CN113710239A - 视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)依赖性癌症的治疗 - Google Patents

视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)依赖性癌症的治疗 Download PDF

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Abstract

描述了用于治疗RORγ依赖性癌症的组合物和方法，癌症包括胰腺癌、肺癌、白血病等。在一些示例实现方式中，用于癌症治疗的药物组合物包括RORγ抑制剂和可选的其他治疗剂，以及公开了使用该药物组合物治疗癌症的方法。

Description

视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)依赖性癌症的治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年2月20日提交的第62/808,231号、2019年8月1日提交的第62/881,890号、2019年9月6日提交的第62/897,202号、2019年9月20日提交的第62/903,595号和2020年1月10日提交的第62/959,607号美国临时专利申请的权益。这些临时申请的内容通过引用整体并入本文。
政府利益声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的授予号R01 CA186043和R01 CA197699的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
序列表
本申请包含序列表，该序列表经由USPTO EFS-Web以ASCII格式提交，在此通过引用整体并入本文。ASCII副本创建于2020年2月20日，命名为Sequence-Listing_009062-8398WO_ST25，大小为13KB。
技术领域
本申请涉及治疗各种类型的视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)依赖性癌症。
背景技术
许多类型的癌症对当前治疗具有高度抵抗力，因此仍然是一种致命的疾病。开发更有效的治疗策略在很大程度上取决于对有助于肿瘤生长和维持的因素的识别。某些类型的癌症共有对癌症干细胞的分子依赖性，并具有类似的分子信号通路。因此，针对靶向常见分子信号通路的新的有效治疗方法导致另外的癌症疗法。
发明内容
一方面，在本文中提供了一种治疗RORγ依赖性癌症的方法。该方法需要向有需要的受试者施用治疗有效量的包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物。在某些实施方式中，受试者患有RORγ依赖性癌症，诸如胰腺癌、白血病和肺癌，肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方式中，受试者患有转移性癌症。在某些实施方式中，RORγ抑制剂包括SR2211、JTE-151、JTE-151A和AZD-0284，或它们的由式I、II、III、IIIA和IV中任一项表示的类似物或衍生物。在某些实施方式中，该方法还需要向受试者施用一种或多种化学治疗剂。可以在施用一种或多种化学治疗剂之前或之后施用包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物。可选地，可以同时施用包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物和一种或多种化学治疗剂。在某些实施方式中，方法还需要在施用包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物之前、之后或期间向受试者施用一种或多种放射疗法。
另一方面，在本文中公开了用于治疗RORγ依赖性癌症的药物组合物。该药物组合物包括治疗有效量的一种或多种RORγ抑制剂。在某些实施方式中，RORγ依赖性癌症包括胰腺癌、白血病和肺癌，肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方式中，癌症是转移性癌症。在某些实施方式中，RORγ抑制剂包括SR2211、JTE-151、JTE-151A和AZD-0284，或它们的由式I、II、III、IIIA和IV中任一项表示的类似物或衍生物。在某些实施方式中，该药物组合物还包括治疗有效量的一种或多种化学治疗剂。在某些实施方式中，该药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂或其组合。
又一方面，在本文中提供了用于RORγ依赖性癌症的组合疗法。该组合疗法包括在施用包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物之前、期间或之后向有需要的受试者进行手术、施用一种或多种化学治疗剂、施用一种或多种放射疗法和/或施用一种或多种免疫疗法。在某些实施方式中，RORγ依赖性癌症包括胰腺癌、白血病和肺癌，肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方式中，癌症是转移性癌症。在某些实施方式中，RORγ抑制剂包括SR2211、JTE-151、JTE-151A和AZD-0284，或它们的由式I、II、III、IIIA和IV中任一项表示的类似物或衍生物。在某些实施方式中，在施用包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物之前、期间、之后对受试者进行或施用手术、化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法。
又一方面，在本文中公开了一种抑制癌细胞生长的方法，所述方法包括使一种或多种癌细胞与有效量的一种或多种RORγ抑制剂于体内、体外或离体接触。在某些实施方式中，RORγ依赖性癌症细胞包括胰腺癌细胞、白血病细胞和肺癌细胞，肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方式中，癌症是转移性癌症。在某些实施方式中，RORγ抑制剂包括SR2211、JTE-151、JTE-151A和AZD-0284，或它们的由式I、II、III、IIIA和IV中任一项表示的类似物或衍生物。
又一方面，在本文中公开了一种检测受试者的癌症、癌症进展或癌症转移的方法，所述方法包括将来自受试者的生物样本诸如血液循环肿瘤细胞、活检样本或尿液中的RORγ水平与健康受试者群体的平均RORγ水平进行比较，其中RORγ水平升高表示受试者患有癌症或癌症转移。
又一方面，在本文中公开了一种确定接受癌症治疗的受试者的预后的方法，该方法包括比较受试者接受癌症治疗之前和之后的生物样本诸如血液循环肿瘤细胞、活检样本或尿液中的RORγ水平，其中RORγ水平降低表示癌症治疗对受试者有效。
附图说明
本申请包含至少一张彩色附图。将根据要求并支付必要费用，向官方提供带有彩色附图的本申请的副本。
图1A至图1P显示胰腺癌细胞的转录组学和表观遗传图谱，揭示了独特的干细胞状态。图1A：来自REM2-KPf/fC小鼠的EpCAM+GFP+(干细胞)和EpCAM+GFP-(非干细胞)肿瘤细胞的RNA-seq和ChIP-seq的总体策略示意图(对于RNA-seq，n＝3，对于ChIP-seq，n＝1)。图1B：KPf/fC干细胞(紫色)和非干细胞(灰色)细胞的主要成分分析。PC1和PC2贡献的方差分别为72.1％和11.1％。图1C：富含干细胞(红色、粉红色)和非干细胞(深蓝色、浅蓝色)的转录物。粉色，浅蓝色，lfdr<0.3；红色，深蓝色，lfdr<0.1。图1D至图1K：干细胞和非干细胞基因特征的基因集富集分析(GSEA)。与发育和干细胞(图1D和图1E)、细胞周期(图1F和图1G)、代谢(图1H和图1I)和癌症复发(图1J和图1K)相关联的细胞状态和选定基因的相应热图。图1D、图1F、图1H和图1J：红色表示重叠基因特征；蓝色表示不重叠的基因特征。图1E、图1G、图1I和图1K：红色，过度表示的基因表达；蓝色，不足的基因表达；阴影表示中值的倍数变化。图1L和图1M：H3K27ac占用的曲棍球棒状图，按信号密度排序。干细胞中的超级增强子(图1L)或干细胞和非干细胞中共有的超级增强子(图1M)由灰色虚线上方和右侧的最高等级和强度信号划分。对与超级增强子相关的选定基因的名称进行了注释。图1N至图1P：跨选定基因的H3K27ac ChIP-seq读数计数，这些基因由干细胞特有的超级增强子标记(图1N)、在干细胞和非干细胞中共有(图1O)，或非干细胞特有(图1P)。
图2A至图2F显示基因组规模的CRISPR筛选识别胰腺癌中的核心干细胞程序。图2A：CRISPR筛选的示意图。从终末期REM2-KPf/fC肿瘤生成三个独立的原代KPf/fC系，并用慢病毒GeCKO V2库(MOI 0.3)转导。细胞在嘌呤霉素选择下的标准2D条件下培养，然后在3D干细胞条件下培养。图2B：慢病毒感染后(灰色条)、2D中嘌呤霉素选择后(红色条)和3D球体形成后(蓝色条)在每个重复中检测到的引导数量。图2C和图2D：在2D(图2C)和3D(图2D)中耗尽的引导的火山状图。图上显示的基因，p<0.005。图2E：整合了干细胞转录组学、表观遗传学和功能分析的网络传播分析。通过RNA-seq(干细胞/非干细胞log2倍数变化>2)在干细胞中富集并在3D干细胞生长条件下(FDR<0.5)耗尽的基因被用于接种网络(三角形)，然后分析已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用。每个节点表示一个单个基因；节点颜色映射到RNA-seq倍数变化；干细胞富集基因，红色；非干细胞富集基因，蓝色；基因没有显着差异表达，灰色。为通过RNA-seq和ChIP-seq(上/上)在干细胞中富集的基因或通过RNA-seq和ChIP-seq(下/下)在非干细胞中富集的基因显示标签；RNA log2倍数变化绝对值大于2.0，ChIP-seq FDR<0.01。七个核心程序由具有高度互连性的基因组定义；每个核心程序都通过基因本体分析(FDR<0.05)进行注释。核心程序内必需基因列于表1中。图2F：来自图2E的网络传播分析，限于通过RNA-seq在干细胞中富集的基因(干细胞/非干细胞log2倍数变化>2)。
图3A至图3W显示胰腺癌干细胞的新通路依赖性的识别。图3A至图3D：选定的网络基因对在体外和在体内KPf/fC细胞生长的功能影响。来自干细胞和发育过程的基因(图3A，Onecut3、Tdrd3、Dusp9)、脂质代谢(图3B，Lpin、Sptssb)和细胞粘附、运动和基质成分(图3C和图3D，Myo10、Sftpd、Lama5、Pkp1、Myo5b)在KPf/fC细胞中经由shRNA被抑制，并通过在体外干细胞球体测定或通过在体内跟踪侧腹移植来评估对肿瘤增殖的影响。球体形成，每个条件n＝3-6；侧腹肿瘤移植，每个条件n＝4。图3E至图3I：对粘附蛋白MEGF家族的优先依赖性的识别。图3E：KPf/fC干细胞和非干细胞中MEGF家族和相关(*Celsr1)基因的相对RNA表达的热图。红色，过度表示；蓝色，表示不足；颜色表示中值的倍数变化。在体外球体形成测定(图3F)和在体内侧腹移植(图3G至图3I)中抑制KPf/fC细胞中的Celsr1、Celsr2和Pear1的影响。球体形成，每个条件n＝3-6；侧腹肿瘤移植，每个条件n＝4。图3J至图3K：Pear1经由KPf/fC细胞中的shRNA受到抑制，并影响干细胞含量(J，p＝0.0629)以及球体培养物中的细胞凋亡(图3K)，以Msi2-GFP的频率为标志(图3J)，或通过FACS评估表达膜联蛋白-V(K)的细胞，每个条件n＝3。图3L：Pear1经由人胰腺癌细胞(FG细胞系)中的shRNA递送受到抑制，并通过在体外干细胞球体测定或通过在体内跟踪侧腹移植来评估对肿瘤增殖的影响。球体形成，n＝3；侧腹肿瘤移植，每个条件n＝4。图3M：表格总结了胰腺癌生长和增殖的关键新依赖性的识别。复选标记表示在shRNA抑制后对指定测定的显着影响。图3N：KPf/fC干细胞和非干细胞中细胞因子和相关受体的相对RNA表达的热图。红色，过度表示；蓝色，表示不足；颜色表示中值的倍数变化。图3O：从KPR172H/+C肿瘤(左)和表达IL10Rβ、IL34和Csf1R的KPR172H/+C肿瘤细胞的单细胞测序映射的细胞类型。CAF，癌症相关联纤维母细胞(红色)；EMT，间充质肿瘤细胞(黄色/绿色)；Endo，内皮细胞(绿色)；ETC，上皮肿瘤细胞(蓝色)；TAM，肿瘤相关联巨噬细胞(品红色)。图3P至图3Q：在EpCAM+肿瘤细胞级分中表达Msi2的细胞的KPR172H/+C肿瘤单细胞测序图谱(图3P)。在EpCAM+Msi2+干细胞级分中表达IL10Rβ(左)、IL34(中)和Csf1R(右)的细胞的KPR172H/+C肿瘤单细胞测序图谱(图3Q)。图3R至图3T：IL-10rβ和Csf1R经由KPf/fC细胞中的shRNA递送受到抑制，并且通过在体外干细胞球体测定(图3R)或通过在体内跟踪侧腹移植(图3S，图3T)来评估对肿瘤增殖的影响。球体形成，每个条件n＝3-6；侧腹肿瘤移植，每个条件n＝4。图3U：IL-10和IL-34经由KPf/fC细胞中的shRNA递送受到抑制，并通过在体外干细胞球体测定来评估对肿瘤增殖的影响，每个shRNA n＝3。图3V：IL-10rβ和Csf1R经由KPf/ fC细胞中的shRNA递送受到抑制，以及对FACS评估的球体培养物中干细胞含量(Msi2-GFP+细胞)的影响，每个条件n＝3。图3W：IL10Rβ经由人胰腺癌细胞(FG细胞)中的shRNA递送受到抑制，并通过在体外干细胞球体测定或通过在体内跟踪侧腹移植来评估对肿瘤增殖的影响。球体形成，n＝3；侧腹肿瘤移植，每个条件n＝4。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图4A至图4R显示免疫调节基因RORγ是胰腺癌增殖的关键依赖性。图4A：从原代KPf/fC肿瘤中分离的干细胞和非干肿瘤细胞中RORγ表达的qPCR分析。肿瘤1、2和3表示来自REM2-KPf/fC小鼠的生物学重复。图4B：在EpCAM+Msi2+细胞级分(表示n＝3只小鼠)内表达RORγ的细胞的KPf/fC肿瘤单细胞测序图谱。图4C：KPR172H/+C肿瘤切片中RORγ表达的代表性图像。RORγ(绿色)、角蛋白(红色)。图4D：正常相邻人胰腺(左)、PanIN(中)和PDAC(右)中RORγ表达的代表性图像。RORγ(绿色)、E-钙粘蛋白(红色)、Dapi(蓝色)。图4E和图4F：通过免疫荧光分析定量患者样本中的RORγ表达。对原代患者肿瘤进行RORγ和E-钙粘蛋白染色，并确定肿瘤内RORγ+细胞的频率(图4E)和E-钙粘蛋白+上皮细胞级分(图4F)。正常相邻，n＝3；胰腺炎，n＝8；PanIN 1，n＝10；PanIN 2，n＝6；PDAC，n＝8。图4G至图4H：在KPR172H/+C(图4G)和KPf/fC(图4H)细胞中经由shRNA递送抑制了RORγ，并评估了对菌落或球体形成能力的影响，每个shRNA n＝3。图4I至图4K：KPf/fC细胞中经由shRNA递送抑制了RORγ，并对球体培养物中Msi2-GFP干细胞含量(图4I)、BrdU(图4J)和膜联蛋白-V(图4K)的影响通过FACS每个条件n＝3进行了评估。图4L：KPf/fC细胞中经由shRNA递送抑制了RORγ，并通过在体内跟踪侧腹移植来评估对肿瘤增殖的影响，每个条件n＝4。图4M和图4N：用shCtrl或shRorc转导的KPf/fC细胞中干细胞程序(图4M)和促肿瘤因子(图4N)的相对RNA表达的热图。红色，过度表示；蓝色，表示不足；颜色表示中值的倍数变化。图4O：随着RORγ缺失而下调的基因(q值<0.05，紫色)、干细胞特异性超级增强子相关联基因(绿色)和与含有RORγ共有结合位点的开放染色质区域相关联基因(橙色)的维恩图。图4P：RORγ共有结合位点在整个基因组中的分布。左图，与干细胞特异性超级增强子相关联的基因组百分比；右图，干细胞相关联超级增强子中RORγ共有结合位点的频率。图4Q：用shCtrl或shRorc转导的KPf/fC细胞中超级增强子相关联基因组的相对RNA表达的热图。红色，过度表示；蓝色，表示不足；颜色表示中值的倍数变化。图4R：由干细胞中的超级增强子标记的基因的H3K27ac ChIP-seq读数计数，这些基因在RORγ耗尽的KPf/fC细胞中下调。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图5A至图5X显示RORγ的药理学靶向在胰腺癌小鼠模型中削弱进展并提高存活率。图5A和图5B：KPf/fC细胞的球体形成能力(图5A)和KPR172H/+C细胞的菌落形成测定(图5B)在RORγ反向激动剂SR2211或媒介物(每个条件n＝3)存在下。图5C和图5D：在SR2211或媒介物存在下生长的低通路KPf/fC肿瘤细胞的类器官形成能力。代表性类器官图像(图5C)和类器官形成的量化(图5D)。图5E至图5I：对用SR2211或媒介物处理3周的侧腹KPf/fC荷瘤小鼠的分析。(图5E)肿瘤建立和处理方法的示意图。总活细胞(图5F)、总EpCAM+肿瘤上皮细胞(图5G)、总EpCAM+/CD133+干细胞(图5H)，以及总EpCAM+/Msi2+干细胞(图5I)(对于媒介物n＝4，对于媒介物+吉西他滨，n＝2，对于SR2211，n＝4，对于SR2211+吉西他滨，n＝3)。图5J：每天用媒介物(灰色)或SR2211(黑色)处理的KPf/fC小鼠的存活率。荷瘤小鼠在8周龄时纳入处理并持续处理直至垂死(p＝0.051，危险比＝0.16，中位存活率：媒介物＝18天，SR2211＝38.5天)。图5K：用媒介物或SR2211处理8天(每个条件n＝2)的已建立肿瘤的REM2-KPf/fC小鼠的实时成像。Msi2-报告基因(绿色)、VE-钙粘蛋白(品红色)、Hoecsht(蓝色)；Msi2-报告基因+干细胞，灰色框。图5L：来自REM2-KPf/fC实时成像的干细胞簇的量化(每个条件n＝2；每只小鼠分析6-10帧)。图5M至图5N：对用SR2211或媒介物处理2周的侧腹KPf/fC荷瘤NSG小鼠的分析。肿瘤建立和处理方法的示意图：在处理前将KPf/fC肿瘤细胞移植到NSG小鼠(缺乏Th17细胞)的侧腹(图5M)。用媒介物或SR2211处理2周后侧腹肿瘤的肿瘤生长率(图5N)。肿瘤体积的倍数变化与处理开始时的体积有关。(每个处理组n＝4-6)。图5O至图5P：WT或RORγ-敲除受体小鼠中KPf/fC侧腹肿瘤生长的分析；RORγ-敲除受体在微环境中耗尽T细胞群。肿瘤建立示意图(图5O)。WT或RORγ-敲除受体小鼠中的侧腹肿瘤的肿瘤生长率(图5P)(每个条件n＝3-4)。图5Q至图5X：携带移植的KPf/fC肿瘤并用SR2211或媒介物处理2周的WT或RORγ-敲除受体小鼠的分析。肿瘤建立和实验策略的示意图(图5Q)。用媒介物或SR2211处理2周的WT受体小鼠中的侧腹肿瘤的肿瘤生长率(图5R)。用媒介物或SR2211处理2周的RORγ-敲除受体小鼠中的侧腹肿瘤的肿瘤生长率(图5S)。最终肿瘤质量(图5T)、总活细胞(图5U)、总EpCAM+肿瘤上皮细胞(图5V)、总EpCAM+/CD133+干细胞(图5W)和总Th17细胞(图5X)在WT和RORγ-敲除受体小鼠中(每个条件n＝5-7)。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图6A至图6K显示RORγ在人胰腺癌中的功能。图6A：使用5个独立的CRISPR引导敲低RORC后人胰腺癌细胞系的菌落形成能力。图6B：人胰腺癌系侧腹肿瘤RORγ(绿色)、E-钙粘蛋白(红色)、Dapi(蓝色)的代表性图像。图6C：在用吉西他滨和媒介物或SR2211处理2.5周的小鼠中源自人胰腺癌系的肿瘤的生长率。肿瘤体积的倍数变化与处理开始时的体积有关。图6D和图6E：存在媒介物或SR2211时的原代患者类器官生长。从基质胶恢复后的类器官(图6D)和类器官周长(图6E，左)或类器官体积(图6E，右)的量化的代表性图像。图6F：用媒介物或SR2211处理1.5周(n＝4)的异种移植物中原代患者来源肿瘤的生长率。图6G：诊断为各种恶性肿瘤的患者肿瘤中的RORC扩增。图6H-图6K：患者组织微阵列中的RORγ染色的分析。PDAC和匹配的PanIN的患者组织微阵列中RORγ的IHC染色示出阴性、细胞质和细胞质+核RORγ染色的TMA评分(图6H)。RORγ染色与肿瘤分期(图6I)、淋巴浸润(图6J)和淋巴结状态(图6K)之间的相关性。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图7A至图7C显示Musashi2+肿瘤细胞富含类器官形成能力，与图1相关。图7A：来自原代分离的Musashi2+(REM2+)和Musashi2-(REM2-)KPf/fC肿瘤细胞的肿瘤类器官形成。培养的细胞数量在代表性图像上方表示。图7B：为REM2+(黑色)和REM2-(红色)类器官形成计算的极限稀释频率(左)。表(右)表示在生物学重复中测试的细胞剂量。图7C：未处理的10-12周龄REM2-KPf/fC小鼠(n＝3)或用吉西他滨处理72小时(n＝1)或分析前6天(n＝1)中增殖(Ki67+)REM2+(左)和REM2-(右)肿瘤细胞的频率；200mg/kg吉西他滨腹腔注射每72小时递送一次。
图8A至图8E显示H3K27ac标记的区域与原代干细胞和非干细胞KPf/fC细胞中的RNA表达一致，与图1A至图1P相关。图8A：H3K27ac峰和基因组特征的重叠。对于每个基因组特征，干细胞(蓝色)和非干细胞(灰色)中H3K27ac峰的频率表示为观察到的峰分布/预期随机基因组分布的比率。图8B和图8C：H3K27ac峰与干细胞(图8B；p＝7.1x10-14)和非干细胞(图8C；p<22x10-16)中RNA表达的一致性。图8D和图8E：比较干细胞和非干细胞的基因表达和H3K27ac富集中观察/预期重叠比率。下/上，在非干细胞中富集的基因表达/在干细胞中富集的H3K27ac；上/下，在干细胞中富集的基因表达/在非干细胞中富集的H3K27ac；下/下，在非干细胞中都富集的基因表达和H3K27ac；上/上，在干细胞中都富集的基因表达和H3K27ac。
图9A至图9C显示在标准条件下和干细胞生长条件下富集的sgRNA，与图2A至图2F相关。图9A：从终末期REM2-KPf/fC小鼠建立三个独立的REM2-KPf/fC细胞系，用于全基因组CRISPR筛选分析。新鲜分离的REM2-KPf/fC肿瘤的干细胞含量(图9A，左)，以及在标准生长条件下选择嘌呤霉素后(图9A，右)。图9B和图9C：在2D(图9B，肿瘤抑制因子)和3D(图9C，干细胞的负调节因子)中富集的引导的火山状图。图上显示的基因，p<0.005。
图10A至图10C显示胰腺癌干细胞的新的调节因子的识别，与图3A至图3W相关。图10A和图10B：shRNA敲低后KPf/fC细胞的球体形成能力。涉及干细胞和发育过程(图10A)或细胞粘附、细胞运动和基质成分(图10B)的选定基因。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01，通过学生t检验或单向方差分析。图10C：来自KPR172H/+C肿瘤的单细胞RNA表达图谱。由EpCAM(最左侧)、Krt19(左侧中间)、Cdh1(右侧中间)和Cdh2(最右侧)的表达限定的肿瘤细胞。
图11A至11C显示由RNA Seq识别的干细胞富集基因的蛋白质验证，与图3A至图3W和图4A至图4R相关。从KPf/fC小鼠分离的EpCAM+干细胞(CD133+)和非干细胞(CD133-)原代肿瘤细胞中Celsr1(图11A)、Celsr2(图11B)和RORγ(图11C)的免疫荧光分析。每张幻灯片分析三帧，并确定Celsr1-high、Celsr2-high或RORγ-high细胞的频率。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01，通过学生t检验或单向方差分析。
图12A和图12B显示证实靶向基因的蛋白质敲低的Westerns，与图3A至图3W和图4A至图4R相关。KPf/fC细胞用针对Pear1(图12A)或RORγ(图12B)的shRNA感染，并在转导后五天通过蛋白质印迹法确定蛋白质敲低效率。相对表达相对于微管蛋白加载对照进行量化。
图13A至图13F显示验证在全基因组CRISPR筛选中识别的脱落物在体内实验的独立重复，与图3A至图3W和图4A至图4R相关。Celsr1(图13A)、Celsr2(图13B)、Pearl(图13C)、IL10Rb(图13D)、CSFlR(图13E)和RORγ(图13F)经由KPf/fC细胞中的shRNA递送受到抑制，并通过在体内跟踪侧腹移植来评估对肿瘤增殖的影响，每个条件n＝4。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图14显示细胞因子受体抑制对KPf/fC细胞中凋亡的影响，与图3A至图3W相关。细胞因子受体IL10Rb和CSF1R在KPf/fC细胞中被shRNA递送抑制，并在球体培养物中培养一周。使用shIL10Rb(p<.05)和shCSF1R(趋势)可以看到KPf/fC细胞的凋亡增加。通过膜联蛋白-V染色和FACS分析确定的凋亡细胞频率，每个条件n＝3。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图15A至图15C显示在体外KPf/fC细胞和培养基中的细胞因子表达，与图3A至图3W相关。培养基和KPf/fC细胞中细胞因子IL-10、IL-34和CSF-1的浓度通过ELISA(Quantikine，R&D Systems)，用于量化的标准曲线进行量化(图15A)。在新鲜球体培养物培养基、KPf/fC干细胞和非干细胞条件培养基(图15B)，以及KPf/fC上皮细胞裂解物(图15C)中量化细胞因子。通过在球体培养基中培养分选的CD133-或CD133+KPf/fC细胞48小时生成条件培养基；过滤培养基并立即测定。将细胞裂解物收集在RIPA缓冲剂中，并以2mg/mL的浓度进行ELISA测定。每个条件n＝3。
图16A至图16C显示与图4A至图4R相关的RORγ下游的上皮特异性程序。图16A：KPf /fC干细胞和非干细胞中转录因子的相对RNA表达的热图，被识别为网络图谱内可能的胰腺癌干细胞依赖性(见图2E)。红色，过度表示；蓝色，表示不足；颜色表示中值的倍数变化。图16B：分析与H3K27ac相关联的基因组区域中的RORγ共有结合位点分布。下/下，在非干细胞中都富集的基因表达和H3K27ac；上/上，在干细胞中都富集的基因表达和H3K27ac。图16C：患者样本的E-钙粘蛋白-基质细胞内RORγ表达的量化。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图17显示IL-1R1对RORγ表达的调节，与图4A至图4R相关。IL1R1被KPf/fC细胞中CRISPR介导的缺失抑制，并通过qPCR评估对RORγ表达的影响。两种不同的引导RNA(sgIL1r1-1和sgIL1r1-2)用于敲除IL1R1；表达通过qPCR量化，并相对于对照(非靶向引导RNA)显示，每个条件n＝3。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图18A至图18C显示RORγ敲低对干细胞超级增强子景观的影响，与图4A至图4R相关。KPf/fC细胞系用shRorc感染并用于H3K27ac ChIP-seq和超级增强子分析，示意图(图18A)。分析H3K27ac峰以评估shCtrl和shRorc样本中的SE重叠(图18B)。shRorc样本中丢失的超级增强子与在原代Msi2-GFP+KPf/fC肿瘤细胞中识别的干细胞富集和干细胞特有的超级增强子交叉，并进一步限于含有RORγ结合基序的SE(图18C)。大多数超级增强子景观在RORγ缺失时保持不变，并且确实发生的景观变化在具有RORγ结合位点的SE中没有富集。ChIP-seq分析在两个独立的KPf/fC细胞系中进行。
图19A至图19C显示与图5A至图5X和图6A至图6K相关的RORγ的药理学靶向。图19A：在纳入RORγ靶向处理之前免疫活性小鼠的侧腹KPf/fC肿瘤的大小。第1组，媒介物；第2组，SR2211；第3组，媒介物+吉西他滨；第4组，SR2211+吉西他滨。图19B：在存在媒介物(左)或SR2211(右)的情况下生长的原代患者类器官的代表性图像。图19C：在干细胞条件下CRISPR引导损耗的分析，用于在干细胞或非干细胞中表达的超级增强子相关联基因。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图20A至图20D显示在体内RORγ抑制后的靶向接合，与图5A至图5X相关。图20A和图20B：9.5周龄的荷瘤KPf/fC小鼠用媒介物或SR2211处理两周(中点)，之后分离、固定肿瘤，并通过免疫荧光分析Hmga2在上皮细胞中的靶向接合。在媒介物或SR2211处理的肿瘤(图20A)代表性图像(图20B)中Hmga2阳性上皮细胞的量化。图20C和图20D：用媒介物或SR2211处理从8周龄到终点的荷瘤KPf/fC小鼠。在媒介物或SR2211处理的肿瘤中Hmga2阳性上皮细胞的量化(图20C)代表性图像(图20D)。每只小鼠分析四帧，每个条件n＝2-4只小鼠，Hmga2(红色)，角蛋白(绿色)。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。Grubbs检验(p＝0.1)用于从中点SR2211处理组中去除异常值。
图21A至图21D显示T细胞亚群在移植到RORγ-敲除受体小鼠中的KPf/fC肿瘤中耗尽，与图5A至图5X相关。分析移植到野生型或RORγ-敲除受体小鼠中的KPf/fC肿瘤中的T细胞亚群(显示对照处理组)。评估了以下群的频率和绝对细胞数：CD45+细胞(图21A)、CD45+/CD3+T细胞(图21B)、CD45+/CD3+/CD8+或CD4+T细胞(图21C)、CD45+/CD3+/CD4+/IL-17+Th17细胞(图21D)；频率计算为肿瘤中的总频率(每个条件n＝5-7)。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过学生t检验或单向方差分析。
图22A至图22J显示SR2211对KPf/fC小鼠中脉管系统和非肿瘤细胞的影响，与图5A至图5X相关。图22A至图22I：来自用媒介物或SR2211处理1周的KPf/fC小鼠的原地形成肿瘤中非肿瘤细胞群的FACS分析。评估了以下群的频率和绝对细胞数：CD45+细胞(图22A)、CD31+细胞(内皮)(图22B)、CD11b/F480+细胞(巨噬细胞)(图22C)、CD11b/Gr-1+细胞(MDSC)(图22D)、CD11c+细胞(树突状)(图22E)、CD45+/CD3+T细胞(图22F)、CD3+/CD8+T细胞(图22G)、CD3+/CD4+T细胞(图22H)、CD4+/IL-17+Th17细胞(图22I)。(每个条件n＝3)。图22J：用媒介物或SR2211处理的KPf/fC小鼠的脉管系统的体内成像，脉管系统的标志是抗VE-钙粘蛋白的在体内递送。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05，通过学生t检验或单向方差分析。
图23A至图23D显示鼠和人胰腺癌细胞中RORγ的下游靶标的分析识别了与图4A至图4R和图6A至图6K相关的共同的促肿瘤细胞因子通路。人类和小鼠胰腺癌细胞中RNA-seq的基因本体和基因集富集分析，以识别受RORγ调节的常见基因和通路。KPf/fC RNA-seq的基因本体分析显示用shRorc下调的基因富集了细胞因子介导的信号通路GO术语(图23A)。将细胞因子介导的信号通路内KPf/fC中的特异性差异表达基因(图23B)与通过人胰腺癌细胞(FG)的RNA-seq分析识别的差异表达基因交叉，其中使用CRISPR敲除RORγ。小鼠和人RNA-seq的基因集富集分析显示了跨物种由RORγ调节的常见细胞因子基因集(图23D)。
图24A至图24G显示所有功能测试基因的RNA敲低效率，与图3A至图3W和图4A至图4R相关。图24A至图24F：用针对所示基因的shRNA感染KPf/fC细胞并确定敲低效率。发育过程(Onecut3、Tdrd3、Dusp9、En1、Car2、Ano1)(图24A)、代谢(Sptssb、Lpin2)(图24B)、细胞粘附、细胞运动、基质成分(Myo10、Sftpd、Pkp1、Lama5、Myo5b、Muc4、Elmo3、Tff1、Muc1、Ctgf)(图24C)、MEGF家族(Megf10、Celsr1、Celsr2、Pear1)(图24D)、细胞因子受体、免疫信号(Csf1R、IL10Rb、IL10、IL34)(图24E)、RORγ(图24F)。每个条件n＝3。图24G：用针对IL10Rb或Pear1的shRNA感染人FG细胞，并确定敲低效率。每个条件n＝3。数据表示为平均值+/-S.E.M.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，****p<0.0001通过学生t检验或单向方差分析。
图25A和图25B显示Msi2的过表达部分拯救shRorc KPf/fC肿瘤细胞的球体形成。图25A：KPf/fC细胞系用慢病毒shRorc或shCtrl和对照过表达或Msi2过表达载体转导。对双重感染的细胞进行分类(绿色和红色)并在球体培养物中培养一周。图25B：qPCR分析显示shRorc和shCtrl感染细胞中的Msi2过表达和shRorc对照细胞中Msi2的敲低。
图26A和图26B显示SR2211处理的KPf/fC细胞的吞噬作用没有差异。KPf/fC细胞系用慢病毒GFP过表达载体转导并移植到免疫活性同窝小鼠的侧腹。建立后，用SR2211或媒介物处理肿瘤；然后通过FACS分析肿瘤中表达GFP的巨噬细胞作为吞噬作用的量度(每个条件n＝2-4)。
图27显示细胞因子受体和信号的TPM值，与图3A至图3W相关。显示了Msi2-和Msi2+细胞中细胞因子和免疫信号的平均RNA-Seq TPM值。
图28显示RORc-null KPf/fC小鼠的分析。野生型、RORC+/-和RORC-/-KPf/fC小鼠的肿瘤质量和细胞计数，每个条件n＝1。
图29显示RORc缺失削弱bcCML生长。
图30显示AZD-0284处理与吉西他滨组合抑制KPf/fC类器官生长。
图31显示单独或与吉西他滨组合的更高剂量的AZD-0284处理抑制KPf/fC类器官生长。
图32显示AZD-0284单独或与吉西他滨组合在抑制KPf/fC类器官生长方面的剂量依赖性作用。
图33显示使用不同肿瘤参数测试AZD-0284在体内对荷瘤KPf/fC小鼠的影响的实验结果。
图34显示使用不同肿瘤参数测试AZD-0284在体内对荷瘤KPf/fC小鼠的影响的实验结果。
图35显示AZD-0284和吉西他滨的组合对原代患者来源的PDX1535类器官生长的显着抑制。
图36显示单独或与吉西他滨组合的更高剂量的AZD-0284处理抑制原代患者来源的PDX1535类器官生长。
图37显示AZD-0284单独或与吉西他滨组合在抑制原代患者来源的PDX1535类器官生长方面的剂量依赖性作用。
图38显示单独或与吉西他滨组合的更低剂量的AZD-0284，有效抑制原代患者来源的PDX1356类器官生长。
图39显示单独或与吉西他滨组合的更高剂量的AZD-0284，有效抑制原代患者来源的PDX1356类器官生长。
图40是显示不同剂量的AZD-0284对原代患者来源的类器官生长的抑制作用的数据汇编。
图41显示使用不同肿瘤参数测试AZD-0284在体内对原代患者来源的异种移植物的影响的实验结果。
图42显示使用不同肿瘤参数测试AZD-0284在体内对原代患者来源的异种移植物的影响的实验结果。
图43显示使用不同肿瘤参数测试AZD-0284在体内对原代患者来源的异种移植物的影响的实验结果。
图44显示了显示AZD-0284在体内对原代患者来源的异种移植物的抗癌作用的数据汇编。
图45显示了显示AZD-0284在体内对原代患者来源的异种移植物的抗癌作用的数据汇编。
图46显示不同剂量的AZD-0284在抑制人白血病k562细胞的菌落形成方面的作用。
图47是使用源自非种系基因工程小鼠模型(GEMM)的胰腺癌细胞的类器官研究的示意图。
图48是使用源自种系基因工程小鼠模型(GEMM)的胰腺癌细胞的类器官研究的示意图。
图49显示JTE-151处理抑制非种系KRAS/p53类器官生长。
图50显示JTE-151处理抑制种系KPf/fC类器官生长。
图51是使用荷瘤KPf/fC小鼠或原代胰腺癌患者来源的异种移植物的JTE-151处理肿瘤的在体内研究的示意图。
图52是来自用30mg/kg JTE-151处理的荷瘤KPf/fC小鼠的数据汇编。
图53显示单独实验的结果，其中用90mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠。
图54显示单独实验的结果，其中用90mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠。
图55显示单独实验的结果，其中用90mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠。
图56显示单独实验的结果，其中用90mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠。
图57是来自用90mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠的数据汇编。
图58是来自用30mg/kg或90mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠的数据汇编。
图59显示单独实验的结果，其中用120mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠。
图60显示单独实验的结果，其中用120mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠。
图61显示单独实验的结果，其中用120mg/kg JTE-151处理荷瘤KPf/fC小鼠。
图62是使用源自携带患者来源的异种移植肿瘤的小鼠模型的胰腺癌细胞的类器官研究的示意图。
图63显示单独或与吉西他滨组合的JTE-151处理，抑制了原代患者来源的PDX1535类器官的生长。
图64显示单独或与吉西他滨组合的JTE-151，在抑制原代患者来源的PDX1535类器官生长方面的剂量依赖性作用。
图65显示单独或与吉西他滨组合的JTE-151处理，抑制了原代患者来源的PDX1356类器官的生长。
图66显示单独或与吉西他滨组合的更高剂量的JTE-151处理，抑制了原代患者来源的PDX1356类器官生长。
图67显示单独或与吉西他滨组合的JTE-151处理，抑制了原代患者来源的PDX202和PDX204类器官生长。
图68是来自用不同剂量的JTE-151处理的原代患者来源类器官的数据汇编。
图69是来自用不同剂量的JTE-151(单独或与吉西他滨组合)处理的人类禁食生长(FG)类器官的数据汇编。
图70显示JTE-151对原代患者来源的PDX1356异种移植物的在体内抗癌作用。
图71显示JTE-151对原代患者来源的PDX1356异种移植物的在体内抗癌作用。
图72显示JTE-151对原代患者来源的PDX1356异种移植物的在体内抗癌作用。
图73显示JTE-151对原代患者来源的PDX1356异种移植物的在体内抗癌作用。
图74显示JTE-151对原代患者来源的PDX1335异种移植物的在体内抗癌作用。
图75显示JTE-151对原代患者来源的PDX1335异种移植物的在体内抗癌作用。
图76显示JTE-151对原代患者来源的PDX1424异种移植物的在体内抗癌作用。
图77显示JTE-151对原代患者来源的PDX1424异种移植物的在体内抗癌作用。
图78是来自携带用JTE-151处理的原代患者来源的异种移植物的小鼠的数据汇编。
图79显示Msi2-CreER/LSL-Myc小鼠在Myc的诱导后发展不同类型的胰腺癌。
图80显示RORγ在腺鳞癌和腺泡癌中表达。RORγ：红色；角蛋白：绿色；DAPI：蓝色。
图81显示胰腺腺鳞癌对SR2211敏感。
图82A至图82B显示腺泡肿瘤来源的类器官对RORγ抑制剂敏感。
图83显示SR2211在抑制LcCA KP肺癌细胞生长方面的剂量依赖性作用。
具体实施方式
在本文中在各种实施方式中公开了识别多种类型癌症常见的癌症靶标的技术诸如RORγ，抑制癌症靶标的小分子化合物的治疗用途，诊断用途和预后用途使用RORγ抑制剂结合一种或多种其他癌症疗法的组合疗法，以及包括RORγ抑制剂的药物组合物。
识别癌症靶标
耐药性和由此产生的复发仍然是胰腺癌中的关键挑战，部分是由肿瘤固有的异质性驱动的，其阻止了对所有恶性细胞的有效靶向。为了更好地了解赋予侵袭性表型和耐药性的通路，利用RNA-seq、ChIP-seq和全基因组CRISPR筛选的组合来系统地绘制胰腺癌干细胞的分子依赖性，胰腺癌干细胞是高度耐药细胞，也富含驱动肿瘤进展的能力。这些数据的整合揭示了免疫调节通路在原地形成肿瘤的干细胞自我更新和维持中的意外作用。特别是，RORγ是一种核激素受体，因其在炎症细胞因子反应和T细胞分化中的作用而闻名，已成为干细胞的关键调节因子。RORγ转录水平在胰腺癌进展过程中增加，并且该基因座在一部分胰腺癌患者中扩增。功能性RORγ抑制，无论是经由遗传还是药理学方法实现，都会导致在体外和在体内胰腺癌生长的显着缺陷，并提高基因工程模型中的存活率。最后，对患者样本的大规模回顾性分析揭示，PanIn病变中RORγ表达与疾病晚期、淋巴管侵犯和淋巴结转移呈正相关，表明RORγ表达可能是预测胰腺癌侵袭性的有用标志物。总的来说，这些数据揭示了胰腺癌干细胞对免疫调节信号的意外共同选择，并表明目前用于自身免疫适应症的疗法应作为胰腺癌患者的一种新的治疗策略进行评估。
虽然细胞毒性剂仍然是大多数癌症的标准治疗方法，但它们的使用通常与初始功效相关联，然后是疾病进展。对于胰腺癌来说尤其如此，这是一种高度侵袭性的疾病，目前的多药化学治疗方案导致30％的患者肿瘤消退，并且在绝大多数病例中很快出现疾病进展。这种进展主要是由于化学疗法无法成功根除所有肿瘤细胞，留下可触发肿瘤再生长的亚群。因此，识别优先耐药的细胞并了解它们的脆弱性对于改进患者预后和对当前疗法的反应至关重要。
以前的工作重点为确定胰腺癌中最具致瘤性的群。通过这种方式，以CD24+/CD44+/ESA+、cMet、CD133、Nestin、ALDH以及最近的DCLK1和Musashi表达为标志的细胞亚群已被证明具有“干细胞”特征，从而丰富了驱动肿瘤发生并重建原始肿瘤异质性的能力。重要的是，这些肿瘤增殖细胞或“癌症干细胞”已被证明对细胞毒性疗法(诸如吉西他滨)具有高度抗性，这与具有高癌症干细胞特征的癌症患者相对于具有低癌症干细胞特征的癌症患者具有较差的预后的发现一致。尽管胰腺癌干细胞起源于上皮，但这些细胞经常表达EMT相关联程序，这可能部分解释了它们在周期中的过度表示和对于接种转移位点的倾向。由于这些研究将干细胞定义为对疾病进展具有特别高风险的群，因此定义维持它们的分子信号仍然是实现完整和持久反应的本质目标。
RNA-seq、ChIP-seq和全基因组CRISPR筛选的组合用于定义维持胰腺癌干细胞侵袭性的分子框架。这些数据确定了调节胰腺癌干细胞的关键节点网络，并揭示了免疫调节基因在胰腺癌干细胞自我更新和维持中的意外作用。其中，RORγ是一种核激素受体，以其在Th17细胞规范和炎症细胞因子产生调节中的作用而闻名，已成为干细胞的关键调节因子。RORγ表达随着进展而增加，通过遗传或药理学方法阻断了RORγ信号，耗尽了癌症干细胞库，并严重抑制了人和小鼠肿瘤的增殖，部分原因是触发了与超级增强子相关联的致癌网络的崩溃。最后，用RORγ抑制剂持续治疗导致胰腺癌原地形成模型的显着改进。总之，这些数据提供了独特的胰腺癌干细胞综合图谱，并识别了可用于改进侵袭性、耐药性胰腺细胞的治疗靶向的关键漏洞。
如在本文中所公开的，胰腺癌干细胞的分子依赖性已被系统地绘制出来，包括也富集驱动进展能力的高度耐药细胞。识别了胰腺癌中具有干细胞特征并显示出驱动致死率和治疗抗性的优先能力的细胞亚群。由于这项工作显示这些癌症干细胞优先耐药并驱动致死性，因此识别了对这些侵袭性胰腺癌细胞的维持和功能至关重要的网络和细胞程序。RNA-Seq、ChIP Seq和全基因组CRISPR筛选的组合用于开发调节胰腺癌的核心程序的网络图谱和表示胰腺癌干细胞核心依赖性的独特的多尺度程序图谱。该分析揭示了免疫调节基因在干细胞功能和胰腺癌生长中的意外作用。特别是，视黄酸受体相关孤儿受体γ(RORγ)成为胰腺癌干细胞的关键调节因子。
如在工作示例中所示的，RORγ表达在正常胰腺细胞中较低，但在上皮肿瘤细胞中随着疾病进展显着增加。ShRNA介导的敲低证实了由基于CRISPR的遗传筛选识别的RORγ的作用，因为它导致在体外胰腺癌细胞的球体形成减少，并在体内显着抑制肿瘤的发生和增殖。与此一致，RORγ的抑制导致在体外胰腺癌球体数量中的剂量依赖性减少，并且在患有晚期胰腺癌的KPC小鼠中联合递送RORγ抑制剂和吉西他滨导致干细胞库损耗并将肿瘤负荷降低一半。此外，RORγ表达在正常人胰腺和胰腺炎中较低，并随着人胰腺癌进展而升高。在人胰腺癌中阻断RORγ可减少在体外和在体内的生长，表明它在人类疾病中也起着重要作用。
白血病和胰腺癌干细胞具有一些共同特征和共有的分子依赖性。如在工作示例中所展示的，KLS细胞是从WT和RORγ-敲除(RORc-/-)小鼠中分离出来的，用BCR-ABL和Nup98-HOXA9进行逆转录病毒转导，并在体外原代和次级菌落测定中培养。观察到在原代和次级菌落测定中菌落数和总菌落面积的显着减少，表明原始细胞危象CML的生长和增殖严重依赖于RORγ。此外，观察到对急性髓性白血病(AML)生长以及淋巴肿瘤中RORγ表达的影响，表明RORγ信号传导在这些癌症中也有作用。
RORγ通路也成为干细胞的关键调节因子，因为它在非干细胞中的RNA和蛋白质水平表达都很低，但在干细胞群中表达富集。RORγ被发现可以调节干细胞中以超级增强子为标志的强致癌基因，并被显示与胰腺癌干细胞的侵袭性有关。经由遗传或药理学方法阻断RORγ信号会耗尽癌症干细胞库，并显着抑制胰腺肿瘤的进展。RORγ的治疗性、遗传性或基于CRISPR的抑制也已被证明可有效减少白血病和肺癌中的癌细胞生长。此外，鉴于上述RORγ在癌症干细胞功能中的作用可能并不特别限于一种癌症，因此有理由相信RORγ通路可广泛用于上皮和其他类型的癌症，这些癌症具有类似的癌症干细胞分子依赖性。综上所述，这表明RORγ信号传导在癌症干细胞中发挥重要作用，并且靶向RORγ通路将有效抑制RORγ表达水平高的干细胞驱动的癌症。
RORγ抑制剂、其类似物和衍生物
各种RORγ抑制剂及其类似物和衍生物可以用于治疗RORγ依赖性癌症。例如，SR2211是一种选择性合成RORγ调节剂和反向激动剂，由以下化学结构表示：
Figure BDA0003297603190000211
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是SR2211的类似物和/或衍生物。例如，RORγ抑制剂可以具有式I的结构：
Figure BDA0003297603190000212
包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体及其药学上可接受的衍生物，其中：
R11、R12、R13和R14独立地选自H、F、Cl、Br和I，并且可以相同或不同，条件是R11、R12、R13和R14中的至少一个不是H；
R15和R17独立地选自H、烷基、卤代烷基和烷氧基并且可以相同或不同；
R16选自H、F、Cl、Br、I、羟基、羟烷基、硫醇、硫醇烷基、氨基和氨基烷基；
Y11和Y12独立地选自N、O和S并且可以相同或不同；以及
Ar11是芳基或杂芳基。
在某些实施方式中，RORγ抑制剂具有式I的结构，包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体和其药学上可接受的衍生物，其中：
R11、R12、R13和R14独立地选自H、F、Cl、Br和I，并且可以相同或不同，条件是R11、R12、R13和R14中的至少一个不是H；
R15和R17独立地选自H、-CH3、-CH2CH3、-CF3和-OCH3，并且可以相同或不同；
R16选自H、OH、SH、F、Cl、Br和I；
Y11和Y12为N；以及
Ar11选自苯基、4-吡啶基、3-吡啶基、2-吡啶基和4-氨基-苯基。
RORγ抑制剂的另一个示例是AZD-0284，另一种反向激动剂，由以下化学结构表示：
Figure BDA0003297603190000221
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是AZD-0284的类似物和/或衍生物。例如，RORγ抑制剂可以具有式II的结构：
Figure BDA0003297603190000231
包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体及其药学上可接受的衍生物，其中：
R21和R22选自H、烷基、卤代烷基和烷氧基并且可以相同或不同；
R23选自H、F、Cl、Br、羟基、羟烷基、硫醇、硫醇烷基、氨基和氨基烷基；
R24选自H、烷基、烷基羰基、羟烷基和烷基亚氨基；
R25选自H、烷基磺酰基和卤代烷基磺酰基；以及
Y21和Y22独立地选自-NH-、S、O和C＝O，条件是Y21和Y22中的至少一个是C＝O。
在某些实施方式中，RORγ抑制剂具有式II的结构，包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体和其药学上可接受的衍生物，其中：
R21和R22选自H、-CH3、-CH2CH3、-CF3和-OCH3，并且可以相同或不同；
R23选自H、OH、SH、F、Cl、Br和I；
R24选自H、CH3、乙酰基、丙酰基、-CH2-CH2-OH、C(＝NH)-CH3和C(＝N-OH)-CH3；
R25选自H、甲磺酰基、三氟甲磺酰基和乙磺酰基；以及
Y21和Y22不同并且独立地选自-NH-和C＝O。
在某些实施方案中，RORγ抑制剂是由以下化学结构表示的AZD-0284(rac-AZD-0284)的外消旋混合物：
Figure BDA0003297603190000241
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是由以下化学结构表示的AZD-0284的反酰胺衍生物的外消旋混合物：
Figure BDA0003297603190000242
RORγ抑制剂的另一个示例是JTE-151，在美国专利号8,604,069中公开为化合物A-58，其化学名称为(4S)-6-[(2-氯-4-甲基苯基)氨基]-4-{4-环丙基-5-[cis-3-(2,2-二甲基丙基)环丁基]异恶唑-3-yl}-6-氧代己酸，由以下化学结构表示：
Figure BDA0003297603190000251
RORγ抑制剂的另一个示例是JTE-151A，由以下化学结构表示：
Figure BDA0003297603190000252
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是JTE-151或JTE-151A的类似物和/或衍生物。例如，RORγ抑制剂可以具有式III的结构：
Figure BDA0003297603190000253
包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体及其药学上可接受的衍生物，其中：
R31、R32和R33独立地选自H、烷基、卤代烷基、烷氧基和芳基；
R34、R35、R36和R37独立地选自H、F、Cl、Br和I，并且可以相同或不同，条件是R34、R35、R36和R37中的至少一个不是H；
R38选自-C(＝O)-OR、C(＝O)NR(R’)、-C(＝S)-OR和-C(＝O)-SR；
Y37是
Figure BDA0003297603190000261
Y31、Y32、Y33和Y34独立地选自O、N和S，并且可以相同或不同；
Y35和Y36独立地选自-NH-、S、O和C＝O，条件是Y35和Y36中的至少一个是C＝O；
n31是0、1、2、3、4、5或6；以及
R和R’独立地选自H和烷基。
在某些实施方式中，RORγ抑制剂具有式III的结构，包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体和其药学上可接受的衍生物，其中：
Y37是
Figure BDA0003297603190000262
R31、R32和R33独立地选自H、烷基、卤代烷基、烷氧基和芳基；
R34、R35、R36和R37独立地选自H、F、Cl、Br和I，并且可以相同或不同，条件是R34、R35、R36和R37中的至少一个不是H；
R38选自-C(＝O)-OR、C(＝O)NR(R’)、-C(＝S)-OR和-C(＝O)-SR；
Y33和Y34独立地选自O、N和S，并且可以相同或不同；
Y35和Y36独立地选自-NH-、S、O和C＝O，条件是Y35和Y36中的至少一个是C＝O；
n31是0、1、2、3、4、5或6；以及
R和R’独立地选自H和烷基。
在某些实施方式中，RORγ抑制剂具有式III的结构，包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体和其药学上可接受的衍生物，其中：
Y37是
Figure BDA0003297603190000271
R31选自H、CH3、CF3、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、环丁基、环戊基、叔丁基、新戊基、环己基和苯基；
R32选自H、CH3、CF3、乙基、丙基、异丙基、环丙基、异丁基、环丁基和环戊基；
R33选自H、CH3、CH2CH3、CF3和OCH3；
R34、R35、R36和R37独立地选自H、F、Cl、Br和I，并且可以相同或不同，条件是R34、R35、R36和R37中的至少一个不是H；
R38是-C(＝O)-OH；
Y31和Y33为O；
Y32和Y34为N；
Y35和Y36不同并且独立地选自-NH-和C＝O；以及
n31是1、2或3。
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是由以下化学结构表示的JTE-151(rac-JTE-151)的外消旋混合物：
Figure BDA0003297603190000272
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是由以下化学结构表示的JTE-151的反酰胺衍生物的外消旋混合物：
Figure BDA0003297603190000281
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是具有式IV结构的JTE-151的类似物和/或衍生物：
Figure BDA0003297603190000282
包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体及其药学上可接受的衍生物，其中：
R41、R42、R43、R44为烷基，并且可以相同或不同；
R45是卤素，优选选自F、Cl、Br和I；
Y41和Y42独立地选自N、O和S，并且可以相同或不同；
Y43和Y44独立地选自-NH-、S、O和羰基，条件是Y43和Y44中的至少一个是羰基；
n41是0、1、2、3、4、5或6；以及
n42是0、1、2、3、4、5或6。
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是JTE-151A的类似物和/或衍生物。例如，RORγ抑制剂可以具有式IIIA的结构：
Figure BDA0003297603190000291
包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体及其药学上可接受的衍生物，其中：
R31、R32和R33独立地选自H、烷基、卤代烷基、烷氧基和芳基；
R34、R35、R36和R37独立地选自H、F、Cl、Br和I，并且可以相同或不同，条件是R34、R35、R36和R37中的至少一个不是H；
R38选自-C(＝O)-OR、C(＝O)NR(R’)、-C(＝S)-OR和-C(＝O)-SR；
Y31、Y32、Y33和Y34独立地选自O、N和S，并且可以相同或不同；
Y35和Y36独立地选自-NH-、S、O和C＝O，条件是Y35和Y36中的至少一个是C＝O；
n31是0、1、2、3、4、5或6；以及
R和R’独立地选自H和烷基。
在某些实施方式中，RORγ抑制剂具有式IIIA的结构，包括其药学上可接受的盐、其药学上可接受的异构体和其药学上可接受的衍生物，其中：
R31选自H、CH3、CF3、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、环丁基、环戊基、叔丁基、新戊基、环己基和苯基；
R32选自H、CH3、CF3、乙基、丙基、异丙基、环丙基、异丁基、环丁基和环戊基；
R33选自H、CH3、CH2CH3、CF3和OCH3；
R34、R35、R36和R37独立地选自H、F、Cl、Br和I，并且可以相同或不同，条件是R34、R35、R36和R37中的至少一个不是H；
R38是-C(＝O)-OH；
Y31和Y33为O；
Y32和Y34为N；
Y35和Y36不同并且独立地选自-NH-和C＝O；以及
n31是1、2或3。
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是由以下化学结构表示的JTE-151A(rac-JTE-151A)的外消旋混合物：
Figure BDA0003297603190000301
在某些实施方式中，RORγ抑制剂是由以下化学结构表示的JTE-151A的反酰胺衍生物的外消旋混合物：
Figure BDA0003297603190000302
术语“烷基”是指直链或支链或环链烃基或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的并且可以包括二价和多价基团。烃基的示例包括但不限于，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基等。
术语“卤代烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个氢被相同或不同卤素取代的烷基，优选选自F、Cl、Br和I的卤素。卤代烷基的示例包括但不限于卤代甲基(例如CF3)、卤代乙基、卤代丙基、卤代丁基、卤代戊基和卤代己基。卤代甲基的示例可以具有-C(X2)(X3)-X1的结构，其中X1选自F、Cl、Br和I；并且X2和X3可以相同或不同，并且独立地选自H、F、Cl、Br和I。
术语“羟烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个氢被羟基取代的烷基。羟烷基的示例包括但不限于羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基和羟己基。羟甲基的示例可以具有-C(X12)(X13)-X11的结构，其中X11为OH；并且X12和X13可以相同或不同，并且独立地选自H和OH。
术语“氨基烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个氢被氨基取代的烷基。氨基烷基的示例包括但不限于氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基、氨基丁基、氨基戊基和氨基己基。氨基甲基的示例可以具有-C(X22)(X23)-X21的结构，其中X21是氨基；并且X22和X23可以相同或不同，并且独立地选自H和氨基。
术语“硫醇烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个氢被硫醇基取代的的烷基。硫醇烷基的示例包括但不限于硫醇甲基、硫醇乙基、硫醇丙基、硫醇丁基、硫醇戊基和硫醇己基。硫醇甲基的示例可以具有-C(X32)(X33)-X31的结构，其中X31是硫代；并且X32和X33可以相同或不同，并且独立地选自H和硫醇。
术语“烷基羰基”是指-C(＝O)-X41，其中X41是如在本文中所定义的烷基。烷基羰基的示例包括但不限于乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和己酰基。
术语“烷基亚氨基”是指-C(＝N-X51)-X52，其中X51是H或OH；并且X52是如在本文中所定义的烷基。烷基亚氨基的示例包括但不限于-C(＝NH)CH3和-C(＝N-OH)CH3。
术语“芳基”是指仅具有碳环原子的芳族基团，任选地被一个或多个选自卤素、烷基、氨基和羟基的取代基取代。芳基的示例包括但不限于苯基和萘基。
术语“杂芳基”是指具有1、2、3或4个杂原子作为环原子的芳族基团，任选地被一个或多个选自卤素、烷基、氨基和羟基的取代基取代。合适的杂原子包括但不限于O、S和N。杂芳基的示例包括但不限于吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、吡咯基和咪唑基。
在本文中公开的小分子化合物的类似物和衍生物在抑制RORγ方面具有改进的活性或保留至少部分活性，并且具有其他改进的特性，诸如对接受该化合物、其类似物和衍生物的受试者的毒性较小。
药学上可接受的盐的示例包括但不限于无毒的无机和有机酸加成盐，诸如源自盐酸的盐酸盐、源自氢溴酸的氢溴酸盐、源自硝酸的硝酸盐、源自高氯酸的高氯酸盐、源自磷酸的磷酸盐、硫酸衍生的硫酸盐、甲酸衍生的甲酸盐、乙酸衍生的乙酸盐、乌头酸衍生的乌头酸盐、抗坏血酸衍生的抗坏血酸盐、苯磺酸衍生的苯磺酸盐、苯甲酸衍生的苯甲酸盐、肉桂酸衍生的肉桂酸盐、柠檬酸衍生的柠檬酸盐、帕莫酸衍生的帕莫酸盐、庚酸衍生的庚酸盐、富马酸衍生的富马酸盐、谷氨酸衍生的谷氨酸盐、乙醇酸衍生的乙醇酸盐、乳酸衍生的乳酸盐、马来酸衍生的马来酸盐、丙二酸衍生的丙二酸盐、扁桃酸衍生的扁桃酸盐、甲磺酸衍生的甲磺酸盐、萘-2-磺酸衍生的萘-2-磺酸盐、邻苯二甲酸衍生的邻苯二甲酸盐、水杨酸衍生的水杨酸盐、山梨酸衍生的山梨酸盐、硬脂酸衍生的硬脂酸盐、琥珀酸衍生的琥珀酸盐、酒石酸衍生的酒石酸盐、对甲苯磺酸衍生的甲苯对磺酸盐等。这些盐可以通过本领域熟知和描述的程序形成。可能不被认为是药学上可接受的其他酸诸如草酸可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明的化合物及其药学上可接受的酸加成盐。
药学上可接受的盐的示例还包括但不限于无毒的无机和有机阳离子盐，诸如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、铝盐、锂盐、胆碱盐、赖氨酸盐和在本文中公开的含有阴离子基团的化合物的铵盐等。这种阳离子盐可以通过本领域的合适程序形成。
药学上可接受的衍生物的示例包括但不限于酯衍生物、酰胺衍生物、醚衍生物、硫醚衍生物、碳酸酯衍生物、氨基甲酸酯衍生物、磷酸酯衍生物等。
组合疗法
在本文中还公开了使用一种或多种RORγ抑制剂或包括在本文中公开的一种或多种RORγ抑制剂的组合物与靶向特定类型癌症的一种或多种其他癌症疗法组合的治疗癌症的方法。RORγ抑制剂或包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物可与一种或多种其他癌症疗法在延长的时间段内依次或同时施用。这种方法可以用于治疗任何RORγ依赖性癌症或肿瘤细胞类型，包括但不限于原发性、复发性和转移性胰腺癌、肺癌和白血病。
RORγ抑制剂和包括在本文中公开的RORγ抑制剂的组合物可与其他常规癌症疗法诸如手术、免疫疗法、放射疗法和/或化学疗法组合使用以获得改进的或协同的治疗效果。例如，可以在施用RORγ抑制剂或包括RORγ抑制剂的组合物之前、期间或之后进行或施用手术、化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法。如本领域普通技术人员将理解的，可将化学疗法、免疫疗法、放射疗法和/或RORγ抑制剂或包括RORγ抑制剂的组合物以相同或不同剂量施用/给药于对其有需要的受试者一次或多次，取决于癌症的诊断和预后。本领域技术人员将能够以不同的顺序组合这些疗法中的一种或多种以实现期望的治疗结果。在某些实施方式中，与单独施用的任何治疗相比，组合疗法实现了协同作用。
根据癌症类型，可选择多种化学治疗剂与在本文中公开的一种或多种RORγ抑制剂或包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物组合使用。在某些实施方式中，用于胰腺癌的化学治疗剂包括但不限于吉西他滨(Gemzar)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康(Camptosar)、奥沙利铂(Eloxatin)、白蛋白结合紫杉醇(Abraxane)、卡培他滨(Xeloda)、顺铂、紫杉醇(Taxol)、多西他赛(Taxotere)和伊立替康脂质体(Onivyde)。在某些实施方式中，用于白血病的化学治疗剂包括但不限于长春新碱或脂质体长春新碱(Marqibo)、柔红霉素或道诺霉素(Cerubidine)、多柔比星(Adriamycin)、阿糖胞苷或胞嘧啶阿拉伯糖苷(ara-C)、(Cytosar-U)、L-天冬酰胺酶或PEG-L-天冬酰胺酶或天冬酰胺酶(Oncaspar)、6-巯基嘌呤(6-MP)(Purinethol)、甲氨蝶呤(Xatmep、Trexall、Otrexup、Rasuvo)、环磷酰胺(Cytoxan、Neosar)、泼尼松(Deltasone、Prednisone Intensol、Rayos)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec)和奈拉滨(Arranon)。在某些实施方案中，用于肺癌的化学治疗剂包括但不限于顺铂(Platinol)、卡铂(Paraplatin)、多西他赛(Taxotere)、吉西他滨(Gemzar)、紫杉醇(Taxol)、长春瑞滨(Navelbine)、培美曲塞(Alime)、白蛋白结合紫杉醇(Abraxane)、依托泊苷(VePesid或Etopophos)、多柔比星(Adriamycin)、异环磷酰胺(Ifex)、伊立替康(Camptosar)、紫杉醇(Taxol)、拓扑替康(Hycamtin)、长春碱(Oncovir)和长春新碱(Oncovin)。
在某些实施方式中，组合疗法导致癌症患者，尤其是转移性癌症患者的临床结果改进和/或存活率更高。在某些实施方式中，与单独施用的任何治疗相比，当以更低的剂量和/或短的时间段施用时，组合疗法实现了相同的治疗效果、更好的治疗效果或甚至协同效果。例如，当在组合治疗中使用RORγ抑制剂和化学治疗剂时，可以以比单独施用RORγ抑制剂或化学治疗剂更低的剂量施用其中之一或两者。在另一个示例中，当RORγ抑制剂和放射疗法用于组合治疗时，可以以更低的剂量施用其中之一或两者，或者与单独施用的RORγ抑制剂或化学治疗剂相比，放射疗法可以在更短的时间内施用。组合疗法的这一优势对临床结果具有显着影响，因为治疗引起的毒性、耐药性和/或其他不良副作用由于剂量减少和/或治疗期间缩短而降低。癌症治疗的一个障碍是许多癌症患者由于副作用的严重性而不得不停止治疗，有时甚至会导致并发症。
在某些实施方式中，多剂量的一种或多种RORγ抑制剂或包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物与其他癌症疗法的多剂量或多周期组合施用。在这些实施方式中，RORγ抑制剂和其他癌症疗法可以以任何期望的间隔同时或依次施用。在某些实施方式中，RORγ抑制剂和其他癌症疗法可以以交替周期施用，例如施用一剂或多剂在本文中公开的RORγ抑制剂，然后施用一剂或多剂化学治疗剂。
使用RORγ抑制剂的预防/治疗方法
在本文中提供了一种治疗和/或预防受试者的RORγ依赖性癌症的方法。该方法需要向受试者施用治疗有效量的在本文中提供的一种或多种RORγ抑制剂或包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物。在某些实施方式中，该方法还需要依次或同时向受试者施用一种或多种其他癌症疗法，诸如手术、免疫疗法、放射疗法和/或化学疗法。
在本文中还提供了一种在受试者中预防或延迟RORγ依赖性良性肿瘤向恶性肿瘤的进展的方法。该方法需要向受试者施用有效量的在本文中提供的一种或多种RORγ抑制剂或包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物。在某些实施方式中，该方法还需要依次或同时向受试者施用一种或多种其他疗法，诸如手术、免疫疗法、放射疗法和/或化学疗法。
如在本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物受试者，优选人类。“有需要的受试者”是指已被诊断患有癌症或患癌症风险较高的受试者。短语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
如在本文中所使用的，关于癌症的术语“治疗”是指部分或完全减轻癌症、预防癌症、降低癌症发生或复发的可能性、减缓癌症的进展或发展，或消除、减少或减缓与癌症相关联的一种或多种症状的发展。例如，“治疗”可以指防止或减缓现有肿瘤的生长变大，防止或减缓癌症的形成或转移，和/或减缓癌症的某些症状的发展。在一些实施方式中，术语“治疗”是指与未施用治疗的受试者相比，受试者的肿瘤数量或大小减少。在一些实施方式中，术语“治疗”是指接受在本文中公开的RORγ抑制剂或包括RORγ抑制剂的药物组合物和/或其他癌症疗法的受试者与未接受这种治疗的受试者相比，癌症的一种或多种症状得到缓解。
如在本文中所使用的，一种或多种RORγ抑制剂或包括一种或多种RORγ抑制剂的药物组合物的“治疗有效量”是在受试者中产生治疗和/或预防癌症的所需效果的RORγ抑制剂或药物组合物的量。在某些实施方式中，治疗有效量是产生最大治疗效果的RORγ抑制剂或药物组合物的量。在其他实施方式中，治疗有效量产生小于最大治疗效果的治疗效果。例如，治疗有效量可以是产生治疗效果同时避免与产生最大治疗效果的剂量相关联的一种或多种副作用的量。特定组合物的治疗有效量将基于多种因素而变化，包括但不限于治疗组合物的特性(例如，活性、药代动力学、药效学和生物有效性)、受试者的生理状况(例如，年龄、体重、性别、疾病类型和阶段、病史、一般身体状况、对给定剂量的反应和其他现有药物)、组合物中任何药学上可接受的载体、赋形剂和防腐剂的性质，以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对RORγ抑制剂或药物组合物的施用的反应并相应地调整剂量。有关其他引导，参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press，伦敦，2012年和Goodman&Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics，第12版，McGraw-Hill，New York，NY，2011，其全部公开内容以引用方式并入本文。
在一些实施方式中，在本文中公开的RORγ抑制剂的治疗有效量为约10mg/kg至约150mg/kg、30mg/kg至约120mg/kg、60mg/kg至约90mg/kg。在一些实施方式中，在本文中公开的RORγ抑制剂的治疗有效量为约15mg/kg、约30mg/kg、约45mg/kg、约60mg/kg、约75mg/kg、约90mg/kg、约105mg/kg、约120mg/kg、约135mg/kg或约150mg/kg。可以向受试者施用单剂量或多剂量的RORγ抑制剂。在一些实施方式中，RORγ抑制剂每天施用两次。
在本领域普通技术人员的能力范围内选择合适的施用途径，诸如口服施用、皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮内施用、鞘内施用或腹膜内施用。为了治疗有需要的受试者，RORγ抑制剂或药物组合物可连续或间歇施用，用于立即释放、控制释放或持续释放。此外，RORγ抑制剂或药物组合物可以每天三次、每天两次或每天一次施用，为期3天、5天、7天、10天、2周、3周或4周。在某些实施方式中，RORγ抑制剂或药物组合物可以每天、每隔一天或每三天施用。RORγ抑制剂或药物组合物可在预定时间段内施用。可选地，可以施用RORγ抑制剂或药物组合物直到达到特定的治疗基准。在某些实施方式中，在本文中提供的方法包括评估一个或多个治疗基准诸如生物样本诸如血液循环肿瘤细胞、活检样本或尿液中的RORγ水平以确定是否继续施用RORγ抑制剂或药物组合物的步骤。
药物组合物
在本文中公开的一种或多种RORγ抑制剂可以配制成药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物仅包括一种RORγ抑制剂。在一些实施方式中，药物组合物包括两种或更多种RORγ抑制剂。药物组合物还可以包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、防腐剂或其组合。“药学上可接受的载体或赋形剂”是指一种药学上可接受的材料、组合物或媒介物，其涉及将感兴趣的化合物从一个组织、器官或身体的一部分携带或运输到另一个组织、器官或身体的一部分。例如，载体或赋形剂可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，或其某种组合。载体或赋形剂的每个成分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它还必须适合与它可能遇到的任何组织、器官或身体的一部分接触，这意味着它不得具有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或任何其他过度超过其治疗益处的并发症的风险。
取决于在前述段落中公开的施用途径，药物组合物可具有各种制剂，例如可注射制剂、冻干制剂、液体制剂、口服制剂等。
在某些实施方式中，药物组合物可以进一步包括一种或多种另外的治疗剂，诸如一种或多种化学治疗剂或一种或多种放射治疗剂。可以将一种或多种另外的治疗剂配制成包括在本文中公开的RORγ抑制剂的相同药物组合物，或配制成用于组合疗法的单独药物组合物。根据癌症类型，可选择多种化学治疗剂与在本文中公开的一种或多种RORγ抑制剂或包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物组合使用。在某些实施方式中，用于胰腺癌的化学治疗剂包括但不限于吉西他滨(Gemzar)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康(Camptosar)、奥沙利铂(Eloxatin)、白蛋白结合紫杉醇(Abraxane)、卡培他滨(Xeloda)、顺铂、紫杉醇(Taxol)、多西他赛(Taxotere)和伊立替康脂质体(Onivyde)。在某些实施方式中，用于白血病的化学治疗剂包括但不限于长春新碱或脂质体长春新碱(Marqibo)、柔红霉素或道诺霉素(Cerubidine)、多柔比星(Adriamycin)、阿糖胞苷或胞嘧啶阿拉伯糖苷(ara-C)、(Cytosar-U)、L-天冬酰胺酶或PEG-L-天冬酰胺酶或天冬酰胺酶(Oncaspar)、6-巯基嘌呤(6-MP)(Purinethol)、甲氨蝶呤(Xatmep、Trexall、Otrexup、Rasuvo)、环磷酰胺(Cytoxan、Neosar)、泼尼松(Deltasone、Prednisone Intensol、Rayos)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec)和奈拉滨(Arranon)。在某些实施方案中，用于肺癌的化学治疗剂包括但不限于顺铂(Platinol)、卡铂(Paraplatin)、多西他赛(Taxotere)、吉西他滨(Gemzar)、紫杉醇(Taxol)、长春瑞滨(Navelbine)、培美曲塞(Alime)、白蛋白结合紫杉醇(Abraxane)、依托泊苷(VePesid或Etopophos)、多柔比星(Adriamycin)、异环磷酰胺(Ifex)、伊立替康(Camptosar)、紫杉醇(Taxol)、拓扑替康(Hycamtin)、长春碱(Oncovir)和长春新碱(Oncovin)。
以下示例旨在说明本发明的各种实施方式。因此，所讨论的特定实施方式或公开的任何特定材料和方法不应被解释为对本发明范围的限制。对本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下可以做出各种等同、改变和修改，并且应当理解，这些等同的实施方式将被包括在本文中。此外，在本公开中引用的所有参考文献通过引用其整体并入本文，就如同在本文中完全阐述一样。
实施例
实施例1：
该工作示例展示了在胰腺癌中涉及RORγ的通路的新识别和表征。该工作示例进一步展示了，使用RORγ抑制剂SR2211对RORγ进行药物阻断可在体外和在体内有效抑制胰腺癌的生长。总的来说，数据展示了RORγ通路提出了治疗癌症的新分子靶标，并可导致开发可用于癌症治疗的新种类疗法的发展。
A.胰腺癌细胞的转录组学和表观遗传图谱揭示了一种独特的干细胞状态
使用胰腺导管腺癌(PDAC)的KPf/fC小鼠模型显示，设计用于反映干细胞信号Musashi(Msi)表达的报告基因小鼠能够有效识别优先具有耐药性和肿瘤再生长的肿瘤细胞。此外，Msi2+肿瘤细胞在有限稀释测定中产生类器官的能力增加了209倍(图7A-图7B)。由于Msi+细胞优先富集肿瘤增殖和耐药性——癌症干细胞的经典限定特性，因此推测Msi报告基因可用作了解胰腺癌中这种侵袭性亚群的分子基础的工具。
为了绘制干细胞状态的功能图谱，结合使用了RNA-seq、ChIP-seq和全基因组CRISPR筛选。基于GFP和EpCAM表达从Msi2-报告基因(REM2)KPf/fC小鼠中分离胰腺癌细胞并通过RNA-seq分析(图1A)。主成分分析显示KPf/fC报告基因+肿瘤细胞在全局转录水平上与报告基因-肿瘤细胞明显不同，表明它们在功能上是由一组独特的程序驱动的，这些程序由超过一千个基因的差异表达限定(图1B-图1C)。关注富含干细胞的基因(lfdr<0.2)以了解可能在功能上维持干细胞表型的转录程序。基因集富集分析(GSEA)用于比较该PDAC干细胞转录组特征与其他细胞特征。这揭示了PDAC干细胞的转录状态与其他发育和干细胞状态密切相关，表明分子特征与其观察到的功能特质一致(图1D-图1E)。此外，PDAC干细胞的转录特征与细胞增殖特征呈负相关(图1F-图1G)，这与化学疗法后干细胞大部分处于静止状态而非干细胞继续循环的发现一致(图7C)。此外，干细胞的特征在于与肿瘤侵袭性相关联的代谢特征，包括增加的硫氨基酸代谢和增强的谷胱甘肽合成，这可以在放射和化学治疗后存活(图1H-图1I)。最后，PDAC干细胞转录组与乳腺癌、肝癌和结肠癌复发的特征具有惊人的相似性，这些程序可以是这些细胞在化学治疗后存活并且驱动肿瘤再生长的能力的基础(图1J-图1K)。
与通过转录组学分析在干细胞中发现的显着分子差异一致，H3赖氨酸-27乙酰化(H3K27ac，图1A、图8A)(一种与活性增强子相关联的组蛋白标记)的分布揭示了差异基因表达程序是由染色质水平的变化驱动的。因此，在干细胞或非干细胞中特异性富集H3K27ac的基因组区域与在每种细胞类型中基因表达增加的区域一致(图8B-图8E；干细胞的相关性：R2＝0.28，p＝7.1x10-14，非干细胞R2＝0.46，p＝22x10-16)。因为已经提出超级增强子是细胞身份的关键驱动因素，所以在干细胞和非干细胞中绘制了共有和特有的超级增强子(图1L-图1P)。这揭示了，并非所有的表观遗传变化在两个群之间都具有相同的不同：虽然大多数启动子和增强子相关联的H3K27ac标记在干细胞和非干肿瘤细胞中是共有的，只有不到5％是特有的，超级增强子相关联的H3K27ac标记更频繁地受到限制，所有超级增强子中有65％是每个群特有的，364个超级增强子是干细胞特有的，而388个超级增强子是非干细胞特有的。此外，干细胞群中的超级增强子由峰值强度和强度明显更高的峰清楚地划分(图1N)，而非干细胞中的超级增强子或者与干细胞共有H3K27Ac，或者仅略微比干细胞中的超级增强子更富集H3K27Ac(图1P)。这些数据表明，胰腺癌中的干细胞具有比非干细胞更明确的超级增强子景观，并提高了超级增强子及其上游转录调节因子可能是胰腺癌中干细胞身份的优先效应子的可能性。为了支持这一点，作为发育和干细胞状态基础的关键转录因子和程序，诸如Klf7、Foxp1、Hmga1、Meis2、Tead4、Wnt7b和Msi2，与KPf/fC干细胞中的超级增强子相关联(图1L，图1N)。
B.基因组规模的CRISPR筛选识别胰腺癌的核心功能程序
在一些实施方式中，进行全基因组CRISPR筛选以限定转录和表观遗传分析揭示的哪些程序表示干细胞的真正功能依赖性。原代细胞培养物高度富集来自Msi报告基因-KPf/ fC小鼠的干细胞(图9A)，并用小鼠GeCKO CRISPRv2 sgRNA库(图2A)转导它们。该筛选被设计为多重筛选以识别常规二维培养物以及选择性允许干细胞生长的3维球体培养物中所需的基因(图2A)。筛选显示了明确的选择证据，在常规培养物中耗尽了807个基因(因此是必需的)(图2B-图2C，p<0.005)，以及在干细胞条件下的另外178个基因(图2B，图2D，p<0.005)。重要的是，筛选显示传统培养物中致癌基因的缺失和肿瘤抑制因子的富集(图2C，图9B)，以及干细胞条件下干细胞信号的缺失和干细胞信号负调节因子的获得(图2D，图9C)。
转录组学和基于CRISPR的功能基因组数据的计算整合是使用类似于以前开发的网络传播方法进行的。首先，在网络中接种优先富集在干细胞RNAseq logFC>2中的基因，并且在CRISPR测定中的3维球体培养中也被识别为干细胞生长所必需的FDR<0.5(图2E)。然后，基于已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用，使用网络传播，使用小鼠STRING相互作用组确定最接近接种的基因。来自RNAseq数据的RNA表达中的倍数变化叠加到生成的子网络上。随后基于基因之间的高度互连性将网络聚类为功能性群落，并且对每个群落进行基因集过度表示分析；该分析识别了围绕不同生物通路构建的七个子网络，从而提供了可能参与驱动胰腺癌生长的“核心程序”的更高层次的视图。这些核心程序将干细胞和多能性通路、发育和蛋白酶体信号、脂质代谢/核受体、细胞粘附/细胞基质/细胞迁移和免疫调节信号识别为干细胞状态不可或缺的通路(图2E、图2F)。
C.劫持免疫调节程序作为胰腺癌细胞的直接调节因子
最终，这种映射的强大之处在于能够提供新依赖性的系统级视图。因此，在一些实施方式中，网络图谱被用作框架以基于转录组学、表观基因组学和CRISPR功能基因组分析来选择整合基因组(表1)。随后经由将病毒shRNA递送到KPf/fC细胞来抑制选择的基因，并通过在体外干细胞球体测定或通过跟踪在体内肿瘤生长来评估对胰腺癌增殖的影响。例如，虽然已知多能性和发育核心程序中的许多基因在胰腺癌中很重要(例如，Wnt、Hedgehog和Hippo通路的元件)，但其他基因尚未被探索，并提出了新的发现机会(图3A、图3M、图10A)和调查作为新目标(表2)。此外，发现新的代谢因子诸如Sptssb(鞘脂代谢的关键因素)和Lpin2(一种参与促炎极低密度脂蛋白生成的酶)是关键的新干细胞依赖性，这涉及将脂质代谢作为对照的关键点(图3B、图3M)。综合分析还识别了在胰腺癌中具有广泛调节模式的新基因家族：因此在粘附/细胞基质核心程序(图3C-图3M，图10B)中，孤儿粘附G蛋白偶联受体的多个EGF重复(MEGF)亚家族的数个成员(12个中的8个优先在干细胞中表达，图3E)诸如Celsr1、Celsr2(图11A，图11B)，以及Pear1/Jedi作为胰腺癌增殖的新调节因子出现，因为它们的抑制(图12A)在体外和在体内强力阻断癌症增殖(图3F至图3M，独立的重复显示在图13A至图13C中)，由细胞死亡的增加和Msi+干细胞含量的减少驱动(图3J，图3K)。
这张图谱的一个意外发现是将免疫通路/细胞因子信号识别为核心程序。与此一致，对RNA-seq和ChIP-seq分析的回顾性分析揭示了，多种免疫调节细胞因子受体及其相关配体在肿瘤上皮细胞中表达，包括干细胞和非干细胞(图3N)。这是特别令人感兴趣的，因为与该程序相关联的许多基因，诸如白介素10(IL-10)、白介素34(IL-34)和菌落刺激因子1受体(CSF1R)，主要在肿瘤微环境的背景下进行了研究，但尚未报告由胰腺上皮细胞直接产生或在功能上影响胰腺上皮细胞。为了更明确地识别这些细胞因子和细胞因子受体是否在上皮细胞中表达，从KPR172H/+C肿瘤细胞(一种独立的胰腺癌模型)中进行了单细胞RNA-seq。这证实了上皮肿瘤细胞中IL10Rβ、IL34和Csf1R的存在(图3O，图10C)。此外，共表达分析揭示了IL10Rβ、IL34和Csf1R在以Msi2表达为标志的KPR172H/+C干细胞中表达(图3P，图3Q)。ShRNA介导的对IL10Rβ和CSF1R的抑制导致球体形成能力的显着缺失(图3R)，并削弱在体内肿瘤的生长和增殖(图3S，图3T，图3W，独立复制如图13D，图13E所示)。IL10Rβ和CSF1R的抑制可能通过触发细胞死亡(图14)和减少Msi+干细胞(图3V)来影响肿瘤生长和增殖。shRNA介导的配体IL10和IL34的抑制具有类似的影响的事实表明配体依赖性活性(图3U)。与此一致，IL-10、CSF和IL-34由上皮细胞表达(图15)，尽管在体内可能存在这些配体的其他来源。总的来说，这些发现展示了胰腺癌干细胞对炎症介体的有趣的正交的共同选择，并且表明调节细胞因子网络的药剂可以直接影响它们在胰腺癌增殖中的功能。
D.RORγ，T细胞命运的介体，是胰腺癌的关键依赖性
在一些实施方式中，为了理解如何控制在上文定义的基因网络，转录因子受到关注，因为它们在调节对细胞命运和身份至关重要的广泛等级程序方面发挥了强大作用。在图谱中识别的53种转录因子中，发现12种通过转录组学和表观遗传学参数在干细胞中富集(图16A)，并且包括了数种已知促进肿瘤发生的先驱因子，诸如Sox9和Foxa2。在胰腺癌中没有已知作用的转录因子(Arntl2、Nr1d1和RORγ)中，只有RORγ可能对可用的临床级拮抗剂起作用。重要的是，在分子水平上，基序富集分析揭示了RORγ位点优先富集在干细胞中相对于非干细胞唯一开放的染色质区域中(p＝0.0087，图16B)和对应于干细胞中高基因表达的开放染色质区域中(p＝0.0032，图16B)。这些发现与RORγ可能在控制基因表达程序中很重要的可能性一致，这些基因表达程序对于定义胰腺癌中的干细胞状态很重要。
RORγ是一种未预料的依赖性，因为它是一种核激素受体，主要在Th17细胞分化的以及昼夜节律的背景下的脂质和葡萄糖代谢的背景下进行研究。与此一致，它映射到被劫持的细胞因子信号/免疫子网络和核受体/代谢子网络(图2E，图2F)。RORγ表达在正常鼠胰腺中较低，但在KPf/fC肿瘤中增加；在原代上皮细胞中，RORγ在干细胞群中富集，并在非干细胞中在RNA和蛋白质水平上均以低水平表达(图4A，图11C)，并通过单细胞RNA Seq分析在EpCAM+Msi+细胞中表达(图4B)。通过免疫组织化学(图4C)，RORγ还在KPR172H/+C肿瘤细胞中表达，表明它不限于一种特定的胰腺癌模型。重要的是，小鼠模型中的RORγ表达可预测在人胰腺癌中的表达。因此，虽然正常人胰腺和胰腺炎中RORγ表达较低，但其表达在疾病进展的上皮肿瘤细胞中显着增加(图4D-图4F，图16C)。功能性shRNA介导的敲低(图12B)证实了由基于CRISPR的遗传筛选识别的RORγ的作用，因为它导致KPR172H/+C和KPf/fC细胞中的干细胞球体形成减少(图4G-图4H)。RORγ敲低导致细胞死亡(膜联蛋白)和增殖(BrDU)增加3倍，随后Msi报告基因KPf/fC球体中Msi+干细胞减少5倍(图4I-图4K)。重要的是，缺乏RORγ的KPf/fC肿瘤细胞在体内肿瘤开始和增殖方面表现出显着缺陷，最终肿瘤体积减少11倍(图4L，图13F中显示的独立重复)。为了测试调节RORγ的通路在胰腺癌中是否重要，在KPf/fC细胞中删除了IL1R1，这导致RORγ表达降低50％(图17)。这表明在胰腺癌细胞中调节RORγ的机制可以至少部分与在Th17细胞中调节RORγ的机制相同。
为了定义胰腺癌细胞中RORγ对照的转录程序，使用ChIP-seq和RNA-seq的组合来绘制由RORγ缺失触发的分子变化。RORγ的缺失导致对驱动癌症生长至关重要的转录程序中的广泛修改，包括干细胞信号诸如Wnt、BMP和Fox(图4M)，以及与肿瘤发生有关的信号诸如Hmga2(图4N)。有趣的是，该转录分析表明，在缺乏RORγ的细胞中，28％的干细胞超级增强子相关基因被下调(图4O)。与此一致，活性染色质区域的ChIP-seq分析识别了RORγ结合位点不成比例地存在于干细胞超级增强子中(图4P)。由RORγ调节的其他超级增强子相关联干细胞基因包括Msi2、Klf7和Ehf(图4Q-图4R)，它们是可控制细胞命运的强力致癌信号。从机制上讲，RORγ的缺失并未显着地影响两个独立的KPf/fC来源的系中的干细胞超级增强子景观(图18)，这表明它可能反而结合预先存在的景观以优先影响转录变化。这些数据共同表明，RORγ是由胰腺癌干细胞中的超级增强子控制的强大致癌效应网络的上游调节因子。
RORγ是胰腺癌的关键依赖性这一发现很重要，因为已经开发出多种抑制剂来靶向自身免疫性疾病中的这一通路。使用反向激动剂SR2211对RORγ的药理学阻断减少了KPf /fC和KPR172H/+C细胞中球体和类器官的形成(图5A-图5D)。为了评估在体内抑制剂的影响，将SR2211单独或与吉西他滨组合递送至携带来源自KPf/fC细胞的已建立侧腹肿瘤的免疫活性小鼠(图5E，图19A)。SR2211作为单一药剂显着降低了KPf/fC来源的侧腹肿瘤的生长(图5F-图5G)。重要的是，虽然吉西他滨单独对癌症干细胞负荷没有影响，但SR2211单独触发CD133+和Msi+细胞中3倍的损耗，与吉西他滨结合导致CD133+11倍的损耗和Msi2+细胞6倍的损耗(图5H，图5I)。这表明SR2211可根除化学疗法耐药细胞的可能性(图5H，图5I)。最后，为了评估对存活率的任何影响，将RORγ抑制剂递送到原地形成的、荷瘤KPf/fC小鼠中；虽然在开始治疗后25天，媒介物治疗的小鼠均未存活，但此时接受SR2211的小鼠中有75％仍然存活，即使在治疗开始后45天，仍有50％小鼠存活。此外，媒介物治疗小鼠的中位存活期为18天，SR2211治疗小鼠的中位存活期为38.5天；SR2211还导致死亡风险降低6倍(图5J，危险比＝0.16)。Hmga2最初从RNA-Seq识别为下游靶标，在体内递送SR2211后在胰腺上皮细胞中下调，表明至少在治疗方案的中点进行有效靶标接合；然而，在来自终末期小鼠的肿瘤中，Hmga2表达与对照肿瘤中的类似，表明靶标接合的潜在缺失或补偿通路的激活(图20)。总的来说，这些数据显示胰腺癌干细胞高度依赖RORγ表达，并表明其抑制性可以导致疾病控制的显着改进。此外，当与吉西他滨组合使用时，它对肿瘤负荷的影响被放大了几倍，这一事实表明它可以与化学疗法协同作用，以更有效地控制通常疗法难治的肿瘤。
为了可视化RORγ阻断是否通过靶向干细胞影响肿瘤进展，将SR2211递送到患有晚期原地形成肿瘤的REM2-KPf/fC小鼠中，随后经由实时成像跟踪反应。在媒介物治疗的小鼠中，基于通过Msi报告基因驱动的GFP表达，可以容易地在整个肿瘤中识别大干细胞簇(图5K-图5L)。SR2211在治疗1周内导致大多数大干细胞簇的显着损耗(图5K-图5L)，在周围组织中没有观察到坏死增加。这为在体内RORγ信号抑制的影响提供了独特的时空视图，并且表明了干细胞损耗是RORγ阻断的早期结果。
由于在免疫活性小鼠或在体内患者中使用抑制剂治疗可能对癌细胞和免疫细胞(诸如Th17细胞)产生影响，因此在免疫功能低下的小鼠中测试了SR2211的效果。如在图5M-图5N中所示，SR2211在免疫缺陷背景下显着影响KPf/fC肿瘤的生长，表明炎性T细胞对其影响不是必需的。为了测试在免疫活性设定中RORγ抑制是否可以通过影响Th17细胞来减缓肿瘤生长，生成了嵌合小鼠。移植到野生型或RORγ缺失受体中的野生型肿瘤同等生长(图5O-图5P)，表明仅在免疫细胞和微环境(如敲除受体中)RORγ的缺失对肿瘤生长没有可检测的影响。最后，将SR2211递送到这些嵌合小鼠中以测试RORγ拮抗剂是否经由Th17细胞影响肿瘤生长，并且SR2211对肿瘤生长、细胞结构和干细胞含量的影响在嵌合野生型和RORγ受体小鼠中是相同的。这些数据共同表明，大多数观察到的RORγ抑制作用是肿瘤细胞特异性的，而不是经由环境/Th17对RORγ的依赖性(图5Q-图5W)；作为对照，发现RORγ缺失确实导致如预测的CD8、CD4和Th17细胞减少(图5X，图21)。SR2211对肿瘤内非肿瘤细胞诸如CD45+、T细胞、CD31+、MDSC、巨噬细胞和树突状细胞结构未检测到显着影响，包括在第7天时(图22)。
为了进一步探索RORγ与人胰腺癌的功能相关性，RORγ在人PDAC细胞中受到遗传和药理抑制剂的抑制。使用5个独立引导的基于CRISPR的RORγ破坏导致菌落形成缺失约3至9倍(图6A)。为了测试RORγ抑制是否可以在体内阻断人肿瘤生长，将人PDAC细胞移植到免疫功能低下的小鼠的侧腹区域，并在治疗开始前让肿瘤变得可触及(图6B)。与媒介物治疗相比，SR2211递送非常有效并且肿瘤生长基本消失，在接受SR2211的小鼠中生长减少近6倍(图6C)。原代患者来源的类器官也对RORγ阻断极为敏感，SR2211治疗后总的类器官体积减少了约300倍(图6D-图6E，甲基纤维素中的照片如图19B所示)。重要的是，在原代患者来源的异种移植物中递送SR2211导致在体内肿瘤生长显着减少(图6F)。有趣的是，人FG和KPC细胞的RNA-seq和基因本体分析识别了一组细胞因子/生长因子作为关键的常见RORγ驱动程序；例如Semaphorin 3c、其受体Neuropilin2、制瘤素M和血管生成素，所有携带RORγ结合基序的高度促肿瘤因子都被识别为小鼠和人胰腺癌细胞中RORγ的共有靶标(图23)。这些数据尤为令人兴奋，因为对胰腺癌患者的分析揭示了约12％的胰腺癌患者中RORC的基因组扩增的事实(图6G)，这提出了一个有趣的可能性即RORC扩增可作为对RORC抑制特别敏感的患者的生物标志物。
最后，为了确定RORγ的表达是否可作为特定临床病理学特征的预后，对来自116名PDAC患者的临床注释回顾性队列的组织微阵列进行了RORγ免疫组织化学(表3)。对于69名患者，匹配的胰腺上皮内瘤变(PanIN)病变可用。分别在113个PDAC病例和55个PanIN病例中可检测到RORγ蛋白(仅细胞质表达/低或细胞质和核表达/高，图6H)，并且分别在3个PDAC病例和14个PanIN病例中不存在。与仅细胞质表达相比，PDAC病例中的核RORγ表达与诊断时较高的病理肿瘤(pT)阶段显着相关(图6I)。此外，PanIN病变中的RORγ表达与浸润性癌的淋巴管浸润(L1，图6J)和淋巴结转移(pN1，pN2，图6K)呈正相关。然而，没有观察到RORγ表达与总生存或无病生存之间的显着相关性，尽管潜在的治疗差异可能会混淆对此类模式的分析。这些结果表明PanIN病变中的RORγ表达和浸润性癌中的核RORγ定位可能是预测PDAC侵袭性的有用标志物。
胰腺癌患者对细胞毒性治疗有反应后最常见的结果不是治愈，而是由富集耐药性干细胞的群驱动的最终疾病进展和死亡。当前公开的技术允许人们通过整合胰腺癌干细胞的表观遗传、转录组学和功能基因组景观来开发胰腺癌干细胞的核心依赖性的综合分子图谱。因此，这些数据为了解治疗耐药性和复发，以及为发现胰腺癌的新弱点提供了新的资源。例如，MEGF孤儿受体家族表示了一个潜在的可操作的粘附GPCR家族，因为此类信号受体已被认为可靶向癌症和其他疾病。重要的是，目前公开的表观遗传分析揭示了超级增强子相关联基因与干细胞条件下的功能依赖性之间的显着关系；与非干细胞中的超级增强子相关联基因相比，干细胞特有的超级增强子相关联基因在干细胞条件下的CRISPR筛选中更有可能脱落(图19C)。这为癌症干细胞功能依赖性的表观遗传和转录组学链接提供了另外的证据，并进一步支持了先前的发现，即超级增强子相关基因可能对维持细胞状态更重要，对扰动更敏感。
目前公开的筛选识别了KPf/fC干细胞对炎症和免疫介体的意外依赖性，诸如CSF1R/IL-34轴和IL-10R信号传导。虽然以前认为这些主要作用于微环境中的免疫细胞，但此处提供的数据表明，干细胞可能已经进化到可以选择这种富集细胞因子的环境，使它们能够抵抗基于免疫的有效消除。这些发现还表明，正在研究胰腺癌的靶向CSF1R的药剂不仅可以作用于肿瘤微环境，还可以直接作用于胰腺上皮细胞本身。这些数据还提出了一种可能性，即设计为激活免疫系统以攻击肿瘤的疗法可以直接对肿瘤细胞产生影响：正如化学疗法可以杀死肿瘤细胞但也可能削弱免疫系统一样，设计为激活免疫系统的疗法诸如IL-10也可能促进肿瘤细胞的生长。需要考虑这种作用的二分法，以便更好地优化免疫调节治疗策略。
由网络图谱驱动的一项重大新发现是将RORγ识别为胰腺癌中被劫持的关键免疫调节通路。这与RORγ在前列腺癌模型中的影响一起表明，该通路可以不仅限于胰腺癌，而且可以更广泛地用于其他上皮癌。有趣的是，虽然如IL17、IL21、IL22和CSF2等细胞因子是Th17细胞中RORγ的已知靶标，但在RORc缺陷的胰腺肿瘤细胞中，这些细胞因子均未下调。RORγ调节以干细胞中超级增强子为标志的强癌基因这一事实表明，它可能对定义胰腺癌中的干细胞状态至关重要。此外，受RORγ抑制影响的基因网络包括其他免疫调节剂，诸如CD47，这增加了它也可能介导与周围生态位和免疫系统细胞相互作用的可能性。最后，这项工作的一个特别令人兴奋之处是RORγ表示胰腺癌的潜在治疗靶标的可能性。鉴于RORγ抑制剂目前正处于自身免疫性疾病的II期试验中，将这些药剂重新定位为胰腺癌疗法值得进一步研究。
E.实验模型、受试者和方法细节
小鼠
REM2(Msi2eGFP/+)报告基因小鼠的产生如前所述(Fox等人，2016)；在实验中使用的所有报告基因小鼠都是Msi2等位基因的杂合子。LSL-KrasG12D小鼠、B6.129S4-Krastm4Tyj/J(库存编号：008179)、p53flox/flox小鼠、B6.129P2-Trp53tm1Brn/J(库存编号：008462)和RORγ基因敲除小鼠(库存号：007571)购自The Jackson Laboratory。Chris right博士提供了Ptf1a-Cre小鼠，如前所述(Kawaguchi等人，2002)。LSL-R172H突变体p53、Trp53R172H小鼠由Tyler Jacks博士提供，如前所述(Olive等人，2004)(JAX库存编号：008183)。上面列出的小鼠具有免疫活性，但已知缺乏TH17 T细胞的RORγ基因敲除小鼠除外，如前所述(Ivanov等人，2006)；这些小鼠在纳入如下面概述的侧腹移植和药物研究时，用抗生素水(磺胺甲恶唑和甲氧苄啶)维持。从杰克逊实验室购买的免疫受损NOD/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/J，库存编号：001303)和NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wji/SzJ，库存编号：005557)小鼠。所有小鼠均不含特定病原体，并在加州大学圣地亚哥分校的动物护理设施中繁殖和饲养。动物可以随意获取食物和水，并在控制温度和湿度下以12小时的明暗循环圈养在通风的笼子中。所有动物实验均根据加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用机构委员会批准的协议进行。在所有小鼠模型中均未发现性别二态性。因此，每个品系的雄性和雌性同样用于实验目的，并且在所有数据集中两种性别都有代表。纳入实验研究的所有小鼠均未接受治疗，并且之前未纳入任何其他实验研究。
REM2-KPf/fC和WT-KPf/fC小鼠(REM2；LSL-KrasG12D/+；Trp53f/f；Ptf1a-Cre和LSL-KrasG12D/+；Trp53f/f；Ptf1a-Cre分别)用于分离肿瘤细胞，建立原代小鼠肿瘤细胞和类器官系，以及如下所述的本土药物研究。REM2-KPf/fC和KPf/fC小鼠在8至11周龄期间纳入药物研究，并在它们在10至12周龄之间达到疾病终末期时用于肿瘤细胞分选和细胞系的建立。REM2-KPf/fC小鼠用于在9.5-10.5周龄之间的在体内成像研究。当KPR172HC(LSL-KrasG12D/+；rp53R172h/+；tf1a-Cre)鼠在16-20周龄之间达到疾病终末期时，它们被用于细胞分选和肿瘤细胞系的建立。在一些研究中，KPf/fC来源的肿瘤细胞被移植到在5-8周龄之间具有免疫活性的同窝小鼠的侧腹。同窝小鼠受体(WT或REM2-LSL-KrasG12D/+；Trp53f/f或Trp53f/f小鼠)不发展疾病或表达Cre.NOD/SCID，而NSG小鼠纳入了在5至8周龄之间的侧腹移植研究；KPf/fC来源细胞系和人FG细胞被皮下移植用于NOD/SCID受体中的肿瘤增殖研究，并且患者来源的异种移植物和KPf/fC来源细胞系被皮下移植到NSG受体中，如下文详细描述。
人和小鼠胰腺癌细胞系
小鼠原代胰腺癌细胞系和类器官是从终末期、未治疗的KPR172HC和WT-和REM2-KPf/ fC小鼠建立的，如下：来自终点小鼠的肿瘤(KPf/fC小鼠为10-12周龄，KPR172HC小鼠为16-20周龄)被分离并解离成单细胞悬液，如下所述。然后将细胞培养在下面详述的3D球体或类器官培养条件中，或者在含有10％FBS、1x pen/strep和1x非必需氨基酸的1x DMEM中进行2D培养。在2D中的第一次传代时，收集细胞并重悬在含有2.5％FBS和2mM EDTA的HBSS(Gibco，Life Technologies)中，然后用FC块染色，然后用0.2μg/106细胞抗EpCAM APC(eBioscience)染色。对EpCAM+肿瘤细胞进行分选，然后重新培养至少一次另外的传代。为了评估任何细胞污染并验证这些细胞系的上皮性质，在第二次传代时再次通过流式细胞术分析细胞的血细胞标记物(CD45-PeCy7，eBioscience)、内皮细胞(CD31-PE、eBioscience)和纤维母细胞(PDGFR-PacBlue，Biolegend)。细胞系同样地来源自雌性和雄性KPR172HC以及WT-和REM2-KPf/fC小鼠；在下文概述的基于细胞的研究中，两种性别被同样地代表。使用第2传代和第6传代之间的细胞系进行功能研究。人FG细胞最初来源于PDAC转移，并且先前已得到验证和描述(Morgan等人，1980)。患者来源的异种移植细胞和类器官来源自最初同意(现已死亡)的PDAC患者，其使用已获得UCSD的IRB批准；细胞被去识别化，因此没有关于患者状态、治疗或其他方面的进一步信息。FG细胞系在含有10％FBS、1xpen/strep(Gibco，LifeTechnologies)和1x非必需氨基酸(Gibco，Life Technologies)的1x DMEM(Gibco，LifeTechnologies)中的2D条件下培养。所有细胞和类器官的3D在体外培养条件如下所述。
PDAC组织微阵列的患者队列
用于RORγ免疫组织化学染色和分析的PDAC患者队列和相应的TMA先前已有报道(Wartenberg等人，2018)。在表3中详细说明了患者特征。简言之，共构建了4个核心尺寸为0.6mm的TMA：三个用于PDAC的TMA，样本来自肿瘤中心和侵袭前沿(每位患者的平均斑点数：10.5，范围：2-27)和一个用于匹配PanIN的TMA(每位患者的平均斑点数：3.7，范围：1-6)。包括来自116名诊断为PDAC的患者(53名女性和63名男性；平均年龄：64.1岁，范围：34-84岁)的肿瘤样本。匹配的PanIN样本可用于69名患者。其中99名患者接受了某种形式的化学治疗；14人接受放射治疗。在评估的任何参数中均未观察到性别二态性，包括总存活期(p＝0.227)、无病间隔期(p＝0.3489)或PDAC(p＝0.9284)或PanINs(p＝0.3579)中的RORγ表达。TMA的创建和使用得到了希腊雅典大学和瑞士伯尔尼大学伦理委员会的审查和批准，并获得了患者或其在世亲属的书面知情同意。
组织解离、细胞分离和FACS分析
小鼠胰腺肿瘤在MEM(Gibco，Life Technologies)中洗涤并在切除后立即切成1-2mm的块。将肿瘤碎片收集到含有10ml Gey's平衡盐溶液(Sigma)、5mg胶原酶P(Roche)、2mgPronase(Roche)和0.2μgDNAse I(Roche)的50ml Falcon管中。样本在37℃孵育20分钟，然后上下吸移10次并返回至37℃。再过15分钟后，将样本上下吸移5次，然后通过100μm尼龙网(Corning)。使用RBC裂解缓冲剂(eBioscience)裂解红细胞，洗涤剩余的肿瘤细胞，然后重悬在含有2.5％FBS和2mM EDTA的HBSS(Gibco,Life Technologies)中，用于染色、FACS分析和细胞分选。在FACSAria III机器(Becton Dickinson)上进行分析和细胞分选，并用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。为了通过流式细胞术分析细胞表面标志物，将5x105细胞重悬在含有2.5％FBS和2mM EDTA的HBSS中，然后用FC块染色，然后用0.5μl每种抗体染色。对于细胞内染色，使用BrdU流式细胞术试剂盒(BD Biosciences)固定和透化细胞；Annexin V细胞凋亡试剂盒用于分析凋亡细胞(eBioscience)。使用以下大鼠抗体：抗小鼠EpCAM-APC(eBioscience)、抗小鼠CD133-PE(eBioscience)、抗小鼠CD45-PE和PE/Cy7(eBioscience)、抗小鼠CD31-PE(BD Bioscience)、抗小鼠Gr-1-FITC(eBioscience)、抗小鼠F4/80-PE(Invitrogen)、抗小鼠CD11b-APC(Affymetrix)、抗小鼠CD11c-BV421(Biolegend)、抗小鼠CD4-FITC(eBioscience)和CD4-Pacific blue(Bioglegend)、抗小鼠CD8-PE(eBioscience)、抗小鼠IL-17-APC(Biolegend)、抗小鼠BrdU-APC(BD Biosciences)和抗-小鼠膜联蛋白-V-APC(eBioscience)。碘化丙啶(Life Technologies)用于染色死细胞。
在体外生长测定
下面描述的是用于胰腺癌细胞的不同生长测定。菌落形成是在基质胶(因此粘附/半粘附条件下)中的检测，而肿瘤球体形成是在非粘附条件下的测定。来自不同来源的细胞类型在不同条件下生长得更好。例如，鼠KPR172H/+C和人FG细胞系在基质胶中生长得更好，而KPf/fC细胞系通常在非粘附的球形条件下生长良好(尽管它们也可以在基质胶中生长)。
胰腺肿瘤球体形成测定
胰腺肿瘤球体形成测定是根据(Rovira等人，2010)进行和修改的。简而言之，用含有shRNA的慢病毒颗粒感染低传代(<6代)WT或REM2-KPf/fC细胞系；转导后72小时分选阳性感染(红色)细胞。将100-300个感染细胞悬浮在肿瘤球培养基中：100μl DMEM F-12(Gibco，Life Technologies)，含有1x B-27补充剂(Gibco，Life Technologies)、3％FBS、100μM B-巯基乙醇(Gibco，Life Technologies)、1x非必需氨基酸(Gibco，Life Technologies)、1xN2补充剂(Gibco，Life Technologies)、20ng/ml EGF(Gibco，Life Technologies)、20ng/ml bFGF2(Gibco，Life Technologies)，和10ng/ml ESGRO mLIF(Thermo Fisher)。将培养基中的细胞培养在96孔超低粘附培养板(Costar)中，并在37℃孵育7天。KPf/fC在体外肿瘤球体形成研究在n＝3孔的两个独立shRNA中每个细胞系至少有n＝3个独立孔进行；然而，这些实验中的大多数是在>1个独立来源的细胞系中另外完成的，n＝3，每个shRNA的n＝3孔。
基质胶菌落测定
对于FG和KPR172H/+C细胞，如下所述将300-500个细胞重悬在50μl肿瘤球培养基中，然后与Matrigel(BD Biosciences，354230)以1:1的比例混合并培养于96孔超低粘附培养板(Costar)。在37℃孵育5分钟后，将50μl肿瘤球培养基置于基质胶层上。7天后计数菌落。对于RORγ抑制剂研究，将SR2211或媒介物添加到肿瘤球培养基中的细胞中，然后与Matrigel 1:1混合并培养。也将SR2211或媒介物添加到置于固化的基质胶层上的培养基中。对于FG菌落形成，n＝5个独立孔，跨越5个独立的CRISPR sgRNA和两个独立的非靶向gRNA。KPR172H/+C细胞以来自一种细胞系的每个shRNA的n＝3孔培养。
类器官培养物检测
如上所述，收获来自10-12周龄终末期REM2-KPf/fC小鼠的肿瘤并将其解离成单细胞悬液。肿瘤细胞先用FC块染色，然后用0.2μg/106个细胞抗-EpCAM APC(eBioscience)染色。对Msi2+/EpCAM+(干细胞)和Msi2-/EpCAM+(非干细胞)细胞进行分选，重悬于20μlMatrigel(BD Biosciences，354230)中。对于有限稀释测定，将单个细胞以20,000至10个细胞/20μL的指定数量重悬在基质胶中，并以圆顶状培养在预热的48孔培养基中。在37℃孵育5分钟后，用300μl PancreaCult类器官生长培养基(Stemcell Technologies)覆盖圆顶。6天后对类器官进行成像和量化。使用基于网络的极限有限稀释分析(ELDA)软件(Hu andSmyth,2009)进行干细胞特性评估的有限稀释分析。Msi2+/EpCAM+(干细胞)和Msi2-/EpCAM+(非干细胞)类器官来源自n＝3独立小鼠，并以指定的细胞数培养。
来自REM2-KPf/fC的类器官如先前所述以～1:2传代(Boj等人，2015)。简而言之，使用细胞回收溶液(Corning 354253)分离类器官，然后使用Accumax细胞分离溶液(Innovative Cell Technologies AM105)进行解离，并培养在预热的48孔培养基上的20μl基质胶(BD Biosciences,354230)圆顶中。在37℃孵育5分钟后，用300μl PancreaCult类器官生长培养基(Stemcell Technologies)覆盖圆顶。将SR2211(Cayman Chemicals 11972)以20mg/ml的浓度重悬在DMSO中，在含有0.2％乙酸的0.9％NaCl中按1:10稀释，并在PancreaCult类器官培养基(Stemcell Technologies)中进一步稀释至指定的稀释度。类器官在存在媒介物或SR2211的情况下生长4天，然后成像和量化，每个治疗组每剂量培养n＝3个独立孔。
原代患者类器官由Andrew Lowy博士建立并提供。简而言之，患者来源的异种移植物在37℃在含有2.5％FBS、5mg/ml胶原酶II和1.25mg/ml Dispase II的RPMI中消化1小时，然后通过70μM网状过滤器。细胞以每50μl基质胶1.5x 105个细胞的密度培养。圆顶固化后，如下添加生长培养基：RPMI含有50％Wnt3a条件培养基、10％R-Spondin1-条件培养基、2.5％FBS、50ng/ml EGF、5mg/ml胰岛素、12.5ng/ml氢化可的松的，以及14μM Rho激酶抑制剂。建立后，类器官如先前所述进行传代和维持(Boj等人，2015)。简而言之，使用细胞回收溶液(Corning 354253)分离类器官，然后用TrypLE Express(ThermoFisher 12604)解离成单细胞悬液，并补充以25μg/ml DNase I(Roche)和14μM Rho激酶抑制剂(Y-27632，Sigma)。细胞以1:2的比例分成20μl圆顶，培养在预热的48孔培养基上。圆顶在37℃孵育5分钟，然后用不含Wnt3a条件培养基的人类完整类器官喂养培养基(Boj等人，2015)覆盖。SR2211按上述方法制备，按指定剂量添加，每3天更新一次。类器官在存在媒介物或SR2211的情况下生长7天，然后成像和量化，每个治疗组每剂量培养n＝3个独立孔。所有图像均在ZeissAxiovert 40CFL上获取。使用ImageJ 1.51s软件对类器官进行计数和测量。
侧腹肿瘤移植研究
对于下面概述的侧腹移植研究，研究人员在可能的情况下对每个肿瘤的指定治疗组进行盲法分析；完成流式细胞术分析后，对小鼠进行去识别化。每项研究移植的肿瘤数量基于过去此类研究的经验，其中数量为10只的组足以确定当调节信号受到干扰时胰腺癌的生长是否受到显着影响(参见Fox等人，2016)。
对于在体内shRNA感染的胰腺肿瘤细胞增殖，细胞用含有shRNA的慢病毒颗粒感染，并在转导后72小时分选阳性感染(红色)细胞。将1000个低传代、shRNA感染的KPf/fC或2x105个shRNA感染的FG细胞重悬在50μl培养基中，然后与基质胶(BD Biosciences)1:1混合。将细胞皮下注射到5-8周龄的NOD/SCID受体小鼠的左侧腹或右侧腹。皮下肿瘤尺寸用卡尺每周1-2x测量，持续6-8周，并对每个shRNA进行两次独立的移植实验，每组n＝4个独立肿瘤。
对于药物治疗的KPf/fC侧腹肿瘤，将2x104低传代REM2-KPf/fC肿瘤细胞重悬在50μl培养基中，然后与基质胶(BD Biosciences)1:1混合。将细胞皮下注射到5-8周龄的无肿瘤、免疫活性同窝小鼠或NSG小鼠的左侧腹或右侧腹。每周两次监测肿瘤生长；当肿瘤达到0.1-0.3cm3时，将小鼠随机纳入治疗组并如下所述治疗3周。治疗3周后，取出肿瘤、称重、解离并通过流式细胞术进行分析。使用标准修正椭球公式1/2(长x宽2)计算肿瘤体积；在免疫活性同窝小鼠受者中每个治疗组n＝2-4个肿瘤，在NSG受者中每个治疗组n＝4-6个肿瘤。
对于嵌合移植研究，将2x104低传代REM2-KPf/fC肿瘤细胞重悬在50μl培养基中，然后与基质胶(BD Biosciences)1:1混合。将细胞皮下注射到5-8周龄RORγ基因敲除或野生型受体的左侧腹或右侧腹；受体小鼠用抗生素水(磺胺甲恶唑和甲氧苄啶)维持。每周两次监测肿瘤生长；当肿瘤达到0.1-0.3cm3时，将小鼠随机纳入治疗组并如下所述治疗3周。治疗3周后，取出肿瘤、称重、解离并通过流式细胞术进行分析。使用标准修正椭球公式1/2(长x宽2)计算肿瘤体积；每个治疗组n＝5-7个肿瘤。
对于药物治疗的人胰腺肿瘤，将2x104人胰腺FG癌细胞或2x106患者来源的异种移植细胞重悬在50μl培养基中，然后与基质胶(BD Biosciences)1:1混合。将细胞皮下注射到5-8周龄NSG受体小鼠的左侧腹或右侧腹。将小鼠随机纳入治疗组并如下所述治疗3周。治疗3周后，取出肿瘤、称重并解离。每周1-2次用卡尺测量皮下肿瘤尺寸。使用标准修正椭球公式1/2(长x宽2)计算肿瘤体积；每个治疗组至少n＝4个肿瘤。
在体内和在体外药物治疗
RORγ反向激动剂SR2211(Cayman Chemicals，11972或Tocris，4869)分别以20mg/ml或50mg/ml的浓度重悬在DMSO中，然后在使用前以1:20的比例混合在8％Tween80-PBS中。将吉西他滨(Sigma，G6423)以20mg/ml重悬于H2O中。对于在体外药物研究，将低传代(<6代)WT-或REM2-KPf/fC细胞、(<10代)KPR172H/+C细胞或FG细胞培养在非粘附性肿瘤球体条件或基质胶菌落条件中在存在SR2211或媒介物的情况下1周。对于携带KPf/fC来源的侧腹肿瘤的KPf/fC同窝小鼠、NSG小鼠和RORγ基因敲除小鼠，以及携带患者来源的侧腹异种移植肿瘤的NSG小鼠，用媒介物(PBS)或吉西他滨(25mg/kg ip，每周1次)单独治疗小鼠或与媒介物(5％DMSO、8％Tween80-PBS)或SR2211(10mg/kg ip，每天)组合治疗小鼠，持续3周。RORγ基因敲除小鼠和成对的野生型同窝小鼠维持在抗生素水(磺胺甲恶唑和甲氧苄啶)中。对于携带侧腹FG肿瘤的NOD/SCID小鼠，小鼠用媒介物(玉米油中的5％DMSO)或SR2211(10mg/kg i.p.，每天)治疗2.5周。根据IACUC协议，每周测量所有侧腹肿瘤2x次，如果肿瘤>2cm3则处死小鼠。对于KPf/fC本土存活研究，8周龄荷瘤KPf/fC小鼠被纳入媒介物(10％DMSO、0.9％NaCl和0.2％乙酸)或SR2211(20mg/kg ip，每天)治疗组，并治疗直至垂死，其中每个治疗组n＝4只单独的小鼠。对于所有药物研究，荷瘤小鼠被随机分配到药物治疗组中；治疗组规模是根据之前的研究确定的(Fox等人，2016)。
免疫荧光染色
根据标准协议，来自KPf/fC小鼠的胰腺癌组织固定在Z-fix(Anatech Ltd，FisherScientific)中，石蜡包埋在桑福德再生医学联盟的UCSD组织学和免疫组织化学核心中。获得5μm切片并在二甲苯中脱蜡。人胰腺石蜡包埋组织阵列获取自US Biomax,Inc(BIC14011a)。对于石蜡包埋的小鼠和人胰腺组织，抗原修复在95-100℃1x柠檬酸盐缓冲剂，pH 6.0(eBioscience)中进行40分钟。切片在含有0.1％Triton X100(Sigma-Aldrich)、10％山羊血清(Fisher Scientific)和5％牛血清白蛋白(Invitrogen)的PBS中阻断。
KPf/fC细胞和人胰腺癌细胞系悬浮在补充有50％FBS的DMEM(Gibco，LifeTechnologies)中，并通过以500rpm的速度离心粘附到载玻片上。24小时后，细胞用Z-fix(Anatech Ltd，Fisher Scientific)固定，在PBS中洗涤，并用含有0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich)、10％山羊血清(Fisher Scientific)和5％牛血清白蛋白(Invitrogen)的PBS阻断。所有与一抗的孵育均在4℃进行过夜。与Alexafluor缀合的二抗(MolecularProbes)在室温下孵育1小时。DAPI(Molecular Probes)用于检测DNA，而图像是用共焦Leica TCS SP5 II(Leica Microsystems)获得的。使用了以下一抗：鸡抗GFP(Abcam，ab13970)1:500、兔抗RORγ(Thermo Fisher，PA5-23148)1:500、小鼠抗E-Cadherin(BDBiosciences，610181)1：500、抗角蛋白(Abcam，ab8068)1:15、抗Hmga2(Abcam.Ab52039)1:100、抗Celsr1(EMD Millipore abt119)1:1000、抗Celsr2(BosterBio A06850)1:250。
肿瘤成像
9.5-10.5周龄的REM2-KPf/fC小鼠用媒介物或SR2211(10mg/kg i.p.，每天)治疗8天。为了成像，通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪(100/20mg/kg)麻醉小鼠。为了使血管和细胞核可视化，在麻醉诱导后立即向小鼠眼眶后注射AlexaFluor 647抗小鼠CD144(VE-钙粘蛋白)抗体和Hoechst 33342。25分钟后，取出胰腺肿瘤并放置于含有5％FBS和2mM EDTA的HBSS中。使用Leica LAS AF 1.8.2软件，在立式Leica SP5共焦系统上用HCX APO L20x物镜获取1024x 1024格式的80-150μm图像。GFP簇大小使用ImageJ 1.51s软件进行测量。本研究中分析了每个治疗组2只小鼠；每只小鼠分析6-10帧。
组织微阵列分析、免疫组织化学(IHC)和染色分析
TMA被切片成2.5μm厚。根据制造商的说明(Leica Biosystems)，使用BOND一抗稀释剂和BOND Polymer Refine DAB检测试剂盒在Leica BOND RX自动免疫染色仪上进行IHC染色。使用柠檬酸盐缓冲剂在100℃进行预处理30分钟，并使用兔抗人RORγ(t)(多克隆，#PA5-23148，Thermo Fisher Scientific)以1:4000的稀释度对组织进行染色。使用Pannoramic P250数字载玻片扫描仪(3DHistech)扫描染色的载玻片。两位获得委员会认证的外科病理学家(C.M.S和M.W.)使用定制的在线数字TMA分析工具Scorenado以独立和随机的方式分析单个TMA斑点的RORγ(t)染色。染色结果的解释符合“肿瘤标志物预后研究的报告建议”(REMARK)指南。对模棱两可和不一致的案例进行了重新联合分析，以达成共识。肿瘤细胞中的RORγ(t)染色在显微镜下分为0(没有任何细胞质或细胞核染色)、1+(仅细胞质染色)和2+(细胞质和细胞核染色)。对于报告了多个不同评分的患者，仅使用最高评分进行进一步分析。没有可解释的组织(少于10个完整的、明确可识别的肿瘤细胞)或其他伪影的斑点/患者被排除在外。
TMA数据统计分析
对患者的特征进行描述性统计。给出了频率、均值和范围值。RORγ(t)表达与分类变量的关联在适当的情况下使用卡方检验或Fisher精确检验进行，而与连续值的相关性使用非参数Kruskal-Wallis或Wilcoxon检验进行测试。使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验分析单变量生存时间差异。所有p值都是双侧的，如果<0.05，则认为是显着的。
shRNA慢病毒构建和生产
Biosettia设计了短发夹RNA(shRNA)构建体并将其克隆到pLV-hU6-mPGK-red载体中。病毒是在用4μg shRNA构建体以及2μgpRSV/REV、2μg pMDLg/pRRE和2μg pHCMVG构建体转染的293T细胞中产生的(Dull等人，1998；Sena-Esteves等人，2004)。收集病毒上清液两天，然后在4℃以20,000rpm超速离心2小时进行浓缩。在本研究中使用的shRNA构建体的敲除效率为45-95％。
RT-qPCR分析
使用RNeasy Micro和Mini试剂盒(Qiagen)分离RNA，并使用Superscript III(Invitrogen)将其转化为cDNA。通过混合cDNA、iQ SYBR Green Supermix(BioRad)和基因特异性引物，使用iCycler(BioRad)进行定量实时PCR。引物序列见表4。所有实时数据均标准化为B2M或Gapdh。
全基因组分析和生物信息学分析、原代Msi2+和Msi2-KPf/fC RNA-seq、数据分析和可视化、干细胞和非干肿瘤细胞分离，然后进行RNA测序
如上所述，收获来自三只独立的10-12周龄REM2-KPf/fC小鼠的肿瘤并将其解离成单细胞悬液。肿瘤细胞先用FC块染色，然后用0.2μg/106个细胞抗EpCAM APC(eBioscience)染色。对70,00-100,00个Msi2+/EpCAM+(干细胞)和Msi2-/EpCAM+(非干细胞)细胞进行分选，并使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用Agilent Tapestation评估总RNA的质量，所有样本的RIN≥7.9。根据制造商说明，使用Illumina的TruSeq Stranded mRNA样本制备试剂盒从65ng RNA生成RNA库，将剪切时间修改为5分钟。在Illumina HiSeq2500上使用V4测序化学对RNA库进行多路复用并使用50个碱基对(bp)单端读数(SR50)进行测序，每个样本的深度约为3000万个读数。
RNA-seq分析
使用kallisto(Bray等人，2016)将RNA-seq fastq文件处理为转录级别摘要，这是一种具有期望最大化的超快伪对齐算法。通过添加来自同一基因的所有转录计数，将转录级别摘要处理为基因级别的摘要。使用DESeq归一化(Anders and Huber 2010)对样本中的基因计数进行归一化，并根据平均丰度过滤基因列表，留下13,787个基因用于进一步分析。使用应用于log2转换计数的R包limma(Ritchie等人，2015)评估差异表达。使用limma函数eBayes(
Figure BDA0003297603190000581
I.和Speed，T.2002)以局部错误发现率lfdr(Efron和Tibshirani，2002)表示每个测试的统计显着性。lfdr，也称为后验错误概率，是给定数据的特定基因未差异表达的概率。
细胞状态分析
对于细胞状态分析，基因集富集分析(GSEA)(Subramanian等人，2005)用Bioconductor GSVA(
Figure BDA0003297603190000582
等人，2013)和Bioconductor GSVAdata c2BroadSets基因集集合进行，这是来自MsigDB3.0的规范基因集的C2集合(Subramanian等人，2005)。简而言之，GSEA根据先前定义的基因集评估排序的基因表达数据集。GSEA使用以下参数进行：mx.diff＝TRUE，verbose＝TRUE，parallel.sz＝1，min.sz＝5，max.sz＝500，rnaseq＝F。
用于组蛋白H3K27ac的原代Msi2+和Msi2-KPf/fC ChIP-seq，干细胞和非干肿瘤细胞分离，然后是H3K27ac ChIP测序
70,000个Msi2+/EpCAM+(干细胞)和Msi2-/EpCAM+(非干细胞)细胞如上所述从一单只小鼠中新鲜分离。如前所述(Deshpande等人，2014)进行ChIP；使用先前描述的协议(Deshpande等人，2014)通过离心使细胞沉淀并与培养基中的1％福尔马林交联。然后在SDS缓冲剂中裂解固定的细胞并在Covaris S2超声仪上进行超声处理。使用了以下设置：占空系数：20％，强度：4和200次循环/突发，持续时间：60秒，总共10次循环以剪切平均片段大小为200-400bp的染色质。H3K27Acetyl的ChIP使用对H3K27Ac修正具有特异性的抗体ab4729(Abcam，Cambridge，UK)进行。根据制造商的协议，使用用于Illumina的NEBNext Ultra IIDNA库制备试剂盒(E7645S和E7600S-NEB)对洗脱的染色质免疫沉淀DNA片段进行库制备。然后在Illumina NexSeq500测序仪上对库制备的DNA进行单端75个核苷酸读数测序，每个样本的测序深度为2000万个读数。
来自ChIP-seq数据的H3K27ac信号量化
使用Bowtie2对齐器(2.1.0版(Langmead和Salzberg，2012)，去除质量评分<15的读数，将预处理的H3K27ac ChIP测序数据与UCSC mm10小鼠基因组对齐。分别使用samtools(version 0.1.16，Li等人，2009)和Picard tools(version 1.98)去除非特有和重复读数。然后使用BEDTools(version 2.17.0)合并重复。使用没有输入对照的SIER-df算法(版本1.1；(Zang等人，2009)，使用冗余阈值为1，窗口大小为200bp，片段大小为150，有效基因组分数为0.75，间隙大小为200bp，E值为1000，来确定干细胞和非干细胞中的绝对H3K27ac占有率。干细胞与非干细胞中的相对H3K27ac占有率如以上确定，不同之处在于使用了SICER-df-rb算法。
确定峰和基因组特征之间的重叠
小鼠诸如编mm10构建中的编码基因等特征的基因组坐标获得来自Ensembl 84构建(Ensembl BioMart)。然后使用自定义python脚本计算确定实验峰和这些基因组特征(数据集A和B)之间的重叠特征和碱基的观察数量与预期数量的对比(Cole等人，2017)。简而言之，计算A的每个区域内与B的每个区域重叠的碱基对数量。使用置换测试来确定预期重叠的预期背景水平，以随机生成>1000组与数据集B具有相同长度和染色体分布的区域，确保仅考虑已测序的基因组区域。然后确定随机数据集和实验数据集之间的重叠，并通过比较偶然发生的重叠(预期)与经验观察(观察)的重叠来估计p值和倍数变化。同样的过程用于确定不同实验数据集的观察与预期重叠。
RNA-Seq/ChIP-Seq相关性，基因表达和H3K27ac修正之间的重叠
使用Cuffdiff算法确定干细胞中上调或下调的基因，使用SICER-df-rb算法确定干细胞中富集或不受欢迎的H3K27ac峰。然后使用R中的“ChippeakAnno”(Zhu等人，2010)和“org.Mm.eg.db”包在基因水平对H3K27ac峰进行注释，并且分离具有完全上调或完全下调(称为“独特向上”或“独特向下”)的峰的基因。然后使用R中的Spearman方法确定上调基因表达与上调H3K27ac占有率，或下调基因表达与下调H3K27ac占有率之间的相关性。
创建复合图
创建了显示跨基因长度的RNA表达和H3K27ac信号的复合图。使用来自Tophat2(Kim等人，2013)的FPKM输出值确定上调和下调的RNA峰，使用SICER算法确定上调和下调的H3K27ac峰。用最近的基因信息注释峰，并计算它们相对于TSS的位置。然后将数据合并到覆盖基因长度间隔为5％的箱中。创建重叠的上/上和下/下组，分别包含上调或下调的RNA和H3K27ac，并且在Excel中绘制这些组内的干细胞峰和非干细胞峰。
超级增强子识别
如Hnisz等人，2013年所述，干细胞和非干细胞中的增强子被定义为具有H3K27ac占有率的区域。在被索引并转换为.gff格式之前，使用SICER-df算法获得了峰值。干细胞和非干细胞的H3K27ac Bowtie2对齐用于通过信号密度对增强子进行排序。然后使用ROSE算法定义超级增强子，拼接距离为12.5kb，TSS禁区为2.5kb。然后使用R包“ChippeakAnno”(Zhu等人，2010)和“org.Mm.eg.db”在基因级别对干细胞或非干细胞产生的超级增强子进行注释，并且使用“ChippeakAnno”确定两组之间的重叠峰。使用工具WebGestalt的基因本体论(GO)过度表征分析功能，将干细胞或非干细胞特有的超级增强子注释到已知的生物通路(Wang等人，2017)。
全基因组CRISPR筛选、CRISPR库扩增和病毒制备
小鼠GeCKO CRISPRv2敲除合并库(Sanjana等人，2014)作为两个半库(A和B)从Addgene(目录号#1000000052)获取。每个库根据Zhang实验室库扩增协议(Sanjana等人，2014)进行扩增，并使用NucleoBond Xtra Maxi DNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel)纯化质粒DNA。对于慢病毒生产，将24x T225烧瓶培养到每个含有10％FBS的1x DMEM中的21x106293T。24小时后，用合并的GeCKOv2库和病毒构建体转染细胞。简言之，去除培养基并替换为12.5ml温热的OptiMEM(Gibco)。每次培养，将200μl PLUS试剂(Life Technologies)、10μg库A和10μg库B与10μg pRSV/REV(Addgene)、10μg pMDLg/pRRE(Addgene)和10μg pHCMVG(Addgene)构建体混合在4ml OptiMEM中。另外，将200μl Lipofectamine(LifeTechnologies)与4ml OptiMEM混合。5分钟后，将质粒混合物与Lipofectamine结合并在室温下孵育20分钟，然后逐滴加入每个烧瓶中。22小时后去除转染培养基，并替换为含有10％FBS、5mM MgCl2、1U/ml DNase(Thermo Scientific)和20mM HEPES pH 7.4的DMEM。在24小时和48小时收集病毒上清液，通过0.45μm过滤器(corning)传代，并在4℃以20,000rpm超速离心2小时进行浓缩。病毒颗粒重悬在含有10％FBS、5mM MgCl2和20mM HEPES pH 7.4的DMEM中，并储存在-80℃。
原代KPf/fC细胞中的CRISPR筛选
如上所述建立了3个独立的原代REM2-KPf/fC细胞系，并维持在含有10％FBS、1x非必需氨基酸和1x pen/strep的DMEM中。在第3代，测试每个细胞系的嘌呤霉素敏感性并确定GeCKOv2慢病毒滴度。在第5代，来自每个细胞系的1.6x108个细胞用GeCKOv2慢病毒以0.3的MOI转导。转导后48小时，收获1x108个细胞用于测序(“T0”)，并根据先前测试的嘌呤霉素敏感性在嘌呤霉素存在下重新培养1.6x108个细胞。细胞每3-4天传代一次，持续3周；在每次传代时，重新培养5x107个细胞以维持库覆盖率。在转导后2周，测试细胞系的球体形成能力。在第3周时，收获3x107个细胞用于测序(“2D；细胞必需基因”)，并将2.6x107个细胞培养在上述球体条件下(“3D；干细胞必需基因”)。在球体条件下1周后，收获肿瘤球用于测序。
对2D数据集的分析揭示了，虽然2D中的生长需要一些基因，但是其他在2D中生长不需要(可检测)的基因仍然需要在3D中生长(例如，Rorc Sox4、Foxo1、Wnt1和ROBO3)。这些发现表明在3D中的生长取决于一组不同或另外的通路。由于只有干细胞会产生3D球体，因此3D数据集中的靶标优先用于后续分析。在3D中显着脱落的基因中，有些基因也在2D中显着或趋势性脱落。
DNA分离、库制备和测序
使用Qiagen Blood and Cell Culture DNA Midi Kit(13343)将细胞沉淀储存在-20℃直至DNA分离。简言之，每1.5x107个细胞，将细胞沉淀重悬在2ml冷PBS中，然后与2ml冷缓冲剂C1和6ml冷H2O混合，并在冰上孵育10分钟。样本在4℃以1300x g的速度沉淀15分钟，然后重悬在含有3ml冷H2O的1ml冷缓冲剂C1中，并再次离心。然后将沉淀物重悬在5ml缓冲剂G2中，并在室温用100μl RNAse A(Qiagen 1007885)处理2分钟，然后在50℃用95μl蛋白酶K处理1小时。使用Genomic-tip 100/G柱提取DNA，在50℃缓冲剂QF中洗脱，并缠绕到300μl TE缓冲剂pH 8.0中。基因组DNA保存在4℃。对于测序，首先从T0、2D和3D(PCR1)的每个重复中分离的总基因组DNA中扩增gRNA。每50μl反应，4μg gDNA与25μl KAPA HiFiHotStart ReadyMIX(KAPA Biosystems)、1μM反向引物1和1μM正向引物1混合物(包括交错)混合。可根据要求提供引物序列。扩增后(98℃20秒、66℃20秒、72℃30秒，×22个循环)，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)净化50μl PCR1产物。然后通过PCR2用Illumina适配子对产生的～200bp产物进行条形码标记。将5μl每种净化的PCR1产物与25μlKAPA HiFi HotStart ReadyMIX(KAPA Biostystems)、10μl H2O、1μM反向引物2和1μM正向引物2混合。扩增后(98℃20秒，72℃45秒，×8个循环)，PCR2产物进行凝胶纯化，并在30μl缓冲剂EB中洗脱。确定所需产物的最终浓度，并将每个样本的等摩尔量合并用于下一代测序。
CRISPR筛选数据的处理
使用fastqc(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)评估序列读取质量。在对齐之前，使用cutadapt v1.11(Martin，2011)与5'-接头TCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG(SEQ ID NO:1)和3'接头GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQ IDNO:2)，其来自存放在Addgene(www.addgene.org/pooled-library/)上的各个库的克隆协议，来修剪sgRNA序列侧腹的5'接头和3'接头。接头识别的容错设置为0.25，修剪后所需的最小读取长度设置为10bp。修剪后的读数在--local模式下使用Bowtie2与GeCKO小鼠库对齐，接种长度为11，允许的接种不匹配为1，间隔函数设置为“S,1,0.75”。完成后，根据Bowtie2报告的原代(‘AS’)和次级(‘XS’)对齐分数，对齐被归类为特有的、失败的、可容忍的或不明确的。原代对齐分数不超过次级对齐分数至少5分的读取被丢弃为不明确的匹配。通过使用“大小-因素”方法对读数计数进行标准化。所有这些都是使用PinAPL-Py网络工具中的实现完成的，详细代码可在github.com/LewisLabUCSD/PinAPL-Py上找到。
gRNA生长和衰减分析
使用参数方法，其中受损基因i的细胞群生长为
Figure BDA0003297603190000631
其中α0是未修正细胞的生长速率，δi是由于基因缺失导致的生长速率变化。由于在每个时间点提取的等分试样大致相同，并且仅代表整个群的一小部分，因此观察到的sgRNA计数ni并不直接对应Ni。对应关系只是相对的：如果我们定义ci≡ni/∑knk为sgRNA物种i的组成部分，则对应关系为ci＝Ni∑kNk。因此，指数只能确定为乘法常数
Figure BDA0003297603190000641
该常数是根据基因缺失通常不影响生长速率的假设确定的。数学上，1＝Amed[ci(0)/ci(t)]。测量基因缺失的影响的统计量被定义为
Figure BDA0003297603190000642
并为每个基因i计算来自：
Figure BDA0003297603190000643
由于对生长必需的基因感兴趣，我们对xi进行了单尾测试。我们将xi的三个值(每个生物重复中的一个)收集到一个向量xi中。具有统计显着性的效应将使所有三个值都大(>1)且一致。如果xi要表示一个点在三维空间中的位置，我们会对靠近身体对角线而远离原点的点感兴趣。一个合适的统计量是s＝(x·n)2-[x-(x·n)n]2，其中
Figure BDA0003297603190000644
是身体对角线方向的单位向量，而·表示标量积。每个基因的q-值(错误发现率)被估计为在空模型中不小于预期的s统计量的数量si除以观察到的数据中不小于s统计量的数量si。空模型通过在xi中为每个实验重新排列基因标签进行数值模拟，彼此独立，重复103次。
STRING交互组网络分析
使用网络方法将CRISPR 3DV实验的结果与RNA-seq结果整合在一起。通过过滤识别出可能的CRISPR必需基因，以包括错误发现率校正p值小于0.5的基因，从而产生94个基因。此处选择了松弛的过滤器是因为以下过滤步骤将有助于消除误报，而网络分析方法有助于放大微弱信号。这些基因以两种方式进一步过滤：首先，我们只包括在RNA-seq数据中表达的基因(这产生了57个基因)，其次，我们进一步限制了在干细胞中通过在RNA-seq中>2对数倍数变化而富集表达的基因(这产生了10个基因)。这些结果用于为网络邻域探索提供种子。我们使用STRING小鼠交互组作为我们的背景网络，仅包括高置信度交互(边缘权重>700)。STRING交互组包含已知和预测的功能性蛋白质-蛋白质相互作用。相互作用由各种来源组装而成，包括基因组背景预测、高通量实验室实验和共表达数据库。交互置信度是所有证据线的加权组合，质量越高的实验贡献越大。高置信度的STRING交互组包含13,863个基因和411,296个边缘。因为并非所有基因都在交互组中找到，我们的种子基因集在与网络集成时会被进一步过滤。这产生了39个CRISPR必需的、RNA表达的种子基因和5个CRISPR必需的、RNA差异表达的种子基因。在将种子基因与背景交互组整合后，我们采用网络传播算法来探索这些种子基因周围的网络邻域。网络传播是利用与相同表型相关的基因倾向于相互作用这一事实来放大弱信号的强大方法。我们实现了网络传播方法，该方法模拟热量如何通过网络从最初热的“种子”节点集开始，通过遍历边缘而有损失地扩散。在每一步，一个单位的热量被添加到种子节点，然后传播到相邻节点。然后从每个节点中去除恒定比例的热量，从而使系统中的热量得以保存。经过多次迭代，节点上的热量收敛到一个稳定值。这个最终的热向量代表了每个节点与种子集的接近程度。例如，如果一个节点在两个最初热的节点之间，它的最终热值会非常高，而如果一个节点离最初热的种子节点很远，它的最终热值会非常低。该过程由以下中描述(Vanunu等人，2010)：
Ft＝W′Ft-1+(1-α)Y
其中Ft是时间t的热向量，Y是热向量的初始值，W′是归一化的邻接矩阵，而α∈(0,1)表示在每个时间步中耗散的总热量的分数。我们检查了网络传播后由最接近种子基因的500个基因组成的子网络的结果。这将被称为“热子网”。为了识别与种子基因相关的通路和生物学机制，我们将聚类算法应用于热子网，将网络划分为组内高度互连的基因组，并与其他组中的基因稀疏连接。我们使用模块化最大化算法进行聚类，该算法已被证明可有效检测蛋白质-蛋白质相互作用网络中的模块或簇。使用工具WebGestalt的过度表征分析功能将这些簇注释为已知的生物通路。我们使用热子网中的500个基因作为背景参考基因集。为了显示网络，我们使用弹簧嵌入布局，该布局通过簇成员资格进行修正(以及一些手动调整以确保标签不重叠)。属于每个簇的基因沿圆圈径向排列，以强调簇内和簇之间的连接。VisJS2jupyter用于网络传播和可视化。节点颜色映射到RNAseq对数倍数变化，蓝色显示下调基因，红色显示上调基因，灰色显示小倍数变化的基因。显示对数倍数变化绝对值大于3.0的基因的标签。种子基因显示为带有白色轮廓的三角形，而热子网中的所有其他基因都是圆圈。通过从富集分析中选择具有代表性的通路来对簇进行注释。
KPR172HC单细胞分析
从两只独立的KPR172hC小鼠新鲜收获的肿瘤使用Miltenyi gentelMACS组织分离器进行机械解离和酶解，以获得单个细胞。10XGenomics Chromium Single Cell Solution用于捕获、扩增和标记来自单细胞的mRNA以及用于scRNA-Seq库制备。库测序在IlluminaHiSeq2500系统上进行。测序数据被输入到Cell Ranger分析管道中，以对齐读数并生成基因-细胞表达矩阵。最后，自定义R包用于进行基因表达分析和使用t-SNE(t-分布式随机邻域嵌入)聚类算法投影的细胞聚类。来自10xGenomics平台上生成的两个独立KPR127hC肿瘤组织的scRNA-seq数据集被合并并用于探索和验证动态发育下肿瘤细胞的分子特征。用于说明Il10rb、Il34和Csf1r等信号的肿瘤细胞使用由Wei Lin博士开发的SuperCT方法从异质细胞成分中表征，并由Seurat FindClusters用Epcam、Krt19和Prom1等的富集信号证实(Xie等人，2018)。肿瘤细胞的tSNE布局是通过Seurat管道使用单细胞数字表达谱计算的。
KPf/fC单细胞分析
如上所述，收集并新鲜解离三个年龄匹配的KPf/fC胰腺肿瘤。肿瘤细胞用大鼠抗小鼠CD45-PE/Cy7(eBioscience)、大鼠抗小鼠CD31-PE(eBioscience)和大鼠抗小鼠PDGFRα-PacBlue(eBioscience)染色，这三种标记物呈阴性的肿瘤细胞被分选以供分析。根据制造商的协议，分离、条码标记单个细胞，并使用Chromium Single Cell 3'GEM库和凝胶珠试剂盒v2，使用10x基因组学平台构建库。库在Illumina HiSeq4000上测序。Cell Ranger软件用于对齐、过滤以及条形码和UMI计数。Seurat R包用于使用用于无监督聚类和细胞类型发现的默认设置进行进一步的二次分析。
shRorc与shCtrl KPf/fC RNA-seq
如上所述建立原代WT-KPf/fC细胞系。来源自单个低传代细胞系(<6传代)的WT-KPf /fC细胞被培养并用含有shCtrl或shRorc的慢病毒颗粒一式三份转导。转导后5天对阳性感染的(红色)细胞进行分选。使用RNeasy Micro Plus试剂盒(Qiagen)分离总RNA。按照制造商的说明，使用Illumina的TruSeq Stranded mRNA样本制备试剂盒(Illumina)从200ngRNA生成RNA库。使用高输出V2试剂盒(Illumina Inc.，San Diego CA)在Illumina NextSeq500上合并库并进行单端测序(1X75)。
读取数据在BaseSpace(basespace.illumina.com)中处理。使用具有默认设置的STAR aligner(code.google.com/p/rna-star/)将读数与Mus musculus基因组(mm10)对齐。使用Cufflinks Cuffdiff包(Trapnell等人，2012)(github.com/cole-trapnell-lab/cufflinks)确定差异转录物表达。然后过滤差异表达数据以仅表示显着差异表达的基因(q值<0.05)。该列表用于特异性显着差异调节通路的通路分析和热图。
组蛋白H3K27ac的shRorc与shCtrl KPf/fC ChIP-seq
如上所述建立原代WT-KPf/fC细胞系。将来自两个独立细胞系的低传代(<6传代)WT-KPf/fC细胞培养并用含有shCtrl或shRorc的慢病毒颗粒一式三份转导。转导后5天对阳性感染的(红色)细胞进行分选。组蛋白H3K27ac的ChIP-seq、信号量化以及峰与基因组特征之间重叠的确定如上所述进行。
使用ROSE算法(younglab.wi.mit.edu/super_enhancer_code.html)从H3K27acChIPseq数据确定对照和shRorc治疗的KPf/fC细胞系以及Musashi干细胞中的超级增强子。然后进一步细化Musashi干细胞超级增强子峰，以仅包括干细胞状态所特有的那些(限定为存在于干细胞中而不是非干细胞中)和/或那些在峰内具有RORγ结合位点的峰。使用‘BSGenome.MMusculus.UCSC.mm10’R包中的‘getSeq’函数提取峰序列。然后使用矩阵RORG_MOUSE.H10MO.C.pcm(HOCOMOCO数据库)作为参考，以及R中的“matchPWM”函数以90％严格度绘制RORγ结合位点。然后为每个KPf/fC细胞系定义基线峰值，为将四个Musashi干细胞峰值列表中的每一个与每个KPC对照SE列表重叠的那些，总共给出八个。R包“GenomicRanges”和“ChIPpeakAnno”用于评估峰重叠，使用的最小重叠为1bp。为了估计在RORC敲低时关闭的超级增强子的比例，通过量化峰重叠然后将其表示为基线列表的比例来评估每个基线条件与相应的KPf/fC shRorc超级增强子列表之间的差异('共有％')。然后将每个条件下特有峰值的比例计算为100％共有％并绘制。
sgRORC与sgNT人RNA-seq
培养人FG细胞并用含有Cas9和非靶向引导RNA或针对Rorc的引导RNA的慢病毒颗粒一式三份进行转导。转导后5天对阳性感染(绿色)细胞进行分选。使用RNeasy MicroPlus试剂盒(Qiagen)分离总RNA。按照制造商的说明，使用Illumina的TruSeq StrandedmRNA样本制备试剂盒(Illumina)从200ng RNA生成RNA库。使用高输出V2试剂盒(IlluminaInc.，San Diego CA)在Illumina NextSeq 500上合并库并进行单端测序(1X75)。
比较RNA-seq和细胞状态分析
使用kallisto(Bray等人，2016)将小鼠KPf/fC和人FG细胞中的RORC敲低和对照RNA-seq fastq文件处理成转录级别摘要。转录级别摘要被处理成基因级别的摘要，并使用sleuth和Wald检验进行差异基因表达(Pimentel等人，2017)。GSEA的执行如上详述(Subramanian等人，2005)。使用Metascape进行基因本体分析，使用自定义分析进行GO生物过程和默认设置，基因具有FDR<5％和beta值>0.5。
cBioportal
来自癌症患者的RORC基因组扩增数据是从纪念斯隆凯特琳癌症中心cBioPortalfor Cancer Genomics(www.cbioportal.org)收集的。
量化和统计分析
使用GraphPad Prism软件版本7.0d(GraphPad Software Inc.)进行统计分析。在体内药物研究的样本量是根据所用胰腺肿瘤模型的可变性确定的。对于侧腹移植和本土药物研究，每组中的荷瘤动物被随机分配到治疗组。治疗规模是根据之前的研究确定的(Fox等人，2016)。数据显示为平均值±SEM。双尾未配对学生t检验与Welch校正或单向方差分析(ANOVA)进行多重比较，在适当时用于确定统计显着性(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)。
每个在体外和在体内研究的复制级别在每个图的图例中注明，并在上面的方法细节部分中进行了详细描述。然而，简而言之，在体外肿瘤球体或菌落形成研究是在n＝3孔的两个独立shRNA中使用每个细胞系的n＝3个独立孔进行的；然而，这些实验中的大部分另外地在>1个独立来源的细胞系中完成，每个shRNA n＝3个孔。对于有限稀释测定，类器官来源自3只独立小鼠；药物治疗的小鼠和人类类器官在每个治疗条件下以每剂量n＝3个孔的方式培养。侧腹shRNA研究独立进行两次，每次实验中每组n＝4个肿瘤。侧腹药物研究在每个治疗组n＝2-7个肿瘤中进行；本地KPf/fC存活研究是在每个治疗组中至少纳入4只小鼠的情况下进行的。实时成像研究用每个治疗组两只小鼠进行。
上面详细解释了对生成的大型数据集的统计考虑和生物信息学分析。简而言之，原代KPf/fC RNA-seq是使用Msi2+和Msi2-细胞进行的，这些细胞从三个不同的终末期KPf/fC小鼠中独立分选。原代KPf/fC ChIP-seq是使用Msi2+和Msi2-细胞进行的，这些细胞从单个终末期KPf/fC小鼠中分选出来。全基因组CRISPR筛选是使用三个生物学上独立的细胞系(来源自三种不同的KPf/fC肿瘤)进行的。肿瘤的单细胞分析表示来自两只KPR172HC和三只KPf/fC小鼠的约～10,000个细胞的合并数据。shRorc和shCtrl KPf/fC细胞的RNA-seq以一式三份进行，而ChIP-seq则从两个生物学独立的KPf/fC细胞系中进行单次复制。
实施例2
该工作示例表明，RORγ通路在更具侵袭性的胰腺癌亚型中发挥重要作用，并且可以防止癌症从良性状态发展为恶性状态。
RORγ抑制已被展示了可以阻止胰腺腺鳞癌(ASCP)的生长，这是最具侵袭性的胰腺癌亚型。创建了一种新的侵袭性胰腺癌的Msi2-CreER小鼠模型，其中Cre被Msi2启动子击退，并且可以通过他莫昔芬递送有条件地触发。这种Msi2-CreER驱动子可以交叉到携带不同突变的小鼠中，突变诸如Ras(导致骨髓增生性肿瘤)、p53或Myc。当Msi2-CreER驱动子与加利福尼亚州拉荷亚在SBP/Rady的Robert Wechsler-Reya博士开发的LSL-MycT58A模型交叉时(Mollaoglu等人，2017)(图79)，它产生了多种癌症类型包括小细胞肺癌、脉络丛肿瘤和早期肾肿瘤。在胰腺中，它导致了腺鳞癌，这是所有胰腺癌中临床预后最差的一种侵袭性胰腺癌亚型，以及腺泡细胞癌(ACC)，一种在儿科患者中富集并以频繁复发为特征的亚型。
使用该模型，在ASCP和ACC肿瘤中观察到RORγ的高表达(图80)，表明RORγ在调节肿瘤生长中的作用。重要的是，该数据得到了功能研究的支持，该研究显示来源自腺鳞癌和腺泡瘤的类器官对RORγ抑制剂SR2211敏感(图81、图82A和图82B)。图82A显示了在媒介物或增加剂量的SR2211存在下的类器官生长，包括0.5μM、1μM、3μM和6μM。图82B显示存在媒介体或3μM SR2211时类器官的代表性图像。3μM或6μM SR2211显着降低了类器官生长。总的来说，这些模型和数据表明，对于不同的胰腺肿瘤亚型，更广泛地需要RORγ，这反过来可能会扩大可以从针对RORγ的新的治疗方法中受益的患者群体。
此外，RORγ抑制剂SR2211可以阻断良性胰腺上皮内瘤变(PanIN)病变的生长。SR2211对分离的原代鼠PanIN来源类器官的影响进行了测试。SR2211减少了类器官数量和类器官体积，表明RORγ抑制可以防止癌症从良性状态发展为恶性状态。
实施例3
该工作示例表明，RORγ在白血病中也发挥着重要作用，并且可能由于白血病和胰腺癌干细胞之间的相似性而成为治疗白血病的有希望的靶标。数据表明，抑制RORγ可有效减少白血病细胞的生长，并将RORγ抑制剂作为治疗白血病的有希望的治疗剂。
鉴于白血病和胰腺癌干细胞之间的共同特征和共有的分子依赖性，使用原始细胞危象慢性粒细胞白血病(CML)作为模型，研究了侵袭性白血病的生长是否也需要RORγ。如在图29中所示，KLS细胞是从WT和RORγ-敲除(Rorc-/-)小鼠中分离出来的，用BCR-ABL和Nup98-HOXA9逆转录病毒转导，并在体外原代和次级菌落测定中培养。重要的是，观察到原代和次级菌落测定中菌落数量和总菌落面积中的显着减少，表明原始细胞危象CML的生长和增殖严重依赖于RORγ。此外，观察到对急性髓性白血病(AML)生长以及淋巴肿瘤中RORγ表达的影响，表明RORγ信号传导在这些癌症中也有作用。
实施例4
该工作示例表明RORγ在肺癌中也发挥重要作用，因为SR2211对RORγ的药理学抑制抑制了肺癌细胞的肿瘤球体形成，表明靶向RORγ的治疗方法可有效治疗肺癌。
如在图83中所示，LuCA KP肺癌细胞用媒介物或增加剂量的SR2211处理，包括0.3μM、0.6μM、1μM和1.2μM。然后计数形成的肿瘤球体的数量，并相对于对照进行量化。所有测试剂量的SR211都显着减少了肿瘤球体的形成，并且减少的程度随着SR2211的剂量而增加。
实施例5
该工作示例展示了AZD-0284(一种RORγ抑制剂)可有效削弱哺乳动物胰腺癌和白血病的生长。结果表明，AZD-0284可成为癌症治疗的有效治疗剂。
使用AZD-0284与吉西他滨组合对RORγ的药理学阻断降低了KPf/fC类器官生长(图30)。KPf/fC类器官来源于REM2-KPf/fC小鼠，这是一种基因型为Msi2eGFP/KrasLSL-G12D/+的胰腺导管腺癌种系基因工程小鼠模型；PdxCRE/+；p53f/f。简而言之，收获来自10-12周龄终末期REM2-KPf/fC小鼠的肿瘤并将其解离成单细胞悬液。肿瘤细胞先用FC块染色，然后用0.2μg/106个细胞抗EpCAM APC(eBioscience)染色。对REM2+/EpCAM+(干细胞)和REM2-/EpCAM+(非干细胞)细胞进行分选，重悬在20μl基质胶(BD Biosciences，354230)中，并在预热的48孔培养基中以圆顶状培养。在37℃孵育5分钟后，用300μlPancreaCult类器官生长培养基(Stemcell Technologies)覆盖圆顶。6天后对类器官进行成像和量化。所有图像均在ZeissAxiovert 40CFL上获取。使用ImageJ 1.51s软件对类器官进行计数和测量。
KPf/fC来源类器官以～1:2的比例维持和传代。简而言之，使用细胞回收溶液(Corning 354253)分离类器官，然后使用Accumax细胞解离溶液(Innovative CellTechnologies AM105)进行解离，并培养在预热的48孔培养基上的20μl基质胶(BDBiosciences，354230)圆顶中。在37℃孵育5分钟后，用300μl PancreaCult类器官生长培养基(Stemcell Technologies)覆盖圆顶。
在媒介物、3μM AZD-0284、0.02nM吉西他滨或两者存在下生长的KPf/fC细胞的类器官形成能力通过类器官体积的成像和测量来评估(图30)。类器官的体积表示为相对于对照。如在图30中所示，0.02nM吉西他滨单独使用或与3μM AZD-0284组合使用可明显减少类器官的体积生长。
还检查了较高剂量的AZD-0284对KPf/fC类器官生长的作用(图31)。在存在媒介物、6μM AZD-0284、0.025nM吉西他滨或两者的情况下培养KPf/fC类器官，然后进行成像。如在图31中所示，单独使用AZD-0284、单独使用吉西他滨或AZD-0284和吉西他滨组合治疗均导致KPf/fC细胞的类器官体积明显减少。
类似地，检查了不同剂量的AZD-0284对KPf/fC类器官的作用(图32)。测试了三种剂量的AZD-0284：3μM、6μM和12μM。对于每种AZD-0284剂量，测试了四种条件：媒介物、单独的AZD-0284、单独的吉西他滨(0.025nM)以及AZD-0284和吉西他滨的组合。与之前描述一致，0.025nM吉西他滨单独导致KPf/fC类器官生长的显着抑制。AZD-0284当单独施用时，在较高剂量(例如6μM或12μM)下具有显着的抑制作用。另一方面，AZD-0284如果与吉西他滨组合使用，导致在所有测试剂量下对KPf/fC类器官生长的抑制作用最高。与对照相比，0.025nM吉西他滨和3μM AZD-0284、6μM AZD-0284或12μMAZD-0284的组合分别导致类器官体积减少3.72、5.81或10.53倍。因此，数据表明RORγ抑制与用于胰腺癌治疗的化学治疗药物之间存在协同作用。
接下来，在体内测试AZD-0284对荷瘤KPf/fC小鼠的影响(图33)。在开始用媒介物、90mg/kg AZD-0284或90mg/kg AZD-0284与吉西他滨组合治疗之前，允许KPf/fC小鼠发生肿瘤。如在图33中所示，接受90mg/kg体重AZD-0284的小鼠表现出较低的肿瘤质量、细胞数量以及EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的缺失。在同时接受AZD-0284和吉西他滨的小鼠中观察到类似的作用，表明AZD-0284，无论是单独施用还是与吉西他滨组合施用，都可以有效减少在体内胰腺肿瘤。
图34显示用单独的吉西他滨、单独的AZD-0284或AZD-0284加吉西他滨治疗的荷瘤KPf/fC小鼠的汇编。AZD-0284以90mg/kg每天一次施用，吉西他滨以25mg/kg每周一次施用，持续3周。如前所述，单独用AZD-0284或AZD-0284和吉西他滨组合治疗的小鼠表现出较低的细胞数量和EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的缺失，表明单独或与化学治疗组合使用的RORγ抑制作为癌症治疗疗法的功效。
此外，评估了AZD-0284对原代患者来源的PDX1535类器官的作用(图35)。PDX1535类器官来源于胰腺癌患者。通过在含有2.5％FBS、5mg/ml胶原酶II和1.25mg/ml DispaseII的RPMI中，在37℃消化患者来源的异种移植物1小时，然后通过70μM网状过滤器，建立原代患者类器官。细胞以每50μl基质胶1.5×105个细胞的密度培养。圆顶固化后，如下添加生长培养基：RPMI含有50％Wnt3a条件培养基、10％RSpondin1-条件培养基、2.5％FBS、50ng/ml EGF、5mg/ml胰岛素、12.5ng/ml氢化可的松，以及14μM Rho激酶抑制剂。建立后，类器官进行传代和维持。简而言之，使用细胞回收溶液(Corning 354253)分离类器官，然后用TrypLE Express(ThermoFisher 12604)解离成单细胞悬液，并补充以25μg/ml DNase I(Roche)和14μM Rho激酶抑制剂(Y-27632，Sigma)。细胞以1:2的比例分成20μl圆顶，培养在预热的48孔培养基上。圆顶在37℃孵育5分钟，然后用不含Wnt3a条件培养基的人类完整类器官喂养培养基覆盖。
在媒介物、3μM AZD-0284、0.02nM吉西他滨或两者存在下生长的原代患者来源的PDX1535类器官(图35)。在治疗结束时对类器官进行成像和测量。如在图35中所示，3μMAZD-0284和0.04nM吉西他滨的组合导致类器官体积显着减少，表明原代患者来源的类器官也对RORγ抑制敏感。
AZD-0284在较高剂量下的作用也在原代患者来源的PDX1535类器官上进行了测试(图36)。PDX1535类器官在存在媒介物、6μMAZD-0284、0.025nM吉西他滨或两者的情况下进行培养，然后进行成像。如在图36中所示，6μM AZD-0284，单独或与吉西他滨组合使用，明显抑制PDX1535类器官的生长。
类似地，检查了不同剂量的AZD-0284对原代患者来源的PDX1535类器官的作用(图37)。测试了三种剂量的AZD-0284：3μM、6μM和12μM。对于每个剂量的AZD-0284，测试了四种条件：媒介物、单独的AZD-0284、单独的吉西他滨(0.025nM)以及AZD-0284和吉西他滨的组合。如在图37中所示，0.025nM吉西他滨单独使用降低了PDZ1535类器官的生长，尽管没有统计学意义。与其对KPf/fC类器官的作用类似，AZD-0284当单独施用时，在较高剂量(例如6μM或12μM)下显着减少PDX1535类器官的体积。然而，如果与吉西他滨结合施用，AZD-0284在所有测试剂量下均显着抑制PDX1535类器官的生长，其抑制程度大于单独使用任一药物。与对照相比，0.025nM吉西他滨和3μM AZD-0284、6μM AZD-0284或12μM AZD-0284的组合分别导致类器官体积减少2.81、4.72或6.90倍。这一结果再次表明RORγ抑制与用于胰腺癌治疗的化学治疗药物之间存在协同作用。
此外，使用上述类器官测定评估了AZD-0284对另一种原发性胰腺癌患者来源细胞PDX1356的作用(图38)。PDX1356类器官在媒介物、3μM AZD-0284、0.05nM吉西他滨或两者的存在下生长，然后在治疗结束时对类器官体积进行成像和测量。如在图38中所示，AZD-0284和吉西他滨，单独或组合使用，导致类器官体积显着减少，证实了原代患者来源的类器官对RORγ抑制敏感。
AZD-0284在较高剂量下的作用也在原代患者来源的PDX1356类器官上进行了测试(图39)。PDX1356类器官在存在媒介物、6μMAZD-0284、0.05nM吉西他滨或两者的情况下进行培养，然后进行成像。如在图39中所示，AZD-0284和吉西他滨单独或组合使用可导致显着减少类器官体积。图40是来自AZD-0284治疗的原发患者来源类器官在体外的所有数据的汇编，包括PDX1356和PDX1535类器官，它表明AZD-0284在3μM和更多的6μM时显着抑制了类器官生长。总的来说，这些数据证实了RORγ作为胰腺癌进展的中枢调节因子，并识别了RORγ抑制剂AZD-0284是一种有效的抗肿瘤治疗剂。
最后，AZD-028对在体内移植了原代患者来源癌细胞的免疫缺陷小鼠的影响进行了测试(图41-图45)。如在图41中所示，携带原代患者来源的PDX1424癌细胞的小鼠用媒介物或60mg/kg AZD-0284治疗3周。AZD-0284治疗导致EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的显着减少，尽管在使用原代患者来源的PDX1444癌细胞的另一个实验中未观察到这种肿瘤抑制作用(图42)。然而，在使用移植了快速生长(FG)细胞的小鼠的实验中重复了类似的抑制作用，这些细胞用不同剂量的AZD-0284或AZD-0284与吉西他滨组合治疗，反映为总细胞数和在用90mg/kg AZD-0284或组合疗法治疗的小鼠中EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的减少(图43)。图44显示来自接受60mg/kg AZD-0284或90mg/kg AZD-0284的携带PDX癌细胞或FG癌细胞(包括PDX1424、PDX1444和FG细胞)的小鼠的数据汇编，如在图中所示。特别是在较高剂量(即90mg/kg)下，AZD-0284治疗减少了EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞。图45是来自携带PDX癌症异种移植或FG癌症异种移植的小鼠的所有数据的汇编，包括PDX1424、PDX1444和FG。与之前的观察结果一致，AZD-0284治疗导致细胞数量、EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的减少，表明AZD-0284在体内治疗胰腺肿瘤是有效的。
鉴于白血病和胰腺癌干细胞之间的共同特征和共有的分子依赖性，对AZD-0284在白血病细胞上的作用进行了测试(图46)。K562是一种侵袭性人类白血病细胞系，由原始细胞危象慢性粒细胞白血病产生。使用不同剂量的AZD-0284对k562细胞进行菌落测定。K562细胞以单细胞水平培养在含有AZD-0284的甲基纤维素中。在计数形成的菌落数量之前，让细胞生长8天。这用于了解k562细胞在不同条件下的功能。与媒介物治疗的细胞相比，用AZD-0284治疗的细胞形成更少的菌落，并且它们的形态更小。如在图46中所示，1μM、3μM、5μM、10μM和15μM的AZD-0284均导致形成的菌落数量显着减少，表明AZD-0284也能有效抑制白血病细胞生长。
综上所述，这些数据表明AZD-0284(一种RORγ抑制剂)是一种有希望的药物，可用于抗癌治疗和/或与化学治疗药物组合使用，以更有效地治疗各种类型的癌症，包括胰腺癌癌症和白血病。
实施例6
该工作示例表明，另一种RORγ抑制剂JTE-151在体外和在体内可有效削弱哺乳动物胰腺癌的生长。结果表明，JTE-15可作为治疗癌症的有效治疗剂。
首先，如上所述，在胰腺细胞类器官上测试了使用JTE-151对RORγ的药理阻断。源自两种基因工程小鼠模型(GEMM)的胰腺癌细胞用于类器官研究(图47、图48)。首先，如在图47中所示，通过开腹手术和胰腺动员，然后是KRASG12D(KRAS的一种活化形式)和sgP53(一种靶向p53的CRISPR引导)的DNA注射，生成了胰腺癌的非种系小鼠模型。然后，使用电穿孔促进DNA掺入胰腺细胞。如此生成的小鼠模型仅在胰腺中发生突变，因此标签为“非种系”。其次，如在图48中所示，使用种系基因工程小鼠胰腺癌模型，其基因型为KrasLSL-G12D/+；PdxCRE /+；p53f/f(KPf/fC)。
如上所述，将来自每个非种系和种系小鼠模型的约4,000个类器官作为单细胞培养在多孔培养基中，并用JTE-151治疗4天(图48)。治疗后分析类器官的数量和大小。在每种情况下都观察到类器官体积的显着削弱(图49，图50)。如在图49中所示，在媒介物、3μMJTE-151、6μM JTE-151或9μM JTE-151存在下生长的非种系KRAS/p53细胞的类器官形成能力通过成像和相对类器官体积的测量进行评估。在量化中，不同剂量的JTE-151沿横轴绘制，类器官的体积沿纵轴表示为相对于对照。测试的所有剂量的JTE-151均明显且显着地削弱了KRAS/p53类器官的生长。类似地，如在图50中所示，来源自种系KPf/fC小鼠模型的胰腺癌细胞在存在媒介物或不同剂量的JTE-151的情况下生长。然后分析类器官体积。沿横轴绘制不同剂量的JTE-151，纵轴表示与对照相比的相对类器官体积。在较低剂量(0.003μM和0.03μM)下，JTE-151减少了类器官的体积，尽管不是在统计学显着水平。然而，在较高剂量(0.3μM、3μM、6μM和9μM)下，JTE-151显着抑制了KPf/fC类器官的生长，与成像结果一致。
接下来，在体内测试了JTE-151对荷瘤KPf/fC小鼠的影响。图51是实验设计的示意图。允许KPf/fC小鼠产生肿瘤，然后荷瘤小鼠接受媒介物或JTE-151，然后在实验结束时分析肿瘤。测试了不同剂量的JTE-151，即30mg/kg、90mg/kg和120mg/kg体重。图52是来自用媒介物或30mg/kg JTE-151每天一次治疗约3周的荷瘤KPf/fC小鼠的数据汇编，它显示JTE-151的治疗导致细胞数量减少和EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的缺失。与对照相比，EpCam+肿瘤上皮细胞的减少具有统计学显着水平。
图53-图56显示单独实验的示例，其中荷瘤KPf/fC小鼠用媒介物或90mg/kg JTE-151以如图中指定的方案治疗3周。例如，如图53和图55所示，小鼠每天一次接受90mg/kgJTE-151，持续3周。在图54中，小鼠每天一次接受90mg/kg JTE-151，持续1周，然后每天两次持续另外2周。在每个实验结束时，分析肿瘤的不同参数，包括肿瘤质量、细胞数量、EpCAM阳性、CD133阳性、EpCAM/CD133阳性、细胞结构和IL-17水平。如在图53-图55中所示，用90mg/kg JTE-151治疗的小鼠表现出肿瘤质量减少、EpCam+肿瘤上皮细胞减少和/或EpCam+/CD133+肿瘤干细胞减少，表明JTE-151的抗癌功效。测试的5只小鼠中有1只对90mg/kg剂量的JTE-151治疗没有反应(图56)。由于不同小鼠之间的差异，尚不清楚无反应小鼠的初始肿瘤大小是否异常大。图57是来自用媒介物(n＝3)或90mg/kg JTE-151(n＝4)治疗3周的荷瘤KPf/fC小鼠的数据的汇编，并且它表明JTE-151的治疗导致肿瘤质量减少、细胞数量减少以及EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的缺失。类似地，图58是来自用媒介物、30mg/kg JTE-151或90mg/kg JTE-151(总共23只小鼠)治疗3周的荷瘤KPf/fC小鼠的数据的汇编，并且它显示以任一剂量治疗的JTE-151均导致细胞数量减少以及EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的缺失。90mg/kg的JTE-151也显着减少了肿瘤质量。
类似地，以120mg/kg的较高剂量在体内对荷瘤KPf/fC小鼠测试了JTE-151的抗癌作用(图59-图61显示三个单独的实验)。对于每个实验，一只小鼠接受媒介物治疗，另一只小鼠接受在图中指定的JTE-151方案。例如，在图59中，JTE-151小鼠接受120mg/kg体重的JTE-151 2周，然后90mg/kg的JTE-151 1周。在前1.5周，JTE-151每天施用一次，在第二个1.5周，JTE-151每天施用两次。如前所述，在每个实验结束时，分析肿瘤的不同参数，包括细胞数量、EpCAM阳性、EpCAM/CD133阳性和IL-17水平。在图59-图61中的每一个，每个图的横轴表示靶标(媒介物与JTE-151小鼠)，纵轴表示指定的测量。接受JTE-151的三只小鼠中至少有两只对药物有反应，如循环IL-17水平的降低所反映的(图59-图60)。在对JTE-151有反应的小鼠中，一致地观察到EpCam+/CD133+肿瘤干细胞的缺失和/或EpCam+肿瘤上皮细胞的缺失，尽管在肿瘤中细胞数量的变化有所不同(图59-图60)，以及1只受试小鼠未表现出反应或IL-17水平下降(图61)。
此外，JTE-151的抗癌作用是在类器官测定中确定的，该测定使用来源自携带原代患者来源的异种移植物的小鼠的胰腺癌细胞。实验设计的示意图显示于图62中，来源自异种移植肿瘤的细胞作为单细胞培养，并在有或没有吉西他滨的情况下用JTE-151治疗1周，然后分析类器官的数量和大小。如在图63中所示，原代患者来源的PDX1535类器官用媒介物、3μM JTE-151、0.05nM吉西他滨或两者治疗，然后进行成像。JTE-151单独治疗、吉西他滨单独治疗或JTE-151和吉西他滨组合治疗均导致PDX1535类器官的类器官体积明显减少。
如在图64中所示，检查了不同剂量的JTE-151对PDX1535类器官的作用。测试了三种剂量的JTE-151：0.3μM、1μM和3μM。对于每个JTE-151剂量，测试了四种条件：媒介物、单独的JTE-151、单独的吉西他滨(0.05nM)以及JTE-151和吉西他滨的组合(沿横轴绘制)。纵轴表示相对类器官体积。在所有测试的剂量下，单独的JTE-151或单独的吉西他滨都导致PDX1535类器官生长的显着抑制。然而，JTE-151和吉西他滨的组合在所有测试剂量下实现了PDX1535类器官生长的最显着减少，以剂量依赖性方式从5.55倍减少到33倍减少。这表明JTE-151与吉西他滨协同作用以阻断患者来源的类器官生长。
如在图65-图66中所示，JTE-151的抗癌作用还使用类器官测定对原代患者来源的PDX1356胰腺癌细胞进行了测试。在媒介物、0.3μM JTE-151、0.05nM吉西他滨或两者存在下生长的PDX1356细胞的类器官形成能力通过类器官体积的成像和测量来评估(图65)。类器官的体积表示为相对于对照。如在图65中所示，吉西他滨和JTE-151，无论是单独施用还是组合施用，都明显减少了类器官的体积生长。如在图66中所示，还检查了较高剂量的JTE-151对PDX1356类器官生长的作用。PDX1356类器官在存在媒介物、3μM JTE-151、0.05nM吉西他滨或两者的情况下进行培养，然后进行成像。再次，如在图66中所示，JTE-151单独治疗、吉西他滨单独治疗或JTE-151和吉西他滨组合治疗均导致PDX1356细胞的类器官体积明显减少。
如在图67中所示，还使用类器官测定对原代患者来源的PDX202和PDX204胰腺癌细胞测试了JTE-151的抗癌作用。3μM JTE-151单独抑制PDX202和PDX204细胞的类器官生长，3μM JTE-151与0.05nM吉西他滨组合抑制PDX204细胞的类器官生长。图68是来自JTE-151治疗的原代患者来源类器官(包括PDX1356、PDX1535、PDX202和PDX204)的所有数据的汇编，它显示0.3μM和3μM的JTE-151显着抑制了来源自原代胰腺癌患者的细胞的类器官生长。
类似地，使用类器官测定检查了不同剂量的JTE-151对人胰腺癌快速生长(FG)细胞的作用(图69)。测试了三种剂量的JTE-151：0.3μM、1μM和3μM。对于每个剂量的JTE-151，测试了四种条件：媒介物、单独的吉西他滨(0.05nM)、单独的JTE-151以及JTE-151和吉西他滨的组合。如在图69中所示，JTE-151在所有测试剂量下，单独施用或与吉西他滨组合施用，导致FG类器官生长的显着抑制。此外，在每个测试剂量下，JTE-151和吉西他滨的组合对FG类器官生长产生最高的抑制作用。总的来说，这些数据证实了RORγ作为胰腺癌进展的中枢调节因子，并识别了JTE-151是一种RORγ抑制剂，可单独或与另一种化学治疗药物组合使用作为有效的抗肿瘤治疗剂。
最后，在体内检查了JTE-151对携带原代患者来源的胰腺癌异种移植物的小鼠的影响(图70-图78)。如在图51中所示，这是实验设计的示意图，移植了原代胰腺癌患者来源的异种移植物的免疫缺陷小鼠被允许发展肿瘤，然后荷瘤小鼠接受媒介物或JTE-151，然后在实验结束时使用不同的参数分析肿瘤，包括肿瘤质量、细胞数量、EpCAM阳性、CD133阳性和EpCAM/CD133阳性。图70-图72显示在使用携带PDX1356异种移植的小鼠的实验中的3轮治疗。在图70-图72中每个图的第一面板的横轴表示治疗天数，纵轴表示肿瘤体积。其余每个面板的横轴表示靶标(媒介物与JTE-151小鼠)，纵轴表示指定的测量。JTE-151以在图中指定的方案施用。例如，在第一轮(图70)中，前25天每天一次以90mg/kg体重施用JTE-151，然后从第26天到第40天每天两次施用。原代患者异种移植显示JTE-151递送后肿瘤生长减少、细胞计数减少、EpCam+肿瘤上皮细胞减少和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞减少。在第二轮(图71)中，JTE-151在第一周以120mg/kg每天两次(总共240mg/kg)施用，然后是1周的药物假期，然后以60mg/kg从第2周到第4周每天一次施用，观察到JTE-151具有类似的减瘤作用。在第三轮(图72)中，JTE-151以90mg/kg每天一次施用，JTE-151治疗再次导致EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞减少。图73显示在3个实验中媒介物-和JTE-151治疗的小鼠之间PDX1356肿瘤生长速率随时间的比较。JTE-151治疗的肿瘤显示出普遍更慢的生长速率，反映在与对照相比斜率的降低。
使用JTE-151以90mg/kg每天一次测试其他两种原代患者来源的异种移植物PDX1535(图74和图75)和PDX1424(图76和图77)。如在图74和图75中所示，PDX1535异种移植物在JTE-151递送后显示出肿瘤质量、总细胞计数、EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞减少的趋势(图74)，尽管肿瘤体积或生长速率没有表现出任何显着差异(图74，图75)。考虑到肿瘤质量和细胞数量减少，肿瘤体积没有显着变化可能是由于坏死细胞在药物治疗后保留了一段时间。如在图76中所示，PDX1424异种移植物也显示出在JTE-151递送后肿瘤质量、总细胞计数、EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞减少的趋势。并且JTE-151治疗的肿瘤显示出更慢的生长速率(图77)。图78是来自用媒介物或JTE-151治疗的原代患者来源的异种移植物的数据的汇编，它显示JTE-151的治疗显着减少了肿瘤质量、细胞数量、EpCam+肿瘤上皮细胞和EpCam+/CD133+肿瘤干细胞，表明其癌症治疗功效。
综上所述，这些数据表明JTE-151治疗在体外类器官培养物中和在体内均阻断了原代哺乳动物胰腺癌细胞(人和小鼠)的生长。总的来说，这些研究展示了用JTE-151靶向RORγ可有效地在体外和在体内阻断胰腺癌的生长，并有可能为胰腺癌带来有效的新疗法。考虑到抑制RORγ已被证明可以减少其他类型的癌症生长，包括白血病和肺癌，JTE-151具有巨大的潜力，可以单独或与化学治疗药物组合用于抗癌疗法。
Figure BDA0003297603190000821
表1显示来自干细胞网络的选定基因，这些基因通过在干细胞中的富集基因表达(RNA-seq)、优先开放(H3K27ac ChIP-seq)或生长必需基因表达(CRISPR筛选)进行识别。RNA-seq：倍数变化表示在干细胞/非干细胞中表达。H3K27ac ChIP-seq：向上表示富集干细胞的H3K27ac峰；干细胞SE，干细胞特有的超级增强子；共有SE，干细胞和非干细胞中的超级增强子；N.D.，未检测到H3K27ac。CRISPR筛选；2D，常规生长条件；3D，干细胞状况；√√√，p<0.005；√，基因排在耗尽引导的前10％(对于2D p<0.049，对于3D p<0.092)；-，基因不在耗尽的前10％。
Figure BDA0003297603190000841
表2包括在胰腺癌中选择新药物靶标，并表示指定拮抗剂的靶标抑制对在体外和在体内胰腺癌细胞生长的影响。复选标记表示在指定测定中观察到的生长抑制程度；–，没有可检测的反应；ND，未确定。
表3：PDAC患者的特性(n＝116)
Figure BDA0003297603190000851
Figure BDA0003297603190000861
表4：RT-qPCR分析的引物序列
Figure BDA0003297603190000871
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<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> hPEAR1 qPCR引物正向
<400> 5
agctgtgacg tgtcctgttc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> hPEAR1 qPCR引物反向
<400> 6
ctgccaacct tccttgcaga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mRorc qPCR引物正向
<400> 7
ggtgataacc ccgtagtgga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mRorc qPCR引物反向
<400> 8
ctgcaaagaa gacccacacc 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCsf1r qPCR引物正向
<400> 9
gcagtaccac catccacttg ta 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCsf1r qPCR引物反向
<400> 10
gtgagacact gtccttcagt gc 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl10rb qPCR引物正向
<400> 11
taagttgtcc acggctccag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl10rb qPCR引物反向
<400> 12
catgggctta cagagtgcaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCelsr1引物正向
<400> 13
gatgctgttg gtcagcatgt 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCelsr1 qPCR引物反向
<400> 14
cgctcatgga ggtgtctgt 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCelsr2 qPCR引物正向
<400> 15
gctgtgtgtg agcatctcgt 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCelsr2 qPCR引物反向
<400> 16
catcatgagt gtgctggtgt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mPear1 qPCR引物正向
<400> 17
agggcacacg gtaacaaaac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mPear1 qPCR引物反向
<400> 18
cacagaacat cacctggctg 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMyo5b qPCR引物正向
<400> 19
ccccttcttt gtagtccttg g 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMyo5b qPCR引物反向
<400> 20
cgtacagcga gctctacacc 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mOnecut3 qPCR引物正向
<400> 21
tttgagcttg ctccaggg 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mOnecut3 qPCR引物反向
<400> 22
gaagcgctac agcatccc 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mTdrd3 qPCR引物正向
<400> 23
cctttcccag gagagcttgt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mTdrd3 qPCR引物反向
<400> 24
gagcctgagc agctaaccat 20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mDusp9 qPCR引物正向
<400> 25
tcagactctc catggtcgc 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mDusp9 qPCR引物反向
<400> 26
cactagctgt ggccaggac 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mSptssb qPCR引物正向
<400> 27
agcgcgtgaa ggagtattt 19
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mSptssb qPCR引物反向
<400> 28
tggtcagtat gatggtgttg ag 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mLpin2 qPCR引物正向
<400> 29
gcccacataa ttcatggttt g 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mLpin2 qPCR引物反向
<400> 30
ggttcaggaa agctcgttga 20
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMyo10 qPCR引物正向
<400> 31
gaagaccacg acgccttct 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMyo10 qPCR引物反向
<400> 32
caatggacag cttctttccc 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mSftpd qPCR引物正向
<400> 33
gagagcccca taggtcctg 19
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mSftpd qPCR引物反向
<400> 34
gtagcccaac agagaatggc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mPkp1 qPCR引物正向
<400> 35
tggctatagg agctgaagcg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mPkp1 qPCR引物反向
<400> 36
cttctccaag ttccaggcag 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mLama5 qPCR引物正向
<400> 37
acccaaggac ccacctgtag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mLama5 qPCR引物反向
<400> 38
tcatgtgtgc gtagcctctc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMegf10 qPCR引物正向
<400> 39
cccagtgaca gagcagtgag 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMegf10 qPCR引物反向
<400> 40
atcacagcat ttcaggaccc 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl10 qPCR引物正向
<400> 41
tgtcaaattc attcatggcc t 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl10 qPCR引物反向
<400> 42
atcgatttct cccctgtgaa 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl34 qPCR引物正向
<400> 43
cgctttctct ggtttcttcg 20
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl34 qPCR引物反向
<400> 44
agctgctcaa agcttccg 18
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mEn1 qPCR引物正向
<400> 45
tccgaatagc gtgtgcagta 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mEn1 qPCR引物反向
<400> 46
cctactcatg ggttcggcta 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCar2 qPCR引物正向
<400> 47
gtcactgagg ggtcctcctt 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCar2 qPR引物反向
<400> 48
tgataaagct gcgtccaaga 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mAno1 qPCR引物正向
<400> 49
cgggagcgtc gagtacttct 20
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mAno1 qPCR引物反向
<400> 50
gcaggaaccc ccaactca 18
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMuc4 qPCR引物正向
<400> 51
ggacatgggt gtctgtgttg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMuc4 qPCR引物反向
<400> 52
ctcactggag agttccctgg 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mElmo3 qPCR引物正向
<400> 53
tgctgagaca caggatgctt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mElmo3 qPCR引物反向
<400> 54
agcactatgc cctgcagttt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mTff1 qPCR引物正向
<400> 55
ccacaattta tcctctcccg 20
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mTff1 qPCR引物反向
<400> 56
gtcctcatgc tggccttc 18
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMuc1 qPCR引物正向
<400> 57
tgctcctaca agttggcaga 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mMuc1 qPCR引物反向
<400> 58
taccaagcgt agcccctatg 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCtgf qPCR引物正向
<400> 59
gcttggcgat tttaggtgtc 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mCtgf qPCR引物反向
<400> 60
cagactggag aagcagagcc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl1r1 qPCR引物正向
<400> 61
atgagacaaa tgagccccag 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl1r1 qPCR引物反向
<400> 62
ggagaaatgt cgctggatgt 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl1b qPCR引物正向
<400> 63
ggtcaaaggt ttggaagcag 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> mIl1b qPCR引物反向
<400> 64
tgtgaaatgc caccttttga 20

Claims (20)

1.治疗RORγ依赖性癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括使所述受试者接受选自以下的一种或多种另外的癌症疗法：化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术及它们的组合，其中在施用所述包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物之前、期间或之后，向所述受试者施用所述一种或多种另外的癌症疗法。
3.抑制癌细胞生长的方法，其包括使一种或多种RORγ依赖性癌细胞与有效量的一种或多种RORγ抑制剂于体内、体外或离体接触。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述RORγ依赖性癌症包括胰腺癌、白血病和肺癌，诸如小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述RORγ抑制剂包括SR2211、JTE-151、JTE-151A和AZD-0284，或它们的由式I、II、III、IIIA和IV中任一项表示的类似物或衍生物。
7.用于治疗RORγ依赖性癌症的药物组合物，其包括治疗有效量的一种或多种RORγ抑制剂。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其还包括选自以下的一种或多种另外的治疗剂：化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂或它们的组合。
9.如权利要求7或8所述的药物组合物，其还包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂或其组合。
10.如权利要求7至9中任一项所述的药物组合物，其中所述RORγ依赖性癌症包括胰腺癌、白血病和肺癌，诸如小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。
11.如权利要求7至10中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症是转移性癌症。
12.如权利要求7至11中任一项所述的药物组合物，其中所述RORγ抑制剂包括SR2211、JTE-151、JTE-151A和AZD-0284，或它们的由式I、II、III、IIIA和IV中任一项表示的类似物或衍生物。
13.用于治疗RORγ依赖性癌症的组合疗法，其包括向受试者施用包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物以及施用另外的癌症疗法，所述施用另外的癌症疗法包括在施用包括一种或多种RORγ抑制剂的组合物之前、期间或之后，使所述受试者进行手术、施用一种或多种化学治疗剂、施用一种或多种放射疗法和/或施用一种或多种免疫疗法。
14.如权利要求13所述的组合疗法，其中所述RORγ依赖性癌症包括胰腺癌、白血病和肺癌，诸如小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。
15.如权利要求13或14所述的组合疗法，其中所述癌症是转移性癌症。
16.如权利要求13至15中任一项所述的组合疗法，其中所述RORγ抑制剂包括SR2211、JTE-151、JTE-151A和AZD-0284，或它们的由式I、II、III、IIIA和IV中任一项表示的类似物或衍生物。
17.一种或多种RORγ抑制剂在制备用于治疗RORγ依赖性癌症的药物中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述RORγ依赖性癌症包括胰腺癌、白血病和肺癌，诸如小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。
19.如权利要求17或18所述的用途，其中所述癌症是转移性癌症。
20.如权利要求17至19中任一项所述的用途，其中所述RORγ抑制剂包括SR2211、JTE-151、JTE-151A和AZD-0284，或它们的由式I、II、III、IIIA和IV中任一项表示的类似物或衍生物。
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