的梯度程序：按给定的分离度最小值、分离度最大值，根据步骤S2计算梯度程序下各组分的分离度，选择使所有组分色谱峰基线分离度且分析时间最短的梯度程序作为最佳梯度洗脱程序，并输出此最佳梯度洗脱程序，以及该程序对应的色谱参数，包括各组分的保留时间、半峰宽及组分之间的分离度。

具体过程如下：

1.1各组分保留值方程的获取和色谱峰宽计算公式

选取样品中各组分的标样，测定其在不同流动相比例下的保留时间，从而建立流动相比例和各物质调整保留时间之间的关系，以及保留时间与半峰宽之间的线性方程。输入分离度最小值、分离度最大值、进样体积、色谱柱柱长、仪器延迟时间和死时间、流动相比例及对应待测组分的保留时间、半峰宽、峰面积和峰高。对于确定的系统而言，这里输入的值均为已知量。仪器延迟时间即为色谱柱死时间，也可统称为系统死时间。

流动相比例

和调整保留时间t′_R关系的保留方程为：

等度条件下待测组分保留时间t′_R与半峰宽W_1/2的线性方程为：

W_1/2＝At′_R+B (2)

其中a、b、c、A、B为拟合参数；各组分的调整保留时间t′_R通过公式 t′_R＝t_R-t₀计算而得，其中，t_R为保留时间，t₀为色谱柱死时间。在不同流动相比例下测得色谱柱死时间、仪器延迟时间、待测组分的半峰宽W_1/2和调整保留时间t_R，即可拟合得出a、b、c、A、B。

对于每种组分，步骤如下：

1)选取多个不同的流动相比例

分别测色谱柱死时间t₀得及不同比例下该组分的半峰宽W_1/2和调整保留时间t′_R；

2)对流动相比例

与对应的调整保留时间t′_R进行线性拟合，确定方程(1)中拟合参数的a、b、c；

3)对半峰宽W_1/2和调整保留时间t′_R进行多项式拟合，确定方程(2)中的拟合参数A、B；

对每种组分重复上述过程，得到每个组分相应的方程(1)和(2)。

1.2组分保留时间和分离效果的预测方法

利用方程(2)，对各组分在任意流动相比例下的移动速度进行积分，得到线性多阶梯度条件下，样品各组分在色谱柱中移动的总距离公式，结合色谱柱长计算各组分的半峰宽W_1/2和调整保留时间t′_R，并以此计算在线富集-分离串联系统系统中富集、反冲、分离及总过程中的峰宽和保留时间。

在多阶线性梯度洗脱条件下，任意时刻流动相体积分数满足方程如下：

其中，

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在系统管路中的延迟时间。

组分在任意无限小的时间步长δt＝t_i+1-t_i内，瞬时的流动相比例可视为恒定，则将公式(3)代入公式(1)，得到lnt′_R和t之间的关系为：

其中，

根据公式(4)，可计算待测组分在任意流动相比例下，任意极小时间段δt内的调整保留时间。若流动相流速F恒定，待测组分在任意极小时间段δt内的移动速度为

即有：

其中，L_column为色谱柱柱长。故移动距离为：

通过速度对时间积分，可获得组分从m时刻到n时刻移动距离为：

当移动总距离等于色谱柱柱长时，待测组分被洗脱，对应时间为其保留时间，即调整保留时间t′_R满足公式(10)，计算机辅助求解其积分上限，即可预测待测组分的t′_R：

其中，L_column为色谱柱柱长，t′_R为待测组分调整保留时间，a′、b、c′、A、 B为拟合参数，

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在系统管路中的延迟时间，t为任意时刻。

若将梯度程序中的任意极小时间段δt(δt趋向于无穷小)视作等度，则将方程 (3)代入方程(2)，即可得梯度程序中任意t时刻待测组分的半峰宽为：

由于梯度条件下，半峰宽沿流动相前进方向的前端W′_{1/2_Front}与后端W′_{1/2_Back}接触到的

不同，在δt时间内前端与后端移动距离的差值不可忽略，故本发明中假设：等度条件的色谱峰为对称的高斯曲线，建立峰形变化的简化模型，以计算t时刻的峰宽 W′_t。如附图1所示，在流动相前进方向前端的半峰宽W′_{1/2_Front}，受到 (t-δt)-W′_t-δt/2时刻下的流动相比例

的影响，而在流动相前进方向后端的半峰宽W′_{1/2_Back}，受到(t-δt)+W′_t-δt/2时刻下的流动相比例

的影响，当后端遇到变化的

时，前端仍然受到

的影响，只有当流动相移动并覆盖了峰宽距离时，

才能到达峰的前端。前端的待测组分在流动相

的影响下，在任意短的时间步长δt中，以恒定的速度移动

前进，其中，t′_{R_Front}为流动相速度为v时，前端待测组分的保留时间调整。因此，前端待测组分在δt时间内的移动距离为：

则可得在流动相前进方向前端的半峰宽W′_{1/2_Front}计算公式为：

其中，变异系数σ_Front＝W_{1/2_Front}×2.235＝W_Front×4， W_{1/2_Front}为色谱峰前半段半峰宽，v_m为流动相的线速度，t′₀为以二通阀代替色谱柱的系统死时间，t₀与t′₀的差值为流动相流经色谱柱的时间。

同理，在流动相前进方向后端的半峰宽W′_{1/2_Back}的计算公式为：

其中，变异系数σ_Back＝W_{1/2_Back}×2.235＝W_Back×4，W_{1/2_Back}为色谱峰后半段半峰宽。

所以，公式(11)被校正为：

其中，W′_{1/2_t}为待测组分在t时刻的半峰宽。对过程中所有的半峰宽W′_{1/2_t}求和，则可得任意线性梯度条件下的表观半峰宽W_1/2。

根据公式(10)和(15)分别得t_R和W_1/2后，按 R＝1.18×(t_R2-t_R1)×(W_{1/2_1}+W_{1/2_2})计算各相色谱峰间的分离度，此分离度公式可用在整个富集、反冲和分离的过程中。

进一步地，所述步骤S2中，富集、反冲、分离过程如附图3所示，六通阀1-6相通时(图3左侧的A部分)，含待测组分的样品溶液流经富集柱(Column 1)，富集待测组分，淋洗杂质，即为富集过程；此后六通阀切换至1-2相通(图3右侧的B部分)，将待测组分由富集柱反冲进分析柱(Column 2)，即为反冲过程；接着，切换六通阀至1-6相通，左泵清洗富集柱的同时，右泵分析柱分离样品，即为分离过程。因此，待测组分的保留时间，由其在Column 1上的富集时间(也称为富集阶段中的待测组分保留时间 t′_enrichment，以下同理)，从Column 1到Column 2的反冲时间(t′_backwash)和在Column 2上的分离时间(t′_separation)这三个部分组成，同理，半峰宽也由富集过程的半峰宽 (W′_{1/2_Enrichment})、反冲过程的半峰宽(W′_{1/2_backwash})和分离过程的半峰宽 (W′_{1/2_separation})三部分组成，均可由公式(10)和式(15)求得，模型的具体构建过程如下。

富集过程

富集过程的最少时间也就是富集阶段中的待测组分保留时间t′_enrichment为所有待测组分都上样到Column 1上的时间，忽略进样器及连接富集柱的管道体积，则

其中，t′_enrichment为富集阶段中的待测组分保留时间；V_sample为定量环的体积，F为流动相流速，。将t′_enrichment作为公式(10)的积分上限，可求得待测组分在Column 1上的移动距离为

其中，L_enrichment为待测组分在富集柱上的移动距离；L_column1为富集柱柱长，

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在富集柱中的延迟时间，t为任意时刻。

将富集过程的流动相比例和t′_enrichment代入式(15)，经在线富集-分离串联系统的软件迭代循环可得待测组分在富集过程中待测组分的半峰宽为W′_{1/2_Enrichment}：

富集过程的分离度根据公式R＝1.18×(t_R2-t_R1)×(W_{1/2_1}+W_{1/2_2}) 计算，t′_R(t)为极小时间间隔时待测组分在该流动相组成时的调整保留时间，t₀为系统死时间，t′₀为以二通替换富集柱后系统的死时间，

为流动相比例分别为

和

时，待测组分流经整个色谱体系的调整保留时间，δt为梯度程序中的任意极小时间段，δt趋向于无穷小时视作等度条件，R为分离度，t_R1、t_R2分别为相邻两色谱峰的保留时间，W_{1/2_1}、W_{1/2_2}分别为相邻两色谱峰的半峰宽。

反冲过程

值得注意的是，当图2中的六通阀从1-6相连切换至1-2相连时，由于Column 1中残留的富集流动相不可忽略，故将反冲过程分为两部分，即残留富集流动相的作用过程和右泵流动相的作用过程。当L_enrichment＝L_elution1+L_elution2时，待测组分被反冲出富集柱，其中L_elution1为残留富集流动相使待测组分移动的距离，L_elution2为右泵流动相使待测组分移动的距离。

残留富集流动相对待测组分的作用时间为其流过待测组分的时间，即

t′_{backwash1_end}＝t_enrichment-t_d-(t_{0_column1}-t_{0_two-portvative}) (20)

其中t_{0_column1}为仅装有富集柱时系统的死时间，t_{0_two-portvative}为以二通阀替代富集柱后系统的死时间，t_enrichment为富集时间，t′_{backwash1_start}和t′_{backwash1_end}分别反冲第一阶段的开始时间以及结束时间。则t′_backwash1通过以下公式计算： t′_backwash1＝t′_{backwash1_end}-t′_{backwash1_start}。

在此过程中，待测组分在Column 1上的移动距离为：

同样的，将富集过程的流动相比例、t′_{backwash1_start}和t′_{backwash1_end}代入式 (15)，经软件迭代循环可得待测组分在残留富集流动相作用过程中的半峰宽 W′_{1/2_backwash1}为：

当L_{backwash 2}≥L_enrichment-L_backwash1时，待测组分被反冲出Column 1，则有：

其中，t′_backwash2可通过将L_backwash2和右泵流动相比例代入公式(10)求解积分上限的方式获得，t′_backwash1和t′_backwash2分别为反冲第一和第二阶段的时间，相应半峰宽W′_{1/2_backwash2}可由t′_backwash2和右泵流动相比例代入方程(15)经软件迭代循环求得，W′_{1/2_backwash1}和W′_{1/2_backwash2}分别为反冲第一和第二阶段的时间所对应的待测组分的半峰宽。

因此，反冲过程待测组分的保留时间及半峰宽为

t′_backwash＝t′_backwash1+t′_backwash2 (24)

W′_{1/2_backwash}＝W′_{1/2_backwash1}+W′_{1/2_backwash2} (25)

富集及反冲过程结束后，六通阀由1-2位切回1-6位，该时刻为 t_enrichment+t_elution1+t_elution2。

分离过程

考虑到在线富集-分离串联系统在实际应用中，富集及反冲过程和分离过程是同时开始运行的(如附图2所示)，因此富集和反冲洗过程的等待时间应从分离过程的时间序列(t_i)中减除，即实际的分离过程时间应该从 t_i-(t_enrichment+t_backwash1+t_backwash2)+t_d开始，相应的实际流动相比例可由公式(3)得到。因此，将积分下限设定为 t_i-(t_enrichment+t_backwash1+t_backwash2)+t_d，将实际流动相比例和分离柱柱长代入公式(10)，求解其积分上限，即得待测组分在分离过程中的保留时间：

将t′_separation和右泵流动相比例代入方程(2-17)经软件迭代循环，则可求得分离过程的半峰宽W′_{1/2_sep}为：

在线富集-分离串联系统

综上，结合公式(17)、(24)和(26)，整个在线富集-高效液相串联系统过程中的保留时间为

t_R＝t′_enrichment+t′_backwash+t′_separation (28)

结合公式(18)、(25)和(27)，整个在线富集-高效液相串联系统过程中的半峰宽为

W_1/2＝W′_{1/2_Enrichment}+W′_{1/2_backwash}+W′_{1/2_separation} (29)

1.3在线富集-分离串联系统梯度程序优化过程

给定分离度最小值、分离度最大值、最大实验时间要求，计算分离度小于设定最小值的不进行优化。根据前述保留时间和分离效果的预测方法，选择使所有组分色谱峰基线分离度且分析时间最短的梯度程序，并输出及对应色谱图等色谱参数。

如附图3所示，步骤如下：

a)设定富集过程流动相梯度初始阶数和前一阶结束时刻为0，初始待优化组分为全部组分；

b)富集过程阶数加1，待计算确定最后一阶的流动相梯度值和结束时间；设定最后一阶流动相比例变化范围为0％～100％、变化步长为5％、计算初始值为0％；

c)设定分离过程流动相梯度初始阶数和前一阶结束时刻为0，初始待优化组分为全部组分；

d)分离过程阶数加1，待计算确定最后一阶的流动相梯度值和结束时间；设定最后一阶流动相比例变化范围为100％～1％、变化步长为-1％、计算初始值为100％；

e)将当前待计算流动相比例，与之前已确定的各阶梯度及对应结束时间组合生成梯度序列和时间序列后，按前述方法，计算保留时间、峰宽、分离度，并记录：

①根据步骤S3计算该流动相比例下全部组分的t_R；

②根据步骤S2中半峰宽W_1/2和t_R关系中的拟合系数及上一步骤中得到的t_R，计算全部组分的W_1/2；

③根据公式R＝1.18×(t_R2-t_R1)×(W_{1/2_1}+W_{1/2_2})计算各相邻色谱峰间的分离度，其中，R为分离度，相邻两色谱峰的保留时间和半峰宽分别为t_R2和t_R1、W_{1/2_1}和W_{1/2_2}；

④记录当前流动相比例、全部组分保留时间、全部组分分离度，将保留时间从小到大排序；

f)按指定步长取下一个比例值，重复步骤e)，直到当前最后阶所有待计算的流动相比例变化范围完成计算为止；

g)根据当前阶数下，最后阶比例变化范围所对应的全部数据，选择最后阶的梯度值：

①比较各流动相比例下，待优化组分中的分离度最小值，全部最小值记为集合A，当集合A中所有元素全部小于给定最小值时，选取集合A最大值，否则，选取集合A 中大于给定最小值的元素中的最小元素；

②选定步骤①中选取的元素对应的流动相比例，确定为最后一阶的流动相梯度值；

h)剔除剩余待优化组分中无需优化的组分：

①步骤g)中选定的分离度最小值对应两个组分，剔除它们自身及保留时间更短的全部组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

②若有超过一个待优化组分，依次从后向前扫描各组分间的分离度，直到分离度小于设定最小值，剔除最后扫描到的组分及保留时间更短的组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

③如果还有超过一个待优化组分，依次从前向后扫描分离度，直到分离度大于设定最大值为止，剔除最后扫描到的组分及保留时间更短的组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

i)如果待优化组分少于两个，优化完成，最后一个梯度无需结束时间；否则，前述最后一次记录的保留时间作为当前梯度阶的结束时间，重复步骤d)-h)计算最后一阶流动相梯度值；

j)计算并记录所得最优在线富集-分离系统梯度程序下，组分中保留时间的最大值 t_{max_M}；

k)重复步骤b)-j)计算所有t_{max_M}，将其从小到大排序，最小t_{max_M}对应的梯度程序即为最优在线富集-分离串联系统梯度程序。

本发明可快速预测使待测组分在最短分析周期内获得最佳分离的在线富集-分离串联系统梯度程序。本发明通过对在线富集-分离串联系统过程进行完整分析建模，并开发快速优化梯度洗脱程序，可快速预测待测组分于在线富集-分离串联系统中最短分析周期内获得最佳分离的的色谱条件，大大提高了工作效率，节约仪器时间、提高检测通量，减少化学品消耗，减少污染。

实施例一

仪器：KH-700DE型数控超声波清洗器(禾创超声仪器有限公司，中国)，梅特勒利多MS-105DU电子分析天平(梅特勒托利多，瑞士)。ThermoFisher UltimateTM3000 高效液相色谱仪，配有DGP-3600RS双三元泵，WPS-3000TRS自动进样器，带六通阀的TCC-3000柱温箱，FLD-3400RS荧光检测器和Chromeleon 7.10工作站(赛默飞世尔科技有限公司，美国)。分析柱：Sunfire C18色谱柱(4.6mm×250mm i.d，5μm，沃特世科技有限公司，美国)；富集柱：Kromosil C₁₈色谱柱(4.6mm×150mm i.d，5μm，汉邦科技有限公司，中国)；流动相：甲醇(A)-水(B)；进样量：5mL；流速：0.9mL/min；检测波长：激发波长为228nm，发射波长为306nm。

选择双酚A(BPA)，双酚B(BPB)，双酚AF(BPAF)，双酚AP(BPAP)，双酚 C(BPC)，双酚芴(BPHF)，双酚Z(BPZ)，双酚P(BPP)，四甲基双酚A(TMBPA) 作为待测组分，设定柱温为30，℃以甲醇(A)-水(B)为流动相体系，分别测定甲醇的体积分数为60％，65％，70％，75％(150mm色谱柱)和65％，70％，75％，80％(250 mm色谱柱)时9种化合物的保留时间、峰面积、峰高及峰宽，如下表所示：

60％甲醇水(150mm色谱柱)的等度分离结果

65％甲醇水(150mm色谱柱)的等度分离结果

70％甲醇水(150mm色谱柱)的等度分离结果

75％甲醇水(150mm色谱柱)的等度分离结果

65％甲醇水(250mm色谱柱)的等度分离结果

70％甲醇水(250mm色谱柱)的等度分离结果

75％甲醇水(250mm色谱柱)的等度分离结果

80％甲醇水(250mm色谱柱)的等度分离结果

在75％甲醇水(250mm色谱柱)的等度条件下，各物质能基线分离，但分析时长并非最短，故测定硫脲的保留时间即仪器死时间，250mm色谱柱的仪器死时间为2.7 min，150mm色谱柱的仪器死时间为1.4min，仪器的延迟时间测定结果为1.1min，并将上述数据输入本梯度预测系统，所得预测梯度程序、保留时间及分离度为：

软件预测值

用所预测梯度对9种待测组分进行分离分析，实验验证结果如下表：

实验实测值

实施例二

仪器：KH-700DE型数控超声波清洗器(禾创超声仪器有限公司，中国)，梅特勒利多MS-105DU电子分析天平(梅特勒托利多，瑞士)。ThermoFisher UltimateTM3000 高效液相色谱仪，配有DGP-3600RS双三元泵，WPS-3000TRS自动进样器，带六通阀的TCC-3000柱温箱，DAD-3400RS荧光检测器和Chromeleon 7.10工作站(赛默飞世尔科技有限公司，美国)。色谱柱：2根Kromosil C₁₈色谱柱(4.6mm×150mm i.d，5μm，汉邦科技有限公司，中国)；流动相：乙腈(A)-水(B)；进样量：5mL；流速：1.5mL/min；检测波长为203nm。

选择人参皂苷R1(R1)，人参皂苷Rg1(Rg1)，人参皂苷Re(Re)，人参皂苷Rb1 (Rb1)，人参皂苷Rd(Rd)作为待测组分，设定柱温为30，℃以乙腈(A)-水(B) 为流动相体系，分别测定乙腈的体积分数为20％，23％，25％(R1，Rg1和Re)和40％， 45％，50％，55％，60％(Rb1和Rd)时对应化合物的保留时间、峰面积、峰高及峰宽，如下表所示：

20％乙腈水(150mm色谱柱)的等度分离结果

23％乙腈水(150mm色谱柱)的等度分离结果

25％乙腈水(150mm色谱柱)的等度分离结果

40％乙腈水(150mm色谱柱)的等度分离结果

45％乙腈水(150mm色谱柱)的等度分离结果

50％乙腈水(150mm色谱柱)的等度分离结果

55％乙腈水(150mm色谱柱)的等度分离结果

60％乙腈水(150mm色谱柱)的等度分离结果

从上述实验结果可看出，各物质难以在等度条件下基线分离，故测定硫脲的保留时间即仪器死时间，150mm色谱柱的仪器死时间为1.4min，仪器的延迟时间测定结果为1.1min，并将上述数据输入本梯度预测系统，所得预测梯度程序、保留时间及分离度为：

软件预测值

用所预测梯度对9种待测组分进行分离分析，实验验证结果如下表：

实验实测值

此结果比中国药典中对应的标准方法(约40分钟)大大缩短，分离度更好，且色谱分离条件更加简单。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、拟合等度条件下待测组分保留时间与流动相中有机相体积分数之间的保留方程以及等度条件下待测组分保留时间与半峰宽之间的线性方程，确定拟合参数；

S2、在流动相流速恒定时，构建待测组分在梯度洗脱条件下的待测组分保留时间、流动相中有机相体积分数、半峰宽之间的基本方程；

S3、构建在线富集-分离串联系统，待测组分进入在线富集-分离串联系统时依次经过富集、反冲、分离三个阶段；根据步骤S2中的基本方程分别计算待测组分在富集、反冲、分离三个阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，进而计算汇总待测组分在整个在线富集-分离串联系统过程中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度；

S4、优化在线富集-分离串联系统的梯度程序：按给定的分离度最小值、分离度最大值，根据步骤S2计算梯度程序下各组分的分离度，选择使所有组分色谱峰基线分离度且分析时间最短的梯度程序作为最佳梯度洗脱程序，并输出此最佳梯度洗脱程序，以及该程序对应的色谱参数，包括各组分的保留时间、半峰宽及组分之间的分离度。

2.根据权利要求1所述的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括：输入分离度最小值、分离度最大值、进样体积、色谱柱柱长、仪器延迟时间和死时间、流动相比例及对应待测组分的保留时间、半峰宽、峰面积和峰高，

等度条件下待测组分保留时间与流动相中有机相体积分数之间的保留方程为：

其中，t′_R为待测组分调整保留时间，t₀为色谱柱死时间，t_R为待测组分保留时间，

为流动相中有机相体积分数，a、b、c为拟合参数；测量t₀以及待测组分在不同

下的t′_R，计算拟合参数a、b、c；

等度条件下待测组分保留时间与半峰宽之间的线性方程为：

W_1/2＝At′_R+B

其中，W_1/2为半峰宽，A、B为拟合参数；测量待测组分在不同

下的t′_R和W_1/2，计算拟合参数A、B。

3.根据权利要求1所述的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于，所述步骤S2中待测组分保留时间、流动相中有机相体积分数、半峰宽之间的基本方程包括：

其中，L_column为色谱柱柱长，t′_R为待测组分调整保留时间，a′、b、c′、A、B为拟合参数，

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在系统管路中的延迟时间，t为任意时刻，W′_{1/2_t}为待测组分在t时刻的半峰宽，

为梯度程序中任意极小时间内待测组分的半峰宽，W′_{1/2_Front}、W′_{1/2_Back}分别为流动相前进方向前端的半峰宽、流动相前进方向后端的半峰宽。

4.根据权利要求1所述的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于，所述步骤S3中构建在线富集-分离串联系统，待测组分进入在线富集-分离串联系统时依次经过富集、反冲、分离三个阶段，具体包括：

在线富集-分离串联系统设有六通阀，六通阀1-6相通时，进入富集过程：含待测组分的样品溶液流经富集柱，富集待测组分，并淋洗杂质；

六通阀切换至1-2相通时，进入反冲过程：待测组分由富集柱反冲进分析柱；

六通阀切换至1-6相通时，进入分离过程：左泵清洗富集柱的同时，右泵分析柱分离样品。

5.根据权利要求4所述的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于，所述步骤S3中待测组分在整个在线富集-分离串联系统过程中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，其计算公式包括：

其中，t_R、W_1/2、R分别为整个在线富集-分离串联系统过程中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，t′_Enrichment、W′_{1/2_Enrichment}、R分别为富集阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，t′_backwash、W′_{1/2_backwash}、R分别为反冲阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，t′_separation、W′_{1/2_separation}、R分别为分离阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度。

6.根据权利要求5所述的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于，所述步骤S3中富集阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度的计算公式包括：

其中，t′_enrichment为富集阶段中的待测组分保留时间；V_sample为定量环的体积，F为流动相流速，L_enrichment为待测组分在富集柱上的移动距离；L_column1为富集柱柱长；

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在富集柱中的延迟时间，t为任意时刻；W′_{1/2_Enrichment}为富集阶段待测组分的半峰宽；a′、b、c′、A、B为拟合参数，t′_R(t)为极小时间间隔时待测组分在该流动相组成时的调整保留时间，t₀为系统死时间，t′₀为以二通替换富集柱后系统的死时间，

为流动相比例分别为

和

时，待测组分流经整个色谱体系的调整保留时间，δt为梯度程序中的任意极小时间段，δt趋向于无穷小时视作等度条件，R为分离度，t_R1、t_R2分别为相邻两色谱峰的保留时间，W_{1/2_1}、W_{1/2_2}分别为相邻两色谱峰的半峰宽。

7.根据权利要求5所述的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于：所述步骤S3中反冲阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度的计算公式包括：

其中，t′_backwash、W′_{1/2_backwash}、R分别为反冲阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，t′_backwash1和t′_backwash2分别为反冲第一和第二阶段的时间，W′_{1/2_backwash1}和W′_{1/2_backwash2}分别为反冲第一和第二阶段的时间所对应的待测组分的半峰宽。

8.根据权利要求5所述的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于：所述步骤S3中分离阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度的计算公式包括：

其中，t′_separation、W′_{1/2_separation}、R分别为分离阶段中的待测组分保留时间、半峰宽和分离度，L_column为分离柱柱长，

分别为第i、第i+1阶梯度流动相中有机相的起始体积分数，t_i、t_i+1分别为第i、第i+1阶梯度的起始时间；t_d为流动相从设定时间开始至其到达色谱柱柱头为止、在富集柱中的延迟时间，t为任意时刻；a″、b、c′、A、B为拟合参数，t′_R(t)为极小时间间隔时待测组分在该流动相组成时的调整保留时间，t₀为色谱柱死时间，t′₀为以二通替换富集柱后系统的死时间，

为流动相比例分别为

和

时，待测组分流经整个色谱体系的调整保留时间，δt为梯度程序中的任意极小时间段，δt趋向于无穷小时视作等度条件，R为分离度，t_R1、t_R2分别为相邻两色谱峰的保留时间，W_{1/2_1}、W_{1/2_2}分别为相邻两色谱峰的半峰宽。

9.根据权利要求1所述的一种用于在线富集-分离串联系统优化梯度程序的方法，其特征在于：所述步骤S4具体包括：

a)设定富集过程流动相梯度初始阶数和前一阶结束时刻为0，初始待优化组分为全部组分；

b)富集过程阶数加1，待计算确定最后一阶的流动相梯度值和结束时间；设定最后一阶流动相比例变化范围为0％～100％、变化步长为5％、计算初始值为0％；

c)设定分离过程流动相梯度初始阶数和前一阶结束时刻为0，初始待优化组分为全部组分；

d)分离过程阶数加1，待计算确定最后一阶的流动相梯度值和结束时间；设定最后一阶流动相比例变化范围为100％～1％、变化步长为-1％、计算初始值为100％；

e)将当前待计算流动相比例，与之前已确定的各阶梯度及对应结束时间组合生成梯度序列和时间序列后，按前述方法，计算保留时间、峰宽、分离度，并记录：

①根据步骤S3计算该流动相比例下全部组分的t_R；

②根据步骤S2中半峰宽W_1/2和t_R关系中的拟合系数及上一步骤中得到的t_R，计算全部组分的W_1/2；

③根据公式R＝1.18×(t_R2-t_R1)×(W_{1/2_1}+W_{1/2_2})计算各相邻色谱峰间的分离度，其中，R为分离度，相邻两色谱峰的保留时间和半峰宽分别为t_R2和t_R1、W_{1/2_1}和W_{1/2_2}；

④记录当前流动相比例、全部组分保留时间、全部组分分离度，将保留时间从小到大排序；

f)按指定步长取下一个比例值，重复步骤e)，直到当前最后阶所有待计算的流动相比例变化范围完成计算为止；

g)根据当前阶数下，最后阶比例变化范围所对应的全部数据，选择最后阶的梯度值：

①比较各流动相比例下，待优化组分中的分离度最小值，全部最小值记为集合A，当集合A中所有元素全部小于给定最小值时，选取集合A最大值，否则，选取集合A中大于给定最小值的元素中的最小元素；

②选定步骤①中选取的元素对应的流动相比例，确定为最后一阶的流动相梯度值；

h)剔除剩余待优化组分中无需优化的组分：

①步骤g)中选定的分离度最小值对应两个组分，剔除它们自身及保留时间更短的全部组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

②若有超过一个待优化组分，依次从后向前扫描各组分间的分离度，直到分离度小于设定最小值，剔除最后扫描到的组分及保留时间更短的组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

③如果还有超过一个待优化组分，依次从前向后扫描分离度，直到分离度大于设定最大值为止，剔除最后扫描到的组分及保留时间更短的组分，记录被剔除组分中保留时间的最大值；

i)如果待优化组分少于两个，优化完成，最后一个梯度无需结束时间；否则，前述最后一次记录的保留时间作为当前梯度阶的结束时间，重复步骤d)-h)计算最后一阶流动相梯度值；

j)计算并记录所得最优在线富集-分离系统梯度程序下，组分中保留时间的最大值t_{max_M}；

k)重复步骤b)-j)计算所有t_{max_M}，将其从小到大排序，最小t_{max_M}对应的梯度程序即为最优在线富集-分离串联系统梯度程序。

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