CN113702649B - 一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，包括下方的平面电极板、中央的间隙层和上盖板，所述下方的平面电极板表面附有电极材料，所述电极材料形成多个电极分布的图案系统，每一块电极均有部分分布于通道内，并有另一部分延伸至装置边缘构成引脚以便与外部设备连接。本发明低成本一次性，适合确定INR和PT。其操作简单、准确性高、采血量小，是一种适合患者进行抗凝自我管理的便携式体外诊断装置。

Description

一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片

技术领域

本发明涉及微流体生物芯片，特别是一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片。

背景技术

人体中凝血系统与抗凝系统在血液内通过各种凝血因子进行调节，形成了复杂的动态平衡。在凝血的第一个阶段，凝血酶参与催化了可溶性血浆蛋白纤维蛋白原向不溶性血纤维蛋白网或血凝块的转化，而凝血酶通常以凝血酶原的非活性形式存在于血液中。

凝血试验通过在各种条件下测定血液样本的凝结时间，从而对相关的血液病症进行预防、诊断和治疗。比如法华林等抗凝药物被广泛使用，此疗法需要对凝血指标频繁监测以调整剂量，避免形成血栓或出现出血的风险。

凝血酶原时间(PT)测试是一种常见的凝血测量方法。该方法是测量从凝血剂激活化到凝血开始所经过的时间，激活剂为组织因子或促凝血酶原激酶，这种机制称为“外源性”途径。

由于不同来源与不同批次的组织因子或促凝血酶原激酶之间存在性质差异，因此通常使用国际标准化比率(INR)来表达凝血酶原时间(PT)。

INR＝(PT ratio)ISI，其中ISI是国际灵敏度指数；

PT ratio＝患者的PT/平均正常PT。

近年来，由用户自主使用Point-of-Care(POC)装置进行凝血检测的需求已经形成了替代传统方法的趋势。由患者在家中自行定期进行可靠的凝血指标的检测可以作为止血病症诊断的初步辅助手段，这可以有效提高患者，尤其是行动不便的患者的治疗效果。与传统的凝血检测仪相比，这种自我检测的家用设备需要具有方便、快捷、廉价、可靠、便携等方面的优势。

目前已经出现开发了诸如CoaguChek的便携式凝固监测器，这样的监测器利用毛细管全血测量凝血酶原时间。这样的传感器已经被证明是一种适合长期口头抗凝血治疗患者的有价值的工具。

专利申请WO 92/21028描述了基于磁性的检测方法。该装置包括凝结室和对照室，每一个都设置了搅拌叶片，它们可在振动磁场中旋转。随着凝血开始并对叶片移动施加阻力，凝血室中叶片的旋转变慢。凝血时间测定为小室中搅拌叶片的相对移动有变化的时间。

在美国专利US 5,110,727提供的方法中，在血液样品中分散金属颗粒，当施加振荡磁场时，诱导颗粒前后运动，其随着血液凝结而减慢。速度的降低与血液样品粘度的增加或凝结开始相关。

专利申请WO 00/06761和WO 02/48707A2描述了设置有与静止血液样品接触的电极的装置，并分别测量血液粘度增加时的电导率和电流变化。

WO 2004/059316A1描述了用于确定血液凝结时间的低成本、一次性装置。该装置配备了至少部分地与流体接触的微传感器并通过测量通道中血液的阻抗和电容来确定血液凝结和流动停止的时间。

专利申请WO 2007/025559A1公开了用于确定血浆或全血样品中凝结的多层装置，其包括一个或多个检测区域，它们都具有至少一种凝结刺激试剂。

专利申请US2007/0122849A1公开了微流体芯片中用于定量分析和检测分析物的样品测定结构。

EP 0394070B1描述了单毛细管通道的微流体装置，其优化了对体积为40μL且停留时间为200s的全血样品中的APTT的确定。该装置将用于活化部分凝血活酶时间测量的活化剂的混合物和磷脂混合物用作试剂。通过毛细管道采用的该检测方法为视觉的或光学的，例如LED，并在血流沿该装置停止时确定APTT。

US 6,900,021描述了微流体装置，其在体外进行该反应和各种化合物对细胞的影响的研究。采用泵、压力差或电场来控制流体流动，而不是通过微流体通道中的毛细管作用。有两个相交叉并与主流路汇合的输入流路，以使得反应能发生。因此，主流路不包括含试剂的区域。另外，试剂不存在于芯片中，而是在不同点和时间加入，这使得芯片能用于具有不同试剂的不同反应测定。

但是，这些装置在生产成本、采血量、操作复杂性等方面仍存在一些缺陷，限制了它们作为一次性部件的应用。因此，仍亟需用于POC和/或NPT凝结时间确定的精确、低成本的一次性芯片和检测方法。

由于电子、材料以及微流体等领域的进步，便携式凝血检测设备已有进一步的进展，制作成本有所降低，操作简化，测试需要更少的全血样品。

CN200880117091.X提供了一种便携式凝血测量仪器，其中包括模拟微毛细血管的一次性微通道芯片，通过采集光学信号并计算样品的动力学参数变化来监测血液或血浆的凝结时间。此外，在芯片上还设置了质量控制通道。

尽管已经有了这些进展，但是当前使用的基于微流体芯片的便携式凝血测量设备具有一些缺陷：在测试过程中，血液样品进入微通道的体积不断增加，而试剂来源仅为微通道入口处设置的一个反应室，虽然试剂中含有增溶剂的成分以提高溶解速度增加扩散速度，但是这种单一反应室的试剂引入方式仍然无法有效控制试剂在血液样品中的扩散行为，因此其在通道中处于不同位置的血液样品中的会产生试剂浓度的随机性差异，这种浓度的随机分配会给不同测试之间带来微小的差异，经过一系列凝血反应后这种微小的差异会不断积累放大，放映在最终的测量结果上会形成较大的误差，导致测试的重复性和可靠性降低。

现有技术未考虑生物分子在内壁的吸附带来的影响。在测试过程中血液中的蛋白质/细胞在通道内壁粘附导致微通道的横截面积发生变化，而此因素在微流体的动力测量过程中影响较大，尤其是当通道的横截面与毛细血管横截面尺寸类似时其内壁被粘附造成的影响尤其重大，而这种影响会严重降低测试结果的可靠性。基于光学传感器的信号采集设备成本较高。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，低成本一次性，适合确定INR和PT。其操作简单、准确性高、采血量小，是一种适合患者进行抗凝自我管理的便携式体外诊断装置。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，包括下方的平面电极板、中央的间隙层和上盖板，所述下方的平面电极板表面附有电极材料，所述电极材料形成多个电极分布的图案系统，每一块电极均有部分分布于通道内，并有另一部分延伸至装置边缘构成引脚以便与外部设备连接。

所述下方的平面电极板使用一次性电极材料镀金PET材料。

所述下方的平面电极板上的各个电极之间的区域无电极材料覆盖，基底裸露在表面，由激光雕刻技术在整张电极板上进行金属剥离，利用金属被剥离的区域的绝缘性将原本均匀覆盖在表面的整张电极板划分为各个独立的电极区域，在没有液体样品进入时各个电极之间均无电路联通。

所述中央的间隙层上具有通孔，所述通孔形状按照流体分布系统的图案进行排布，所述下方的平面电极板、中央的间隙层的通孔与上盖板三者通过粘合剂进行结合后可形成微通道，微通道的图形以及横截面尺寸由间隙层的通孔调控，所述微通道通过适当的器件经由一端连接至待测样品引入部位。

所选的粘合剂使用热封或压敏粘合剂或亲水性制剂，在粘合剂中添加表面活性剂，所述粘合剂中的成分不与流体样品反应或不干扰凝结反应。

所述中央的间隙层由塑料通过适当的工艺制成，具体为采用COC、PMMA、PC、PSU、SAN、PETG、PS和PP材料，使用模压和软蚀刻印刷或激光雕刻技术进行加工。

所述微通道中设有亲水性表面，所述亲水性表面存在于下方的平面电极板、中央的间隙层的通孔与上盖板上，覆盖微通道内壁，所述亲水性表面由亲水性化学涂层提供。

所述微通道内壁的亲水涂料中混入对生物分子具有吸附的材料，所述对生物分子具有吸附的材料包括聚乙二醇、聚氧乙烯，或者使用电引发聚合的方式在电极上修饰具有抗蛋白吸附功能的两性聚合物，所述具有抗蛋白吸附功能的两性聚合物包括pCBMA、pCBAA。

所述微通道内的电极表面修饰有干试剂，所述干试剂的修饰采用喷涂等常规的液体加工方式进行修饰，再经过干燥步骤完成。

进行检测时，需要向入口添加血液或血浆样品，血液或血浆由该入口进入样品分配通道，沿通道分流进入凝结通道和一个或多个对照通道，沿通道流动并与通道内的电极接触，由电极记录各个通道内的行程L和时间t；

在血液凝结前的时间t时，样品在通道内的行程L表示如下：

L＝L(t)

L’＝L’(t)

其中L和 L’分别为凝结和对照通道中的行程，时间t＝0为样品进入通道后首次接触促凝血试剂，并引起第一次电导率变化的时刻，因为其为组织因子或促凝血酶原激酶溶解并启动反应机制的时刻，并且该时刻容易为电极信号所记录；

分流具有几乎相同的运动动力学，直至凝结通道中开始凝结，最早血液凝结发生时的这个时刻被鉴定为凝血酶原时间，并导致粘度的突然增加，这时，沿凝结通道的流动动力学相对于对照通道减速，通过持续监测作为时间函数的行程L，可计算该行程对时间的导数，这可认为是样品在通道内的流动速度V，样品在通道内的流动速度可以表示如下：

V＝V(t)

V’＝V’(t)

可通过某个时间在凝结和对照通道中的行程或速度的差值L(t)-L’(t)，以及V(t)-V’(t)，并设置适当阈值“ΔL”以及“ΔV”来来确定PT，在PT之前，粘度被认为是恒定的，凝结和对照通道中的L和V具有较小差异，在时间tp时，行程差或速度差刚刚超过阈值，该时刻即为PT。

相比于现有技术，本发明的优点在于：本发明为一次性微流控芯片用于检测血液凝结时间，通过沿着微通道分布且与样品接触的电极测量流经微通道的样品的电导率变化，以此为基础来监测通道中流动的样品的动力学参数变化，以实现对样品凝固时间的确定，特别适合确定PT和INR的检测，其制作方法简单，适合大规模生产，成本低廉。

在微通道内的电极表面设置了干试剂，干试剂均匀分布在血液样品流经的途径中。这样随着进入微通道的血液样品体积的不断增加，血液样品可以在行进过程中不断补充试剂，从而使试剂在血液样品中的浓度维持不变，解决了试剂在样品中因为消耗和扩散不均匀导致的测试结果重复性差的问题，提高了准确性和可靠性。本方案中存有试剂均匀分布在通道中，所以此设计不会改变通道的微流体动力学性能。并且由于试剂布置在微通道内，其附着面积小，因此不会明显提高其成本，而同时又可以有效提高测试效果。

本设计中在通道内引入了具有抵抗血液中生物分子吸附功能的成分，比如在通道内壁的亲水涂料中混入聚乙二醇、聚氧乙烯，也可以在电极上以电引发聚合的方式修饰具有抗蛋白吸附功能的两性聚合物如pCBMA、pCBAA等，这样有效降低了血液中蛋白质/细胞在通道内壁上的粘附，提高了测试结果的可靠性。

使用电极测量样品的电导率变化，检测方便，信号明显，制作方法简单，成本进一步降低。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2为本发明实施例俯视图。

图3为本发明实施例电极图案与微通道设计图。

图4为本发明另一种微通道和电极的分布示意图。

图5为本发明微通道横截面示意图。

图6为本发明凝结和对照两个通道中的行程和时间的关系图。

图7为本发明样品在通道内的流动速度V对时间t作图的曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。

如图1所示，本发明的微流体装置为三层组装件，包括下方的平面电极板、中央的间隙层和上盖板。在下方的电极板表面附有电极材料，按照一定的设计形成多个电极分布的图案系统，每一块电极均有部分分布于通道内，并有另一部分延伸至装置边缘构成引脚以便与外部设备连接。优选的，可以使用生物传感器领域中的常用的一次性电极材料镀金PET材料作为电极板。电极板上的各个电极之间的区域无电极材料覆盖，基底裸露在表面，其具体加工方法可以由激光雕刻技术在整张电极板上进行金属剥离，利用金属被剥离的区域的绝缘性将原本均匀覆盖在表面的整张电极板划分为各个独立的电极区域，以确保在没有液体样品进入时各个电极之间均无电路联通。其中电极材料应具有导电性好、化学稳定性高、厚度小（通道内外电极材料与基材之间的高度差不应影响通道的密合性，并且在通道中电极材料所形成的高度对流体动力学行为不产生明显影响）、与电极板基材的附着力强、易加工等特性。

中央的间隙层上具有通孔，其形状按照流体分布系统的图案进行排布。电极板、间隙层的通孔与上盖板三者通过粘合剂进行结合后可形成微通道，微通道的图形以及横截面尺寸可由间隙层的通孔调控。微通道通过适当的器件经由一端连接至待测样品引入部位。所选的粘合剂可使用热封和压敏粘合剂，可采用亲水性制剂，在粘合剂中添加表面活性剂，需要注意粘合剂中的成分不与流体样品反应或不干扰凝结反应。

电极板、间隙层的通孔与上盖板所形成的通道中，流体无需外力，仅通过毛细管作用即可引起流动。技术人员能够调整间隙层中通孔的图形、大小和形式以获得能够控制样品的流动方向、位置或速度。间隙层可由塑料通过适当的工艺制成，比如，可采用COC、PMMA、PC、PSU、SAN、PETG、PS和PP等材料，使用模压和软蚀刻印刷或激光雕刻等技术进行加工。

为了产生流体样品的毛细流动，通道中需要亲水性表面，以便提供足够的负压。这种亲水性表面可存在于下方电极板、间隙层的通孔与上盖板上，覆盖通道内壁。亲水性表面由亲水性化学涂层提供。还需要在通道内壁修饰具有对血液中的蛋白质/细胞等生物分子具有抗吸附作用的成分，以防止生物分子在通道内壁粘附导致微通道的横截面积发生变化。因为本发明基于血液样本的流动动力学进行测试，当通道的横截面与毛细血管横截面尺寸类似时，横截面的微小变化会对微流体的动力测试产生严重的影响。因此，为了提高测试结果的可靠性，需要对通道内壁进行抗生物分子吸附的修饰。优选的方法，可以在用于通道内壁的亲水涂料中混入对生物分子具有吸附的材料，比如聚乙二醇、聚氧乙烯，也可以使用电引发聚合的方式在电极上修饰具有抗蛋白吸附功能的两性聚合物如pCBMA、pCBAA等。

化学涂层中，

需要注意的是，在排气口处不可修饰亲水涂料，需要保留通道本身的疏水表面以便使其具有对液体样品的停止作用。

如图2所示，在芯片上的微通道由一个入口、主通道、两个以上分流通道、排气口构成。可以根据具体需要设计多种微通道的排布路线图形，在本实施例中，芯片纵向长度为5厘米，横向长度为4.5厘米，微通道如图所示方式排列，入口宽度3毫米，主通道宽度1毫米，分流通道宽度150微米，间隙层厚度150微米，因此分流通道的横截面为边长150微米的正方形。

通道内布满亲水涂层。当血液样品接触入口时，由于毛细管作用，血液样品会进入主通道并会沿通道运动。样品流至主通道与分流通道的交汇处时，将分成多个路线进入各个分流通道。而在每个分流通道的末端都具有排气口，排气口处的通道内壁没有修饰亲水涂料，因此如果样品运动至排气口,将在此处停止，不会流出装置外。在本发明的装置中，样品流动仅由毛细作用驱动，无需外力。

电极板上的电极图案包括电极和引脚。其中电极的位置需要与微通道的分布图形对应，应确保组装完成后电极按照一定顺序埋设在通道中，沿着通道的路径分布；电极延伸至通道外在装置边缘处构成引脚，引脚可以以欧姆接触的方式连接进入与外部设备的电路，其作用是传递指令和电信号，引脚可以设置成任意适合与常用电子接口器件连接的图形。电极和引脚可以用整张平面电极材料加工得到。样品在微通道中流动时将流经通道内的电极，使各个电极之间形成电路联通。当通道中两个相邻电极之间发生联通时将引起二者之间的电导率的突变，这个电路变化可以很容易地被通过引脚与电极连接的外部仪器监测到，而此时即为样品前沿流至通道中距离入口较远，即样品行程较大的电极的时间。根据电路设计图，可以确定此时样品在通道中的行程，并记录发生此变化的时间。以此方法，通过对电路中电信号和时间的记录，可以确定样品在微通道内运行的行程、时间、速度等流体动力学参数。通过带有嵌入软件的微处理器处理检测信号并生成动力学流动数据曲线，用算法来确定凝结时间。

如图3所示，微通道的分布图形采用图2所示的方案，电极板上电极图案与微通道的分布图形对应，这种电极图案可以在镀金PET上使用激光雕刻技术加工实现加工。

电极分布图案将微通道分割为多段区域，每一段区域都有一块单独的电极对应，方便将该区域的电信号传至通道外。当测试样沿着微通道流动，在其从某一段区域经过，抵达下一段区域的时候，将接触下一段区域的下表面电极，这会在此相邻的两段区域的电极之间形成电路连通，进而形成电导信号的突变而被外部仪器检测到。由于微通道图案和电极分布图案为已知设定，因此到达此段区域的行程为确定值，另外可以通过设备记录电导率发生突变的时刻确定液体样品抵达此段区域的时间。由此可以得到样品在微通道内运行的行程、时间、速度等流体动力学参数，通过生成的动力学流动数据曲线，用算法来确定凝结时间。

如图4所示，在本实施例中，芯片纵向长度为6厘米，横向长度为1厘米，微通道如图所示方式排列，入口宽度6毫米，主通道宽度3毫米，分流通道宽度250微米，间隙层厚度250微米，因此分流通道的横截面为边长250微米的正方形。

如图5所示，下表面由电极板基材和电极材料共同构成，两侧表面由间隙层构成，上表面由上盖板构成。电极板、间隙层和上盖板之间由粘合剂结合。需要注意的是，电极材料的厚度需要足够小。原因在于，有电极材料覆盖的区域和无电极材料覆盖的区域的结合部位会从通道内延伸至通道外，而二者结合处的高度差约为电极材料的厚度，而在平面电极板和间隙层结合时，此高度差应不可足以对通道的封闭性产生影响，并且在通道中此高度差也不应对流体动力学行为产生明显影响，因此这个高度差应该足够小，也就是电极材料的厚度需要足够小而不应对上述问题产生不利影响。通道修饰有对血液中的蛋白质/细胞等生物分子具备抗吸附作用的成分的成分，可以在用于通道内壁的亲水涂料中混入对生物分子具有吸附的材料，比如聚乙二醇、聚氧乙烯，也可以使用电引发聚合的方式在电极上修饰具有抗蛋白吸附功能的两性聚合物如pCBMA、pCBAA等。在通道内的电极表面修饰有干试剂。干试剂的修饰可采用喷涂等常规的液体加工方式进行修饰，再经过干燥步骤完成。

芯片设有多个通道，在每个通道内的电极表面修饰有合适的干试剂，其均匀分布在血液样品流经的途径中。需要注意的是，通道中修饰试剂的起始位置需要与能够传出电导率信号变化的第一个电极位置重合，便于利用电信号记录时间。比如在图3展示的实施例中，在沿通道分布的第二个电极的位置开始设置干试剂。当血液样品流经此电极时，如果是凝结通道，则试剂中的激活剂成分溶解进入血液启动凝血机制，这个时刻即为启动反应机制的时刻。而与此同时血液样品接触到前二个电极时，在两个电极之间形成了通路，电路检测到电导率的变化并记录该时刻，于是启动时刻被记录。随后，血液样品继续沿着通道流动，通道中后续的试剂不断溶解进入样品。这种试剂沿通道均匀分布的设计目在于，随着进入微通道的血液样品体积的不断增加，血液样品可以在行进过程中不断补充试剂，从而使试剂在血液样品中的浓度维持不变，解决了试剂在样品中因为消耗和扩散不均匀导致的测试结果重复性差的问题，提高了准确性和可靠性。本方案中存有试剂分布均匀，所以此设计不会改变通道的微流体动力学性能。并且由于试剂在微通道内壁，其附着面积小，不会明显提高其成本，而同时又可以有效提高测试效果。本设计中，由于上述记录启动反应时刻的需要，因此未采用将试剂混入亲水涂料中涂在通道内壁的设计。干试剂的修饰可采用喷涂等常规的液体加工方式进行修饰，再经过干燥步骤完成。

干试剂成分，修饰方法：

凝结通道中的干试剂组成如下：

凝结通道中的主要化合物为起始凝结级联的促凝血酶原激酶，比如人促凝血酶原激酶重组蛋白。另外还含有其他具有快速增溶，增强稳定性等作用的化合物，比如羟丙基纤维素、白蛋白、海藻糖、聚乙二醇、Triton、聚凝胺、磷酸缓冲剂等

随着血液样品沿着通道的流动，并在各个电极之间形成通路，仪器记录电极之间的电导率发生突变的时间即为血液样品前缘到达相应电极的时间。因为电极在芯片上的位置固定，所以血液样品在通道中到达各个电极的行程可根据设计方案得到。由此可以得到血液血液样品流动前缘的位置和到达该位置的时间，并确定样品在微通道内的行程L和流动时间t。通过带有嵌入软件的微处理器处理检测信号并生成动力学流动数据曲线，用算法来确定凝结时间。

芯片包括凝结和一个或多个对照通道，图3所示为一个凝结通道和一个对照通道的实施例。血液样品进入芯片后被毛细作用向各个通道分流。凝结通道和对照通道中所使用的试剂组成不同。凝结通道中的试剂中包含一定量的组织因子或促凝血酶原激酶，用于激活凝血反应机制，并通过通道内的电极的电信号监测该通道内样品的流体动力学参数，优选流体前缘的位置或速度。对照通道中的试剂位置、电极位置的设计和数据获取方法与凝结通道相同，只是对照通道中的试剂成分与凝结通道中的试剂成分不同。对照通道的试剂为具有可提供已知且固定(或小范围)的凝结时间的特定试剂，例如肝素、柠檬酸盐、草酸盐、EDTA等具有抑制凝结效果的试剂，目的是为凝结时间提供参照通道的动力学数据。比较所述凝结和对照通道的动力学参数，即可确定血液样品的凝结时间。

根据以上描述的特点可知，本芯片适合用于确定凝结激活和开始凝结之间经过的时间，即凝血酶原时间，以及与其相关的参数的推算，如计算INR。

进行检测时，需要向入口添加血液或血浆样品，血液或血浆由该入口进入样品分配通道，沿通道分流进入凝结通道和一个或多个对照通道，沿通道流动并与通道内的电极接触，由电极记录各个通道内的行程L和时间t。

在血液凝结前的时间t时，样品在通道内的行程L可表示如下，

L＝L(t)

L’＝L’(t)

其中L和 L’分别为凝结和对照通道中的行程。时间t＝0为样品进入通道后首次接触促凝血试剂，并引起第一次电导率变化的时刻。因为其为组织因子或促凝血酶原激酶溶解并启动反应机制的时刻，并且该时刻容易为电极信号所记录。

分流具有几乎相同的运动动力学，直至凝结通道中开始凝结。最早血液凝结发生时的这个时刻被鉴定为凝血酶原时间，并导致粘度的突然增加。这时，沿凝结通道的流动动力学相对于对照通道减速。通过持续监测作为时间函数的行程L，可计算该行程对时间的导数，这可认为是样品在通道内的流动速度V。样品在通道内的流动速度可以表示如下：

V＝V(t)

V’＝V’(t)

可通过某个时间在凝结和对照通道中的行程或速度的差值L(t)-L’(t)，以及V(t)-V’(t)，并设置适当阈值“ΔL”以及“ΔV”来来确定PT。在PT之前，粘度被认为是恒定的，凝结和对照通道中的L和V具有较小差异，在时间tp时，行程差或速度差刚刚超过阈值，该时刻即为PT。对于行程L或流动速度的实时记录以及两通道中参数的差值以及与阈值的比较等计算工作可采用电路嵌入程序实现。

使用图2、图3的微通道以及电极分布设计方案，使用电极记录时间t和行程L。以下将行程L对时间t作图，以及将速度V对时间t作图，利用凝结通道和对照通道的曲线差异来确定PT。

在图6中展示了凝结和对照两个通道中的行程和时间的关系。图中两条曲线开始出现明显差异的时间即为凝血酶原时间。在凝血酶原时间之前，凝结和对照两个通道之间的曲线差异很小，仅受非均一的环境条件、制造公差和检测噪声的影响。

也可以使用样品在通道内的流动速度V对时间t作图，如图7所示。

Claims (6)

1.一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，其特征在于包括下方的平面电极板、中央的间隙层和上盖板，所述下方的平面电极板表面附有电极材料，所述电极材料形成多个电极分布的图案系统，每一块电极均有部分分布于通道内，并有另一部分延伸至装置边缘构成引脚以便与外部设备连接；

所述中央的间隙层上具有通孔，所述通孔形状按照流体分布系统的图案进行排布，所述下方的平面电极板、中央的间隙层的通孔与上盖板三者通过粘合剂进行结合后形成微通道，微通道的图形以及横截面尺寸由间隙层的通孔调控，所述微通道通过适当的器件经由一端连接至待测样品引入部位，所述待测样品为血液样品或血浆样品；

所述多个电极分布的图案系统将微通道分割为多段区域，每一段区域都有一块单独的电极对应，用于将该区域的电信号传至通道外；

所述微通道中设有亲水性表面，所述亲水性表面存在于下方的平面电极板、中央的间隙层的通孔与上盖板上，覆盖微通道内壁，所述亲水性表面由亲水性化学涂层提供；

所述微通道内的电极表面修饰有干试剂，所述干试剂的修饰采用包括喷涂的液体加工方式进行修饰，再经过干燥步骤完成；所述干试剂均匀分布在血液样品或血浆样品流经的途径中；

所述微流体生物芯片还具有以下a)或b)之一的构造：

a)所述微通道内壁的亲水性化学涂层中混入对生物分子具有抗吸附作用的材料，所述对生物分子具有抗吸附作用的材料包括聚乙二醇或聚氧乙烯；或者

b)使用电引发聚合的方式在电极上修饰具有抗蛋白吸附功能的两性聚合物，所述具有抗蛋白吸附功能的两性聚合物包括pCBMA或pCBAA。

2.根据权利要求1所述的一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，其特征在于所述下方的平面电极板使用一次性电极材料镀金PET材料。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，其特征在于所述下方的平面电极板上的各个电极之间的区域无电极材料覆盖，基底裸露在表面，由激光雕刻技术在整张电极板上进行金属剥离，利用金属被剥离的区域的绝缘性将原本均匀覆盖在表面的整张电极板划分为各个独立的电极区域，在没有血液样品或血浆样品进入时各个电极之间均无电路联通。

4.根据权利要求1所述的一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，其特征在于所述粘合剂使用热封或压敏粘合剂或亲水性制剂，在粘合剂中添加表面活性剂，所述粘合剂中的成分不与待测样品反应或不干扰凝结反应。

5.根据权利要求1所述的一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，其特征在于所述中央的间隙层采用COC、PMMA、PC、PSU、SAN、PETG、PS或PP材料，使用模压、软蚀刻印刷或激光雕刻技术进行加工。

6.根据权利要求1-2、4-5中任意一项所述的一种用于测定血液凝结时间的微流体生物芯片，其特征在于进行检测时向入口添加血液样品或血浆样品，血液样品或血浆样品由所述入口进入样品分配通道，沿通道分流进入凝结通道和一个或多个对照通道，沿通道流动并与通道内的电极接触，由电极记录各个通道内的行程L和时间t；

在血液凝结前的时间t时，样品在通道内的行程L表示如下：

L＝L(t)

L’＝L’(t)

其中L和L’分别为凝结通道和对照通道中的行程，时间t＝0为样品进入通道后首次接触促凝血试剂并引起第一次电导率变化的时刻，t＝0时刻为电极信号所记录，在t＝0时刻组织因子或促凝血酶原激酶溶解并启动反应机制；

分流具有几乎相同的运动动力学，直至凝结通道中开始凝结，最早血液凝结发生时的时刻t_p被鉴定为凝血酶原时间PT，并导致粘度的突然增加，这时，沿凝结通道的流动动力学相对于对照通道减速；

通过持续监测作为时间函数的行程L，计算该行程对时间的导数，这被认为是样品在通道内的流动速度V，样品在通道内的流动速度表示如下：

V＝V(t)

V’＝V’(t)

通过某个时间在凝结通道和对照通道中的行程差L(t)-L’(t)或速度差V(t)-V’(t)并设置适当阈值ΔL或ΔV来确定PT，在PT之前，粘度被认为是恒定的，凝结通道和对照通道中的L和V具有较小差异，在时间t_p时，所述行程差或所述速度差刚刚超过阈值，该时刻即为凝血酶原时间PT。

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